本發(fā)明屬于番荔枝花粉檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢定番荔枝花粉生活力的方法。

背景技術(shù)：

1、番荔枝又稱釋迦，為番荔枝科（annonaceae）番荔枝屬（ annona）多年生半落葉性小喬木，在我國熱帶及亞熱帶地區(qū)（福建、廣東、廣西、云南、海南等地）擁有超過400年栽培歷史，近年來隨著香蕉、芒果、甘蔗等傳統(tǒng)熱區(qū)作物/果樹種植發(fā)展趨于飽和，番荔枝逐年受到追捧，成為新的增長點(diǎn)。然而其相關(guān)栽培技術(shù)在我國仍處于初級階段，理論研究與實際生產(chǎn)種植仍然存在很多待優(yōu)化的方面。介于此，對番荔枝生產(chǎn)及科研中一些關(guān)鍵問題開展針對性的探索意義重大。

2、人工授粉是是指用人工將植物花粉傳送到柱頭上完成受精的技術(shù)措施，在生產(chǎn)上它是提升番荔枝品種座果率和果實品質(zhì)的重要手段，同時對于番荔枝種質(zhì)資源創(chuàng)新而言，其也是新種質(zhì)創(chuàng)制的重要實現(xiàn)技術(shù)之一?，F(xiàn)有的番荔枝授粉的方法主要有以下兩種：

3、1.自然授粉（風(fēng)媒蟲媒等）：利用空氣流動及昆蟲等自然行為完成授粉。優(yōu)點(diǎn)：前期省工；缺點(diǎn)：針對生產(chǎn)主栽品種ap番荔枝、鳳梨釋迦等，產(chǎn)量極低，果形不端正，果實成熟時期分散，采收不便，低投入低產(chǎn)出。

4、2.人工授粉方法：手工收集花粉，對可授狀態(tài)的雌蕊進(jìn)行人工授粉操作。具體為：

5、分批次修剪（按照市場需求及果實發(fā)育期進(jìn)行計算），待群體臨開花前雌花進(jìn)行可授狀態(tài)檢查（環(huán)境溫濕度是否適合，柱頭是否發(fā)育正常，是否濕潤有粘液覆蓋），開花前約4-6h進(jìn)行授粉樹集中臨成熟花朵的收集，陰涼處批量分散存放，待雄蕊花藥自然爆開后，收集花粉

6、對開花前一日處于雌蕊成熟狀態(tài)的花朵進(jìn)行涂抹授粉。優(yōu)點(diǎn)：可根據(jù)市場批量集中授粉，集中優(yōu)化管理，同步化果實成熟期，果實端正，品質(zhì)高，投入產(chǎn)出比較前兩種方式高。缺點(diǎn)：花粉收集需要每個授粉日提前進(jìn)行，需要耗費(fèi)人工。且花粉存在較明顯的花粉活力波動，甚至出現(xiàn)花粉敗育，導(dǎo)致授粉效果不佳費(fèi)時費(fèi)工的問題產(chǎn)生。

7、上述比較可以看出，對番荔枝花人工授粉是目前最佳生產(chǎn)解決方案。對于人工授粉而言，充分的授粉和座果率高度依賴于足夠的花粉活力，對于儲存?zhèn)溆没蛘吲R成熟階段的花粉的精確活力判斷無論對番荔枝雜交試驗科學(xué)研究的順利開展或者生產(chǎn)上人工授粉均具有重要意義。

8、多數(shù)番荔枝存在修剪后固定天數(shù)抽稍成花的特性，因此在合適的季節(jié)人工差異化修剪可對不同番荔枝花期進(jìn)行同步化調(diào)控。但僅此無法獲得理想授粉結(jié)果。雌雄蕊的互作在臨開花時候是復(fù)雜的，番荔枝花是完全花（每朵花包括功能完整的雌蕊群與雄蕊群），存在明確的雌性期與雄性期，大部分品種為雌蕊先熟，開花過程包括花瓣開裂、快速張開（雌蕊成熟期），柱頭粘液消失、雌蕊群褐化（雌蕊衰老、可授性喪失），花藥爆裂、花粉釋放（雄蕊成熟期），這樣的特性注定了花粉與柱頭最適授粉時期存在天然時間差，無法同步。主栽品種ap番荔枝和鳳梨釋迦的花粉一般在下午或傍晚成熟，晚間8-11點(diǎn)為生產(chǎn)上的授粉時間。

9、花粉活力主要取決于環(huán)境溫度、濕度與花粉狀態(tài)（水分含量、成熟度、內(nèi)容物）以及上述諸因素的綜合。番荔枝科植物花粉由于花粉含水量高，對干燥敏感，其開裂后不能長時間存活。花期溫度濕度對發(fā)育進(jìn)程及雌雄蕊活力影響十分明顯，干旱高溫會導(dǎo)致花發(fā)育異常，花粉敗育，而過高濕度亦能影響花藥開裂散粉。因此對于花粉活力的判斷和快速，對于番荔枝人工授粉效率的提高具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種快速檢定番荔枝花粉生活力及發(fā)育階段的染色方法，不僅能對花粉進(jìn)行活力檢測，亦能進(jìn)一步對其發(fā)育時期及細(xì)胞核動態(tài)進(jìn)行示蹤，為生產(chǎn)上花粉活力檢測及開展花粉萌發(fā)過程理論研究提供方便。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

3、一種用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液計，包括以下質(zhì)量濃度的組分：蔗糖6-16%、椰子乳（ccm）0.1-1%、硝酸鈣（ca(no3?)?2·4h2o）250μg/ml、硫酸鎂（mgso?4·7h2o）200μg/ml、硝酸鉀（kno3）100μg/ml、硼酸（h3bo3）100μg/ml、peg8000?5%，熒光素二乙酸酯（fda）20-50μg/ml、碘化丙啶（pi）3-10μg/ml。

4、進(jìn)一步，所述的用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液計，包括以下質(zhì)量濃度的組分：蔗糖6-16%、椰子乳0.1-1%、硝酸鈣?250μg/ml、硫酸鎂?200μg/ml、硝酸鉀100μg/ml、硼酸100μg/ml、peg8000?5%，熒光素二乙酸酯20-50μg/ml、碘化丙啶3-5μg/ml。

5、進(jìn)一步，所述的用于番荔枝花粉染色的混合液，以混合液計，包括以下質(zhì)量濃度的組分：蔗糖6-16%、椰子乳0.1-1%、硝酸鈣250μg/ml、硫酸鎂?200μg/ml、硝酸鉀100μg/ml、硼酸100μg/ml、peg8000?5%，熒光素二乙酸酯20μg/ml、碘化丙啶3μg/ml。

6、以上所述的一種用于番荔枝花粉染色的混合液的制備方法，包括以下步驟：

7、（1）取配方量的熒光素二乙酸酯先使用少量丙酮溶解完全，以剛好將溶質(zhì)全部溶解為上限，備用；

8、（2）取配方量的碘化丙啶使用去離子水溶解；按照配比添加蔗糖、椰子乳、硝酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸和peg8000，加入去離子水溶解蔗糖、椰子乳、硝酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸、peg8000，直至體積約為總體積的95%，加入步驟（1）已經(jīng)溶解的熒光素二乙酸酯，統(tǒng)一定容即可。

9、一種快速檢定番荔枝花粉生活力的方法，包括以下步驟：

10、（1）雄蕊預(yù)處理

11、將花藥分散備用；

12、（2）試劑混合孵育

13、將待測花粉轉(zhuǎn)移至硅膠染色板樣品槽內(nèi)，滴加以上所述的混合液，移液槍反復(fù)吸吐以充分反應(yīng)，避光靜置30s后滴加至載玻片，加蓋蓋玻片；

14、（3）熒光鏡檢

15、寬場熒光顯微鏡：選擇bf、wg與wb通道分別作明場、紅色熒光與綠色熒光觀察與圖像采集，明場用于花粉外觀、聚合情況檢測，紅色熒光用于花粉細(xì)胞核數(shù)量檢測、綠色熒光用于花粉活力檢測；

16、激光共聚焦顯微鏡：激發(fā)光選擇488nm激光束，檢測光波長520nm處收集熒光素二乙酸酯的綠色熒光、647nm處收集碘化丙啶的紅色熒光；同時補(bǔ)充收集esid的明場信號觀察花粉外觀；對上述三個信號進(jìn)行圖像采集；

17、（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計

18、對獲得的不同通道圖像使用軟件進(jìn)行計算統(tǒng)計，計算花粉活力。

19、進(jìn)一步，所述的步驟（1）中，如果是臨開花花粉爆出（爆粉）的狀態(tài)，或者是貯存的花藥，直接取出花藥即可下一步處理；如果是更早的未離體的花藥，需要使用鑷子將花藥打散，以便從花上分離下來。

20、進(jìn)一步，所述的步驟（2）中，每10枚花藥滴加9-20μl以上所述的混合液。

21、進(jìn)一步，所述的步驟（2）中，移液槍反復(fù)吸吐5次；避光靜置30s；蓋玻片為6mm直徑圓形蓋玻片。

22、進(jìn)一步，所述的步驟（4），所述的花粉活力的計算方法為：花粉活力=產(chǎn)生綠色熒光的花粉數(shù)目/花粉數(shù)目*100%，和/或花粉活力=花粉內(nèi)不被著色的花粉數(shù)目/花粉數(shù)目*100%以綜合判定）

23、進(jìn)一步，所述的步驟（4）采用imagej軟件進(jìn)行計算統(tǒng)計。

24、本發(fā)明的有益效果：

25、本發(fā)明所述的混合液及檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

26、采用本發(fā)明所述的混合液進(jìn)行花粉活力檢測，比傳統(tǒng)的fda-pi雙染色擁有更持久的熒光壽命，花粉一定時間內(nèi)維持形態(tài)不爆裂，最長可以維持10h，能持續(xù)觀察到體外萌發(fā)過程，利于對花粉活力的檢測結(jié)果進(jìn)行驗證，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

27、混合液用量每次可以低至10μl（試劑濃度fda?20μl/mg及pi?3.0μl/mg）熒光試劑用量大幅度降低，毒性減低，總消耗量相對于常規(guī)的100μl每次可以大大降低。

28、除了能佐證fda對細(xì)胞活力的鑒定結(jié)果，亦能夠部分充當(dāng)細(xì)胞核染色的角色，本混合液對于細(xì)胞核的染色能力可部分取代dapi。對于活力低的樣品直接染色wg通道或647nm觀察統(tǒng)計細(xì)胞核情況，對于高活力樣品僅需要增加一步額外的滅活處理亦能數(shù)出花粉細(xì)胞核數(shù)目，幫助花粉發(fā)育階段的確定，與花粉活力檢測結(jié)果可以相互印證，便于綜合判斷花粉活力。

29、相較清水分散外觀檢定、ttc、碘碘化鉀常規(guī)染色鑒定而言，結(jié)果更可靠。

30、染色速度更快，沒有離心等過程，對于牛心番荔枝、黃龍番荔枝、非洲驕傲、鳳梨釋迦、泰國番荔枝等均可以實現(xiàn)染色，操作更加簡便。