專利名稱:用于afm研究的病毒樣品的制備方法及制得的病毒樣品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于AFM研究的病毒樣品的制備方法及制得的病毒樣品。
技術(shù)背景
原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope, AFM)是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來 的第三代顯微鏡，其特點是具有極高的分辨率，垂直分辨率可達(dá)到0. lnm。作為研究生物樣 品的一種探測工具，AFM近幾年越來越受到生物學(xué)家們的重視，它特別適用于對生物大分子 進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能相互作用的研究。新解理的云母由于具有原子級的平整度且對生物分子無 破壞性的特點從而成為一種理想的研究生物分子的AFM成像襯底。近來，利用AFM研究病 毒形貌、病毒蛋白外殼彈性以及病毒與受體間作用力已成為較熱門的課題[F. Kienberger et al. , Biol. Proced. Online 6 120 ；Y. G. Kuznetsov, et al. , J. Virol 77 11896 ； I.L. Ivanovska et al.，PNAS,101 7600 ；A. Negishi et al.，Glycobiology, 14 969]。但 由于病毒在溶液中具有易于積聚的特性[R. Floyd et al.，Appl. Environ. Microbiol. 35 1084]，以及病毒外殼與云母表面復(fù)雜的作用力等因素的影響，使得在制備病毒樣品的過程 中難于獲得病毒顆粒在襯底上分散性好的病毒樣品，從而為后續(xù)研究造成諸多不便。因此 如何將病毒均勻地分散在云母襯底上，一直是令人困擾的難題。雖然人們采用簡單物理吸 附或者修飾云母襯底表面后再吸附病毒的方法解決了一些制備病毒樣品的問題。但是這兩 種方法特異性較強(qiáng)，未必適合于每種病毒，重復(fù)性不是很好，而且采用上述兩種方法都不能 夠很好地解決病毒在襯底表面上積聚的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中病毒顆粒在襯底上分散不均，提供一種用于AFM研 究的病毒樣品的制備方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是在病毒溶液中 添加少量甘油，然后取含甘油的病毒溶液滴加在云母襯底上來制備出分散性很好的病毒樣
P
ΡΠ O
本發(fā)明的用于AFM研究的病毒樣品的制備方法具體包括如下步驟
A)將病毒溶液滴加在云母襯底表面上形成病毒液滴；
B)用干凈氣體吹開云母襯底表面上的病毒液滴；
C)用雙蒸水沖洗云母襯底表面；
D)干燥；
其特征在于
步驟A)中，該病毒溶液含有甘油，該甘油的體積濃度為0. 5% 5% (Υ/Υ0)。
在本發(fā)明的用于AFM研究的病毒樣品的制備方法中，若病毒溶液中的甘油濃度過 高，如超過5%，云母襯底表面形成的膜不易沖洗掉，制成的病毒樣品的表面黏性較大，在成 像過程中針尖容易“粘”在云母襯底上，影響成像質(zhì)量，而且病毒粒子的表觀高度表現(xiàn)為很 低；若病毒溶液中的甘油濃度過低，如低于0.5%，起不到分散作用。本發(fā)明的病毒溶液中甘油的含量優(yōu)選 3% (V/V。)，更優(yōu)選 2%諫0)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“表觀高度”是指圖象中粒子的最高點與襯底間的高度差，這種 高度實際上是一種相對高度而不是粒子的絕對高度。如果粒子表觀高度很低，那么就無法 從高度來判斷粒子是否就是所要的病毒了，因為在病毒溶液中還有其他高度要小于正常病 毒粒子的物質(zhì)，如蛋白殘片等，它們也能夠吸附在襯底上，高度可能只有幾納米，而它們有 可能附著在那層膜上，這樣這些小粒子從圖象中看起來就和病毒粒子一樣了，無法進(jìn)行辨 認(rèn)。
本發(fā)明的病毒溶液的溶劑是雙蒸水，該病毒溶液中的甘油是分析純甘油，所有這 些是為了避免雜質(zhì)混入病毒溶液中，并同時稀釋病毒溶液中的鹽含量，最終提高AFM的成
像質(zhì)量。
本發(fā)明的含甘油的病毒溶液可以通過下列方法制得將病毒原溶液(市售產(chǎn)品) 用雙蒸水稀釋到一定濃度，用雙蒸水將甘油(分析純A.R)稀釋到30% (V/X)，取20yL稀 釋后的病毒溶液，計算應(yīng)該添加甘油溶液體積量，添加稀釋后的甘油溶液，使得最終病毒溶 液中甘油的體積濃度應(yīng)為0. 5 5%。
在本發(fā)明中，步驟A)中，該病毒溶液的滴度較佳地為IO9 IO11個/mL，更佳地為 IO10 個 /mL。
在本發(fā)明中，術(shù)語“滴度”是指每毫升溶液中所含有的是具有感染活性的病毒數(shù)， 是通過噬斑試驗滴定出來的。
步驟A)中，所述的病毒選自重組腺相關(guān)伴隨病毒，包括血清1型、2型、3型、4型、 5型、6型、7型或8型重組腺相關(guān)伴隨病毒。
步驟A)中，所述的云母襯底為裸云母，由于云母的干凈程度對生物樣品的制備和 后來的AFM成像影響都很大，因此在制備樣品前必須剝離好云母。所述的云母較佳地是新 解理的面積為4 10平方厘米的薄層，滴加的病毒溶液的體積可以是2 4 μ L ；步驟C) 中，較佳地用15 20 μ L雙蒸水沖洗云母襯底表面，以洗去云母襯底表面病毒溶液中的殘 留物，如鹽、蛋白殘片等。若使用過多的雙蒸水不但沖洗掉了云母襯底表面殘留的甘油，也 沖掉了過多的病毒顆粒，較少的水沖洗不凈云母襯底表面殘留的甘油，影響成像質(zhì)量。
步驟Α)形成的病毒液滴靜置15 40秒，優(yōu)選30秒，再進(jìn)行步驟B)，以便粒子能 更好地粘附于云母襯底表面上；若靜置時間過長，病毒粒子就易于在表面上積聚在一起。
步驟B)中，所述的干凈氣體可以是空氣、氮氣、氧氣、氬氣、氫氣以及其它任何干 凈氣體等，優(yōu)選空氣和氮氣等常用氣體，因這種氣體廉價易得。
在本發(fā)明中，術(shù)語“干凈氣體”是指該氣體中沒有可見的大粒子，如塵埃，粉塵等， 這種干凈氣體可以是從洗耳球中吹出的空氣所達(dá)到的干凈程度即可。
步驟B)中，用干凈氣體吹開云母襯底表面上的病毒液滴的同時傾斜云母襯底，以 使病毒液滴充分分散開來。
在本發(fā)明中，術(shù)語“傾斜云母襯底”是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在用干凈氣體吹開云 母襯底表面上的病毒液滴的同時使云母襯底成一定的傾斜角度，并以使病毒液滴能夠完全 分散開來且不會從云母襯底表面上滑落為準(zhǔn)。
步驟B)之后，云母襯底表面上的病毒殘液用濾紙吸干，以防止某些被吹到云母襯 底邊緣位置的溶液在那里發(fā)生聚集，然后又流回到中心位置產(chǎn)生回流現(xiàn)象，并最終防止產(chǎn)生病毒粒子積聚現(xiàn)象。
本發(fā)明的制備方法較佳地是，在步驟B)之后或者濾紙吸干病毒殘液之后，在進(jìn)行 步驟C)之前，云母襯底靜置5 10分鐘，以便病毒粒子更牢固地吸附在云母襯底上。
步驟D)中，所述的干燥通風(fēng)干燥，較佳地是用上述干凈氣體吹干進(jìn)行通風(fēng)干燥。 所述的干凈氣體也可以選自空氣和氮氣等常用氣體，更好地是與步驟B)中使用的干凈氣 體相同。
本發(fā)明的干燥后的云母襯底還需進(jìn)一步粘貼于基片上，再用于AFM研究。
本發(fā)明的另一目的是提供由本發(fā)明的制備方法制得的病毒樣品。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明通過在病毒溶液中添加甘油從而使得病毒 顆粒在襯底上分散性好，試驗重復(fù)率高，而且病毒溶液中的病毒不易受到破壞，試驗方法簡 單。本發(fā)明的制備方法中的試劑低廉易得、用量少、無毒無害。從而本發(fā)明的病毒樣品的制 備方法及制得的病毒樣品為后續(xù)研究提供了先決條件，例如使用AFM研究病毒外殼彈性、 病毒與受體間作用力等。


圖1為用于AFM研究的制備病毒樣品的示意圖；圖2A為對照組病毒樣品的AFM圖，
掃描范圍IOymXlOym,襯底為新解理的云母襯底；
圖2B為試驗組病毒樣品的AFM圖，
掃描范圍IOymXlOym,襯底為新解理的云母襯底；
圖3A為甘油濃度1. 3%的病毒溶液制備的病毒樣品的AFM圖，
掃描范圍3μπιΧ3μπι，襯底為新解理的云母襯底；
圖3Β為甘油濃度3%的病毒溶液制備的病毒樣品的AFM圖，
掃描范圍3μπιΧ3μπι，襯底為新解理的云母襯底；
圖3C為甘油濃度5%的病毒溶液制備的病毒樣品的AFM圖，
掃描范圍3μπιΧ3μπι，襯底為新解理的云母襯底；圖4為重組腺相關(guān)伴隨病毒1型樣品的AFM圖；
圖5為重組腺相關(guān)伴隨病毒5型樣品的AFM圖；
右上方條柱是圖中所示粒子與云母襯底間的高度對比示意，即顏色越深，粒子的 表觀高度越低，顏色越白，表觀高度也越高。
具體實施方式
以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
圖1為用于AFM研究的制備病毒樣品的示意圖。首先用鑷子夾緊剝離好的云母襯 底1，然后在云母襯底1的中心位置上滴加病毒溶液形成病毒液滴2，靜置半分鐘后，使用干 凈氣體(如空氣或氮氣)3吹開病毒液滴，同時也可將云母襯底輕輕傾斜以利于病毒液滴的 散開，待病毒液滴從云母襯底上散開后用濾紙吸去殘余溶液，5分鐘后取雙蒸水滴在云母襯 底中心上洗去云母襯底上的殘留物，最后表面用干凈氣體吹干干燥。
實施例1[0047]實驗組病毒樣品的制備
重組腺相關(guān)伴隨病毒2型(recombinant adeno-associated virus, rAAV2)溶液 (購自于北京本元正陽基因技術(shù)有限公司)，其滴度為6 X IO11個/mL，用雙蒸水將其稀釋到 6X101(I個/mL;分析純甘油用雙蒸水稀釋到30% (V/V0)；取20 μ L稀釋后的病毒溶液，添加 0.7μ L濃度為30%的甘油溶液，從而制得最終甘油濃度為(V/V0)的病毒溶液。取一小 片云母用小鑷子或者刀片將其小心地解理成薄層，并將它剪成3cmX3cm左右作為云母襯 底；在云母襯底中心位置上滴加2 μ L的含甘油的病毒溶液形成病毒液滴，靜置半分鐘， 然后再用純度為99. 99%的干凈氮氣輕輕吹開，同時將云母襯底輕輕傾斜以利于病毒液滴 的散開，殘液用濾紙吸走。5分鐘后用移液槍取15 μ L雙蒸水沖洗云母襯底表面，取濾紙放 置在云母襯底邊緣吸取云母襯底表面上的水溶液，最后用氮氣(純度為99. 99%)吹干云母 襯底表面，得到病毒樣品。
對照組病毒樣品的制備
同時制備對照組病毒樣品，其在制備過程當(dāng)中，病毒溶液中不含有甘油，其它同 上。
將上述制得的試驗組病毒樣品和對照組病毒樣品分別粘貼于基片上，并用AFM進(jìn) 行成像，結(jié)果如圖2Α(對照組病毒樣品的AFM圖)和圖2Β(試驗組病毒樣品的AFM圖)所示。
由圖2B可見，使用本發(fā)明的制備方法可使得病毒在云母襯底上均勻地分散，無病 毒積聚，所有病毒互相分散開來；而由圖2A可見，不含甘油的病毒溶液制得的病毒樣品中， 病毒粒子積聚成大小不均一的團(tuán)。
實施例2
不同甘油濃度對病毒樣品制備的影響
以重組腺相關(guān)伴隨病毒2型樣品的制備為例，分別取甘油濃度為1.3%、3%和 5%的病毒溶液制備成樣品，其它同實施例1，結(jié)果如圖3A、3B和3C所示。掃描范圍為 3 μ mX 3 μ m。
由圖3A、3B、3C可知，當(dāng)甘油濃度超過3 %達(dá)到5 %時，云母襯底表面如同覆蓋上一 層膜，病毒粒子都“包埋”在這層膜中，從而病毒粒子的表觀高度表現(xiàn)為很低。這也間接說 明了甘油濃度不能過大，否則會影響最終成像質(zhì)量。
結(jié)論本發(fā)明通過在病毒溶液中添加甘油從而使得重組腺相關(guān)伴隨病毒顆粒在襯 底上均勻分散開，解決了病毒顆粒在襯底上易積聚的問題，從而為后續(xù)研究提供了先決條 件，例如使用AFM研究重組腺相關(guān)伴隨病毒或其它病毒的外殼彈性、病毒與受體間作用力等。
實施例3
重組腺相關(guān)伴隨病毒1型溶液(購自于北京本元正陽基因技術(shù)有限公司)，其滴度 為5 X IO12個/mL，用雙蒸水將其稀釋到10 X IOltl個/mL ；分析純甘油用雙蒸水稀釋到30% (V/V0)；取20 μ L稀釋后的病毒溶液，添加0. 7 μ L濃度為30 %的甘油溶液，從而制得最終 甘油濃度為(VZV0)的病毒溶液。取一小片云母用小鑷子或者刀片將其小心地解理成薄 層，并將它剪成2cmX2cm左右作為云母襯底；在云母襯底中心位置上滴加3 μ L的含甘 油的病毒溶液形成病毒液滴，靜置40秒鐘，然后再用干凈空氣輕輕吹開，同時將云母襯底輕輕傾斜以利于病毒液滴的散開，殘液用濾紙吸走。10分鐘后用移液槍取18 μ L雙蒸水沖 洗云母襯底表面，取濾紙放置在云母襯底邊緣吸取云母襯底表面上的水溶液，最后用干凈 空氣吹干云母襯底表面，得到病毒樣品，結(jié)果如圖4所示。
實施例4
實驗組病毒樣品的制備
重組腺相關(guān)伴隨病毒5型溶液(購自于北京本元正陽基因技術(shù)有限公司)，其滴 度為6 X IO11個/mL，用雙蒸水將其稀釋到1 X IO10個/mL ；分析純甘油用雙蒸水稀釋到30 % (V/V0)；取20 μ L稀釋后的病毒溶液，添加0. 7 μ L濃度為30%的甘油溶液，從而制得最終甘 油濃度為(V/V0)的病毒溶液。取一小片云母用小鑷子或者刀片將其小心地解理成薄層， 并將它剪成2. 5cmX2. 5cm左右作為云母襯底；在云母襯底中心位置上滴加4 μ L的含
甘油的病毒溶液形成病毒液滴，靜置15秒鐘，然后再用純度為99. 99%的干凈氮氣輕輕吹 開，同時將云母襯底輕輕傾斜以利于病毒液滴的散開，殘液用濾紙吸走。8分鐘后用移液槍 取20 μ L雙蒸水沖洗云母襯底表面，取濾紙放置在云母襯底邊緣吸取云母襯底表面上的水 溶液，最后用氮氣(純度為99.99%)吹干云母襯底表面，得到病毒樣品，結(jié)果如圖5所示。
權(quán)利要求
一種用于AFM研究的病毒樣品的制備方法，該方法包括如下步驟A)將病毒溶液滴加在云母襯底表面上形成病毒液滴；B)用干凈氣體吹開云母襯底表面上的病毒液滴；C)用雙蒸水沖洗云母襯底表面；D)干燥；其特征在于步驟A)中，該病毒溶液含有甘油，該甘油的體積濃度為0.5％～5％；所述的病毒選自重組腺相關(guān)伴隨病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于步驟A)中，該甘油的體積濃度為 3% ；該病毒溶液的滴度為IO9 IO11個/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的制備方法，其特征在于步驟Α)中，所述的云母是新解理 的面積為4 10平方厘米的薄層，滴加的病毒溶液的體積為2 4 μ L ；步驟C)中，用15 20 μ L雙蒸水沖洗云母襯底表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的制備方法，其特征在于步驟Α)形成的病毒液滴靜置 15 40秒再進(jìn)行步驟B)，步驟B)中所述的干凈氣體選自空氣和氮氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于步驟B)中，用干凈氣體吹開云母襯 底表面上的病毒液滴的同時傾斜云母襯底。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于步驟B)之后，云母襯底表面上的病 毒殘液用濾紙吸干。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5或6所述的制備方法，其特征在于在進(jìn)行步驟C)之前，云母襯底 靜置5 10分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的制備方法，其特征在于步驟D)中，所述的干燥是通風(fēng)干燥。
9.一種由權(quán)利要求
1所述的制備方法制得的病毒樣品。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種用于AFM研究的病毒樣品的制備方法及制得的病毒樣品，該病毒樣品的制備方法包括如下步驟A)將病毒溶液滴加在云母襯底表面上形成病毒液滴；B)用干凈氣體吹開云母襯底表面上的病毒液滴；C)用雙蒸水沖洗云母襯底表面；D)干燥；其中，步驟A)中，該病毒溶液含有甘油，該甘油的體積濃度為0.5％～5％。本發(fā)明通過在病毒溶液中添加甘油從而使得云母襯底表面上的病毒樣品均勻分散，試驗重復(fù)率高，而且病毒溶液中的病毒不易受到破壞。本發(fā)明的制備方法中的試劑造價低廉，無毒無害可輕易獲得。
文檔編號G01N1/28GKCN101109675 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200610029275
公開日2010年12月15日 申請日期2006年7月21日
發(fā)明者呂軍鴻, 張志祥, 張益 , 李海, 王化斌, 王鵬, 胡鈞 申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (4),