專利名稱:探針復(fù)合物的制作方法
本發(fā)明涉及制造探針復(fù)合物的技術(shù)，該探針復(fù)合物中，探針和檢測標(biāo)記如半抗原或低分子量肽通過中介物連接到載體。如此制得的探針復(fù)合物可廣泛用于采用免疫反應(yīng)的免疫測量，包括酶免疫測定和免疫組織化學(xué)。
免疫組織化學(xué)法和免疫測定法已經(jīng)被用作一種利用抗原和抗體之間的免疫反應(yīng)檢測生物中的自身抗原或外源抗原的方法。這些方法的高特異性和靈敏度使其可能檢測生物中的少量物質(zhì)而無需分離這些物質(zhì)。
免疫組織化學(xué)法是通過抗原和抗體之間的特異性反應(yīng)來檢測抗原在細(xì)胞和組織內(nèi)的定位的方法。廣泛采用的免疫組織化學(xué)ABC法是按照以下步驟進(jìn)行的。從冷凍組織或石蠟固定組織制作組織切片。用牛血清白蛋白等將它們封閉以防止非特異性結(jié)合。使其與結(jié)合感興趣抗原的生物素化抗體反應(yīng)以形成抗原和生物素化抗體之間的復(fù)合物。在免疫復(fù)合物中加入抗生物素蛋白偶聯(lián)的酶如辣根過氧化物酶(HRP)以形成生物素-抗生物素蛋白酶復(fù)合物，并通過酶的發(fā)色或發(fā)光底物檢測感興趣的抗原?；蛘?，可將包括熒光素的熒光材料或包括吖啶酯的發(fā)光材料加到抗生物素蛋白中以檢測感興趣的抗原。
檢測生物樣品如血清中的抗原的免疫測定方法可按照以下步驟進(jìn)行。將與待測抗原結(jié)合的捕獲抗體固定到固相如微型板上。隨后用牛血清白蛋白等進(jìn)行封閉過程以防止非特異性吸附到抗體和固相。加入含有待測抗原的樣品，使捕獲抗體結(jié)合感興趣的抗原。將探針復(fù)合物加入捕獲的抗原中，該探針復(fù)合物中，探針如識別抗原的抗體和半抗原如生物素連接。這導(dǎo)致在固相如微型板上形成免疫復(fù)合物捕獲抗體-抗原-探針復(fù)合物。免疫復(fù)合物中的生物素與HRP標(biāo)記的抗生物素蛋白偶聯(lián)，加入HRP的發(fā)色或發(fā)光底物以測量感興趣的抗原。
如上所述，免疫組織化學(xué)法和免疫測定法使用含有探針如抗體和與其相連的生物素的探針復(fù)合物。同時(shí)，已經(jīng)開發(fā)的方法中，半抗原如二硝基苯酚(DNP)、洋地黃毒苷(DIG)或FITC可代替生物素連接到抗體以產(chǎn)生探針復(fù)合物，同時(shí)酶被偶聯(lián)到識別這些半抗原以進(jìn)行檢測的抗體上(參見，例如，非專利文獻(xiàn)1)。
已經(jīng)開發(fā)出不使用酶的免疫測定法，其中，通過將熒光底物如熒光素和發(fā)光底物如吖啶酯而非生物素連接到抗體來制造探針復(fù)合物，然后用熒光或發(fā)光進(jìn)行檢測。
這些免疫化學(xué)方法和免疫測定法是高度靈敏和特異的檢測方法。然而，生物中有許多難以通過常規(guī)方法檢測的痕量物質(zhì)。例如，正常個(gè)體的人胃泌素釋放肽前體(proGRP)的血清濃度約為14pg/ml，這說明與在正常人中血清濃度為5-20ng/mL的癌胚抗原(CEA)或甲胎蛋白相比需要約1000倍的靈敏度。作為外源抗原，血液中丙肝病毒(HCV)的病毒水平非常低，正因如此，需要能夠檢測每毫升100-1,000拷貝病毒RNA的靈敏度，表示為蛋白質(zhì)濃度，這約等于每毫升0.03-0.3皮克核心抗原。
嘗試提高免疫組織化學(xué)法和免疫測定法的靈敏度以檢測生物中的痕量物質(zhì)。在可能影響提高免疫組織化學(xué)法和免疫測定法靈敏度的各種因素中，一個(gè)因素是提高連接有探針如上述結(jié)合抗原的抗體和生物素的探針復(fù)合物的功能。例如，增加連接到一種抗體分子的生物素分子的數(shù)目將增加含有結(jié)合到生物素的抗生物素蛋白的分子和結(jié)合抗生物素蛋白的酶的數(shù)量，從而增強(qiáng)發(fā)色或發(fā)光信號以提高靈敏度。
然而，半抗原被直接連接到抗體以制備常規(guī)的包含探針如抗體和與其連接的生物素或半抗原的探針復(fù)合物。例如，一種方法中，抗體中的氨基與引入生物素的NHS酯反應(yīng)以通過共價(jià)結(jié)合連接生物素和抗體。在該方法中，對反應(yīng)條件的研究將增加連接到一種抗體分子的生物素分子的數(shù)量。然而，抗體中所含氨基的數(shù)量和可連接到抗體的生物素的數(shù)量都是有限的。此外，連接于抗體抗原決定簇附近的氨基的生物素可能會由于空間位阻而對抗體與其抗原的結(jié)合造成不良影響。
此外，當(dāng)連接的半抗原是疏水物質(zhì)時(shí)，將通過許多疏水性半抗原與抗體的結(jié)合而增強(qiáng)探針復(fù)合物整體的疏水性。在進(jìn)行免疫組織化學(xué)法和免疫測定法時(shí)，探針復(fù)合物的強(qiáng)疏水性將導(dǎo)致由于疏水鍵造成的復(fù)合物與組織或平板的非特異性結(jié)合，所導(dǎo)致的背景提高阻礙了足夠靈敏度的獲得。
非專利文獻(xiàn)1Harlow E和Lane，D.《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》(AntibodiesLABORATORY MANUAL)(U.S.)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，340-341頁。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種具有確保用于高靈敏度免疫測定的高度操作能力的可溶性高靈敏探針復(fù)合物。
為了解決上述問題，發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)，可通過將親水中介物連接到載體并將檢測標(biāo)記如生物素、半抗原、放射性同位素或低分子量肽和抗體連接到中介物來制造該高靈敏探針復(fù)合物，從而完成了本發(fā)明。通過將親水中介物連接到載體，能連接增加數(shù)量的檢測標(biāo)記，同時(shí)探針復(fù)合物整體變得親水，從而可獲得不誘導(dǎo)非特異性反應(yīng)并具有高度操作能力的探針復(fù)合物。
[圖1]本發(fā)明的探針復(fù)合物的示意圖。
本發(fā)明的探針復(fù)合物是經(jīng)過改進(jìn)以檢測生物內(nèi)源抗原和蛋白質(zhì)的探針復(fù)合物。使用這些探針復(fù)合物能夠通過免疫組織化學(xué)法和免疫測定法測量以前無法測量的抗原和蛋白質(zhì)。
此外，由于中介物的親水性提高了探針復(fù)合物的親水性，因此即便檢測標(biāo)記如半抗原、生物素、放射性同位素和低分子量肽是疏水的，整體疏水性也將降低。因此預(yù)計(jì)免疫反應(yīng)中通過疏水鍵發(fā)生的非特異性反應(yīng)將減少。
在本發(fā)明中，親水性物質(zhì)如中介物連接到載體，探針和檢測標(biāo)記如生物素、半抗原、放射性同位素、低分子量肽和凝集素直接連接到親水性物質(zhì)。這里使用的檢測標(biāo)記是標(biāo)記的物質(zhì)，以將本發(fā)明的探針復(fù)合物用于免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明中，對載體沒有限制，只要其分子量范圍為20,000-4,000,000。然而，為提高靈敏度，需要分子量超過一定水平的載體以使更為大量的探針如抗體和半抗原可與它們結(jié)合。載體的例子包括多糖、高分子量蛋白質(zhì)和肽聚合物，它們具有20,000-20,000,000，優(yōu)選20,000-4,000,000，更優(yōu)選70,000-2,000,000的適當(dāng)分子量。當(dāng)使用多糖和肽聚合物時(shí)，具有更多側(cè)鏈的載體相比那些分子量相同但側(cè)鏈較少的載體能結(jié)合更多中介物。
用于本發(fā)明的多糖載體包括，但不限于葡聚糖、氨基葡聚糖、菲可(Ficoll)、糊精、瓊脂糖、各種纖維素、殼多糖、水溶性脫乙酰殼多糖和可溶性淀粉。用于本發(fā)明的高分子量蛋白質(zhì)載體包括，但不限于β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白和血藍(lán)蛋白等?？捎糜诒景l(fā)明的肽聚合物載體是包括聚賴氨酸在內(nèi)的各種肽聚合物。
分子量不小于2000的各種水溶性物質(zhì)可用作本發(fā)明的中介物。例如，中介物包括蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白、人血清白蛋白、運(yùn)鐵蛋白、核糖核酸酶、酪蛋白、血紅蛋白和卵清蛋白，以及抗生物素蛋白可溶性脫乙酰殼多糖。也可使用肽聚合物，如聚賴氨酸。
探針可以是任何能結(jié)合待測物質(zhì)的蛋白質(zhì)，如抗體(單克隆抗體和多克隆抗體)及其片段(F(ab’)2、Fab’、Fab、F(abc’)、Fabc’等)，以及各種受體。也可使用各種抗生物素蛋白(抗生物素蛋白D、鏈霉抗生物素蛋白等)、蛋白A、蛋白G、蛋白L、各種凝集素(伴刀豆球蛋白A、小扁豆凝集素、菜豆(Phaseolus Vulgaris)凝集素等)和核酸結(jié)合探針分析物等。
可使用任何抗體，只要它們能結(jié)合感興趣的抗原或分析物。用蛋白酶類如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理抗體可得到片段，如F(ab’)2和Fab?？贵w的重鏈(H鏈)通常通過S-S鍵相互連接，用還原劑可斷裂該鍵。還原劑包括半胱胺和巰基乙醇，用還原劑也可將F(ab′)2切成Fab’，從而產(chǎn)生新的巰基(SH)。這種抗體片段(F(ab’)2、Fab’、Fab、F(abc’)、Fabc’等)可用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的中介物上可連接諸如半抗原、低分子量肽和凝集素等物質(zhì)作為檢測標(biāo)記，這些物質(zhì)可用于檢測免疫反應(yīng)產(chǎn)生的信號。檢測標(biāo)記是經(jīng)過標(biāo)記以便將探針復(fù)合物用于免疫測量的物質(zhì)。預(yù)計(jì)這種檢測標(biāo)記是生物素或半抗原。半抗原包括二硝基苯酚(DNP)、洋地黃毒苷(DIG)和FITC等。當(dāng)生物素連接到探針復(fù)合物時(shí)，例如，用酶如HRP、熒光物質(zhì)如熒光素或發(fā)光材料如吖啶酯標(biāo)記的對生物素具有親合力的抗生物素蛋白與探針復(fù)合物反應(yīng)，并可通過發(fā)色、熒光或發(fā)光等檢測信號。
同時(shí)，熒光材料和發(fā)光材料如異硫氰酸熒光素(FITC)和吖啶酯可作為半抗原直接連接到中介物。此外，可通過熒光或發(fā)光檢測信號。
此外，將放射性同位素直接連接到中介物以及將放射性同位素標(biāo)記的半抗原連接到中介物都是允許的。此時(shí)，可通過它們的放射性檢測信號。
而且，可連接DIG和DNP作為半抗原。這里，可檢測用酶、熒光材料或發(fā)光材料標(biāo)記的DIG-或DNP-結(jié)合抗體反應(yīng)生成的信號。此時(shí)，任何材料都可用作免疫測量系統(tǒng)的檢測標(biāo)記，只要能得到抗半抗原的抗體即可。
除了半抗原，低分子量肽也可用作檢測標(biāo)記。將低分子量肽連接到探針復(fù)合物的中介物上，并用酶、熒光材料或發(fā)光材料標(biāo)記抗該肽的抗體以進(jìn)行信號檢測。這些肽可含有糖鏈或脂質(zhì)。
當(dāng)通過抗檢測標(biāo)記的抗體檢測免疫反應(yīng)信號時(shí)，也可使用除半抗原和低分子量肽之外的材料，只要該檢測標(biāo)記是能產(chǎn)生抗體的抗原性物質(zhì)并可連接到中介物即可。
也可將發(fā)光或發(fā)色酶的底物連接到中介物作為檢測標(biāo)記，因?yàn)槊概c底物反應(yīng)使得信號檢測得以進(jìn)行。
要連接到本發(fā)明探針復(fù)合物的檢測標(biāo)記的理想分子量不大于10,000。這是因?yàn)槟切┚哂休^高分子量的標(biāo)記可能由于連接到中介物的分子數(shù)有限而無法提高免疫測定的靈敏度。
此外，各種凝集素(伴刀豆球蛋白A、小扁豆凝集素、菜豆凝集素等)也可用作檢測標(biāo)記。
我們下面將非限制性地簡單闡述探針復(fù)合物的制造方法。
在本發(fā)明中，制造了載體與中介物連接的復(fù)合物。例如，當(dāng)它們連接到作為載體的帶有糖鏈的葡聚糖或菲可等以及連接到作為中介物的蛋白質(zhì)如BSA和酪蛋白時(shí)，首先使葡聚糖或菲可與高碘酸鈉反應(yīng)生成醛基。醛基與蛋白質(zhì)如BSA中的氨基反應(yīng)，形成含有載體和中介物的復(fù)合物。
該復(fù)合物相比那些僅含有載體的復(fù)合物不僅親水性增加，而且可用于連接探針和半抗原等的面積也增加。
作為檢測標(biāo)記的探針和半抗原然后被連接到中介物上。為控制連接的探針和半抗原的數(shù)量，用于各連接的官能團(tuán)宜互不相同。例如，如果將生物素作為半抗原而Fab’作為探針連接到BSA(中介物)，可考慮使用下述方法。
將磺基-NHS-LC-生物素的NHS酯(其中NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)酯連接到生物素)結(jié)合到BSA的氨基上。同時(shí)，在BSA中引入接頭以連接Fab’和BSA。用鹽酸半胱胺、DTT(二硫蘇糖醇)等還原BSA內(nèi)的S-S鍵，產(chǎn)生巰基。巰基與作為接頭的1，2-二馬來酰亞胺反應(yīng)引入馬來酰亞胺基。馬來酰亞胺基和Fab的巰基反應(yīng)得到含有載體、中介物、檢測標(biāo)記和探針的探針復(fù)合物。
檢測標(biāo)記包括各種半抗原、放射性同位素和肽。當(dāng)將肽連接到中介物時(shí)，半胱氨酸被引入肽的末端，例如，中介物如BSA中的巰基和氨基可用于連接。也可用接頭將琥珀酰亞胺基等引入中介物以使它們與肽中的氨基反應(yīng)。
可用共價(jià)鍵將上述載體連接到中介物、將中介物連接到檢測標(biāo)記并將中介物連接到探針。各種官能團(tuán)可用于共價(jià)鍵連接。例如，可利用醛基和氨基、肼基和醛基、馬來酰亞胺基和巰基、琥珀酰亞胺基和氨基、乙烯基和羥基基、乙烯基和巰基之間的共價(jià)鍵，但不限于這些官能團(tuán)之間的連接。如果載體、中介物、檢測標(biāo)記和探針缺乏合適的官能團(tuán)，可通過引入帶有官能團(tuán)的接頭分子實(shí)現(xiàn)連接。
可接受任何接頭，只要它們具有兩個(gè)或多個(gè)不同或相同的官能團(tuán)即可。
所得包含載體、中介物、探針和作為檢測標(biāo)記的半抗原或低分子量肽的探針復(fù)合物可用于免疫反應(yīng)如免疫組織化學(xué)和免疫測定。當(dāng)使用生物素時(shí)，可將抗原連接到探針復(fù)合物，然后使抗生物素蛋白-HRP與加入的比色底物或發(fā)光底物反應(yīng)，從而進(jìn)行檢測。除了HRP，結(jié)合(連接)到酶如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶或螢光素酶的抗生物素蛋白也可用于檢測。
或者，吖啶酯及其衍生物可連接到探針復(fù)合物。吖啶酯由于具有NHS酯可與BSA等的氨基反應(yīng)。吖啶酯可用于化學(xué)發(fā)光免疫測定，并可用于高靈敏測量系統(tǒng)。
當(dāng)將DNP、DIG、FITC或低分子量肽用作檢測標(biāo)記時(shí)，可通過共價(jià)鍵將它們連接到中介物。酶如HRP可連接到可特異性結(jié)合這些材料的抗體，并可通過發(fā)色和發(fā)光進(jìn)行檢測。
我們下面將描述關(guān)于探針復(fù)合物的制造方法和它們的性能的實(shí)施例，以更加詳細(xì)地非限制性地闡述本發(fā)明。
(實(shí)施例1)用菲可400作為載體制造生物素-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物稱量44mg菲可400(Amersham Bioscienses)并將其溶于0.8mL 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，加入0.4mL高碘酸鈉溶液并混合。室溫孵育2小時(shí)后通過凝膠過濾(SephadexG25，Amersham Bioscienses)除去過量高碘酸鈉，加入牛血清白蛋白(BSA)溶液并在室溫反應(yīng)3小時(shí)，將BSA加入菲可。為穩(wěn)定反應(yīng)產(chǎn)物，加入硼酸二甲胺(DMAB；Seikagaku Corporation)并混合，室溫反應(yīng)1小時(shí)，然后加入Tris溶液以封閉菲可上未反應(yīng)的醛基。室溫反應(yīng)過夜后，通過凝膠過濾(Sephacryl S300，1.6×30)純化反應(yīng)產(chǎn)物，并測量280nm的吸光度以計(jì)算載體BSA偶聯(lián)物的濃度。用鹽酸半胱胺還原1mg載體BSA偶聯(lián)物，過量鹽酸半胱胺通過凝膠過濾(Sephadex G25，AmershamBiosciences)除去，加入溶于二甲基甲酰胺的1，2-二馬來酰亞胺和磺基-NHS-LC生物素(Pierce #21335)水溶液并混合，然后將混合物室溫孵育1.5小時(shí)使其反應(yīng)，在載體BSA偶聯(lián)物中引入馬來酰亞胺基和生物素。通過凝膠過濾(Sephadex G25，AmershamBiosciences)除去過量1，2-二馬來酰亞胺和磺基-NHS-LC生物素。在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中抗-HCV核心抗原單克隆抗體的F(ab)’2的溶液(等量C11-14 F(ab)’2和C11-9 F(ab)’2的混合物)中加入1/10體積0.15M鹽酸半胱胺，混合物于37℃孵育1.5小時(shí)，通過凝膠過濾(Sephadex G25，Amersham Biosciences)除去過量鹽酸半胱胺以獲得抗-HCV核心抗原單克隆抗體Fab’。將該Fab’和馬來酰亞胺和生物素偶聯(lián)的載體-BSA混合，于4℃孵育過夜，進(jìn)行凝膠過濾(Sephacryl S300，1.6×30)以除去游離Fab’。此時(shí)，本發(fā)明的載體BSA-Fab’復(fù)合物似乎接近空隙分?jǐn)?shù)(void fraction)，就SephacrylS300分子量1,500,000的排阻極限而言，估計(jì)該復(fù)合物的分子量為數(shù)十萬或更高。測量用這種方法制備的載體BSA-Fab’復(fù)合物在280nm的吸光度，并計(jì)算濃度(假定吸光度與抗體濃度相等)。
(實(shí)施例2)用常規(guī)方法制備生物素化的抗-HCV核心抗原單克隆抗體按照磺基-NHS-LC-生物素(Pierce #21335)所附文件所述的方法制備生物素化的抗體。在PBS中混合磺基-NHS-LC-生物素和抗-HCV核心抗原單克隆抗體(等量C11-14IgG和C11-9 IgG的混合物)，并在室溫孵育1小時(shí)，然后通過凝膠過濾(Sephadex G25，Amersham Biosciences)除去過量磺基-NHS-LC-生物素。測量生物素化的抗-HCV核心抗原單克隆抗體在280nm的吸光度以計(jì)算抗體濃度。
(實(shí)施例3)實(shí)施例1中制備的生物素-抗-HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物與實(shí)施例2中用常規(guī)方法制備的生物素化的抗-HCV核心抗原單克隆抗體的比較。
用0.1M乙酸鹽/0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 4.8)將抗-HCV核心抗原單克隆抗體調(diào)至4μg/mL，在96孔微型板的各孔中加入250μl，并將各孔在4℃孵育過夜。用PBS洗滌之后在各孔加入350μl 0.5％酪蛋白，各孔在室溫孵育3小時(shí)。加入濃度為0fmol/L、148fmol/L、444fmol/L、1333fmol/L、4000fmol/L、12000fmol/L和36000fmol/L的重組HCV核心抗原(c11)作為樣品，將各孔于室溫下攪拌著孵育1小時(shí)。用含0.05％Tween 20的10mM磷酸鹽緩沖液pH 7.3(洗滌液)洗滌6次后，在各孔中加入濃度為1μg/mL的實(shí)施例1中制備的生物素-抗-HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物和實(shí)施例2中用常規(guī)方法制備的生物素化的抗-HCV核心抗原單克隆抗體各200μl作為第二抗體，并將各孔室溫孵育1小時(shí)。用洗滌液洗滌6次后，在各孔加入200μL稀釋5,000倍的HRP連接的抗生物素蛋白溶液，并將各孔在室溫孵育30分鐘。隨后，用洗滌液洗滌6次后，在各孔加入200μL底物溶液(鄰苯二胺-過氧化物混合物)，各孔在室溫孵育30分鐘，并加入50μL 5N硫酸以終止反應(yīng)。在微型板閱讀器(MPRA4i，TOSOH)上測量492nm的吸光度(參考波長為600nm)。表1顯示了加入各濃度重組HCV核心抗原(c11)的孔的吸光值減去0fmol/L的吸光值得到的值。
如表1所示，當(dāng)使用常規(guī)方法制得的生物素化的抗體時(shí)我們不能發(fā)現(xiàn)444fmol/L核心抗原和0fmol/L之間有任何區(qū)別，而在實(shí)施例1中制備的生物素-抗體復(fù)合物顯然足以檢測444fmol/L核心抗原，甚至是進(jìn)一步稀釋3倍的148fmol/L核心抗原。當(dāng)比較吸光度時(shí)，相比用常規(guī)方法獲得的生物素-抗體復(fù)合物，本發(fā)明的生物素-抗體復(fù)合物在1333fmol/L時(shí)的吸光度高出約5倍，在444fmol/L時(shí)的吸光度高出約6倍。
權(quán)利要求
1.一種探針復(fù)合物，其中，親水中介物連接到載體，探針和檢測標(biāo)記連接到中介物。
2.如權(quán)利要求
1所述的探針復(fù)合物，其特征在于，所述檢測標(biāo)記是生物素。
3.如權(quán)利要求
1所述的探針復(fù)合物，其特征在于，所述檢測標(biāo)記是半抗原。
4.如權(quán)利要求
1所述的探針復(fù)合物，其特征在于，所述檢測標(biāo)記含有放射性同位素。
5.如權(quán)利要求
1所述的探針復(fù)合物，其特征在于，所述檢測標(biāo)記是具有結(jié)合抗體能力的物質(zhì)。
專利摘要
[問題]提供具有確保用于高靈敏度免疫測定的高度操作能力的可溶性高靈敏探針復(fù)合物。[解決問題的方法]可通過將親水中介物連接到載體并將檢測標(biāo)記如生物素、半抗原或低分子量肽和抗體連接到中介物來制造該高靈敏探針復(fù)合物。通過將親水中介物連接到載體，可連接許多半抗原分子，同時(shí)探針復(fù)合物整體變得親水，從而可獲得不誘導(dǎo)非特異性反應(yīng)并具有高度操作能力的探針復(fù)合物。
文檔編號G01N33/547GK1993618SQ200580025719
公開日2007年7月4日 申請日期2005年7月28日
發(fā)明者青柳克巳, 飯?zhí)锞妹雷? 松原直子, 石田雄彥 申請人:株式會社先端生命科學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan