專利名稱：測定血中脂結(jié)合唾液酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定血中，主要是人血液中類脂結(jié)合唾液酸含量的新方法。
治療中的難題之一就是惡性疾病(下指癌癥)，因?yàn)檫@是其是否能治愈的決定因素。在這個(gè)方面，生物化學(xué)方法的發(fā)展給出了樂觀的前景。癌癥研究的主線之一就是找到內(nèi)源性物質(zhì)，它們在癌變過程中在體液(血液，尿，脊液)中的濃度發(fā)生顯著和特征地變化。這些物質(zhì)叫做腫瘤標(biāo)記物(下稱TM)。至今已發(fā)現(xiàn)50多種具有TM性質(zhì)的物質(zhì)，但還沒有一般認(rèn)為的“癌試驗(yàn)”，在癌癥檢查中即還沒有能給有確定并完全可信賴的答復(fù)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。導(dǎo)致這種情況的原因是因?yàn)閷Υ蟛糠諸M物質(zhì)而言，其測定的生物學(xué)基礎(chǔ)，特別是腫瘤狀態(tài)和TM物質(zhì)的量之間的關(guān)系還未得到闡明或所得結(jié)果含混不清。另一個(gè)原因是腫瘤標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它們的分離和測定非常困難并且在大多數(shù)情況下用現(xiàn)存的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室裝備和人員難以解決，因此，它們的測定很昂貴并且難以得到較為可靠的結(jié)果。
唾液酸(N-乙?；窠?jīng)氨酸)為形成膜的糖脂和一些糖蛋白及血液基團(tuán)物質(zhì)的一個(gè)組份。在測定細(xì)胞膜中糖蛋白和糖脂組份的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞及其質(zhì)膜中的神經(jīng)節(jié)苷脂的水平升高，因此測定神經(jīng)節(jié)苷脂水平的變化可以作為一個(gè)TM試驗(yàn)(G.Togoaswaren“惡性轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞膜表面糖蛋白”，AdvancesinCancerResearch，Vol.38，AcademicPress，Inc.1983，IBSNO-12-006638-6)，但迄今為止已知神經(jīng)節(jié)苷脂的分析測定方法非常復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此它們不能作為常規(guī)方法而實(shí)際應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室中。
血清中唾液酸水平或類脂結(jié)合唾液酸(LSA，唾液酸成份之一)的濃度與神經(jīng)節(jié)苷脂有較好的關(guān)系。此組份可以用較為簡便的分析方法檢測。幾個(gè)研究小組都在真實(shí)臨床事例中考察并證實(shí)了LSA作為腫瘤標(biāo)記物的實(shí)用性。Katopodis等[CancerResearch42，5270-5275(1982)]測定了850個(gè)病人取的樣中的血漿LSA水平，670人臨床證實(shí)患有癌癥，180人無腫瘤。作者觀察到患病組和無病組的LSA水平顯著不同?；疾〗M97%的樣品的LSA水平高于20毫克/100毫升(平均值為26.3毫克/100毫升)，而由健康人和患非腫瘤的良性病的病人中取的樣的平均LSA水平為17.6毫克/100毫升。作者認(rèn)為LSA水平高于20毫克/100毫升即為病理性的。作者也觀察到，LSA水平的測定可用于跟蹤病程，即指示治愈或加重了。
