專利名稱:用于鑒定改變植物細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)的野生型表達(dá)的組合物的方法
用于鑒定改變植物細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)的野生型表達(dá)的組合物的方法
發(fā)明背景
為處理植物、種子、組織和器官以調(diào)節(jié)或調(diào)整植物的物理特性所需要的組合物和方法的尋找涉及鑒定負(fù)責(zé)所需特性的靶基因或蛋白，然后篩選各種“測試”化合物對所述靶基因/蛋白的影響。通常將植物與每種測試化合物接觸，然后在常規(guī)情況下生長以確定一種或多種測試化合物對野生型植物的影響。這樣的篩選技術(shù)在確定所涉及的靶基因和生長植物以觀察每種測試化合物的效果上均需要相當(dāng)長的時(shí)間。
最近，已經(jīng)提出了鑒定目標(biāo)植物的基因或蛋白的方法以促進(jìn)化合物篩選。參見，例如美國專利申請公開號US 2005/0221290和美國專利申請公開號US 2007/0265164。
在本領(lǐng)域中仍然需要更簡單且更快速的鑒定影響植物細(xì)胞中野生型基因/蛋白 表達(dá)的化合物的方法。
發(fā)明概述
本文所述的組合物和方法允許快速鑒定選擇性地改變植物細(xì)胞中野生型基因的表達(dá)或蛋白的表達(dá)的測試化合物的組合。所述方法允許在為了獲得這些信息不得不將植物培養(yǎng)至充分生理成熟之前，在機(jī)理上確定化合物是如何表現(xiàn)和相互作用。這些方法為測試化合物對植物的影響提供了遺傳學(xué)評估。
在一個(gè)方面，描述了一種用于鑒定選擇性地改變植物細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的化合物的組合的方法。一種這樣的方法包括比較(a)來自單獨(dú)接觸第一測試化合物的植物細(xì)胞或組織的第一表達(dá)譜，(b)來自單獨(dú)接觸另外的測試化合物的相同的植物細(xì)胞或組織的另外的表達(dá)譜，和(C)來自接觸所述第一測試化合物和所述另外的測試化合物的組合的相同的植物細(xì)胞或組織的組合表達(dá)譜。在該方法的其他實(shí)施方案中，另外的化合物包括兩種或更多種另外的化合物。與第一譜(a)和另外的譜(b)相比，組合化合物譜(C)中多種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或模式上任何扣除背景的、顯著的改變鑒定出兩種或更多種化合物的組合在影響植物的生長特性中是有用的。在一種實(shí)施方案中，表達(dá)譜的改變是協(xié)同的。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)譜的改變是拮抗的。
在上述方法的任一種中，所述比較步驟通過生成數(shù)值或圖形數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)處理器或計(jì)算機(jī)程控的設(shè)備任選地進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，通過將第一測試化合物(a)與另外的測試化合物(b)組合于為了同時(shí)或共同施用于植物的單一的組合物或試劑盒中，制備影響植物生長特性的組合物。
在下面詳細(xì)的描述中進(jìn)一步描述這些方法和組合物的其它方面及優(yōu)勢。

附圖簡述
圖I是顯示由于施用化合物，I-甲基環(huán)丙烯(MCP)vs.玉米基因(UT)、甲氧基丙烯酸酯(Strobiliurin) (STB) vs. UT、或MCP和STB的組合vs. UT,差異表達(dá)的玉米基因的數(shù)目和分布的圖。交叉的圓圈表明當(dāng)用MCP處理玉米植株時(shí)，與未處理的相比，934個(gè)基因(實(shí)體列表I)的表達(dá)顯著改變(> 2倍)，其中一個(gè)362個(gè)基因的子集響應(yīng)于這種條件發(fā)生了特有的改變。當(dāng)使用殺菌劑甲氧基丙烯酸酯(strobilurin)處理相同植物時(shí),僅有185個(gè)基因(實(shí)體列表2)的表達(dá)顯著改變，其中78個(gè)基因的變化是此條件特有的。但是，當(dāng)將這兩種化合物的組合施用于玉米植株時(shí)，共1128個(gè)基因在表達(dá)上發(fā)生了改變(實(shí)體列表3)，其中僅有568個(gè)基因發(fā)生了對該組合特有的變化。
圖2是顯示由于施用化合物，I-甲基環(huán)丙烯(MCP)vs.未處理的擬南芥基因(UT)、甲氧基丙烯酸酯(STB)vs.UT、*MCP/STB的組合vs. UT，差異表達(dá)的擬南芥基因的分布圖。交叉的圓圈表明當(dāng)用MCP處理擬南芥植株時(shí)，與未處理的相比，411個(gè)基因(實(shí)體列表I)的表達(dá)統(tǒng)計(jì)地改變(> 5倍)，其中202個(gè)特有的基因表達(dá)改變。當(dāng)使用殺菌劑甲氧基丙烯酸酯處理相同植物時(shí)，僅有278個(gè)基因(實(shí)體列表2)的表達(dá)統(tǒng)計(jì)地改變，其中80個(gè)基因是此條件特有的。但是，當(dāng)將這兩種化合物的組合施用于植株時(shí)，僅93個(gè)基因(實(shí)體列表3)在表達(dá)上顯著地改變，其中僅44個(gè)特有的基因變化。
發(fā)明詳述
本文所述的組合物和方法提供對影響植物生長特性的化合物的組合的快速、有效的鑒定。本文所述的方法的特征在于在執(zhí)行所述方法之前沒有任何對確定特定靶基因的需要。同樣這些方法不要求任何指定基因增強(qiáng)的表達(dá)，而是依賴于多個(gè)基因/蛋白表達(dá)的改變模式。該模式可以包括響應(yīng)測試化合物的組合的多個(gè)基因的上調(diào)和/或下調(diào)。
如本文所用的，術(shù)語“植物細(xì)胞或組織樣品”指單一的植物細(xì)胞或植物細(xì)胞的培養(yǎng)物或植物的全部或部分。代表的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物或植物組織可以衍生自單一的特定細(xì)胞類型、細(xì)胞類型的組合；單一的特定組織類型；組織類型的組合；單一的特定植物器官；或植物器官的組合。這樣的細(xì)胞選自植物組織和器官，包括但不限于營養(yǎng)組織，例如，根、莖、或葉，和生殖組織，如果實(shí)、胚珠、胚、胚乳、珠被、種子、種皮、花粉、花瓣、萼片、雌蕊、花、花藥、或任何胚組織。
如本文所用的，術(shù)語“植物”選自雙子葉或單子葉植物。這樣的植物包括裝飾用的開花植物，以及供人類或動(dòng)物食用的植物或植物部分。例如，提供這些方法中所使用的細(xì)胞的合適的植物可以是稻(rice)、玉米(maize)、小麥(wheat)、大麥(barley)、高粱(sorghum)、小米(millet)、柳枝稷(switchgrass)、芒草(miscanthus)、禾本科植物(grass)、燕麥(oats)、番爺(tomato)、馬鈴薯(potato)、香蕉(banana)、稱猴桃(kiwifruit)、鱷梨(avocado)、甜瓜(melon)、芒果(mango)、甘鹿(cane)、甜菜(sugar beet)、煙草(tobacco)、木瓜(papaya)、桃(peach)、草莓(strawberry)、懸鉤子(raspberry) >黑莓(blackberry)、藍(lán)莓(blueberry)、萵苣(lettuce)、甘藍(lán)(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、洋蔥(onion)、西蘭花(broccoli)、抱子甘藍(lán)(brussel sprout)、棉花(cotton)、雙低菜(canola)、葡萄(grape)、大豆(soybean)、油菜(oil seed rape)、蘆笑(asparagus)、豆類(beans)、胡蘿卜(carrots)、黃瓜(cucumbers)、爺子(eggplant)、瓜類(melons)、秋葵(okra)、歐防風(fēng)(parsnips)、花生(peanuts)、椒類(peppers)、菠蘿(pineapples)、倭瓜(squash)、甘薯(sweet potatoes)、黑麥(rye)、羅馬甜瓜(cantaloupes)、豌豆(peas)、南瓜(pumpkins)、向日葵(sunflowers)、菠菜(spinach)、蘋果(apples)、樓桃(cherries)、酸果蔓(cranberries)、葡萄柚(grapefruit)、梓檬(lemons)、酸橙(limes)、油桃(nectarines) > 橙(oranges) > 桃(peaches)、梨(pears)、橘柚(tangelos)、柑橘(tangerines)、百合(lily)、磨香石竹(carnation)、菊(chrysanthemum)、矮牽牛(petunia)、薔薇(rose)、天竺葵(geranium)、堇菜(violet)、唐菖蒲(gladioli)、蘭(orchid)、丁香(lilac)、海棠(crabapple)、楓香樹(sweetgum)、槭樹(maple)、一品紅(poinsettia)、刺槐(locust)、稃(ash)、楊(poplar)、鍛樹(linden tree)和擬南芥(Arabidopsis)。
這樣的植物細(xì)胞的特征在于不同組的核酸分子的表達(dá)。在所述植物的任一物理狀態(tài)，這些核酸分子，例如植物基因或其編碼的產(chǎn)品中的某些比其他表達(dá)的更多或更少，從而提供了多個(gè)基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)模式。可以將這種模式稱為表達(dá)“譜”或“指紋”，其可以鑒定細(xì)胞的生理狀態(tài)。因此，術(shù)語“表達(dá)譜”指細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中可鑒定的分子組的表達(dá)模式?？梢员碚髌浔磉_(dá)譜的代表性分子類型包括mRNA轉(zhuǎn)錄物或由其衍生的cDNA ;蛋白；磷蛋白；碳水化合物；脂質(zhì)，代謝產(chǎn)物；或mRNA轉(zhuǎn)錄物、蛋白、磷蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物的任意組合或排列。可以獲得這樣的表達(dá)譜以代表在任一生理狀態(tài)的野生型或背景譜，或當(dāng)植物在特定的物理狀態(tài)，例如它已被暴露于化學(xué)劑或環(huán)境條件時(shí)，在細(xì)胞中觀察到的改變的譜。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)譜是植物細(xì)胞的完整基因組或編碼的基因產(chǎn)物的完整集合。在另一實(shí)施方案中，每個(gè)表達(dá)譜包含植物完整基因組編碼的基因或基因產(chǎn)物的子集。在某些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物是植物蛋白。在仍有的其它實(shí)施方案中，譜跟蹤作為譜中一種或多種基因產(chǎn)物改變的結(jié)果的植物代謝中的相應(yīng)變化。
在本文所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，形成相關(guān)表達(dá)譜的基因或基因產(chǎn)物的子集包含3、4、5、6、7、8、9或10種或更多種基因或基因產(chǎn)物。在另一實(shí)施方案中，形成表達(dá)譜的基因或基因產(chǎn)物的子集包含20、30、40、50、60、70、80、90或100種或更多種基因或基因產(chǎn)物。還有其它在本文所述的方法中有用的表達(dá)譜是由150、200、250、300、350、400、450或500種或更多種基因或基因產(chǎn)物形成的。還有其它在本文所述的方法中有用的表達(dá)譜是由750、850、1000、1500、2000種或更多種基因或基因產(chǎn)物，包括多達(dá)植物細(xì)胞的整個(gè)基因組形成的。根據(jù)獲得的顯示差異表達(dá)的基因數(shù)，最典型地選擇> 2倍變化或> 5倍變化的截止值以將分析集中于最有意義的子集。為形成對本文所述的方法有用的表達(dá)譜，評價(jià)的植物細(xì)胞的表達(dá)譜必須與相同植物細(xì)胞樣品的背景表達(dá)譜以及來自第一測試化合物的表達(dá)譜和另外的表達(dá)譜均顯著地改變。
如本文所用的，術(shù)語植物的“物理狀態(tài)”包括但不限于以下條件增加的乙烯敏感性，降低的乙烯敏感性，提高的成熟，對脅迫、熱、種群密度或鹽度增加的抗性，對脅迫、熱、種群密度或鹽度降低的抗性，增加的病原體抗性，降低的病原體抗性，增加的開花，增加的氮效率，增加的除草劑抗性，增加的光合活性和增加的產(chǎn)量。
如本文所用的，術(shù)語“測試化合物”或“另外的化合物”指測試其在暴露于植物、植物細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)其對植物表達(dá)譜的作用的化合物。這樣的化合物可以包括當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)對植物具有已知或未知作用的化合物。這樣的化合物可以包括已知的植物疾病或調(diào)節(jié)試劑，或者可以是使用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的各種方法中的任一種獲得的未知化合物。測試化合物可以存在于合適的載體、稀釋劑或溶液中，并且可以通過浸潰、噴霧、粉化、淋、滴、或灌溉植物或植物細(xì)胞來應(yīng)用。
為產(chǎn)生用于本文所述的方法的表達(dá)譜，每種植物或植物細(xì)胞或組織來自相同的植物，并在組成，例如細(xì)胞的數(shù)量及密度、細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、植物生長條件等方面，是基本相同的。每種植物、植物細(xì)胞或培養(yǎng)物與第一測試化合物；或另外的測試化合物，或所述第一測試化合物與所述另外的測試化合物的組合中的一種接觸以在所述植物的細(xì)胞或組織中的至少三種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)上產(chǎn)生改變的時(shí)間。通常將“足以……的時(shí)間”定義為至少5、10、15、25、30、45、或60分鐘，或者至少為1、2、3、4、5、6至12小時(shí)或24小時(shí)。組合中的化合物可以同時(shí)或連續(xù)地施加到植物或植物細(xì)胞。此外，在某些實(shí)施方案中，另外的測試化合物不止一種單一的化合物而其本身可以是混合物。在某些實(shí)施方案中，第一測試化合物是對植物細(xì)胞具有已知作用的化合物而另外的化合物是對細(xì)胞具有未知作用的化合物，或者是相反的情況。在其它實(shí)施方案中，第一測試化合物和另外的測試化合物均對細(xì)胞具有未知的獨(dú)立作用。同樣，在本方法中需要使用的測試化合物的量與田間試驗(yàn)或在實(shí)驗(yàn)室種植植物所需的量相比是相當(dāng)小的。當(dāng)然，用于細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的組合物的合適的量將取決于化合物本身的特性，但可以包括至少O. 2,0. 5,0. 8或I. O或更多微克每毫克培養(yǎng)物中的細(xì)胞，或者以稀釋液的mL表示的相同的量以供施用于植物或植物組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測試化合物的量包含至少2、5、8或10或更多微克每毫克培養(yǎng)物中的細(xì)胞，或者以稀釋液的mL表示的相同的量以供施用于植物或植物組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測試化合物的量包含至少2、5、8或10或更多毫克每毫克培養(yǎng)物中的細(xì)胞，或者以稀釋液的mL表示的相同以供施用于植物或植物組織?！?br>接觸植物細(xì)胞、組織或植物后，在與化合物接觸后的2、5、10、20、30、40、50或60分鐘，或2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24小時(shí)內(nèi)收集組織樣品。在一些實(shí)施方案中，可以在與化合物接觸后的2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、26、28、30天取樣組織。又在其他實(shí)施
方案中，可以在接觸植物細(xì)胞、組織或植物后的長達(dá)6個(gè)月每月進(jìn)行取樣以便獲得化合物的更長效的下游作用。
該方法進(jìn)一步包括產(chǎn)生來自單獨(dú)接觸第一測試化合物的植物細(xì)胞或組織的表達(dá)譜，來自單獨(dú)接觸另外的測試化合物的植物細(xì)胞或組織的表達(dá)譜；和來自接觸所述測試化合物和所述另外的化合物的組合的植物細(xì)胞或組織的組合化合物表達(dá)譜的步驟。
可以通過下列方法中的一種或多種常規(guī)地獲得表達(dá)譜的產(chǎn)生和表征將適當(dāng)制備的樣品應(yīng)用于植物基因組或其編碼產(chǎn)物的多聚核酸微陣列。Affymetrix，Inc或許多其他微陣列制造商已經(jīng)描述了這種微陣列的例子。微陣列的產(chǎn)生或使用可以接著mRNA表達(dá)模式檢測；適當(dāng)制備的樣品的2-維凝膠電泳以衍生蛋白表達(dá)的模式；將樣品應(yīng)用于抗體陣列以衍生蛋白表達(dá)譜；將樣品應(yīng)用于差異結(jié)合到特定肽的多核苷酸的陣列以衍生蛋白表達(dá)模式。同樣地，通過質(zhì)譜對適當(dāng)制備的樣品的分析可以用于衍生mRNA或蛋白的表達(dá)模式?？梢酝ㄟ^基于珠的mRNA和蛋白表達(dá)的分析方法,例如LynxTherapeutics, Inc.、Illumina, Inc.或Luminex, Inc.描述的方法,對適當(dāng)制備的樣品進(jìn)行分析以衍生mRNA或蛋白的表達(dá)模式。下面的實(shí)施例中描述的技術(shù)同樣可以用于這些目的。為了在本文所述的方法中使用，可以使用上述的方法以外的任何表征樣品的多種分子成分的特有表達(dá)譜的方法。參見，例如US2007/0265164 ；US2005/0221290 ;或在藥品專利US 7，332，272，等本領(lǐng)域現(xiàn)存的其它已知的產(chǎn)生表達(dá)譜的描述中描述的產(chǎn)生表達(dá)譜的技術(shù)。
在某些實(shí)施方案中，通過提取、酶促擴(kuò)增和用可檢測的信號產(chǎn)生試劑標(biāo)記植物的mRNA來產(chǎn)生表達(dá)譜。然后將此種標(biāo)記的核酸分子暴露在微陣列上，該微陣列已分散地點(diǎn)有與植物細(xì)胞表達(dá)的許多或全部可能的mRNA種類互補(bǔ)的DNA序列。標(biāo)記的植物細(xì)胞表達(dá)的核酸分子與分散的斑點(diǎn)差異地雜交，賦予與樣品中每一分子的濃度成比例的可檢測的信號。使用已有技術(shù)，例如，微陣列讀取器快速檢測和定量每個(gè)斑點(diǎn)的信號強(qiáng)度。確定就各種植物細(xì)胞(例如野生型植物細(xì)胞、第一化合物處理的植物細(xì)胞、第二化合物處理的植物細(xì)胞、和用兩種測試化合物處理的植物細(xì)胞)而言的那些相同mRNA轉(zhuǎn)錄物或整個(gè)基因組的表達(dá)水平。當(dāng)產(chǎn)生了各種表達(dá)譜并在通過合適的聚類或其他技術(shù)分析結(jié)果之前，減去形成表達(dá)譜的基因/基因產(chǎn)物的背景表達(dá)水平。背景表達(dá)水平獲得自相同類型的植物、植物細(xì)胞/培養(yǎng)物產(chǎn)生的譜，它們已暴露于與“測試”植物細(xì)胞或培養(yǎng)物相同的培養(yǎng)和環(huán)境條件，但是沒有與所述第一化合物或任何另外的化合物接觸。
此后，將單獨(dú)處理的譜與組合的譜相比較以鑒定在不同處理的植物細(xì)胞之間具有不同的表達(dá)水平和模式的mRNA轉(zhuǎn)錄物。所謂的“加合表達(dá)譜”是每一單獨(dú)處理的表達(dá)譜的組合的預(yù)期的計(jì)算結(jié)果。
本文所述的方法可以使用植物細(xì)胞培養(yǎng)物，而不是整個(gè)植株在高通量分析中進(jìn)行。例如，在96孔或更多孔的培養(yǎng)板中建立數(shù)以千計(jì)的植物細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)物，其中每個(gè)孔用不同的測試化合物處理。如上所述處理和提取RNA。然后將每個(gè)樣品暴露于野生型植 物細(xì)胞的單獨(dú)的微陣列。通過一個(gè)微陣列讀取器或多個(gè)微陣列讀取器讀取每個(gè)微陣列以衍生每種測試化合物對植物細(xì)胞表達(dá)譜的效果。計(jì)算預(yù)期的加合譜并使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析將預(yù)期的結(jié)果與實(shí)際的組合表達(dá)譜相比。
表達(dá)譜分析(expression profiling)也可以利用多種基因的轉(zhuǎn)錄率的同時(shí)檢測。通過對正經(jīng)歷某種干擾的細(xì)胞、組織或植物的快速順序的陣列測量獲得該率?？梢元?dú)立考慮表達(dá)水平的率的改變率，和率的陣列，或與絕對表達(dá)水平組合考慮，以獲得包含更多信息的表達(dá)譜。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將對許多生物分子，例如mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)率的同時(shí)檢測應(yīng)用于本文所述的方法。
本文所述的方法進(jìn)一步包括通過比較各自的表達(dá)譜，鑒定組合的化合物表達(dá)譜的基因或基因產(chǎn)物和形成單獨(dú)接觸第一測試化合物和另外的化合物的細(xì)胞/培養(yǎng)物的表達(dá)譜的那些在表達(dá)水平或模式上的顯著改變?？梢酝ㄟ^目視檢查譜或可理想地通過生成數(shù)值或圖形數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)處理器或計(jì)算機(jī)程控的設(shè)備進(jìn)行這一比較步驟。以平均值(mean)或均值(average)、數(shù)值平均值或數(shù)值平均值的范圍、數(shù)值模式、或圖形模式表示形成各種表達(dá)譜的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的每個(gè)改變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，改變是與在第一測試化合物譜和另外的測試化合物譜中相同的基因或基因產(chǎn)品的加合表達(dá)相比，組合化合物譜中相同的所選基因或基因產(chǎn)物的上調(diào)。在另一實(shí)施方案中，改變是與在第一測試化合物譜和另外的測試化合物譜中相同的基因或基因產(chǎn)品的加合表達(dá)相比，組合化合物譜中相同的所選基因或基因產(chǎn)物的下調(diào)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變是組合化合物譜中一種或多種所選基因或基因產(chǎn)品表達(dá)的變化，其中所選基因或基因產(chǎn)物與在產(chǎn)自第一譜和另外的譜的加合改變的譜中的野生型水平相比是未變的。例如，與組合化合物表達(dá)譜中的野生型表達(dá)水平相比改變的基因或基因產(chǎn)物是在第一測試化合物譜、另外的測試化合物譜、或通過單獨(dú)的譜預(yù)測的加合譜中改變的不同的基因或基因產(chǎn)物。或者，相同的基因或基因產(chǎn)物形成比較的表達(dá)譜，但改變涉及在組合化合物譜中相同的選定的基因或基因產(chǎn)物的上調(diào)，所述基因或基因產(chǎn)物在第一譜和另外的譜的單獨(dú)的或預(yù)測的加合表達(dá)譜中是不受影響或下調(diào)的。再或者，顯著的改變涉及在組合化合物譜中相同的選定的基因或基因產(chǎn)物的下調(diào)，所述基因或基因產(chǎn)物在第一譜和另外的譜的單獨(dú)的或預(yù)測的加合表達(dá)譜中是不受影響或上調(diào)的。在組合表達(dá)譜和單獨(dú)表達(dá)譜(或從其預(yù)測的加合譜)之間的又一顯著改變涉及在形成組合譜的單獨(dú)基因或基因產(chǎn)物的特性上相對于形成通過第一測試化合物譜和另外的測試化合物譜形成的單獨(dú)或預(yù)期的加合譜的改變。例如，在產(chǎn)生自第一譜和另外的譜的加合改變的譜中與野生型水平相比未改變的某些基因/基因產(chǎn)物在組合譜中是上調(diào)或下調(diào)的，而在產(chǎn)生自第一譜和另外的譜的加合改變的譜中與野生型水平相比上調(diào)或下調(diào)的其他基因/基因產(chǎn)物與組合譜中表達(dá)的野生型水平相比是未變的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在組合化合物表達(dá)譜中顯著改變的鑒定與選擇的對植物細(xì)胞的作用，例如與單獨(dú)由測試化合物或另外的化合物導(dǎo)致的作用不同的作用，或與這兩種化合物預(yù)期的加合作用相比不同的，更大或更小的作用是相關(guān)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變的作用是由一種測試化合物導(dǎo)致的作用的顯著增強(qiáng)·或減少和由其他化合物導(dǎo)致的作用的減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，改變的作用是能夠基于它們的表達(dá)譜預(yù)期的由測試化合物和另外的化合物的加合使用產(chǎn)生的作用的顯著提高。在又一實(shí)施方案中，組合表達(dá)譜導(dǎo)致與由測試和另外的化合物的單獨(dú)的作用本身或預(yù)期的加合作用導(dǎo)致的作用不同的作用。
在另一實(shí)施方案中，化合物的組合具有協(xié)同作用，其是在組合化合物的譜中植物的基因或基因產(chǎn)物在表達(dá)模式或水平上，與由第一和另外的表達(dá)譜的模式或水平中的加合改變所預(yù)測的相比更大的改變。在某些實(shí)施方案中，在組合表達(dá)譜中表達(dá)模式或水平的改變是在或上調(diào)或下調(diào)的形成第一和另外的譜的加合改變的模式的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)上至少2倍的改變。在其它實(shí)施方案中，改變是基于它們的表達(dá)譜預(yù)測的這兩種化合物的加合作用(上調(diào)或下調(diào))所期望的至少3、4、5、6、7、8、9、10或大于20倍。
在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化合物的組合具有拮抗作用，其是與第一和另外的譜的加合改變的表達(dá)模式或水平產(chǎn)生的相比，在組合化合物譜中的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)模式或水平上的改變幅度的減少。這種類型的結(jié)果表明這兩種化合物對植物細(xì)胞具有拮抗作用。
因此，通過應(yīng)用本發(fā)明的方法，并將用不同的化合物組合處理的植物細(xì)胞所產(chǎn)生的表達(dá)譜與兩種或更多種化合物的單獨(dú)表達(dá)譜，或它們計(jì)算出的加合表達(dá)譜結(jié)果相比較，此方法提供了一種快速且有效的篩選化合物的組合以供治療各種植物疾病或狀況，例如脅迫的影響，以延遲成熟等，而不必要在化合物中培養(yǎng)植物。
這些方法及其所獲得的結(jié)果進(jìn)一步允許用于治療植物疾病或操縱植物的物理狀態(tài)的組合物或試劑盒的配制。每種組合物或試劑盒包含有效的協(xié)同作用量的本文所述的方法鑒定的至少兩種化合物。那些化合物可以物理混和為單一制劑以供應(yīng)用于植物，或可以存在于試劑盒中的獨(dú)立容器中以供同時(shí)或連續(xù)應(yīng)用于田間的植物。
以下實(shí)施例說明了上面討論的方法的某些實(shí)施方案，其通過使用第一測試化合物，即植物生長調(diào)節(jié)劑I-甲基環(huán)丙烯(I-MCP)，和作為另外的測試化合物的50%w/w的水分散性顆粒制劑(Bayer Environmental Science, NorthCarolina)的 COMPASS 殺真菌劑月虧菌酯(trifloxystrobin)來生成。已觀察到甲氧基丙烯酸酯類除了其作為殺菌劑的益處之夕卜，還對植物健康的有一些作用。盡管這些化合物均是已知的，也被聲稱是協(xié)同作用的，將它們用于證明所要求保護(hù)的方法的性能。這些實(shí)施例不限制權(quán)利要求
和說明書的披露。[0040]實(shí)施例I :玉米植物的生長和處理
在充滿FAFARD 3B 盆栽混合物(Conrad Fafard, Inc. , Agawam, Massachusetts)的I夸脫盆中種植雜交玉米種子(每盆一株植物)。在溫室中培養(yǎng)玉米，以12小時(shí)的光周期和每24小時(shí)澆水或根據(jù)需要澆水以保持無脅迫條件。當(dāng)玉米植株達(dá)到VlO生長階段，將盆按每處理具有3個(gè)重復(fù)布置到4個(gè)植株的隨機(jī)化的完整區(qū)塊設(shè)計(jì)中(the potswere arranged into a randomizedcomplete block design with 4 plants with 3replications per treatment)。使用標(biāo)準(zhǔn)的CO2噴霧器以20gal/英畝載體體積(carriervolume)處理玉米植株。
處理是
對照使用0. 035 % v/v 有機(jī)娃(organosiIicone)表面活性劑 SILWETL-77 (HelenaChemical Co. , Collierville, TN)的油 / 佐劑標(biāo)準(zhǔn)(check)
化合物I :A17492F (MCP) 25g 活性成分 / 公頃(ai/ha)+0. 035% SILffET 表面活性·劑
化合物2 C0MPASS殺菌劑1χ+0· 035% SILffET表面活性劑
組合(I和 2) 1MCP 25g/ha+C0MPASS 殺真菌劑lx
噴霧施用后兩個(gè)小時(shí)，采樣受到噴霧的上部葉。對于每一植株，取5片2英寸的葉片，切成小片并合并到50mL聚丙烯管中。立即將樣品在干冰上冷凍并在干冰上過夜發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室以供處理。
實(shí)施例2 :玉米RNA制備和雜交
A.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
使用安捷倫(Agilent)單色全基因表達(dá)譜分析設(shè)計(jì)定義處理的參照未處理的玉米葉組織差異表達(dá)的基因。將3個(gè)技術(shù)陣列重復(fù)(Agilent Technologieslnc. , SantaClara, CA)進(jìn)行雜交以比較參照未處理的葉組織，以COMPASS殺真菌劑和/或I-MCP處理的葉組織之間不同的轉(zhuǎn)錄物豐度。
使用Dow AgroSciences定制生產(chǎn)的60聚體(60_mer)全面轉(zhuǎn)錄組范圍的(comprehensive transcriptome-wide)玉米(Zea maize)寡核苷酸陣列進(jìn)行微陣列雜交。該陣列代表了獲得自公開數(shù)據(jù)源的超過58，000種不同的玉米轉(zhuǎn)錄物(AgilentTechnologies Inc. , Santa Clara, CA)。微陣列芯片使用 Agilent 格式 2xl05K 印制，包括100個(gè)探針的10個(gè)拷貝，44，196個(gè)探針的2個(gè)拷貝，14，355個(gè)探針的I個(gè)拷貝，以及1325個(gè)Agilent摻入對照(spike-in control)。使用制造商的Sure-Print技術(shù)原位合成60聚體的獨(dú)特和特異性寡核苷酸。
B. RNA的分離和純化
將30_50mg冷凍葉組織樣品重懸于450 μ L RNeasy 試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)的RLT提取緩沖液以進(jìn)行RNA提取。然后通過向各冷凍樣品中加入一顆3mm的研磨珠并使用GenoGrinder設(shè)備以速率300, IX研磨3分鐘將組織研磨成細(xì)粉末。根據(jù)制造商的說明純化總RNA。然后使用NanoDrop 分光光度計(jì)并用標(biāo)準(zhǔn)的1%瓊脂糖凝膠電泳顯影來對純化的總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量控制。
C. cRNA 標(biāo)記
為了標(biāo)記，將來自處理和未處理組織的總共I. 0μ g純化的RNA根據(jù)Agilent (Santa Clara, CA)單色基于微陣列的基因表達(dá)QuickAmp 標(biāo)記方案反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增并用Cy3_CTP標(biāo)記。由于Dow AgroSciences-生產(chǎn)的用于基因表達(dá)的玉米AGILENT 微陣列(P/N G4503A，設(shè)計(jì)ID 022232)包含內(nèi)部摻入對照，也根據(jù)制造商的說明使用單色RNA摻入試劑盒(Agilent, Santa Clara, CA)標(biāo)記。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄樣品并使用T7RNA聚合酶擴(kuò)增。擴(kuò)增后使用Qiagen的RNeasy微型旋轉(zhuǎn)柱純化cRNA并使用NanoDrop分光光度計(jì)定量。由下面的公式確定Cy3的比活性(Cy3濃度)/ (cRNA濃度)*1000=pmol的Cy3每μ g的cRNA。用于雜交的樣品標(biāo)準(zhǔn)化至825ng,其中比活性>8. Opmol的Cy3每μ g的 cRNA。
D.雜交
根據(jù)制造商的說明使用Agilent Technologies (Santa Clara, CA)基因表達(dá)雜交試劑盒、洗滌緩沖液試劑盒、穩(wěn)定和干燥溶液雜交寡聚基因表達(dá)陣列。在完全自動(dòng)化的TECAN HS4800 PR0 (TECAN U.S. ,Research TrianglePark,NC)上進(jìn)行雜交。在65°C注入雜 交混合物并在65°C的載片預(yù)雜交(sildepre-hybridization) 30秒的步驟后在攪拌下溫育17小時(shí)。然后在37° C用AgilentGE洗液# I洗滌載片I分鐘，接著是在30°C用AgilentGE洗液# 2進(jìn)行的I分鐘第二洗滌和使用氮?dú)獾脑?0° C的2分鐘和30秒的最后干燥步驟。立即掃描載片以盡量減少環(huán)境氧化劑對信號強(qiáng)度的影響。
E.掃描、特征提取和QC度量
使用Agilent G2565CA微陣列激光掃描儀以SureScan 高分辨率技術(shù)(AgilentTechnologies, Santa Clara, CA)掃描陣列。用于掃描每個(gè)陣列的方案定義了染料通道、掃描區(qū)域和分辨率、TIFF文件動(dòng)態(tài)范圍、PMT增益和對于最終圖像結(jié)果的設(shè)置的參數(shù)。一旦掃描了陣列，遵循特征提取方案，其具有為安置和優(yōu)化網(wǎng)格擬合，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)，標(biāo)識異常(flagging outlier)，計(jì)算背景偏差、錯(cuò)誤和比率，和計(jì)算質(zhì)量控制度量定義的參數(shù)。
掃描和特征提取方案完成后，生成了包含Cy3圖像的TIFF文件，以及質(zhì)量控制度量報(bào)告和包含所有原始數(shù)據(jù)的最終文件(TXT)。圖像文件(TIFF)用于檢測載片的一般質(zhì)量，摻入對照在正確位置(四角)上且以正確強(qiáng)度存在確認(rèn)雜交、洗滌、掃描和特征提取過程是成功的。質(zhì)量控制(QC)報(bào)告提供變化系數(shù)的值并用于基于AgilentTechnologies (Santa Clara, CA)提供并設(shè)計(jì)的陽性和陰性(原核基因和人工序列)摻入對照衡量數(shù)據(jù)的分散。該報(bào)告用于確定數(shù)據(jù)分布、均勻性、背景、重現(xiàn)性、靈敏度和數(shù)據(jù)的一般質(zhì)量。將包含所有原始數(shù)據(jù)的TXT文件上傳到GeneSpring 程序(Agilent, Santa Clara,CA)進(jìn)行分析。
F.數(shù)據(jù)上傳、標(biāo)準(zhǔn)化、過濾和統(tǒng)計(jì)分析
掃描和特征提取后，將原始數(shù)據(jù)文件上傳到GeneSpring GX版本10. O. 2 (Agilent, Santa Clara, CA)并創(chuàng)建將各陣列數(shù)據(jù)文件定義為樣本并分配合適的參數(shù)值的項(xiàng)目。將具有相同參數(shù)值的樣品作為重復(fù)對待。創(chuàng)建解釋(interpretation)以指定樣品如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件分組并用于顯現(xiàn)和分析數(shù)據(jù)。在開始分析前進(jìn)行基于摻入對照的樣品質(zhì)量控制以確保數(shù)據(jù)的質(zhì)量。生成一份報(bào)告。
使用全局百分轉(zhuǎn)變標(biāo)準(zhǔn)化方法(global percentile shiftnormalizationmethod)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)以盡量減少系統(tǒng)性的非生物學(xué)差異并標(biāo)準(zhǔn)化陣列以進(jìn)行交叉比較。然后基于標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中的20%和100%之間的表達(dá)水平過濾數(shù)據(jù)并限制到進(jìn)行研究的每個(gè)樣品中在截止值內(nèi)具有顯著的值。通過選擇進(jìn)行研究的每一單獨(dú)樣品中標(biāo)記為存在的實(shí)體并去除標(biāo)記為臨界(Marginal)或缺失的實(shí)體進(jìn)行另一組過濾。
使用此最終的實(shí)體列表(陣列中表示的基因)作為輸入，以校正的P值P彡O. 05和O. 05的Benjamin-Hochberg多重測試校正FDR使用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。然后由一個(gè)特定的變化倍數(shù)過濾顯著性實(shí)體的最終列表，并用于數(shù)據(jù)解釋。圖I圖例顯示了實(shí)施例3、4和5的結(jié)果。
實(shí)施例3 :1-甲基環(huán)丙烯誘導(dǎo)的玉米基因表達(dá)
以I-甲基環(huán)丙烯(I-MCP)處理玉米導(dǎo)致微陣列上934個(gè)基因的差異表達(dá)(彡2倍變化)。從這些基因中，進(jìn)一步分析了 I-MCP處理特有的362個(gè)基因的子集。在此分析中，我們集中于注釋基因并尋找基因的相關(guān)功能組內(nèi)的變化/趨勢。這些基因的表達(dá)及假定的功能如表I所示。
表I中特定基因的分析表明，誘導(dǎo)了在這個(gè)特定實(shí)驗(yàn)中表達(dá)改變的參與翻譯的10個(gè)基因中的9個(gè)的表達(dá)，而只有一個(gè)是被抑制的。由于全局翻譯通常是響應(yīng)于非生物和生物脅迫首先被抑制的進(jìn)程之一，一般翻譯機(jī)構(gòu)組分的表達(dá)可以充當(dāng)植物中一般脅迫水平的指示劑。這些數(shù)據(jù)表明植物并沒有受脅迫和可能經(jīng)歷了降低水平的脅迫。基因例如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶或硫氧還蛋白相關(guān)蛋白在脅迫條件下經(jīng)常是被誘導(dǎo)的，并且觀察到的這些基因的表達(dá)的減少與降低的脅迫水平是一致的。在第三類中，編碼特定脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白(例如通用應(yīng)激蛋白)的基因的表達(dá)降低表示脅迫降低，而參與細(xì)胞擴(kuò)展的β_擴(kuò)張蛋白的表達(dá)增加，與脅迫降低相符合。參與ABA生產(chǎn)的viviparousl4的表達(dá)增加,和由于乙烯和ABA通常彼此對抗，這可能表明I-MCP處理導(dǎo)致乙烯信號傳導(dǎo)降低。整體而言，I-MCP處理似乎導(dǎo)致了脅迫相關(guān)基因表達(dá)的降低，以及反映更積極的代謝的一組基因的表達(dá)的增加。接著后面的實(shí)施例10的表I列出了響應(yīng)于單獨(dú)的I-MCP差異表達(dá)的提供信息的玉米基因。
實(shí)施例4 Compass殺真菌劑誘導(dǎo)的玉米基因表達(dá)以COMPASS甲氧基丙烯酸酯殺真菌劑處理玉米導(dǎo)致了微陣列上185個(gè)基因的差異表達(dá)(> 2倍變化)。其中，一個(gè)78個(gè)基因的子集是COMPASS處理特有的。與I-MCP處理相比，在此處理中觀察到比較少的差異表達(dá)的基因。這可能是由于COMPASS甲氧基丙烯酸酯殺真菌劑在處理后需要超過2個(gè)小時(shí)以在基因表達(dá)水平上產(chǎn)生顯著的變化。
實(shí)施例5 :1-MCP和Compass殺真菌劑的組合誘導(dǎo)的玉米基因表達(dá)
以I-甲基環(huán)丙烯和甲氧基丙烯酸酯殺真菌劑Compass的組合處理玉米導(dǎo)致了微陣列上1128個(gè)基因的差異表達(dá)(> 2倍變化)。從這些基因中，進(jìn)一步分析了組合處理特有的568個(gè)基因的子集。在此分析中，我們集中于注釋基因并尋找基因的相關(guān)功能組內(nèi)的變化/趨勢。條件比較的圖形結(jié)果如圖I所示。
這些基因的表達(dá)及假定的功能如表2所示。這些基因的分析表明，誘導(dǎo)了在這個(gè)特定實(shí)驗(yàn)中表達(dá)改變的參與翻譯的7個(gè)基因中的3個(gè)的表達(dá)，而4個(gè)是被抑制的。與單獨(dú)I-MCP處理所觀察到的不同，組合處理沒有揭示任何與全局翻譯的狀態(tài)一致的趨勢。但是，觀察到基因，例如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶或抗壞血酸過氧化物酶的表達(dá)減少與降低的脅迫水平相一致。在這個(gè)特定實(shí)驗(yàn)中表達(dá)變化的5個(gè)這些基因中4個(gè)降低了，只有I個(gè)增加。在第三類中，編碼特定脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的(例如溫度誘導(dǎo)的)蛋白的7個(gè)基因中的5個(gè)的表達(dá)降低，表明脅迫降低，僅有2個(gè)增加。2個(gè)參與防御應(yīng)答的基因也有所下降，表明脅迫的降低。除草劑安全劑(safener)結(jié)合蛋白的表達(dá)增加了，其參與結(jié)合保護(hù)玉米免受某些除草劑(如氯乙酰苯胺和硫代氨基甲酸酯)的傷害并作為一種保護(hù)機(jī)制誘導(dǎo)谷胱甘肽生產(chǎn)或增加谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的安全劑。在單獨(dú)甲氧基丙烯酸酯處理中此蛋白同樣增加，表明這可能是一個(gè)特異性應(yīng)答甲氧基丙烯酸酯而誘導(dǎo)的基因。它可能充當(dāng)甲氧基丙烯酸酯處理/應(yīng)答的潛在的標(biāo)記基因。在另一類中，參與將CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽，以協(xié)助葉綠體中為進(jìn)行光合作用的CO2濃度的提高，的碳酸酐酶的表達(dá)增加了。但是，在I-MCP處理中此相同基因的表達(dá)降低了。此外，在來自組合處理的568個(gè)特有基因的子集中，參與卡爾文循環(huán)的其他三個(gè)基因的表達(dá)降低，表明在光合作用中可能的降低。
在進(jìn)一步的類別中，一種組蛋白脫乙酰基酶(經(jīng)常參與轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的酶)的表達(dá)增力口，而另一種組蛋白脫乙?；傅谋磉_(dá)減少。一種可能的解釋是，在相同條件下，不同的家族成員可能差異性地發(fā)揮作用。參與茉莉酸(jasmonate)的生物合成，通常認(rèn)為是脅迫相關(guān)激素的丙二烯氧化物合酶(allene oxidesynthase)的表達(dá)降低,表明在脅迫水平上可能的降低。因此，一些變化表明脅迫上可能的降低，而其他則可能不會(huì)。綜上所述，這些結(jié)果表明這兩種化合物相拮抗地發(fā)揮作用?！0074]實(shí)施例6 :擬南芥植物的生長和處理
在充滿砂質(zhì)粘土培養(yǎng)基的6英寸盆中種植13顆擬南芥種子(Columbia品種)。出苗后，將盆減稀到每盆10個(gè)植株。在溫室中培養(yǎng)植株，以12小時(shí)的光周期和每24小時(shí)澆水或根據(jù)需要澆水以保持無脅迫條件。當(dāng)擬南芥植株達(dá)到營養(yǎng)OBBCH IKBBCH 30)階段(大約在種植后2-3周)，將盆按每處理具有3個(gè)重復(fù)布置到10個(gè)植株的隨機(jī)化的完整區(qū)塊設(shè)計(jì)中。使用標(biāo)準(zhǔn)的CO2噴霧器以20gal/A載體體積處理植株。
處理是
對照油/ 佐劑標(biāo)準(zhǔn)(O. 035%v/v SILffET 佐劑 L-77)
化合物I :A17492F (MCP) 25g ai/ha+0. 035%SILWET 佐劑
化合物2 COMPASS 殺真菌劑 1χ+0· 035%SILWET 佐劑
組合1MCP25g/ha+C0MPASS 殺真菌劑 Ix
噴霧施用后兩個(gè)小時(shí)，采樣受到噴霧的葉。對于每一處理，從每10株植株取2片葉并合并到50ml聚丙烯管中。立即將樣品在干冰上冷凍并在干冰上過夜發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室以供處理。
實(shí)施例7 :擬南芥RNA的制備和雜交
A.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
使用Agilent單色全基因表達(dá)譜設(shè)計(jì)定義處理的參照未處理的擬南芥葉組織差異表達(dá)的基因。將3個(gè)技術(shù)陣列重復(fù)(Agilent Technologies Inc. , SantaClara, CA)進(jìn)行雜交以比較參照未處理的葉組織，以甲氧基丙烯酸酯和/或I-MCP處理的葉組織之間不同的轉(zhuǎn)錄物豐度。從Agilent Technologies獲得擬南芥載片，產(chǎn)品# G2519F,設(shè)計(jì)ID021169。
B. RNA的分離和純化
將30_50mg冷凍的葉組織樣品重懸于450 μ L RNeasy試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)的RLT提取緩沖液以進(jìn)行RNA提取。然后通過向各冷凍樣品中加入一顆3mm的研磨珠并使用GenoGrinder設(shè)備以速率300, IX研磨3分鐘將組織研磨成細(xì)粉末。根據(jù)制造商的說明純化總RNA。然后使用NanoDrop 分光光度計(jì)并用標(biāo)準(zhǔn)的1%瓊脂糖凝膠電泳顯影來對純化的總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量控制。
C. cRNA 的標(biāo)記
為了標(biāo)記，將來自處理和未處理組織的總共I. 0μ g純化的RNA根據(jù)Agilent (Santa Clara, CA)單色基于微陣列的基因表達(dá)QuickAmp 標(biāo)記方案反轉(zhuǎn)錄,擴(kuò)增并用Cy3-CTP標(biāo)記。由于用于基因表達(dá)的Agilent擬南芥微陣列(產(chǎn)品#G2519F，設(shè)計(jì)ID021169)包含內(nèi)部摻入對照,也根據(jù)制造商的說明使用單色RNA入試劑盒(Agilent, SantaClara，CA)標(biāo)記。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄樣品并使用T7RNA聚合酶擴(kuò)增。擴(kuò)增后使用Qiagen的RNeasy微型旋轉(zhuǎn)柱純化cRNA并使用NanoDrop分光光度計(jì)定量。由下面的公式確定Cy3的比活性(Cy3濃度)/ (cRNA濃度)*1000=pmol的Cy3每μ g的cRNA。用于雜交的樣品標(biāo)準(zhǔn)化至825ng,其中比活性>8. Opmol的Cy3每μ g的cRNA。
D.雜交
根據(jù)制造商的說明使用Agilent Technologies (Santa Clara, CA)基因表達(dá)雜交試劑盒、洗滌緩沖液試劑盒、穩(wěn)定和干燥溶液雜交寡聚基因表達(dá)陣列。在完全自動(dòng)化的TECAN HS4800PR0 (TECAN U. S. ,Research Triangle Park，NC)雜交儀上進(jìn)行雜交。在65°C注入雜交混合物并在65°C載片預(yù)雜交30秒的步驟后在攪拌下溫育17小時(shí)。然后在37° C用Agilent GE洗液# I洗滌載片I分鐘，接著是在30°C用Agilent GE洗液# 2進(jìn)行的I分鐘第二洗滌和使用氮?dú)獾脑?0° C的2分鐘和30秒的最后干燥步驟。立即掃描載片以盡量減少環(huán)境氧化劑對信號強(qiáng)度的影響。
E.掃描、特征提取和QC度量
使用Agilent G2565CA微陣列激光掃描儀以SureScan 高分辨率技術(shù)(AgilentTechnologies, Santa Clara, CA)掃描陣列。用于掃描每個(gè)陣列的方案定義了染料通道、掃描區(qū)域和分辨率、TIFF文件動(dòng)態(tài)范圍、PMT增益和對于最終圖像結(jié)果的設(shè)置的參數(shù)。一旦掃描了陣列，遵循特征提取方案，其具有安置和優(yōu)化網(wǎng)格擬合，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)，標(biāo)識異常，計(jì)算背景偏差、錯(cuò)誤和比率，和計(jì)算質(zhì)量控制度量定義的參數(shù)。掃描和特征提取程序完成后，生成了包含Cy3圖像的TIFF文件，以及質(zhì)量控制度量報(bào)告和包含所有原始數(shù)據(jù)的最終文件(TXT)。圖像文件(TIFF)用于檢測載片的一般質(zhì)量，摻入對照在正確位置(四角)上且以正確強(qiáng)度存在確認(rèn)雜交、洗滌、掃描和特征提取過程是成功的。質(zhì)量控制(QC)報(bào)告提供變化系數(shù)的值并用于基于Agilent Technologies (Santa Clara, CA)提供并設(shè)計(jì)的陽性和陰性(原核基因和人工序列)摻入對照衡量數(shù)據(jù)的分散。該報(bào)告用于確定數(shù)據(jù)分布、均勻性、背景、重現(xiàn)性、靈敏度和數(shù)據(jù)的一般質(zhì)量。將包含所有原始數(shù)據(jù)的TXT文件上傳到GeneSpring(Agilent, Santa Clara, CA)進(jìn)行分析。
F.數(shù)據(jù)上傳、標(biāo)準(zhǔn)化、過濾和統(tǒng)計(jì)分析
掃描和特征提取后，將原始數(shù)據(jù)文件上傳到GeneSpring GX版本
10.O. 2 (Agilent, Santa Clara, CA)并創(chuàng)建將各陣列數(shù)據(jù)文件定義為樣本并分配合適的參數(shù)值的項(xiàng)目。將具有相同參數(shù)值的樣品視為重復(fù)。創(chuàng)建解釋以指定樣品如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件分組并用于顯現(xiàn)檢測和分析數(shù)據(jù)。在開始分析前進(jìn)行基于摻入對照的樣品質(zhì)量控制以確保數(shù)據(jù)的質(zhì)量。生成一份報(bào)告。
使用全局百分轉(zhuǎn)變標(biāo)準(zhǔn)化方法標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)以盡量減少系統(tǒng)性的非生物學(xué)差異并標(biāo)準(zhǔn)化陣列以進(jìn)行交叉比較。然后基于標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)中的20%和100%之間的表達(dá)水平過濾數(shù)據(jù)并限制到進(jìn)行研究的每個(gè)樣品中在截止值內(nèi)具有顯著的值。通過選擇進(jìn)行研究的每一單獨(dú)樣品中標(biāo)記為存在的實(shí)體并去除標(biāo)記為臨界或缺失的實(shí)體進(jìn)行另一組過濾。
使用此最終的實(shí)體列表(陣列中表示的基因)作為輸入，以校正的P值P彡O. 05和O. 05的Benjamin-Hochberg多重測試校正FDR使用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。然后由一個(gè)特定的變化倍數(shù)過濾顯著實(shí)體的最終列表，并用于數(shù)據(jù)解釋。圖2圖例顯示了實(shí)施例8-10每一種條件顯著表達(dá)的基因的比較，和這些條件中任一種表達(dá)的特有基因的數(shù)目。
實(shí)施例8 :擬南芥中I-甲基環(huán)丙烯誘導(dǎo)的基因表達(dá)
以I-甲基環(huán)丙烯(I-MCP)處理擬南芥導(dǎo)致微陣列上411個(gè)基因的差異表達(dá)(彡5 倍變化)。從這些基因中，進(jìn)一步分析了 I-MCP處理特有的202個(gè)基因的子集。在此分析中，我們集中于注釋基因并尋找基因的相關(guān)功能組內(nèi)的變化/趨勢。這些基因的表達(dá)及假定的功能如表3所示。如特有的MCP基因集合中反映的I-MCP處理似乎導(dǎo)致脅迫相關(guān)基因表達(dá)的減少，以及一組已知為乙烯-誘導(dǎo)的基因，例如，I3DFl. 2、幾丁質(zhì)酶、ACS2、SAG13表達(dá)的降低。雖然使用的微陣列芯片中代表的幾丁質(zhì)酶基因是否類似地受到調(diào)節(jié)是未知的，注意到α -幾丁質(zhì)酶是乙烯誘導(dǎo)型的。此外，乙烯調(diào)節(jié)往往參與的一組ABA調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)降低表明它們可能確實(shí)代表表達(dá)上真實(shí)減少。在脅迫條件過程中經(jīng)常誘導(dǎo)基因，例如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶或硫氧還蛋白相關(guān)蛋白，而且觀察到的這些基因表達(dá)的減少與脅迫降低的水平是一致的。此外，編碼表達(dá)受到特定脅迫(例如通用應(yīng)激蛋白)誘導(dǎo)的蛋白的基因的表達(dá)降低表明脅迫降低。這在玉米微陣列實(shí)驗(yàn)中也觀察到。受傷抑制的ACS5表達(dá)的增加也與脅迫減少是一致的。催化茉莉酸生物合成第一步的丙二烯-氧化物環(huán)化酶(A0C3)的表達(dá)降低，表明在脅迫水平上可能的減少。類似地，在玉米微陣列實(shí)驗(yàn)中，參與茉莉酸生物合成，通常被認(rèn)為是脅迫相關(guān)的激素的丙二烯氧化物合酶的表達(dá)降低。這表明在脅迫水平上可能的減少。乙烯誘導(dǎo)丙二烯氧化物合酶的表達(dá)。一種F-box家族蛋白的表達(dá)降低和一些F-box蛋白受到乙烯的下調(diào)，例如那些調(diào)節(jié)性EIN3。幾個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)降低，已知一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子是受到乙烯誘導(dǎo)的，其他的由乙烯抑制。2種含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的表達(dá)降低。乙烯應(yīng)答因子(ERFS)，其中幾種受乙烯誘導(dǎo)，是乙烯應(yīng)答因子/apetala2家族成員。其他基因的表達(dá)，即含甲硫氨酸亞砜還原酶結(jié)構(gòu)域的蛋白、S-腺苷甲硫氨酸-依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶/甲基轉(zhuǎn)移酶MAPKKK19、ATP結(jié)合/激酶/蛋白激酶/蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、蛋白激酶家族蛋白、備選氧化酶、過氧化物酶和MYB蛋白，顯示某種模式，但不知道它們是否是受乙烯調(diào)節(jié)的。接著后面的實(shí)施例10的表3列出了響應(yīng)于單獨(dú)的I-MCP差異表達(dá)的提供信息的擬南芥基因。數(shù)據(jù)表明，總體而言，I-MCP處理導(dǎo)致脅迫相關(guān)基因的表達(dá)的降低。
實(shí)施例9 :擬南芥中COMPASS殺真菌劑誘導(dǎo)的基因表達(dá)
以COMPASS甲氧基丙烯酸酯殺真菌劑處理擬南芥導(dǎo)致了微陣列上278個(gè)基因的差異表達(dá)(> 5倍變化)。其中，一個(gè)80個(gè)基因的子集是COMPASS處理特有的?？梢苑纸M以提供對COMPASS處理作用的了解的注釋的基因如表4中所示。80個(gè)COMPASS單獨(dú)處理特有的基因的分析揭示了基因表達(dá)的一些模式，包括營養(yǎng)貯藏蛋白、茉莉酸-Zim-結(jié)構(gòu)域蛋白、腈特異性蛋白(Nitrile Specifier Protein)、α -淀粉酶、O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族2蛋白、轉(zhuǎn)移酶家族蛋白、作為JA誘導(dǎo)的傷口響應(yīng)基因的JR1、核苷磷酸酶家族蛋白、棕櫚酰蛋白硫酯酶家族蛋白、半胱氨酸蛋白酶、NAI2的降低。但是，不知道它們是否是受乙烯調(diào)節(jié)的。在其它注釋的基因中，沒有觀察到影響共同通路的基因組而因此無法確定趨勢，因此，基于這些的結(jié)論將是高度不確定的。在這種處理中，我們觀察到很少數(shù)的差異表達(dá)的基因。COMPASS甲氧基丙烯酸酯殺真菌劑在處理后可能需要超過2個(gè)小時(shí)以在基因表達(dá)水平上產(chǎn)生顯著的變化。
單獨(dú)用I-MCP或COMPASS處理后有165個(gè)共同的基因的事實(shí)表明，在兩種處理之間有比甲氧基丙烯酸酯單獨(dú)處理特有的基因更多的共同的基因，這表明甲氧基丙烯酸酯處理可能改變與I-MCP處理的相同的基因的子集。每種處理共同的提供信息的基因如表5所示，接著后面的實(shí)施例10。多編碼過氧化物酶基因表達(dá)的降低表明在控制細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的脅迫應(yīng)答上的減少。GST表達(dá)的降低與此一致。WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的降低與I-MCP處理看到的是相似的。對基因集合的其他分析揭示了基因表達(dá)的一些模式，包括晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白、β -葡糖苷酶/銅離子結(jié)合/巖藻糖苷酶/水解酶、水解O-糖基化合物、營養(yǎng)貯藏蛋白、富含羥脯氨酸糖蛋白家族蛋白、jacalin凝集素家族蛋白、脂肪酸還原酶的降低。但是，不知道它們是否是受乙烯調(diào)節(jié)的。
接著后面的實(shí)施例10的表4列出了響應(yīng)于單獨(dú)的COMPASS差異表達(dá)的提供信息的擬南芥基因。下表5列出了單獨(dú)I-MCP或COMPASS處理共同的提供信息的擬南芥基因。
實(shí)施例10 :擬南芥中I-MCP和Compass殺真菌劑的組合誘導(dǎo)的基因表達(dá)
以I-甲基環(huán)丙烯和COMPASS甲氧基丙烯酸酯殺真菌劑的組合處理擬南芥導(dǎo)致微陣列上93個(gè)基因的差異表達(dá)(> 5倍變化)。從這些基因中，進(jìn)一步分析了組合處理特有的44個(gè)基因的子集。在此分析中，我們集中于注釋基因并尋找基因的相關(guān)功能組內(nèi)的變化/趨勢。圖2顯示了條件比較的圖形結(jié)果。
這些注釋的基因的表達(dá)及假定的功能如表6所示。雖然代表I-MCP和甲氧基丙烯酸酯組合處理改變的特有基因的基因集合是很小的，44個(gè)基因，但觀察到基因表達(dá)上的一些模式，包括乙烯應(yīng)答元件結(jié)合家族蛋白(ERFs)和含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子(屬于ERF/AP2轉(zhuǎn)錄因子超家族)的增加。該數(shù)據(jù)表明，可能已經(jīng)發(fā)生了脅迫信號上的增加。疾病抗性蛋白和C-重復(fù)序列結(jié)合因子，其是一種DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(注意CBF2阻遏應(yīng)激激素乙烯誘導(dǎo)的葉衰老)的表達(dá)增加表明應(yīng)激信號傳導(dǎo)的改變。另一種乙烯應(yīng)答性因子，發(fā)病相關(guān)的基因，AGD2樣防御應(yīng)答蛋白I和幾種熱休克蛋白的表達(dá)降低表明在應(yīng)激應(yīng)答上可能的降低。因此，在擬南芥中，這兩種化合物不是如玉米中的結(jié)果那樣拮抗地發(fā)揮作用。此數(shù)據(jù)為對于在這些實(shí)施例中測試的兩種化合物的物種和/或單子葉植物/雙子葉植物特異性應(yīng)答提供了證據(jù)。下表6列出了響應(yīng)于I-MCP和COMPASS殺真菌劑組合差異表達(dá)的提供信息的擬南芥基因。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定選擇性地改變植物細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括 比較 來自與第一測試化合物接觸的植物細(xì)胞或組織的第一表達(dá)譜， 來自與另外的測試化合物接觸的相同植物細(xì)胞或組織的另外的表達(dá)譜，和來自與所述第一測試化合物和所述另外的測試化合物接觸的相同植物細(xì)胞或組織的組合化合物表達(dá)譜， 其中將各植物細(xì)胞或組織接觸足以在所述植物的細(xì)胞或組織中的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)上產(chǎn)生改變的時(shí)間；并且其中每種表達(dá)譜包含所述植物細(xì)胞或組織的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或模式；和 鑒定組合化合物譜的基因或基因產(chǎn)物與所述第一譜和另外的譜的加合改變的基因或基因產(chǎn)物之間在表達(dá)水平或模式上顯著的、意想不到的改變。
2.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟 將來自相同植物的植物細(xì)胞或組織與下述之一接觸 i.第一測試化合物； .另外的測試化合物；或 iii.所述第一測試化合物和所述另外的測試化合物的組合；和產(chǎn)生 iv.來自與(i)接觸的植物細(xì)胞或組織的第一表達(dá)譜； v.來自與(ii)接觸的植物細(xì)胞或組織的另外的表達(dá)譜；和 vi.來自(iii)的植物細(xì)胞或組織的組合化合物表達(dá)譜。
3.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中組合化合物譜中經(jīng)接觸的植物細(xì)胞的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)相對于所述第一譜和所述另外的譜的加合改變的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的改變與所述化合物組合導(dǎo)致的對植物細(xì)胞的選擇的作用相關(guān)。
4.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中在比較步驟前從每種譜減去來自未與任何所述第一或另外的測試化合物接觸的相同植物的細(xì)胞或組織的野生型基因或基因產(chǎn)物表達(dá)譜。
5.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中表達(dá)譜的改變作為平均值(mean)或均值(average)、數(shù)值平均值或數(shù)值平均值的范圍、數(shù)值模式、圖形模式或表達(dá)譜的形式表示。
6.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述改變選自下組 在組合化合物譜中相同的選擇的基因或基因產(chǎn)物與第一譜和另外的譜中相同基因或基因廣物的加合表達(dá)相比的上調(diào)；和 在組合化合物譜中相同的選擇的基因或基因產(chǎn)物與第一譜和另外的譜中相同基因或基因廣物的加合表達(dá)相比的下調(diào)；和 在組合化合物譜中一種或多種選擇的基因或基因產(chǎn)物的特性或表達(dá)的改變，所述選擇的基因或基因產(chǎn)物在由第一譜和另外的譜的加合改變產(chǎn)生的譜中是未改變的。
7.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述第一化合物對植物具有已知的作用而其中所述另外的化合物對植物具有未知的作用。
8.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中每種表達(dá)譜包含由植物的完整基因組編碼的基因或基因產(chǎn)物的子集。
9.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物是植物蛋白。
10.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其進(jìn)一步包括鑒定作為基因產(chǎn)物改變的結(jié)果的植物代謝物中的相應(yīng)改變。
11.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中化合物的組合具有協(xié)同作用，其是在組合化合物譜中植物的基因或基因產(chǎn)物在表達(dá)模式或水平上的改變與由所述第一和另外的表達(dá)譜在模式或水平上的加合改變產(chǎn)生的相比更大。
12.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中化合物的組合具有拮抗作用，其是在組合化合物譜中基因或基因產(chǎn)物在表達(dá)模式或水平上的改變幅度與由所述第一和另外的譜的加合改變的表達(dá)模式或水平產(chǎn)生的相比減少。
13.依照權(quán)利要求
11所述的方法，其中在組合表達(dá)譜中表達(dá)模式或水平上的改變是在形成所述第一和另外的譜的加合改變的模式的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)上至少2倍的改變。
14.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中基因或基因產(chǎn)物表達(dá)譜的選擇的改變是處于選自下組的狀態(tài)的植物典型的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)模式增加的乙烯敏感性，降低的乙烯敏感性，提高的成熟，對脅迫、熱、種群密度或鹽度增加的抗性，對脅迫、熱、種群密度或鹽度降低的抗性，增加的病原體抗性，降低的病原體抗性，增加的開花，增加的氮效率，增加的除草劑抗性，增加的光合活性和增加的產(chǎn)量。
15.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述另外的化合物包括兩種或更多種另外的化合物。
16.依照權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自選自下組的植物稻、玉米、小麥、大麥、高粱、小米、柳枝稷、芒草、禾本科植物、燕麥、番茄、馬鈴薯、香蕉、獼猴桃、鱷梨、甜瓜、芒果、甘蔗、甜菜、煙草、木瓜、桃、草莓、懸鉤子、黑莓、藍(lán)莓、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、洋蔥、西蘭花、抱子甘藍(lán)、棉花、雙低菜、葡萄、大豆、油菜、蘆筍、豆類、胡蘿卜、黃瓜、茄子、瓜類、秋葵、歐防風(fēng)、花生、椒類、菠蘿、倭瓜、甘薯、黑麥、羅馬甜瓜、豌豆、南瓜、向日葵、菠菜、蘋果、櫻桃、酸果蔓、葡萄柚、檸檬、酸橙、油桃、橙、桃、梨、橘柚、柑橘、百合、麝香石竹、菊、矮牽牛、薔薇、天竺葵、堇菜、唐菖蒲、蘭、丁香、海棠、楓香樹、槭樹、一品紅、刺槐、涔、楊、椴樹和擬南芥。
17.一種用于鑒定選擇性地改變植物細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的協(xié)同化合物的方法，所述方法包括 (a)比較 i.來自與第一測試化合物接觸的植物細(xì)胞或組織的第一表達(dá)譜； .來自與另外的測試化合物接觸的相同植物細(xì)胞或組織的另外的表達(dá)譜，和 iii.來自與所述第一測試化合物和所述另外的測試化合物接觸的相同植物細(xì)胞或組織的組合表達(dá)譜， 其中將各植物細(xì)胞或組織接觸足以在所述植物的細(xì)胞或組織中的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)上產(chǎn)生改變的時(shí)間；并且其中每種表達(dá)譜包含所述植物細(xì)胞或組織的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或模式；和 (b)鑒定組合化合物譜(a)(iii)的基因和基因產(chǎn)物與第一譜(a) (i)和另外的譜(a)( )的組合的基因和基因產(chǎn)物之間在表達(dá)水平或模式上顯著的、意想不到的改變。
18.依照權(quán)利要求
1-17任一項(xiàng)所述的方法，其中通過生成數(shù)值或圖形數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)處理器或計(jì)算機(jī)程控設(shè)備進(jìn)行比較。
專利摘要
一種用于鑒定選擇性地改變植物細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的化合物的方法，所述方法包括將來自與第一測試化合物接觸的植物細(xì)胞或組織的第一表達(dá)譜，來自與另外的測試化合物接觸的相同植物細(xì)胞或組織的另外的表達(dá)譜，和來自與所述第一測試化合物和另外的測試化合物接觸的相同植物細(xì)胞或組織的組合化合物表達(dá)譜進(jìn)行比較，其中將各植物細(xì)胞或組織接觸足以在所述植物的細(xì)胞或組織中的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)上產(chǎn)生改變的時(shí)間；并且其中每種表達(dá)譜包含所述植物細(xì)胞或組織的至少一種基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或模式；和鑒定組合化合物譜的基因或基因產(chǎn)物與第一譜和另外的譜的加合改變的基因或基因產(chǎn)物之間在表達(dá)水平或模式上顯著的、意想不到的改變。
文檔編號C12Q1/68GKCN102918394SQ201180026430
公開日2013年2月6日 申請日期2011年5月26日
發(fā)明者J.F.福布斯, J.L.羅西錢, D.O.岡薩雷斯 申請人:羅姆及哈斯公司, 陶氏益農(nóng)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan