本發(fā)明屬于生物標志物的檢測領域，具體涉及一種血液腫瘤生物標志物的檢測方法。

背景技術：

1、血液腫瘤（hematological?malignancies，hm）是指來源于造血細胞的惡性疾病，屬異質性疾病，可以累及骨髓、血液及全身各個臟器和組織，其發(fā)病率和死亡率均居前列，是嚴重危害人類健康的重大疾病。一般而言，血液腫瘤分為1)白血?。捍罅堪┘毎麛U散，影響骨髓或血液，循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生血液的能力嚴重受損；2)淋巴瘤：影響淋巴細胞的癌變形成稱為淋巴瘤；3)骨髓瘤：由漿細胞形成的癌變，漿細胞可通過識別和攻擊細菌來幫助人體對抗感染，當骨髓瘤導致癌細胞在骨髓中積聚時，會因此排擠健康的血細胞。目前導致這些血液腫瘤的原因尚不完全清楚。隨著白血病和骨髓瘤在骨髓內的生長，它們會干擾骨髓產(chǎn)生正常血細胞的能力，包括白細胞，紅細胞和血小板，這可能導致機體頻繁的感染，貧血和容易瘀傷出血。淋巴瘤通常表現(xiàn)為淋巴結腫大，也可能于擾人體抵抗感染的能力。此外，骨髓瘤產(chǎn)生的物質會削弱骨骼，并產(chǎn)生異常蛋白質，從而導致多發(fā)性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害等癥狀。

2、血液腫瘤的分型復雜，診斷、治療個體化差異大，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高血液腫瘤患者存活率的重要措施。由此，發(fā)展高靈敏度、高特異性的腫瘤細胞檢測及鑒別方法，有助于實施及時且有效的治療手段，精準、快速的識別，也有助于藥物篩選。

3、血液腫瘤生物標志物不僅是特定的細胞分子，還包括各類核酸、分泌蛋白質和小分子代謝物等。常見的血液腫瘤生物標志物如下：1）dna類，主要有原癌/抑癌基因的過度表達、位點突變、染色體畸變、dna甲基化等，如bcr/abl融合基因是白血病中最重要的生物標志物之一，c-myc基因也常常是惡性淋巴瘤機制的研究重點；2）rna類，mir-15/16被證實在慢性淋巴細胞白血病中下調，mir-21、mir-155被發(fā)現(xiàn)在b細胞淋巴瘤患者血清中明顯升高；3）蛋白質類，如cd20是35-47kda的非糖基化四跨膜蛋白，在多數(shù)b細胞淋巴瘤中表達。

4、分子生物學、免疫組織化學等提供了多種生物標志物的檢測手段，但進一步開發(fā)高效準確、快速簡便、成本較低的檢測新方法，依然具有較大應用空間。

技術實現(xiàn)思路

1、基于以上問題，本發(fā)明提供一種血液腫瘤生物標志物的檢測方法，血液腫瘤生物標志物為circrna，具體涉及circ_0035559、circ_0001857、circ_0000745、circ_0132266、circ_0000707、circ_0007099、circ_0000190及circ_0087776的檢測，本發(fā)明制備sers探針用于檢測，sers探針由sers基材及競爭性雙鏈分子組成，sers基材是聚4-苯乙烯磺酸鈉對ag?np@4mbn@sio2?np改性后獲得，競爭性雙鏈分子為待測circrna設計的s1鏈與s2鏈，s1鏈通過sh基團與sers基材連接，s2鏈上含有拉曼信號分子，與待測circrna共同競爭s1鏈。本發(fā)明的sers探針，能較好的檢測血液腫瘤生物標志物，精準度較高。

2、本發(fā)明提供一種血液腫瘤生物標志物的檢測方法，包含一種sers探針，所述sers探針是由sers基材與競爭性雙鏈分子組成，sers基材是采用聚4-苯乙烯磺酸鈉對ag?np@4mbn@sio2?np進行改性后獲得，所述sers基材的制備方法如下：

3、l1.按照體積比2-2.5：1.5-1.8：1稱量超純水、無水乙醇和氫氧化銨溶液，在30-40℃水浴環(huán)境下以100-180rpm的轉速攪拌20-30min，獲得溶液1，按照體積比8-10：1稱量超純水與硅酸四乙酯，攪拌至分散均勻，獲得溶液2，按照體積比1：1-1.2將溶液1與溶液2混合，加熱至40-50℃以200-250rpm的轉速處理1-1.5h，結束后采用體積分數(shù)為50%的乙醇溶液清洗并重懸，以3000-4000g離心力離心20-30min，沉淀干燥后獲得納米二氧化硅；

4、l2.按照質量體積比20-30：1稱量步驟l1所獲納米二氧化硅與4-巰基苯甲腈溶液，以200-250w功率進行超聲處理20-30min，結束后以6000-8000g離心力離心15-20min，沉淀重懸于超純水中獲得溶液3；

5、l3.按照質量體積比10-15mg：2-3mg：1.2-1.5mg：5-8ml稱量檸檬酸鈉、硝酸銀、氯化鈉與超純水，室溫下以150-200rpm的轉速攪拌處理3-4min，獲得溶液4，按照體積比25-30：1：600-610稱量溶液4、抗壞血酸溶液與超純水，將超純水加熱至45-50℃后，快速投入溶液4及抗壞血酸溶液，以150-200rpm的轉速加熱回流90-120min，結束后繼續(xù)攪拌至冷卻到室溫，即獲得納米銀溶膠；

6、l4.按照體積比1：1.2-1.5稱量步驟l2所獲溶液3與步驟l3所獲納米銀溶膠，以2000-2500rpm的轉速攪拌10-15min，結束后以3000-4000g離心力離心20-30min，結束后沉淀真空干燥，獲得物質1；

7、l5.將步驟l4所獲物質1分散在質量百分比濃度為3-5%的聚4-苯乙烯磺酸鈉溶液中，室溫下靜置30-45min，結束后以2800-3000g離心力離心10-15min，沉淀真空干燥后即獲得sers基材。

8、較佳地，步驟l2中4-巰基苯甲腈溶液的濃度為3-4mm，沉淀在超純水中的質量體積濃度為5-8g/l。

9、較佳地，步驟l3中抗壞血酸溶液的質量體積濃度為18g/l。

10、所述競爭性雙鏈分子包含circrna的s1鏈與s2鏈，所述circrna涉及circ_0035559、circ_0001857、circ_0000745、circ_0132266、circ_0000707、circ_0007099、circ_0000190及circ_0087776。

11、其中，circ_0035559的s1鏈、s2鏈序列分別為：

12、5’-tcatccacaccttcatggaagcttttt-sh-3’；

13、5’-x-gggggtccatgaaggtgt-3’。

14、其中，circ_0001857的s1鏈、s2鏈序列分別為：

15、5’-ctgattcactcctccatgtccttcgtctctctttttt-sh-3’；

16、5’-x-gggggagagacgaagga-3’。

17、其中，circ_0000745的s1鏈、s2鏈序列分別為：

18、5’-ttagttgttgtaaaggccccttggccagcagacttttt-sh-3’；

19、5’-x-gggggtgctggccaaggcca-3’。

20、其中，circ_0132266的s1鏈、s2鏈序列分別為：

21、5’-aggattacatgacatctgacctgacaggcagactttttt-sh-3’；

22、5’-x-gggggtctgcctgtcaggt-3’。

23、其中，circ_0000707的s1鏈、s2鏈序列分別為：

24、5’-acaaaagccagttactgccagcagctgtgaaactctttttt-sh-3’；

25、5’-x-gggggtttcacagctgct-3’。

26、其中，circ_0007099的s1鏈、s2鏈序列分別為：

27、5’-aacaaacctaaaagtctttggtcagaagaggacagttttt-sh-3’；

28、5’-x-gggggtcctcttctgaccaa-3’。

29、其中，circ_0000190的s1鏈、s2鏈序列分別為：

30、5’-tctggaattacccactataaagatacatgaagattttt-sh-3’；

31、5’-x-gggggtcatgtatctttata-3’。

32、其中，circ_0087776的s1鏈、s2鏈序列分別為：

33、5’-agactccctcacatttaattctccttctccattttt-sh-3’；

34、5’-x-gggggagaaggagaattaa-3’。

35、較佳地，各circrna的s2鏈5’端x表示拉曼信號分子，拉曼信號分子選用對巰基苯甲酸（mba）、對硝基苯硫酚（nt）、3,3'二乙基硫醛三碳菁化碘（dttc）、羅丹明6g（r6g）、結晶紫（cv）、4-氨基苯硫醇（4-atp）、4-氨基苯硫酚（4-abt）、4-羥基苯硫酚（4-hbt）、4-巰基吡啶（4-mpy）中的一種或多種。

36、所述sers探針的制備方法如下：

37、s1.將競爭性雙鏈分子采用1×te緩沖液溶解，獲得濃度為15-20μm的s1鏈溶液及s2鏈溶液，按照體積比1：1-1.2將s1鏈溶液與s2鏈溶液混合，獲得混合溶液1，加入混合溶液1體積5-8倍的tris-hcl緩沖溶液，加熱至90-96℃并保持8-10min，獲得混合溶液2，加入混合溶液2體積0.02-0.03倍的tcep溶液，繼續(xù)保持30-45min，結束后獲得混合溶液3；

38、s2.將sers基材加入到混合溶液3中，在37℃水浴下靜置8-10h，結束后以5000-6000g離心力離心10-15min，沉淀采用超純水重懸，再次離心，沉淀重懸在超純水中，即獲得質量體積濃度為8-10g/l的sers探針。

39、較佳地，步驟s1中tris-hcl緩沖溶液的濃度為25mm，tcep溶液的濃度為40μm。

40、較佳地，步驟s2中sers基材在混合溶液3中的質量體積濃度為20-30g/l。

41、較佳地，上述sers探針的制備，各物質用量對應涉單一circrna的競爭性雙鏈分子。

42、本發(fā)明的有益效果如下：

43、本發(fā)明對血液腫瘤生物標志物進行檢測，待測生物標志物為circrna，circrna具有共價的閉環(huán)結構，缺乏聚腺苷化的尾部，此結構使其具有穩(wěn)定性及抗外切酶降解的能力，不僅是細胞內的關鍵調控分子，而且有研究證明其在血液腫瘤的進展中發(fā)揮著重要作用，而傳統(tǒng)的檢測技術較難檢測到低豐度的circrna。本發(fā)明設計一種sers探針，由sers基材及競爭性雙鏈分子組成，以聚4-苯乙烯磺酸鈉對ag?np@4mbn@sio2?np改性獲得sers基材，該sers基材具有較佳的穩(wěn)定性，4mbn作為內標分子嵌入到兩種納米材料之間，持續(xù)監(jiān)測校準拉曼信號，且不受外界環(huán)境的影響，納米銀溶膠作為外層，是借助其熱點效應產(chǎn)生強烈的電磁場增強效果，從而放大拉曼信號分子的檢測信號，聚4-苯乙烯磺酸鈉改性能對ag?np@4mbn@sio2?np（物質1）進行保護，避免納米銀受到氧化或污染，同時增強整個sers基材的使用效果。本發(fā)明同時提供一種競爭性雙鏈分子，是根據(jù)待測circrna進行設計，s1鏈上含有sh基團，tcep還原劑處理后能連接到sers基材上，s2鏈上含有拉曼信號分子，與待測circrna共同競爭s1鏈，當待測circrna含量較低時，s2鏈與s1鏈結合緊密，拉曼信號較強，當待測circrna含量較高時，待測circrna與s1鏈結合緊密，拉曼信號較弱。

44、本發(fā)明選擇的血液腫瘤生物標志物，即circ_0035559、circ_0001857、circ_0000745、circ_0132266、circ_0000707、circ_0007099、circ_0000190及circ_0087776，其研究相對廣泛，與血液腫瘤各疾病之間的關系較為密切，如circ_0035559被認為可用于急性髓系白血病的預測/監(jiān)測。本發(fā)明的sers探針，能較好的檢測血液腫瘤生物標志物，精準度較高。