專利名稱:一種利用物理磨損afm探針操縱dna分子的方法及其探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微納機(jī)械傳感器領(lǐng)域，特別涉及一種物理磨損原子力顯微鏡(AFM)探針探測或操縱DNA分子的方法及其探針。
背景技術(shù)：
DNA，幾乎是所有生命的遺傳物質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)生物學(xué)的宏觀體系的研究，避免信息的平均化，對單個(gè)DNA分子攜帶的遺傳信息的分析日益受到科學(xué)界的重視。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，首先需要先將單個(gè)DNA分子分離出來。
原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope, AFM)在掃描DNA樣品的過程中，探針與DNA之間存在相互作用，因此通過控制探針施加給樣品表面的作用力，能夠?qū)崿F(xiàn)對DNA分子的精確操縱。
2002年,AFM輕敲模式下的negative lift被引入到DNA分子納米操縱中，胡鈞老師等利用此種方法對DNA分子推拉和卷曲，實(shí)現(xiàn)了以DNA寫“DNA”。
這種可視化拾取DNA的納米操縱方法對DNA測序和基因組DNA的單倍體型分析具有重大意義。然而，由于AFM探針和納米顆粒的相互作用十分復(fù)雜，用AFM納米操縱技術(shù)拾取DNA的效率仍十分低下。
有文獻(xiàn)報(bào)道(Modificationof AFM tips for Facilitating Picking-up ofNanoparticles. Chinese Physics Letters. 2008 ；25 :2407) 3_ 氨丙基三乙氧基娃燒((3_aminopropyl)-triethoxysilane, APTES)修飾探針表面和在APTES修飾的云母表面物理磨損探針能提高金納米顆粒的拾取效率。然而到目前為止，沒有任何關(guān)于基于AFM納米操縱技術(shù)提高DNA拾取效率的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的AFM納米操縱技術(shù)拾取DNA的效率十分低下的缺陷，提供一種AFM探測或操縱DNA分子的方法，該方法拾取DNA的效率高。本發(fā)明同時(shí)提供該方法中所用的AFM探針及其制備方法。
本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究和廣泛試驗(yàn)，驚喜地發(fā)現(xiàn)AFM納米操縱過程中，探針對DNA分子拾取率低的原因之一是所用的探針針尖過于尖細(xì)，和DNA分子的作用面積太小。tip (探針)/DNA/substrate (襯底)三者之間的相互作用力是極為敏感的，若探針不經(jīng)過物理磨損，很多情況下只能將DNA卷曲成球形，但球形DNA只能隨著探針的移動而移動，而無法吸附在探針上(如圖I所示)，導(dǎo)致即使在襯底適合拾取的情況下，不合適的探針也會降低DNA拾取效率。因此，本發(fā)明人通過物理磨損的方式來制備AFM探針，并利用該探針進(jìn)行DNA分子的探測或操縱，發(fā)現(xiàn)大大提高了探針對DNA分子的拾取率，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下
本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是一種AFM探測或操縱DNA分子的方法，包括采用物理磨損的探針拾取DNA分子。[0011]其中所述的物理磨損探針是指針尖經(jīng)過了物理磨損，具有一定的曲度的探針。所述的物理磨損探針的曲率半徑較佳的是40 200nm。
其中所述的物理磨損探針可以是采用各種物理方式磨損針尖而得的，較佳地是在各種襯底表面對探針的針尖進(jìn)行機(jī)械磨損；所述的表面更佳地是APTES修飾的云母或者是裸云母的表面，最佳地是在裸云母表面進(jìn)行物理磨損。
本發(fā)明中，對探針的物理磨損的方法較佳地包括以下步驟在裸云母襯底表面進(jìn)行AFM輕敲模式中的抬高模式(lift mode)成像，掃描范圍300X300nm 800nmX800nm,抬高掃描(lift scan)高度-50 -lOOnm，掃描速率9 30Hz。溫度22°C，相對濕度40%，其中，更佳地掃描范圍是500nmX500nm，抬高掃描高度是-60nm，掃描速率是18Hz。掃描角度較佳地分別是0° ,45°和90°，較佳地掃描時(shí)間各為I分鐘。
本發(fā)明所述探針較佳地包括非接觸/輕敲模式探針、接觸模式探針、導(dǎo)電探針、磁性探針、大長徑比探針、硅探針、和類金剛石碳AFM探針/全金剛石探針中的一種或幾種，本發(fā)明所述探針更佳地是AFM探針，所述探針最佳地是彈性系數(shù)48Nm-l，共振頻率330kHz的 硅懸臂 NSC-Il 型 AFM 探針(Mikro Masch)。
本發(fā)明所述DNA分子的替代物較佳地包括蛋白質(zhì)和碳?xì)浠衔锏取?br>本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是一種AFM探針的制備方法，其中包括將AFM探針在裸云母表面物理磨損的步驟。
本發(fā)明中，所述的AFM探針的制備方法較佳地包括以下步驟在裸云母襯底表面進(jìn)行AFM輕敲模式中的抬高模式成像,掃描范圍300X300nm 800nmX800nm,抬高掃描高度-50 -lOOnm，掃描速率9 30Hz。溫度22°C，相對濕度40%，其中更佳地掃描范圍是500nmX500nm，抬高掃描高度是-60nm，掃描速率是18Hz。較佳地掃描角度分別是0° ,45°和90° ,掃描時(shí)間各為I分鐘。
本發(fā)明所述的探針是針尖經(jīng)過了物理磨損，曲率半徑增加的探針。所述的探針的曲率半徑較佳地是40 200nm。
本發(fā)明所述探針種類較佳地包括非接觸/輕敲模式探針、接觸模式探針、硅探針、導(dǎo)電探針、磁性探針、大長徑比探針和類金剛石碳AFM探針/全金剛石探針中的一種或幾種。本發(fā)明所述探針更佳地AFM探針，所述AFM探針最佳地是彈性系數(shù)48Nm-l，共振頻率330kHz 的硅懸臂 NSC-Il 型 AFM 探針(MikroMasch)。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三是通過上述方法制備得到的AFM探針。
本發(fā)明所述探針較佳地包括非接觸/輕敲模式探針、接觸模式探針、導(dǎo)電探針、磁性探針、硅探針、大長徑比探針和類金剛石碳AFM探針/全金剛石探針中的一種或幾種，本發(fā)明所述探針更佳地是AFM探針，所述AFM探針最佳地是彈性系數(shù)為48Nm-l，共振頻率為330kH 的硅懸臂 NSC-Il 型 AFM 探針(Mikro Masch)。
本發(fā)明所述方法可以廣泛應(yīng)用到納米加工與操縱技術(shù)，可針對各種生物大分子包括核酸分子，蛋白質(zhì)分子和碳?xì)浠衔锓肿拥?，通過改變作用力而進(jìn)行微小結(jié)構(gòu)加工或探測，本發(fā)明更佳地可針對DNA分子進(jìn)行分選，切割，搬運(yùn)等操作。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)在裸云母襯底表面磨損探針可增加探針與DNA分子的接觸面積，從而增加兩者之間的相互作用力，達(dá)到提高DNA拾取效率的目的。與在APTES修飾的云母表面磨損探針的方法以及未經(jīng)物理磨損探針比較，本發(fā)明制備探針表面極少吸附其它物質(zhì)，不影響DNA分子的拾取，同時(shí)增加了探針的曲率半徑，提高了 DNA分子的拾取效率。


以下結(jié)合
本發(fā)明的特征和有益效果。
圖I是未經(jīng)物理磨損的探針操縱DNA的AFM圖像
a)納米操縱前；b)目標(biāo)DNA被卷曲成球形；c)球形DNA隨著探針的移動而移動，無法吸附在探針上高度標(biāo)尺(Height scale) :3nm。
圖2是AFM探針物理磨損后的襯底的AFM圖像
a)裸云母表面不同角度磨損探針后圖像；b)APTES修飾的云母表面不同角度磨損探針后圖像高度標(biāo)尺(Height scale) :50nm。·
