本發(fā)明屬于犬心臟損傷的檢測領域，具體涉及一種檢測犬心臟損傷的試劑盒及應用。

背景技術：

1、在犬中，亦稱為粘液性二尖瓣變性(mmvd)、退行性二尖瓣疾病(dmvd)、瓣膜退行性疾病(vdd)或瓣膜病的瓣膜性心臟病(vhd)，是由于心瓣膜的變性或病變而導致的常見心臟病。這種變性通常與瓣膜的不可滲透性有關，而瓣膜的不可滲透性又導致每次心跳時心耳中的血液回流。這導致送入動脈的血液量減少，從而導致二尖瓣厚度大量增加。vhd的功能性后果是增加了對心肌的體積和/或壓力負荷，導致心力衰竭及其后果：呼吸短促(或呼吸困難)、咳嗽、腎衰竭或肺水腫。此外，遺傳、壓力、焦慮、缺氧、感染或內分泌失調會使該病惡化。在犬中，瓣膜病的退行性改變的特征在于細胞外基質的過度生成和沉積，破壞了小葉和腱索中的膠原含量和組織(患有粘液性二尖瓣變性的犬中血小板、血漿、二尖瓣小葉和左心室心肌組織中的血清素濃度，se?cremer等，j?vet?intern?med?2014；1-3)。mmvd主要影響像騎士查理王犬、約克夏犬、貴賓犬之類的小型犬。

2、心肌肌鈣蛋白(ctnt)是一種結構蛋白，存在于肌原纖維細絲中，有3種不同結構的亞單位，肌鈣蛋白t(ctnt)、肌鈣蛋白i(ctni)、肌鈣蛋白c(ctnc)，均由不同基因所編碼。其中ctnt是心臟的特異性抗原，在心肌內以游離和結合兩種形式存在，含量豐富。當心肌受損時便迅速釋放入血，血中半衰期為120min，其釋放動力學特點是血中出現(xiàn)時間早，持續(xù)時間長，峰值濃度高。作為心肌損傷的標志物，它的種屬特異性非常強，與骨骼肌肌鈣蛋白幾乎不發(fā)生交叉反應。ctnt因其高度心肌特異性、高敏感度、診斷的早期性而被認為是目前反映心肌損傷最好的直接病理學血清標志物之一，其診斷價值遠遠超過了以往的含m和b亞基的肌酸磷酸同工酶(ckmb)等。因此，測定血清ctnt濃度可反映心肌受損的嚴重程度。在危重病早期即存在較高比例的心肌損傷，認為心肌損傷與復蘇患者高死亡率有關。心跳驟停后復蘇成功率較低，既往的研究表明心肌損傷是造成心肺復蘇成功后患者早期死亡的主要原因之一。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種檢測犬心臟損傷的試劑盒及應用。

2、本發(fā)明目的之一提供檢測犬心臟損傷的探針，包括：

3、探針p208a-1：biotin-tttttttttacaagctttttgctcgtcttatcccccc-fam,?seq?idno:3；

4、探針p208b：

5、biotin-tttttttttacaaaccttttgttcgtcttattttttttttttttttttttttttttttttt-fam,?seq?id?no:4。

6、本發(fā)明目的之一提供檢測犬心臟損傷的偶聯(lián)物，包括鏈霉親和素包被的納米磁珠及偶聯(lián)于所述納米磁珠上的所述的探針。

7、其中，所述偶聯(lián)物的制備方法包括：

8、將洗滌干凈的鏈霉親和素包被的納米磁珠于緩沖液ii中重懸，加入如權利要求1所述的探針于恒溫搖床上輕微震蕩，孵育20min；

9、將得到的孵育產物進行磁分離，棄去上清液，所得沉淀用緩沖液ii洗滌，去除未結合的探針，再加入1ml6%bsa封閉液，反應2h；

10、產物用pbs緩沖溶液洗滌，再用100μl結合緩沖液ii重懸，得到的納偶聯(lián)物于4℃保存。

11、其中，緩沖液ii為10?mm?tris-hcl，1.0?mm?edta，2.0?m?nacl，ph?7.5。

12、本發(fā)明目的之一提供檢測犬心臟損傷的試劑盒，包括所述探針或所述偶聯(lián)物及雙鏈特異性核酸切割酶。

13、進一步地，所述試劑盒還包括：緩沖液i：5.0?mm?tris-hcl，0.5?mm?edta，1.0?mnacl,?ph?7.5；緩沖液ii：10?mm?tris-hcl，1.0?mm?edta，2.0?m?nacl，ph?7.5；雜交緩沖液：50?mm?tris-hcl，25?mm?mgcl2，ph?8.0；te緩沖液：10?mm?tris-hcl，1?mm?edta-2na，12.5?mm?mgcl2，ph?8.0；醋酸鈉緩沖液：0.1?m?醋酸鈉，0.1m醋酸，ph?3.5。進一步地，所述試劑盒還包括鏈霉親和素修飾的納米磁珠。

14、進一步地，所述試劑盒還包括：流動相a相：30mm磷酸二氫銨+10mm四丁基溴化銨+10mm?l-3-溴樟腦磺酸胺和5%乙腈水溶液；流動相b相：甲醇＋10mm、四丁基磷酸二氫銨。

15、本發(fā)明目的之一提供檢測犬心臟損傷的方法，包括：

16、將所述偶聯(lián)物與待測樣本充分混合，于40°c孵化180min后，用磁鐵將磁珠和未反應的dna探針從溶液中分離出來；

17、將上清液注入hplc系統(tǒng)進行檢測，hplc系統(tǒng)包括：采用purospher?star?rp-18封端柱(150?mm×4.6?mm?i.d.，5μm)用于mirna的分離，柱溫保持在35°c；熒光檢測器設置激發(fā)波長為495nm，發(fā)射波長為520nm；流速為1ml/min；進樣量為2μl；進行相同的梯度洗脫：采取梯度洗脫：b?相的比例在?20?min?內從?10%變化到?60%；流動相a相：30mm磷酸二氫銨+10mm四丁基溴化銨+10mm?l-3-溴樟腦磺酸胺和5%乙腈水溶液；流動相b相：甲醇＋10mm的四丁基磷酸二氫銨。

18、本發(fā)明目的之一提供所述探針或所述偶聯(lián)物在制備檢測犬心臟損傷的試劑盒中的應用。

19、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

20、本發(fā)明提供的探針能夠被偶聯(lián)至磁珠表面形成偶聯(lián)物，便于對mirna-208a和mirna-208b同時檢測。

21、本發(fā)明提供的偶聯(lián)有探針的偶聯(lián)物能夠在dsn的輔助下，實現(xiàn)循環(huán)擴增，快速捕捉目標mirna。

22、本發(fā)明提供的探針、偶聯(lián)物及試劑盒對目標mirna具有高度匹配性，能夠對抗相關錯配序列及其他rna序列的干擾。

23、本發(fā)明提供的探針、偶聯(lián)物及試劑盒能夠對犬血清樣本進行檢測，根據(jù)血清檢測結果判斷犬心臟損傷情況，其準確度高于常規(guī)方法。

技術特征：

1.檢測犬心臟損傷的探針，其特征在于，包括：

2.檢測犬心臟損傷的偶聯(lián)物，其特征在于，包括鏈霉親和素包被的納米磁珠及偶聯(lián)于所述納米磁珠上的如權利要求1所述的探針。

3.根據(jù)權利要求2所述的偶聯(lián)物，其特征在于，其制備方法包括：

4.根據(jù)權利要求3所述的偶聯(lián)物，其特征在于，緩沖液ii為10?mm?tris-hcl，1.0?mmedta，2.0?m?nacl，ph?7.5。

5.檢測犬心臟損傷的試劑盒，包括如權利要求1所述的探針或權利要求2~4任一所述的偶聯(lián)物及雙鏈特異性核酸切割酶。

6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，還包括：

7.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，還包括：

8.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，還包括：鏈霉親和素修飾的納米磁珠。

9.檢測犬心臟損傷的方法，其特征在于，包括：

10.權利要求1所述的探針在制備檢測犬心臟損傷的試劑盒中的應用。

技術總結
本發(fā)明屬于犬心臟損傷的檢測領域，具體涉及一種檢測犬心臟損傷的試劑盒及應用。該試劑盒包括探針、偶聯(lián)物或試劑盒能夠在DSN的輔助下，實現(xiàn)循環(huán)擴增，快速捕捉目標miRNA。本發(fā)明提供的探針、偶聯(lián)物及試劑盒能夠對犬血清樣本進行檢測，根據(jù)血清檢測結果判斷犬心臟損傷情況，其準確度高于常規(guī)方法。

技術研發(fā)人員：黃挺,李杰,孫堯
受保護的技術使用者：上?；`生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6