R.S.Shamberger[J.Clin.Chem.Biochem.22，647-651(1984)]測定了134無腫瘤人員(健康人和良性病病人)和160癌癥患者的血漿唾液酸水平。94%的癌變病人的血漿唾液酸濃度病理性高。在這一組中，63個(gè)已發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人的唾液酸水平明顯高于未轉(zhuǎn)移的病人，這表明腫瘤分期和大小與血漿中唾液酸的濃度間存在關(guān)系。對10個(gè)癌癥患者，作者比較43熟知的癌變胚胎抗原試驗(yàn)(CEA)和唾液酸測定在診斷上的實(shí)用性。只有4位病人觀察到病理性高的CEA，而全部10個(gè)病人的唾液酸水平都高。作者還發(fā)現(xiàn)某些炎癥(關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，潰瘍，等等)也伴有唾液酸升高現(xiàn)象。
A.M.Dnistrian等[Cln.Chem.27/10，1737-1739(1981);Cancer50，1815(1982)]考查了LSA作為乳腺癌的TM的情況。作者觀察到與健康的對照組比較LSA水平顯著升高。作者考查了用不同方法治療的病人的LSA水平變化并觀察到病理與LSA水平變化之間存在關(guān)連。作者還比較了從125位臨床證實(shí)患癌癥病人取樣的血漿中的CEA和LSA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)78%的病人的LSA水平病理性的高，而只有35%的病人的CEA水平病理性高。
從上述文獻(xiàn)看出，LSA水平的測定可用于指示癌癥的存在，估計(jì)腫瘤的分期和大小并且跟蹤病理。
雖然已發(fā)展了數(shù)種測定血漿中LSA含量的方法，但只有美國專利USP4，342，567公開的方法相對簡單并能在一般臨床實(shí)驗(yàn)室條件下常規(guī)應(yīng)用。按照此方法，血漿先用蒸餾水稀釋，然后用氯仿和甲醇混合物萃取到脂溶組份，此后水一甲醇層用磷鎢酸處理，分離得到的沉淀重新溶于水，鹽酸，往水溶液中加入Cu(Ⅱ)鹽和雷鎖辛，血漿中的唾液酸含量用所產(chǎn)生的顏色反用光度分析測定。
我們曾試圖按上述方法的詳細(xì)說明書重復(fù)此方法。從三位人員取的血漿每份按30組平行分析，連續(xù)4天重復(fù)分析。我們發(fā)現(xiàn)時(shí)間一樣品的30次分析結(jié)果存在極大的偏差(25-30%)，這對臨床一化學(xué)目的是難以接受的。不同日期的重復(fù)性也很差，平均值的偏差超過20%。此方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是吸收對濃度曲線的斜率太低，結(jié)果是，單位LSA濃度變化相應(yīng)的吸收變化用臨床實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的精度平均為0.0005AU的光度計(jì)測定時(shí)誤差很大?？瞻自囼?yàn)(即用蒸餾水代替血漿作為樣品)顯示，特別是當(dāng)LSA濃度低于20毫克/100毫升時(shí)，有用的信/噪比低于或約為3∶1，這個(gè)數(shù)字是可測量性的極低值。所有這些情況導(dǎo)致了USP4，342，567給出的方法未能付諸實(shí)用。
當(dāng)逐步檢查USP4，342，567公開的方法時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)含唾液酸部分的沉淀是測量精度的決定步驟。USP4，342，567的方法所用的沉淀劑磷鎢酸不能選擇性地沉淀出含唾液酸組份。除了要沉淀的組分外，其它干擾蛋白組分也沉淀并變性。這可由下述事實(shí)來反映即使按照引用的參考沉淀的蛋白也不能完全重新溶解。作為一個(gè)主要缺陷，USP4，342，567未能公開人血液中多種組成蛋白中哪種(些)成份應(yīng)該分離出，血液中的多種組成蛋白間的結(jié)構(gòu)和組成變化很大。因此，沉淀結(jié)果不能用一獨(dú)立方法參照。
我們首先建立了一個(gè)超離心方法作為獨(dú)立方法來測定欲測蛋白組份的特點(diǎn)。我們所用的超離心方法的條件如下溫度20℃制備管體積11.5毫升梯度重量含氯化鈉0.9%的水溶液8.5毫升作為上層，3毫升血漿(d＝1.3克/毫升)作為下層。
轉(zhuǎn)速50，000r.p.m.
旋轉(zhuǎn)時(shí)間120分鐘超離心分離的基礎(chǔ)就是利用各蛋白和脂蛋白組份由于其水合形式的密度不同而浮動的速度不同，從而形成分明的帶而相互分開。這個(gè)帶能用注射器從制備管中定量取出并進(jìn)行進(jìn)一步檢查。因此用于測定LSA的組份的量可用超離心法非常準(zhǔn)確地測定。所分離的組份的理化性質(zhì)如下密度1.125-1.210克/毫升分子量(3.86-1.86)×10道爾頓脂/蛋白比52/48對系列分析來說，超離心方法太昂貴，費(fèi)時(shí)，但它非常準(zhǔn)確，可以作為參照以檢定化學(xué)沉淀法的可靠性。
我們進(jìn)一步的工作就是建立一個(gè)選擇性沉淀含LSA組份的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含LSA組份可以用下列試劑選擇地定量沉淀。
a)含葡聚糖硫酸酯(分子量10，000至20，000)15-35毫克/毫升的溶液于pH值5.8至7.5間，或b)含聚乙烯醇(分子量4，000至10，000)15-55克/100毫升的溶液在pH9-11間，或c)含水溶性錳(Ⅱ)鹽的溶液于pH值5.5.至7.5間，其相應(yīng)的Mn2+含量為8.7-13克/100毫升沉淀組份的唾液酸含量可以用USP4，342，567公開的顏色反應(yīng)方法測定，結(jié)果精確而具重復(fù)性。當(dāng)用pH值為7至9的緩沖水溶液重新溶解沉淀時(shí)，測量精度可以提高。
據(jù)上所述，本發(fā)明涉及一個(gè)測定血液，主要是人血液中脂結(jié)合唾液酸含量的測定方法，其中血漿用水稀釋，然后用水不溶性溶劑萃取除去中性類脂，含脂結(jié)合唾液的脂蛋白組份從水相中沉淀出，沉淀出的脂蛋白組份重新溶解，往溶液中加入一個(gè)無機(jī)酸、一個(gè)Cu(Ⅱ)鹽和雷鎖辛，根據(jù)與雷鎖辛產(chǎn)生的顏色反應(yīng)計(jì)算出血漿中脂結(jié)合唾液酸的含量。根據(jù)本發(fā)明。
a)含分子量在10，000至20，000間的葡聚糖15-35毫克/100毫升的溶液作為沉淀劑，其pH值5.8至7.5，或b)含分子量為4，000至10，000的聚乙烯醇15-55克/100毫升的溶液作為沉淀劑，其pH值為9至11，或c)含Mn2+濃度為8.7-13克/100毫升的水溶性Mn(Ⅱ)鹽作為沉淀劑，其pH值為5.5.至7.5。
據(jù)本發(fā)明，沉淀最好用緩沖性水溶液(pH為7至9)重新溶解。
較好的沉淀劑為水溶性Mn(Ⅱ)鹽，如Mn SO4，Mn(NO3)2，Mn Cl2，Mn Br2或Mn I2，其中最好為Mn Cl2。此鹽的濃度在20-30克/100毫升間，較好的在22-27克/100毫升間，沉淀較好地在pH6.0±0.1進(jìn)行。
含三(羥甲基)氨基甲烷10毫摩爾/升的緩沖水溶液證明為最好的重新溶解沉淀的溶液。
當(dāng)血漿在-20℃下保存時(shí)其LSA含量6個(gè)月不發(fā)生變化。與雷鎖辛形成的有色復(fù)合物的顏色密度室溫下6個(gè)小時(shí)內(nèi)無變化。這是進(jìn)行系列分析的基礎(chǔ)。
本專利的方法主要用于系列快速癌癥篩選及診斷及跟蹤癌癥的治愈過程從而估計(jì)某個(gè)療法。另外，此方法還可用于腫瘤研究中的藥理檢查中，如估計(jì)一個(gè)潛在的抗腫瘤藥的作用。
本發(fā)明用下述非限制性實(shí)施例詳細(xì)說明。
實(shí)施例------人血液中LSA含量的測定靜脈血用來測定。取血樣后把樣品在4000r.p.m下離心15分鐘，冷凍0.6ml樣品。在-20℃下樣品的脂結(jié)合唾液酸的濃度6個(gè)月內(nèi)保持不變。
開始分析前，試管用甲醇充分沖洗，干燥，并置冰箱內(nèi)予冷，每個(gè)試管內(nèi)加入0.2毫升血清樣品和0.2毫升雙蒸水，混合物用Vortex攪拌器攪拌15秒，然后置于0℃水浴中。每個(gè)待測樣品及對照品取兩份平行樣品。
預(yù)先冷卻的2∶1體積比的氯仿比甲醇溶液3毫升一份加入各試管中，試管中的物質(zhì)用Vortex攪拌器攪拌30秒鐘。然后把試管置于冰水浴中，然后把予冷至4℃的雙蒸水0.5毫升加入各樣品，試管內(nèi)樣品用Vortex攪拌器攪拌15秒，混合物室溫放置5分鐘。然后樣品在3000r.p.m下離心10分鐘，各取1毫升上清液小心地注入標(biāo)號的離心管中，各加入0.1毫升MnCl溶液，試管內(nèi)混合物用Vortex攪拌器攪拌然后靜置5分鐘。MnCl溶液的配制如下25克無水MnCl溶于80毫升雙蒸水中，用0.1N的氫氧化鈉溶液或0.1NHCl溶液調(diào)pH值至6.0±0.1，然后用雙蒸水把體積調(diào)至100毫升。
在另一組系列實(shí)驗(yàn)中，葡聚糖硫酸酯溶液作為沉淀劑。分子量為15，000的葡聚糖20毫克溶于含NaCl0.9%的水溶液100毫升中。1毫升此溶液加入1毫升上清液中，混合物用Vortex攪拌器攪拌，然后室溫靜置5分鐘。
在量組系列實(shí)驗(yàn)中，聚乙烯醇作為沉淀劑。分子量為6，000的聚乙烯醇20毫克溶于80毫升0.2摩爾1升的甘氨酸緩沖液中，溶液用0.1NNaOH或0.1NHCl溶液調(diào)pH值至10.0±0.1，然后用雙蒸水調(diào)體積至100毫升。1毫升此溶液加于1毫升上清液中，混合物用Vortex攪拌器攪拌，然后室溫靜置5分鐘。
靜置畢后混合物在4000r.p.m下離心15分鐘，上清液完全傾出而保留沉淀(上清液棄掉)。
向各離心管中各加入1毫升三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液，重新溶解沉淀。溶10毫摩爾三(羥甲基)氨基甲烷于1升雙蒸水中并調(diào)pH值至8.6便得三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖液。
光度測量用的標(biāo)準(zhǔn)和空白樣的配制如下50毫克分析純的唾液酸溶于100毫升雙蒸水中，所得溶液作為儲存以用來配制另兩個(gè)溶液(25毫克/100毫升和12.5毫克/100毫升)。標(biāo)準(zhǔn)溶液在+4℃下保存。取上述三溶液各0.2毫升注入離心管中，然后用雙蒸水把各離心管的體積調(diào)至1毫升。1毫升雙蒸水作為空白。
各樣品(標(biāo)準(zhǔn)、空白、對照、試驗(yàn)血漿)中加入1毫升雷鎖辛試劑溶液。雷鎖辛試劑溶液的制備如下2克分析純的雷鎖辛溶于100毫升雙蒸水中。2.49克無水硫酸銅溶于100毫升雙蒸水中。然后10毫升雷鎖辛溶液與0.25毫升硫酸銅溶液和9.75毫升雙蒸水混合，再加入100毫升分析純的濃鹽酸溶液。
試管置于100℃水浴中整10分鐘，然后立刻浸入0℃冰水浴中10分鐘。各試管中加入85∶15體積/體積的乙酸乙酯比正丁醇混合物2毫升，試管內(nèi)混合物用Vortex攪拌器攪拌5分鐘。偶爾攪拌下放置試管，樣品在2500r.p.m下離心10分鐘，然后取各離心管中取蘭色上清液充滿測量皿中。蘭色的密度6個(gè)小時(shí)內(nèi)無變化。
在波長為580納米時(shí)進(jìn)行光度測量。光度的零點(diǎn)用雙蒸水定。然后，依所用的光度計(jì)的類型(單光或雙光)，所測結(jié)果或者與空白比較，或者從樣品的消光值減去空白的消光值而得到校正的結(jié)果E(校正)＝E(測量)-E(空白)LSA含量依下列兩種方法之一計(jì)算1)從已知濃度的唾液酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的消光值對濃度所作曲線或通過計(jì)算。由于稀釋，初始濃度通過下表進(jìn)行重新計(jì)算
初始濃度測得的濃度消光值(毫克/100毫升)(微克/200毫升)501000.50825500.25212.5250.127按上述描述所建立的校正曲線可用計(jì)算出上清液(體積為1毫升)中唾液酸的含量。曲線給出的是1毫升上清液中唾液酸的含量，單位為微光。血漿中唾液酸的含量測定用下式計(jì)算LSA(毫克/100毫升)＝A×0.72其中A是以微克/毫升為單位的上清液中唾液酸的含量，0.72是稀釋度和由微克至毫克轉(zhuǎn)換而得到的因子。
2)通過第二種計(jì)算方法，利用參考血漿樣品其已知LSA濃度。從幾個(gè)平行的測量結(jié)果通過下式計(jì)算出因子FF＝C(參考)/E(參考)，其中C(參考)為參考血漿中以毫克/100毫升為單位的LSA含量，E(參考)為參考血漿的消光值。欲測樣品的LSA含量用下式計(jì)算LSA(毫克/100毫升)＝E(測量)×F，其中E(測)為欲測樣品的消光值。
測量的可靠性用上述描述的超離心方法進(jìn)行校正。由15個(gè)不同病人得到的血漿樣品的LSA含量超離心(VC)，Mn Cl2沉淀法，葡聚糖硫酸酯(DS)沉淀法，聚乙烯醇(PG)沉淀法，和USP4，342，567所描述的方法測定。結(jié)果列于表Ⅰ。
表1
由表Ⅰ數(shù)據(jù)表明，以超速離心法-其可提供絕對精確的數(shù)據(jù)所得結(jié)果為參考，其與本發(fā)明所用方法所得結(jié)果非常一致，以二氯化錳為沉淀劑的方法所得結(jié)果最佳，因?yàn)樵摲椒ǖ南嚓P(guān)系數(shù)為0.995。與此相反，已知方法所得結(jié)果與參考方法所得結(jié)果具有明顯差異。
在同一實(shí)驗(yàn)室中，檢查本發(fā)明方法的重復(fù)性，海蘭德(Hyland)正常參比血清中LSA水平，經(jīng)30天分別測定，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，不同的測定系列的重復(fù)性好于±10%，即該方法可行。
在不同實(shí)驗(yàn)室檢查重復(fù)性，幾百個(gè)血清樣品于不同的兩實(shí)驗(yàn)室中分析測定，分析測定的全部基本特征(人員，儀器型號)均不同，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用相同的參比血清時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性不超過±10%的精確限度。
基于幾百次LSA測定的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)受過良好訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)助手在一個(gè)工作日內(nèi)用完全手工操作而可進(jìn)行至少80-100次測定。
本發(fā)明方法的應(yīng)用在實(shí)際臨床中得到驗(yàn)證，結(jié)果根據(jù)以下分級進(jìn)行分類正常水平低于18mg/100ml正常-病理水平18-20mg/100ml病理水平高于20mg/100ml1)一般應(yīng)用
LSA測定應(yīng)用于115例健康人或良性病患者時(shí)表明，95%例的LSA水平低于20mg/100ml。正在治療的5例肺炎病人的LSA水平為20-25mg/100ml，與文獻(xiàn)描述的觀察結(jié)果完全一致。
患有各種惡性疾病(腫瘤、結(jié)腸癌、胃癌、睪丸癌、乳腺癌、喉癌等)的94位病人的LSA水平的測定與其它致癌物質(zhì)(新蝶呤、多胺等)的測定結(jié)果一致。
在一組病人(30人)中，在臨床上證明是發(fā)病的活動期進(jìn)行了測定，除一位晚期肝癌病人，其余病人均測得病理性的高LSA水平。
在另外一組幾年前已進(jìn)行腫瘤切除的病人(64位)中，進(jìn)行測定的目的在于確定其確無腫瘤存在或腫癌復(fù)發(fā)的可能性。20%的病人(13人)的LSA水平以及其它致癌物質(zhì)均表明呈惡性疾病或處于活動期，對這些病人給出“活動型腫瘤可能性很高”的診斷。25%的病人(16人)的LSA水平以及其它致癌物質(zhì)的水平給出的不確定的結(jié)果。某些數(shù)據(jù)正常，而其它數(shù)據(jù)達(dá)到病理上的高水平。這些病人被診斷為“可疑病例”。建議它們的醫(yī)生更經(jīng)常地對其檢查并應(yīng)用其它診斷儀器，將注意力轉(zhuǎn)向其它惡性疾病的可能性，如炎癥。55%的病人(35人)的LSA水平及其致癌物質(zhì)水平于正常范圍內(nèi)。因此他們作可能是無腫瘤存在。
2)明確的腫瘤類型的鑒定對惡性婦科腫瘤卵巢癌進(jìn)行檢查，全面而詳盡的病例記錄(組織學(xué)檢查、手術(shù)、治療方法及治療時(shí)間等)由我們處理，其有助于我們對于LSA的腫瘤標(biāo)記作用做出可靠的判斷。
經(jīng)組織學(xué)檢查確診為卵巢癌的142位患者的LSA水平于手術(shù)前，并在隨后的不同治療措施中，進(jìn)行了檢查，平均做5-7次檢查。由實(shí)驗(yàn)室測定的參數(shù)結(jié)合LSA水平判定，CA-125單克隆抗原值與LSA水平進(jìn)行比較，因?yàn)镃A-125是目前國際上公認(rèn)的最敏感的腫瘤標(biāo)記物，其可用于指示和追蹤上皮卵巢之的存在。
結(jié)果綜述如下a)95%的患者術(shù)前測定表明LSA水平增高到病理水平，然而病理性CA-125值的比例于同期低于95%。
b)在成功的全部切除腫瘤后，其LSA值平均在45天內(nèi)回復(fù)正常值，這基本上與CA-125的10倍的半衰期一致(48-50天)。
c)LSA在跟蹤疾病的進(jìn)展時(shí)與CA-125的敏感性實(shí)際上是相同的，LSA可以100%可靠地指示其擴(kuò)散。LSA還可指示治療后的好轉(zhuǎn)與恢復(fù)過程，但LSA水平下降的速度和程度低于CA-125。
d)在復(fù)發(fā)病例中，有80%的患者在出現(xiàn)臨床癥狀之前，由LSA預(yù)測指出。
e)所有經(jīng)臨床確證的復(fù)發(fā)病例，LSA均有病理性升高。
f)在非上皮腫瘤(胚腫瘤等)，約占卵巢癌病例20%，CA-125不能用做可靠的指示。而LSA被證明為敏感性不變的腫瘤標(biāo)記物，在這種癌的檢查中意義很大。
g)為了評價(jià)其作為良性與惡性腫瘤辨別劑的價(jià)值，測定了25位肌瘤患者和12位良性卵巢囊腫患者的LSA水平。病理性的高LSA水平未在住一這些病例中測出。
使用本發(fā)明的方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于1)實(shí)驗(yàn)室方面a)這項(xiàng)測定不需專門訓(xùn)練，可由任何具有常規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作技能的人完成。
b)工具、儀器裝置水平一般的實(shí)驗(yàn)室，即可進(jìn)行該測定，而不需任何專門的附加裝置。
c)當(dāng)精確地按分析步驟操作時(shí)，可靠的測定可在不同實(shí)驗(yàn)室測得。
d)基于該方法所需消耗的勞動和時(shí)間，其可用于大量測定的系列分析。
e)化學(xué)藥品及工具的成本比目前應(yīng)用的與之相應(yīng)的腫瘤標(biāo)記物測定(CEA，CA-125，AEP等)的成本降低很多(大約10倍)。
f)基于本發(fā)明方法所用試驗(yàn)工具組裝簡易，時(shí)間及勞動被節(jié)省，而不同實(shí)驗(yàn)室間測定的可靠性也可提高。
2)臨床方面人血液中脂結(jié)合唾液酸含量在治療惡性疾病中可用作指征，尤其在下列領(lǐng)域中a)篩選，早期識別，支持其它診斷根據(jù)惡性病程的類型和分期，LSA值指示疾病可能存在的可能性為70-93%。由于該方法操作相對簡單且價(jià)格低廉，其可用于大規(guī)模篩選，它被作為常規(guī)篩選方法并不必額外增加財(cái)政來源和投資。當(dāng)然，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)LSA測定單獨(dú)不能解決癌癥的確切間題，然而它是一個(gè)精心安排的診斷系統(tǒng)中很重要的一個(gè)組成部分。
在篩選過程中，LSA可用于測定綜合癥存在的可能性，因此其它更加復(fù)雜，因而也更加昂貴、專門的診斷試驗(yàn)可以在較窄的范圍內(nèi)進(jìn)行而集中在可被懷疑的病例上。這種多步篩選系統(tǒng)的出現(xiàn)，可導(dǎo)致產(chǎn)生比目前方法更有效的綜合癥確認(rèn)方法。
b)跟蹤惡性腫瘤患者的癥狀，檢查治療方法的效果。
在恢復(fù)的機(jī)會方面，不斷跟蹤腫瘤病人的狀態(tài)至少與早期確認(rèn)一樣重要，LSA測定，結(jié)合其它實(shí)驗(yàn)室的和診斷的方法，可用于客觀的癌癥監(jiān)護(hù)系統(tǒng)中有價(jià)值的組成部分。在這種應(yīng)用中，LSA水平隨時(shí)間的變化在辨別無腫瘤及發(fā)展階段中，以及在檢查各種治療方法的效果時(shí)，是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.血中脂結(jié)合唾液含量的一個(gè)測定方法。其中血清用水稀釋，以與水不混溶的有機(jī)溶劑或混合溶劑提取，除去中性脂，含脂結(jié)合唾液酸的脂蛋白部分從水相中沉淀出，沉淀的脂蛋白部分(重新溶解，將礦物酸、二價(jià)銅鹽及雷瑣辛(間苯二酚)加入溶液，根據(jù)由雷瑣辛產(chǎn)生的顏色反應(yīng)，可計(jì)算出血清中脂結(jié)合唾液酸的含量，特征在于a)分子量為10，000到20，000的葡聚糖用做沉淀劑，溶液濃度為15-35mg/100ml。沉淀在pH5.8-7.5時(shí)進(jìn)行，或者；b)聚乙烯醇，分子量4，000-10，000，用做沉淀劑，濃度為15-55g/100ml，沉淀在pH9到10進(jìn)行，或者；c)水溶性的二價(jià)錳鹽用做沉淀劑在溶液中相當(dāng)于Mn2+濃度為8.7-13g/100ml。沉淀時(shí)pH5.5-7.5。
2.權(quán)利要求1中的方法，特征為濃度為20-30g/100ml的二氯化錳溶液做沉淀劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，特征在于沉淀的脂蛋白部分，用pH7-9的緩沖水溶液重新溶解。
4.權(quán)利要求2或3的方法，特征為濃度為22-27g/100ml的二氯化錳溶液，用做沉淀劑，沉淀時(shí)pH6.0±0.1。
5.權(quán)利要求1到4的方法，特征為濃度為10毫摩爾/升的三-(羥甲基)-氨基甲烷水溶液用做緩沖水溶液重新溶解沉淀出的脂蛋白部分。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于血中脂結(jié)合唾液酸的測定方法，主要為人血，其血清被水稀釋，隨后以與水不混溶的有機(jī)溶劑或混合溶劑提取，除去中性脂，含有脂結(jié)合唾液酸的脂蛋白部分被從水相中沉淀出，沉淀出的脂蛋白部分被重新溶解，礦物酸，二價(jià)銅鹽和雷瑣辛加入溶液中，根據(jù)與雷瑣辛產(chǎn)生的顏色反應(yīng)可計(jì)算出血清中脂結(jié)合唾液酸的含量。
文檔編號G01N33/58GK1045185SQ8910423
公開日1990年9月5日 申請日期1989年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月24日
發(fā)明者貝拉·舒曼, 塔馬斯·普萊 申請人:雷納爾菲諾夫吉澤吉亞爾公司