圖3是AFM探針的掃描電鏡(LEO，1530VP)圖像
a)未經(jīng)磨損的探針；b)在裸云母表面磨損的探針；c)在APTES修飾的云母表面磨損的探針。
圖4是APTES修飾的云母表面磨損探針的DNA拾取的AFM圖像
a)納米操縱前；b)納米操縱過程中，污染物從探針表面掉落到襯底表面，影響DNA拾取高度標(biāo)尺(Height scale) :3nm。
圖5是在裸云母表面磨損探針的DNA拾取的AFM圖像
a)納米操縱前；b)目標(biāo)DNA被卷曲成球型；c)卷成球型的DNA分子被成功拾取高度標(biāo)尺(Height scale) :3nm。
圖6是在APTES修飾的云母表面磨損探針同在裸云母表面磨損的探針拾取DNA得到干凈圖像的概率圖。
圖7是未經(jīng)物理磨損的探針同在裸云母表面磨損的探針DNA拾取效率圖。
具體實(shí)施方式
下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列效果實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)驗(yàn)溫度22°C，相對濕度40%。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
所用原料的來源和設(shè)備的名稱規(guī)格為
原子力顯微鏡(AFM)Multimode AFM(Nanoscope V, Veeco/DigitalInstruments, Santa Barbara, CA)；
AFM探針彈性系數(shù)48N m_l，共振頻率330kHz的硅懸臂NSC-Il型AFM探針(MikroMasch)；
Taq DNA 聚合酶Ex Taq DNA polymerase Hotstart (TaKaRa Bio)；
pBR322 質(zhì)粒(TaKaRa Bio. Inc.，Dalian, China)；
APTES (3-氣丙基二乙氧基娃燒)(Sigma)。
實(shí)施例I將經(jīng)過物理磨損的AFM探針應(yīng)用于DNA分子的探測和操縱
I. I對AFM探針進(jìn)行物理磨損
在兩種不同襯底表面APTES修飾的云母、裸云母對探針進(jìn)行物理磨損，物理磨損步驟為在裸云母和APTES修飾的云母表面分別進(jìn)行AFM輕敲模式lift mode,掃描范圍500nmX500nm, lift scan高度_60nm，掃描速率18Hz，分別O。、45。、90。掃描，掃描時(shí)間各為I分鐘。
在裸云母上磨損和在APTES修飾的云母上磨損，都對襯底造成了很大的損傷，坑洞深度為3nm-20nm，周圍也均被蹭起了碎片，如圖2所示，這些碎片可能來自于襯底的，也可能來自于探針。通過對比可得，兩種襯底的物理磨損并沒有很大差別。
隨后，將經(jīng)過物理磨損后的AFM探針用掃描電子顯微鏡(scanning electronmicroscope, SEM)進(jìn)行高分辨率觀測，如圖3所示。由此可知無論是在裸云母上還是在APTES修飾的云母上，經(jīng)過物理磨損的AFM探針的曲率半徑增加到了 40 200nm，同時(shí)也可看到在裸云母上磨損的探針尖端非常干凈，而在APTES修飾的云母表面上磨損的探針尖端有不知名的物質(zhì)存在，恰恰是這點(diǎn)導(dǎo)致了 DNA納米操縱結(jié)果的顯著差別。
I. 2將經(jīng)過物理磨損過的探針用于DNA分子的拾取。
拾取過程具體步驟為首先需要對樣品進(jìn)行“探底”，所謂“探底”就是在目標(biāo)DNA附近選擇小范圍區(qū)域100X IOOnm IOOOnmX IOOOnm關(guān)閉慢掃描(即停止Y方向掃描，使探針始終掃描同一條掃描線)；然后逐漸增加負(fù)抬高的高度，降低掃描管，從而增加針尖對DNA分子的作用力。與此同時(shí)，仔細(xì)觀察該位置掃描線信號的變化，當(dāng)發(fā)現(xiàn)抬高振幅曲線不再起伏時(shí)，便是探測到襯底表面。具體拾取過程和步驟可參照文獻(xiàn)(ArtificialDNA patterns by mechanical nanomanipulation.Nano Letters.2002 ；2 :55-7 ；Positioning isolation and biochemical analysis of single DNA molecules basedon nanomanipulation and single-molecule PCR. Journal of the American ChemicalSociety. 2004 ;126 :11136-7 ;Single_base resolution and long-coverage sequencingbased on single-molecule nanomanipulation. Nanotechnology. 2007 ;18.)。
DNA 樣品的制備過程首先，體積比 0. 5% 的 APTES (3-aminopropyl-triethoxysilane)溶液修飾云母襯底4min，溫度20 25°C，相對濕度40 60% ,MilliQ水沖洗。120°C烘烤3小時(shí)，置于干燥器中備用。
569bp DNA 擴(kuò)增模板是質(zhì)粒 pBR322 (TaKaRa Bio. Inc.，Dalian, China)擴(kuò)增569bpDNA片段引物(該片段序列在質(zhì)粒PBR322上的位置3632th 4200th)
Ex-p1:5，-GTCGTTTGGTATGGCTTCA-3，，
Ex-p2 :5’ -GACAATAACCCTGATAAATGCT-3’，
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
569bp DNA PCR 擴(kuò)增程序
95°C預(yù)變性 5min ;95°C、30s 變性，58°C、30s 退火，72°C、30s 延伸共 35 循環(huán)；72°C、IOmin延伸。
聚合酶為Ex Taq DNA polymerase Hotstart (TaKaRa Bio),隨后將 PCR 產(chǎn)物純化并保存在TE緩沖液中。PCR產(chǎn)物經(jīng)純水稀釋，通過“分子梳”方法將DNA分子固定在襯底表面。本發(fā)明所述分子梳技術(shù)是一種有效的拉伸DNA分子的手段，它利用流體流動過程中施加的力將DNA分子拉伸開并且平鋪在固體表面上。具體操作步驟是首先滴一滴約2iU的DNA溶液于APTES修飾的云母表面，接著用一潔凈的蓋玻片一邊45°角輕輕靠近液滴，并拉動蓋玻片，使得DNA分子隨著液滴的流動平鋪在襯底表面。[0059]接下來選定輕敲模式對DNA樣品表面成像，選定目標(biāo)DNA進(jìn)行納米操縱拾取。首先將掃描范圍縮小至250nmX 250nm,打開慢掃描，根據(jù)“探底”測得的數(shù)值對于此種探針來說，一般為-9 _20nm，適當(dāng)下降0 3nm，然后從上到下或從下到上掃描目標(biāo)DNA，將DNA卷曲成球形。最后放大掃描范圍，觀察目標(biāo)DNA是否被成功拾取。
實(shí)驗(yàn)表明，在不同襯底上磨損的探針對于DNA拾取的影響是不同的。
在APTES修飾的云母表面磨損的探針在納米操縱過程中，容易從探針上掉落東西到襯底表面上，如圖4所示，影響拾取的進(jìn)行。這可能是因?yàn)樵谖锢砟p時(shí)，探針和襯底表面的相互作用力很大，破壞了云母表面的APTES層，使得吸附在云母表面的APTES轉(zhuǎn)而吸附在探針上，可能云母碎片也吸附在探針上，就如SEM圖3c所示。用黏附了其他物質(zhì)的探針去拾取DNA就會不可避免的掉落物質(zhì)，也就無法拾取DNA。
再用裸云母表面磨損探針進(jìn)行DNA拾取，DNA既被卷曲成球形，又被成功地從襯底上拾取起來，而且保持了樣品的表面干凈，如圖5所示。大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明21個(gè)在APTES修飾的云母表面磨損的探針中，有16個(gè)探針在操縱過程中在襯底上掉落東西，使得DNA無法拾取。相反地，41個(gè)在裸云母上磨損的探針中，35個(gè)探針可以得到干凈的圖像，如圖6所示。這個(gè)結(jié)果表明，AFM探針在裸云母上進(jìn)行物理磨損比在APTES修飾的云母上更適合做DNA的納米操縱。
比起未經(jīng)過磨損的探針，在裸云母上磨損的探針的DNA拾取效率大大提高，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)揭示83%在裸云母上磨損的探針(33 of 40 tips)可成功拾取DNA，同時(shí)未經(jīng)磨損的探針的DNA拾取成功率僅為45% (9 of 20tips)，如圖7所示。
發(fā)明人基于大量實(shí)驗(yàn)的摸索發(fā)現(xiàn)，在裸云母表面對探針進(jìn)行物理磨損不僅可保持襯底表面的潔凈，還可增加探針與DNA分子的接觸面積，從而增加兩者之間的相互作用力，達(dá)到提高DNA拾取效率的目的。拾取的DNA可進(jìn)一步應(yīng)用于各種遺傳信息分析、進(jìn)行低拷貝PCR擴(kuò)增應(yīng)用于基因測序或基因操縱等技術(shù)中。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種AFM探測或操縱DNA分子的方法，其特征在于，包括采用物理磨損的探針拾取DNA分子。
2.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的物理磨損探針的曲率半徑是40 200nm。
3.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的物理磨損探針是在裸云母表面物理磨損的探針。
4.如權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于，所述的物理磨損的方法包括以下步驟在裸云母襯底表面進(jìn)行AFM輕敲模式中的抬高模式成像，掃描范圍是300nmX300nm 800nmX800nm，抬高掃描高度是-50 -lOOnm，掃描速率是9 30Hz，所述的掃描角度分別為O。、45°和90°，掃描時(shí)間各為I分鐘。
5.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述的探針選自非接觸/輕敲模式探針、接觸模式探針、導(dǎo)電探針、磁性探針、大長徑比探針、硅探針、和類金剛石碳AFM探針/全金剛石探針中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述DNA分子被蛋白質(zhì)或碳?xì)浠衔锾娲?br>7.—種AFM探針的制備方法，其特征在于，包括將AFM探針在裸云母表面物理磨損。
8.如權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，所述的物理磨損的方法包括以下步驟；在裸云母襯底表面進(jìn)行AFM輕敲模式中的抬高模式成像，掃描范圍是300nmX300nm 800nmX800nm，抬高掃描高度是-50 -lOOnm，掃描速率是9 30Hz，所述的掃描角度分別為O。、45°和90°，掃描時(shí)間各為I分鐘。
9.如權(quán)利要求
8所述的方法，其特征在于，所述的探針選自非接觸/輕敲模式探針、接觸模式探針、導(dǎo)電探針、磁性探針、大長徑比探針、硅探針、和類金剛石碳AFM探針/全金剛石探針中的一種或幾種。
10.一種如權(quán)利要求
7 9任一項(xiàng)所述方法制備的AFM探針。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種AFM探測或操縱DNA分子的方法，其中包括采用物理磨損的探針拾取DNA分子；本發(fā)明還公開了所述AFM探針及其制備方法。本發(fā)明公開的物理磨損的方法包括以下步驟在裸云母襯底表面進(jìn)行AFM輕敲模式中的抬高模式成像，通過該方法物理磨損后的AFM探針的曲率半徑增加。本發(fā)明所述的AFM探針曲率半徑增加后，表面極少吸附其它物質(zhì)，在保證襯底和探針潔凈的同時(shí)大大提高了DNA分子的拾取效率。
文檔編號G01Q60/38GKCN102798736SQ201210112726
公開日2012年11月28日 申請日期2012年4月17日
發(fā)明者段娜, 張益 , 胡鈞 申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan