專利名稱:一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置的制作方法
一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置
(-)技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型提供一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，尤其是提供通過鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤中不同細(xì)胞亞型的相對(duì)比率來評(píng)估其惡性程度的裝置，更具體的說，是利用探針跳躍模式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)依據(jù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中不同細(xì)胞亞型的形貌特征通過鑒定不同亞型的相對(duì)比率來診斷該腫瘤惡性程度的裝置。
背景技術(shù)：
神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)是一種幼兒常見的顱外惡性實(shí)體瘤。在過去的20多年里對(duì)其一直沒有適宜的診斷和治療手段，尤其是當(dāng)該疾病沒能及早診斷而發(fā)展到第三、四期時(shí)，其治愈率及預(yù)后效果更差。診斷治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的主要困難是源于該腫瘤細(xì)胞自身的異質(zhì)性和腫瘤干細(xì)胞特性。
神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞主要有三種細(xì)胞亞型組成N型(成神經(jīng)細(xì)胞型)、S型(基質(zhì)粘連型細(xì)胞)和I型(中間型細(xì)胞)，并且這三種亞型在培養(yǎng)過程中會(huì)自發(fā)出現(xiàn)，它們的生化特性、分化潛能、惡性程度等有所不同。在生化特性上，I型的多能干細(xì)胞特性最顯著，其更新、增值能力也最強(qiáng)，并且I型細(xì)胞同時(shí)表達(dá)了 N型和S型的特征性生化指標(biāo)。依惡性程度而言，I型最強(qiáng)，N型其次，S型最弱。從進(jìn)一步分化的角度而言，I型可以向N型、S型分化，N型與S型之間也存在相互轉(zhuǎn)化的情況。這諸多動(dòng)態(tài)變化的因素影響了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性程度，增加了診斷治療的難度。
大量臨床病例顯示S型細(xì)胞含量高、細(xì)胞高度分化是良性神經(jīng)母細(xì)胞瘤的特征， 而I型、N型細(xì)胞與腫瘤的惡性程度與復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，因此可以通過分析三種亞型相對(duì)比率來鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度。目前，最直接的診斷手段就是利用顯微鏡技術(shù)根據(jù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中三種細(xì)胞亞型的形貌特征來評(píng)估瘤的惡性程度。然而，普通光學(xué)顯微鏡由于受到光學(xué)衍射極限的限制，其最高分辨率不能滿足分辨形態(tài)相近的I型與N型細(xì)胞的需要；電鏡探測中需要對(duì)生物樣品進(jìn)行固化和噴金處理，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且會(huì)改變甚至破壞樣品表面形貌，降低鑒定的準(zhǔn)確度；由于利用針尖與樣品間的作用力進(jìn)行負(fù)反饋控制，原子力顯微鏡(AFM)探針與活體細(xì)胞胞體的輕微接觸不可避免，且在掃描高度急劇變化且與基底附著度低的復(fù)雜生物樣品(例如圓形的神經(jīng)母細(xì)胞瘤N型和I型細(xì)胞)時(shí)，存在著負(fù)反饋控制顯微鏡技術(shù)所無法逾越的困難。
2009年，在負(fù)反饋控制的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(SICM)基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的探針跳躍模式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(HPICM)不僅秉承了原有的可直接在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下實(shí)時(shí)、非接觸式、高分辨率地探測活體生物樣品表面三維微觀結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)，而且克服了傳統(tǒng)SICM連續(xù)負(fù)反饋控制掃描模式的不足，實(shí)現(xiàn)了對(duì)高度急劇變化且表面形態(tài)復(fù)雜的活體生物樣品的納米尺度高分辨率掃描成像(見圖幻。這就使得在生理?xiàng)l件下、非接觸式、 高分辨率鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤中不同細(xì)胞亞型的相對(duì)比率并診斷其惡性程度成為可能。
實(shí)用新型
[0006]本實(shí)用新型提供一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，它運(yùn)用探針跳躍模式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)在室溫條件下(23士2°C)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行生理?xiàng)l件下、非接觸式、高分辨率掃描成像，進(jìn)而鑒定三種細(xì)胞亞型的相對(duì)比率，評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性程度。
本實(shí)用新型的技術(shù)方案一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/ AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、HPICM 掃描控制系統(tǒng)、HPICM掃描探頭及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)；所說的充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說的置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與外置電流放大器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所說的參比Ag/ AgCl電極與外置電流放大器連接；所說的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器分別于與外置電流放大器、 HPICM掃描控制系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)連接；所說的HPICM掃描探頭由一個(gè)Z向平板壓電陶瓷和一個(gè)XY向平板壓電陶瓷定位系統(tǒng)組成，分別與HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所說的計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)分別于外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接。
上述所說的玻璃微探針由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細(xì)管經(jīng)程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，硼硅酸鹽微電極玻璃毛細(xì)管OD 1. 00mm, ID 0. 59mm ；本裝置中使用尖端內(nèi)壁直徑 50nm，電阻 150ΜΩ的玻璃微探針。
上述所說的外置電流放大器采用美國Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器；HPICM掃描控制系統(tǒng)采用英國Ionscope公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡控制系統(tǒng)。
上述所說的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的Digidatal440A
數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。
上述所說的Z向平板壓電陶瓷采用德國Wiysik Instrumente公司的25ymLISA 高精度平板壓電陶瓷，XY向平板壓電陶瓷定位系統(tǒng)采用德國I^hysildnstrumente公司的 100 X 100 μ m PIHera納米級(jí)平板壓電陶瓷掃描臺(tái)。
本裝置的工作原理通過采用SBC671IDSP主板的ICnano SICM控制組件 (Ionscope Ltd，英國)操控帶有探針的Z向平板壓電陶瓷的上下跳躍及載有生物樣品的納米級(jí)平板壓電陶瓷掃描臺(tái)的XY向移動(dòng)，并以20kHz的高速采樣頻率實(shí)時(shí)監(jiān)測流入納米尺度玻璃微探針的電流變化；利用MultiClamp 700B膜片鉗放大器(Molecular Devices，美國) 給HPSICM的微探針提供+200mV的電壓；HPSICM不再采用傳統(tǒng)SICM的連續(xù)負(fù)反饋掃描控制模式，取而代之的是微探針在生物樣品表面以設(shè)定幅度Z向上下跳躍的模式進(jìn)行掃描。
本實(shí)用新型的工作過程(1)由于典型的N型細(xì)胞胞體呈圓形、折光性強(qiáng)、相互間形成類神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；典型的S型細(xì)胞扁平、貼壁緊；而I型細(xì)胞的形貌介于N型和S型之間，單個(gè)細(xì)胞形狀比較對(duì)稱；根據(jù)上述形貌差異，隨機(jī)選取典型的三種亞型細(xì)胞，利用探針跳躍模式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)對(duì)其分別進(jìn)行掃描成像；( 利用成像分析軟件測量出每個(gè)成像細(xì)胞的高度和體積，然后按亞型對(duì)細(xì)胞的這些形貌數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別得到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中三種亞型的細(xì)胞高度和體積的范圍和平均值及三種亞型之間的差異性；統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤中三種細(xì)胞亞型的細(xì)胞高度具有極顯著差異，故細(xì)胞高度可作為鑒定三種亞型的主要依據(jù)；三種亞型細(xì)胞體積的差異性有所不同，故可作為鑒定三種細(xì)胞亞型的參考依據(jù)；C3)依據(jù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤三種細(xì)胞亞型鑒定標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確判斷隨機(jī)成像細(xì)胞所屬類型，進(jìn)而鑒定出神經(jīng)母細(xì)胞瘤中三種細(xì)胞亞型的相對(duì)比率用于評(píng)估該腫瘤的惡性程度。上述所說的步驟O)中的成像分析軟件采用SICM Image Viewer分析軟件。
本實(shí)用新型的優(yōu)越性在于只需對(duì)分離的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行日常培養(yǎng)，無需對(duì)不同細(xì)胞亞型進(jìn)行篩選分離，也無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固化染色等預(yù)處理，可以在腫瘤細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件下對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)鑒定，過程直觀簡便，鑒定的準(zhǔn)確度高。


圖1為本實(shí)用新型所涉一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為利用探針跳躍模式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行掃描成像的原理和細(xì)胞模型示意圖。
圖3為神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中三種細(xì)胞亞型的細(xì)胞高度和體積(其中，*表示N型與S型、N型與I型的細(xì)胞體積都差異明顯P < 0. 005，η = 12 表示N型與S型、S型與 I型、N型與I型的細(xì)胞高度差異都非常明顯P < 0. 0005, η = 12)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置(見圖1)，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、HPICM掃描控制系統(tǒng)、HPICM掃描探頭及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)；所說的充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說的置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的 Ag/AgCl電極分別與外置電流放大器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所說的參比Ag/AgCl電極與外置電流放大器連接；所說的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器分別于與外置電流放大器、HPICM掃描控制系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)連接；所說的HPICM掃描探頭由一個(gè)Z向平板壓電陶瓷和一個(gè) XY向平板壓電陶瓷定位系統(tǒng)組成，分別與HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所說的計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)分別于外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接。
上述所說的玻璃微探針由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細(xì)管經(jīng)程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，硼硅酸鹽微電極玻璃毛細(xì)管OD 1. 00mm, ID 0. 59mm ；本裝置中使用尖端內(nèi)壁直徑 50nm，電阻 150ΜΩ的玻璃微探針。
上述所說的外置電流放大器采用美國Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器；HPICM掃描控制系統(tǒng)采用英國Ionscope公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡控制系統(tǒng)。
上述所說的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的Digidatal440A
數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。
上述所說的Z向平板壓電陶瓷采用德國Wiysik Instrumente公司的25ymLISA 高精度平板壓電陶瓷，XY向平板壓電陶瓷定位系統(tǒng)采用德國Wiysik Instrumente公司的 100 X 100 μ m PIHera納米級(jí)平板壓電陶瓷掃描臺(tái)。
以上對(duì)本實(shí)用新型的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本實(shí)用新型的實(shí)施范圍；此外，本實(shí)用新型提供的是一種評(píng)估方法，神經(jīng)母細(xì)胞瘤中三種細(xì)胞亞型的相對(duì)比率與惡性程度之間的量化關(guān)系不屬于本實(shí)用新型的涵蓋范圍。凡依本實(shí)用新型申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本實(shí)用新型專利的涵蓋范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、HPICM掃描控制系統(tǒng)、HPICM掃描探頭及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)；所說的充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中；所說的置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與外置電流放大器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所說的參比Ag/AgCl電極與外置電流放大器連接；所說的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器分別于與外置電流放大器、HPICM掃描控制系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)連接；所說的HPICM掃描探頭由一個(gè)Z向平板壓電陶瓷和一個(gè)XY向平板壓電陶瓷定位系統(tǒng)組成，分別與HPICM掃描控制系統(tǒng)連接；所說的計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)分別于外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器和HPICM掃描控制系統(tǒng)連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于所說的玻璃微探針由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細(xì)管經(jīng)程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，硼硅酸鹽微電極玻璃毛細(xì)管OD 1. 00mm, ID 0. 59mm ；本裝置中使用尖端內(nèi)壁直徑 50nm，電阻 150ΜΩ的玻璃微探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于所說的外置電流放大器采用美國Molecular Device公司的Multiclamp 700B放大器；HPICM掃描控制系統(tǒng)采用英國Ionscope公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡控制系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于所說的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的Digidatal440A數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于所說的 Z向平板壓電陶瓷采用德國Wiysik Instrumente公司的25 μ mLISA高精度平板壓電陶瓷， XY向平板壓電陶瓷定位系統(tǒng)采用德國Wiysik Instrumente公司的100 X 100 μ m PIHera納米級(jí)平板壓電陶瓷掃描臺(tái)。
專利摘要
一種評(píng)估神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性程度的裝置，其特征在于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、外置電流放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器、HPICM掃描控制系統(tǒng)、HPICM掃描探頭及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)；本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是可在正常生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，整個(gè)診斷過程直觀簡便，無需對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理且診斷準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)G01Q60/44GKCN202093046SQ201020572295
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年10月22日
發(fā)明者劉曉, 張彥軍, 楊茜 申請(qǐng)人:國家納米技術(shù)與工程研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan