專利名稱:基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置的制作方法
基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置 (-)技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物用膜片鉗技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是指一種基于掃描納米玻璃探針顯 微鏡技術(shù)的探測(cè)活體細(xì)胞膜表面離子通道活性的高分辨率膜片鉗技術(shù)，即一種基于掃描探 針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置。
背景技術(shù)：
電生理學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展從一開(kāi)始就與電子儀器的革新與進(jìn)步緊密相連，儀器設(shè) 備靈敏度和分辨率的提高為深入探知生物電本質(zhì)創(chuàng)造了條件。1976年德國(guó)馬普研究所的 Erwin Neher 和 Bert Sakmann 博士創(chuàng)建膜片鉗技術(shù)(patch-clamp techniques)以來(lái)，它給 電生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展乃至整個(gè)生物學(xué)研究帶來(lái)了一場(chǎng)革命，人們因此對(duì)離子通道 本質(zhì)的認(rèn)識(shí)有了一個(gè)質(zhì)的飛躍。這一偉大的貢獻(xiàn)使Neher和Sakmarm獲得了 1991年度的 諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。膜片鉗技術(shù)的發(fā)展對(duì)離子通道的功能及細(xì)胞功能的調(diào)控研究起到 了巨大的推動(dòng)作用，其為闡明離子通道病的發(fā)病機(jī)理并探索治療的新途徑提供了有效的研 究方法。然而，任何技術(shù)與方法都不是盡善盡美的，膜片鉗技術(shù)自發(fā)明伊始就從未停止過(guò)被 改進(jìn)和完善。根據(jù)特定的試驗(yàn)條件又發(fā)展出了多種模式的膜片鉗技術(shù)，從而保證了該技術(shù) 可用于多種細(xì)胞功能的研究?，F(xiàn)在，每年都有數(shù)千篇膜片鉗技術(shù)方法及其應(yīng)用方面的文獻(xiàn) 報(bào)道，該技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用已成為現(xiàn)代生物學(xué)的主要內(nèi)容之一。大量的膜片 鉗技術(shù)研究結(jié)果表明大量的膜片鉗技術(shù)研究結(jié)果表明細(xì)胞膜的離子通道并不是均一分 布的，而是通常分布在細(xì)胞表面的微觀結(jié)構(gòu)中，離子通道的這種分布方式與細(xì)胞生理功能 緊密相連。如具有保鈉排鉀功能的腎上皮細(xì)胞，其特異性咪吡嗪敏感的上皮細(xì)胞Na+通道和 電壓敏感型K+通道多分布在約100納米大小的微絨毛上。離子通道與細(xì)胞表面亞細(xì)胞微 觀結(jié)構(gòu)及其生理功能緊密相關(guān)的現(xiàn)實(shí)，向傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)發(fā)起了新的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的膜片 鉗技術(shù)須先借助光學(xué)顯微鏡來(lái)在細(xì)胞膜表面進(jìn)行玻璃微電極針尖定位后再進(jìn)行離子通道 的記錄，由于光學(xué)衍射極限的限制使普通光學(xué)顯微鏡的最高分辨率很難突破200納米，導(dǎo) 致傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)不能準(zhǔn)確研究離子通道與小于200納米的細(xì)胞表面微結(jié)構(gòu)的關(guān)系。加 之，許多生物樣品的光透過(guò)性不好，這更加降低了傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的分辨率。因此，低分辨 率的傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)已不能滿足目前生物學(xué)研究的需要。
隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展及掃描探針顯微鏡技術(shù)(SPM)在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用， 使高分辨率地實(shí)時(shí)探測(cè)活體生物樣品成為可能。1989年，加州大學(xué)的Hansma教授利用掃 描探針顯微鏡的負(fù)反饋控制技術(shù)，用玻璃微探針作為掃描探針設(shè)計(jì)出了非接觸式的掃描離 子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(scanningion conductance microscopy, SICM)(見(jiàn)圖1)。但是由于當(dāng) 時(shí)負(fù)反饋控制方法及精確定位技術(shù)的局限與不足，纖細(xì)的玻璃微滴管探針在掃描時(shí)經(jīng)常意 外地與樣品表面接觸并導(dǎo)致針尖或樣品的毀損，所以掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)在其發(fā)明后 的很長(zhǎng)一段時(shí)間僅適用于平坦的PET薄膜的掃描成像。1997年英國(guó)倫敦帝國(guó)理工學(xué)院的 Korchev教授對(duì)掃描離子電導(dǎo)探針顯微鏡的負(fù)反饋控制等技術(shù)進(jìn)行重大改進(jìn)后，使該顯微 鏡技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)活體生物樣品表面結(jié)構(gòu)的非接觸三維實(shí)時(shí)探測(cè)，并逐步成為納米生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景的一種掃描納米玻璃探針顯微鏡技術(shù)。SICM可以實(shí)時(shí)高 分辨率地非接觸式探測(cè)活體生物樣品表面形貌，其納米尺度玻璃微滴管掃描探針與膜片鉗 用玻璃微電極相似且同樣在電解液中工作，因此為建立高分辨率的膜片鉗技術(shù)提供了技術(shù)保障。
實(shí)用新型
本實(shí)用新型的目的在于提供一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝 置，它針對(duì)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)分辨率的不足，提供了一種利用掃描探針顯微鏡非接觸式掃描 的高分辨率來(lái)精確定位膜片鉗玻璃微滴管電極，建立了一種基于非接觸掃描探針顯微鏡掃 描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗技術(shù)，從而為研究細(xì)胞膜表面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定生理 功能(離子通道特性)的關(guān)系提供了全新技術(shù)手段。
本實(shí)用新型的技術(shù)方案一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置， 其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/ AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、SICM樣品掃描臺(tái)、SICM負(fù)反饋掃描控制電路、 SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)、商用膜片鉗前置電流功率放大器及膜片鉗數(shù)模/模 數(shù)轉(zhuǎn)換器；所說(shuō)的充滿電解液的玻璃微探針和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng) 液中；所說(shuō)的置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電 流功率放大器連接；所說(shuō)的膜片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接； 所說(shuō)的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接；所說(shuō)SICM負(fù)反饋掃描 控制電路與SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說(shuō)的內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿 置于SICM樣品掃描臺(tái)上。
上述所說(shuō)的膜片鉗前置電流功率放大器采用美國(guó)Molecular Device公司的Axon 商用膜片鉗技術(shù)。
上述所說(shuō)的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國(guó)Molecular Device公司的Axon商 用膜片鉗技術(shù)。
上述所說(shuō)的SICM負(fù)反饋控制電路采用英國(guó)I0NSC0PE公司的ICnanoSICM非接觸 式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)。
上述所說(shuō)的SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)采用英國(guó)I0NSC0PE公司的 ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)。
本實(shí)用新型的工作過(guò)程為(1)用SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)及SICM負(fù) 反饋掃描控制電路控制玻璃微探針在細(xì)胞表面非接觸地掃描并獲得細(xì)胞膜表面的高分辨 率成像；(2)在SICM負(fù)反饋掃描控制電路的作用下膜片鉗玻璃微探針?lè)墙佑|地精確定位于 樣品表面待研究的特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上；(3)關(guān)閉SICM負(fù)反饋掃描控制電路，再像傳統(tǒng) 膜片鉗一樣完成玻璃微探針與細(xì)胞膜片接觸并形成兆歐姆封接；(4)細(xì)胞膜片上的離子通 道電流通過(guò)膜片鉗前置電流功率放大器放大、膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采集，從而實(shí)現(xiàn)離 子通道記錄。
本實(shí)用新型的工作原理:Ag/AgCl電極置于充滿電解液的玻璃微探針中作為掃描 探針，內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于SICM樣品掃描臺(tái)上，參比電極置于培養(yǎng)皿的細(xì) 胞培養(yǎng)液中，并通過(guò)負(fù)反饋電路實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探針內(nèi)電極與參比電極之間電導(dǎo)的變化。當(dāng)探針接近細(xì)胞表面時(shí)，由于允許離子流入玻璃微探針針尖自由空間的減小，離子電導(dǎo)也隨之減 小。在掃描過(guò)程中，SICM負(fù)反饋控制電路通過(guò)高精度XYZ三維壓電陶瓷來(lái)保持玻璃探針電 極與細(xì)胞表面距離的恒定(即非接觸)。
本實(shí)用新型的優(yōu)越性本實(shí)用新型的高分辨率的膜片鉗技術(shù)可被方便地用于研究 多種細(xì)胞膜上納米尺度微結(jié)構(gòu)中離子通道的“開(kāi)”、“閉”動(dòng)力學(xué)、離子通透性等，從而為研究 細(xì)胞膜表面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定生理功能的關(guān)系提供了全新的技術(shù)手段。


圖1為現(xiàn)有技術(shù)非接觸式的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本實(shí)用新型所涉一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置的 結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為本實(shí)用新型所涉一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置的 工作流程圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例我們利用英國(guó)I0NSC0PE公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微 鏡技術(shù)融合美國(guó)Molecular Device公司的Axon商用膜片鉗技術(shù)，來(lái)建立新型的基于非接 觸掃描探針顯微鏡技術(shù)掃描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗。主要用Axon商用膜片鉗系統(tǒng)的 前置電流功率放大器和數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器來(lái)替代SICM顯微鏡自有電流放大器(見(jiàn)圖2)。 圖中，Ag/AgCl電極置于充滿電解液的玻璃微探針中作為掃描探針，內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿置于SICM樣品掃描臺(tái)上，參比電極置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中，并通過(guò)負(fù)反饋電 路實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探針內(nèi)電極與參比電極之間電導(dǎo)的變化。當(dāng)探針接近細(xì)胞表面時(shí)，由于允許離 子流入玻璃微探針針尖自由空間的減小，離子電導(dǎo)也隨之減小。在掃描過(guò)程中，SICM負(fù)反 饋控制電路通過(guò)高精度XYZ三維壓電陶瓷來(lái)保持玻璃探針電極與細(xì)胞表面距離的恒定(即 非接觸)。
在高分辨率膜片鉗實(shí)施例的具體操作步驟中(圖3)，首先用SICM高精度XYZ三維 壓電陶瓷掃描臺(tái)及負(fù)反饋掃描控制系統(tǒng)控制玻璃電極探針在細(xì)胞表面非接觸地掃描并獲 得細(xì)胞膜表面的高分辨率成像；在負(fù)反饋和掃描控制系統(tǒng)幫助下膜片鉗玻璃電極非接觸精 確定位于樣品表面待研究的特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上；關(guān)閉負(fù)反饋和掃描控制系統(tǒng)，再像傳 統(tǒng)膜片鉗一樣完成玻璃電極與細(xì)胞膜片兆歐姆封接及進(jìn)行離子通道記錄。這種高分辨率的 膜片鉗技術(shù)可被方便地用于研究多種細(xì)胞膜上納米尺度微結(jié)構(gòu)中離子通道的“開(kāi)”、“閉”動(dòng) 力學(xué)、離子通透性等，從而為研究細(xì)胞膜表面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定生理功能的關(guān)系提 供了全新的技術(shù)手段。
以上所述僅為本實(shí)用新型基于英國(guó)I0NSC0PE公司的ICnano SICM非接觸式掃描 離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)融合美國(guó)Molecular Device公司的Axon商用膜片鉗技術(shù)所建立的活 體細(xì)胞的高分辨率膜片鉗技術(shù)手段，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依據(jù)本實(shí)用新 型的構(gòu)成方式和操作原理，還可以將其他掃描探針顯微鏡技術(shù)與其他商用膜片鉗系統(tǒng)相結(jié) 合而建立類似的高分辨率膜片鉗系統(tǒng)，這些均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、SICM樣品掃描臺(tái)、SICM負(fù)反饋掃描控制電路、SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)、商用膜片鉗前置電流功率放大器及膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器；所說(shuō)的充滿電解液的玻璃微探針和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說(shuō)的置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電流功率放大器連接；所說(shuō)的膜片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接；所說(shuō)的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接；所說(shuō)SICM負(fù)反饋掃描控制電路與SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說(shuō)的內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于SICM樣品掃描臺(tái)上。
專利摘要
一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、SICM樣品掃描臺(tái)、SICM負(fù)反饋掃描控制電路、SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺(tái)、商用膜片鉗前置電流功率放大器及膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器；本實(shí)用新型的優(yōu)越性本實(shí)用新型的高分辨率的膜片鉗技術(shù)可被方便地用于研究多種細(xì)胞膜上納米尺度微結(jié)構(gòu)中離子通道的“開(kāi)”、“閉”動(dòng)力學(xué)、離子通透性等，從而為研究細(xì)胞膜表面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定生理功能的關(guān)系提供了全新的技術(shù)手段。
文檔編號(hào)G01Q60/44GKCN201654064SQ200920250660
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年11月20日
發(fā)明者張彥軍 申請(qǐng)人:國(guó)家納米技術(shù)與工程研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan