專利名稱：一種快速鑒別作物種子純度的方法
一種改進的、利用電泳法快速鑒別作物種子，特別是禾本科作物種子純度的方法，屬選種技術(shù)領(lǐng)域。
隨著現(xiàn)代種植技術(shù)的發(fā)展，人的對種子重要性的認識越來越高，種子的質(zhì)量或者說高質(zhì)量的種子純度成為增產(chǎn)的關(guān)鍵。當(dāng)前，鑒別禾本科作物種子純度，例如玉米種子，一直采用形態(tài)法，即從待檢種子的外觀開始，直至種苗和全株長成，隨訪檢查，借以判別是否純種。這種方法有著難以克服的缺點一是形態(tài)特征不易掌握，用直覺去判斷種子的純度，易產(chǎn)生較大的誤差;二是確定種子的純度時間長，與生產(chǎn)嚴重脫節(jié)，鑒別一批種子一般需三個月左右，最快的也要十幾天。且鑒定與生產(chǎn)同步進行，鑒定結(jié)論作出之時，即是作物長成定型之日，生米做成熟飯，無法彌補;三是浪費大量的人財物，而得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度都很低。如何迅速準(zhǔn)確地鑒定出作物種子的純度，一直是國內(nèi)外研究的課題。
對此，國際上曾有人利用等電聚焦技術(shù)分析種子蛋白質(zhì)的方法，去鑒別種子的純度。其原理是兩性載體(ampholion)在電場的作用下形成一個PH梯度，蛋白質(zhì)分子運動到與其等電點相同的PH區(qū)段，就不再運動，這種方法分辨率較高，也比較準(zhǔn)確，但兩性載體價格昂貴，檢測費用高。
浙江大學(xué)、中國科學(xué)院遺傳研究所提出利用同工酶電泳技術(shù)鑒別種子純度，但這種方法要求待檢種子必須都能發(fā)芽，若是死種子，酶就喪失了活力，電泳后也就無法判定種子的歸屬。
中國科學(xué)院植物研究所利用電泳技術(shù)分析玉米種子的純度，采用未脫脂的玉米粉，用尿素提取蛋白，凝膠先進行予電泳而后加樣。這種方法較為簡單易行，但存在以下問題一是蛋白質(zhì)在電泳過程中易產(chǎn)生沉淀;二是電泳分辨率不高;三是有些蛋白質(zhì)同脂肪結(jié)合在一起，對蛋白質(zhì)遷移率有影響，常發(fā)生拖帶現(xiàn)象，使蛋白圖譜不清晰。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用電泳技術(shù)，迅速準(zhǔn)確地鑒定作物種子純度的簡便實用方法。它應(yīng)具備較低的檢測成本，而又能獲得清晰的蛋白圖譜。
除此之外，本發(fā)明還應(yīng)解決蛋白質(zhì)的沉淀和蛋白圖譜中的拖帶現(xiàn)象。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的利用電泳技術(shù)，以一定濃度一定PH值的Tris-乳酸緩沖液配膠，使其在電場中形成PH梯度膠，使待測種子蛋白質(zhì)分子在電場作用下遷移至與其等電點一致的PH區(qū)段，并一直聚焦在那里，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子分離完后，再按傳統(tǒng)的方法染色照相，即可獲得清晰的蛋白圖譜。然后，將待測種子蛋白圖譜與標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖譜相比較，即可求得被測種子的純度。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳述。
本發(fā)明的關(guān)鍵是尋找一種電泳檢測所需要的低成本高效率的PH梯度膠，即制作出合適的分離膠(包括重膠液和輕膠液)和成層膠。中國科學(xué)院植物所采用的分離膠的成份是(以總體積20ml為例，下同)重膠液(20%)輕膠液(10%)30%丙烯酰胺8.0ml30%丙烯酰胺40ml乳酸鈣0.2g乳酸鈣0.2gTEMED20-30μlTEMED15-25μl10%APS30-50μl10%APS40-60μl水4.0ml水8.0ml成層膠的成份是(5%)30%丙烯酰胺1.0ml乳酸鈣0.1gTEMED30μl10%APS40-60μl水5.0ml其中TEMED是指NN，N′N′-四甲基乙二銨，APS是指過硫酸銨。
本發(fā)明所用分離膠是在上述組份基礎(chǔ)上，加入Tris-乳酸(Tris是指三羥甲基氨基甲烷)和尿素，各組份含量為重膠液(15-25%)輕膠液(10-15%)Tris-乳酸1.7-5ml尿素0.5-4g0.5-4g
30%丙烯酰胺5-8.3ml3.3-5ml水5-6.7ml乳酸鈣0.05-0.15g0.05-0.15gTEMED25-40μl15-40μl10%APS30-60μl30-60μl本發(fā)明所用成層膠(3.5-7%)是在原成膠的基礎(chǔ)上，加入尿素而成，其組份含量為尿素0.5-1g30%丙烯酰胺0.5-1ml水3.2-3.7ml乳酸鈣0.05-0.1gTEMED20μl10%APS30μl由于在膠中加入了尿素，增加了蛋白質(zhì)的溶解度，從而克服了電泳過程中的沉淀現(xiàn)象。
為了防止在蛋白圖譜中出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，增加清晰度，在制備被檢樣品時首先要對種子進行脫脂，脫脂溶劑可采用丙酮、乙醚等。
以下給出本發(fā)明所用分離膠和成層膠的幾個實施例1、重膠液單各濃度中的含量組份名稱位18%21%24%Tris-乳酸ml4.33.11.9尿素g11.5330%丙烯酰胺ml5.76.98.1乳酸鈣g0.10.150.15TEMEDμl30303010%APSμl5050502、輕膠液單各濃度中的含量組份名稱位10%12%15%尿素g11.63.430%丙烯酰胺ml3.344.8水ml6.765.2乳酸鈣g0.10.150.13TEMEDμl30303010%APSμl5050503、成層膠單各濃度中的含量組份名稱位4%5%7%30%丙烯酰胺ml0.560.70.98乳酸鈣g0.040.060.1水mL3.63.53.2尿素g0.40.70.96TEMEDμl20202010%APSμl303030制備被檢種子蛋白圖譜的操作步驟如下1、制備樣液將被檢種子粉碎，用丙酮進行脫脂，然后將脫脂后的玉米粉加入1M的尿素充分振蕩、離心后，制得蛋白樣液。
2、準(zhǔn)備膠室按常規(guī)方法制備好膠室，底部瓊脂濃度為1%，高度為3厘米左右。
3、灌膠按配方將重膠液、輕膠液及成層膠配好。將輕膠液倒入梯度混合儀內(nèi)遠離導(dǎo)管的筒內(nèi)，打開閥門，讓輕膠液充滿兩筒之間的通道，關(guān)閉閥門，把重膠液倒入另一筒。將梯度混合儀放在磁力攪拌器上，開啟電源攪拌。將導(dǎo)管插入膠室，調(diào)整膠液的流速，并迅速打開開關(guān)注膠。待膠液離凹玻璃上口3厘米時，停止灌膠并在膠液上注入一薄層水，待膠聚合后，抽出復(fù)蓋水，注入成層膠，并插入“梳子”，制出符合要求的樣品槽。爾后將膠室轉(zhuǎn)移到電泳槽上，用瓊脂將玻璃板與電泳槽有機板之間的間隙封好。
4、加樣用微量進樣器吸取30-40μl的樣液，加入樣品槽，再加一些0.1M乳酸溶液，然后用瓊脂將樣品槽密封。
5、電泳在上電極室加入0.1M的乳酸溶液，下電極加入Tris-乳酸緩沖液，上電極為正極，下電極為負極，接通電源。在上電極室膠的正上方上加入甲基綠指示劑，待甲基綠到達底部時，即可收電泳。
6、制備蛋白圖譜將電泳后的凝膠取出，切除成層膠及瓊脂，將分離膠移入染色盤內(nèi)，倒入染色液染色，染畢后用脫色劑脫色，直至背景無色為止，即可得到被檢干種子蛋白的電泳區(qū)帶圖譜。如需要，圖譜可照象留擋。
將被檢種子蛋白的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)種子蛋白圖譜相比較，即可求得被檢種子的純度。
用本發(fā)明做玉米種子純度鑒定，所得圖譜清晰，沒有沉淀和拖帶現(xiàn)象，分辨率明顯提高，圖譜中的蛋白譜帶數(shù)增多。例如中單2號玉米種子的譜帶由原來的9條(指采用中國科學(xué)院植物所所用方法制得的蛋白圖譜中的譜帶數(shù)，下同)增至18條;丹玉13號玉米種子的譜帶由原來的7條增至15條等等。由于譜帶增加，使檢測的結(jié)果更為準(zhǔn)確。經(jīng)計算，其平均誤差為0.34%，與形態(tài)法相比較，其準(zhǔn)確度是形態(tài)法三葉期的21倍，花期的25倍，全生育成株的3倍。同GB3543-83國際中允許的誤差相比，準(zhǔn)確度也提高近3倍。
另外，用本發(fā)明鑒定種子純度非常迅速，時間僅需30小時，而形態(tài)法則需720-3000小時。由于檢測迅速，使農(nóng)民完全可以在播種前檢測完畢，且準(zhǔn)確度高，避免了劣種、假種所帶來的經(jīng)濟損失。檢測費用低，與采用兩性載體的等電聚焦法相比，成本降低了近90%。本發(fā)明可以廣泛用于檢測禾本科作物，諸如玉米、小麥、高梁、谷子等種子的純度。
權(quán)利要求
1.一種快速鑒別種子純度的方法，它利用電泳技術(shù)，將被檢種子粉碎，制備蛋白質(zhì)樣液，加入膠室內(nèi)，進行電泳、染色及脫色等操作后，制得其蛋白圖譜，而后與標(biāo)準(zhǔn)種子的蛋白圖譜相比較，求得被檢種子的純度，電泳膠室所用的分離膠由重膠液及輕膠液在梯度混合儀上混配而成，其中，重膠液由丙烯酰胺、乳酸鈣、N、N、N′、N′-四甲基乙二胺、過硫酸銨及水組成，輕膠液由丙烯酰胺、乳酸鈣、N、N、N′、N′-四甲基乙二胺、過硫酸銨和水組成，成層膠由丙烯酰胺、乳酸鈣、NN、N′、N′-四甲基乙二胺、過硫酸胺及水組成，其特征在于在分離膠中加入尿素和三羥甲基氨基甲烷乳酸緩沖液，在成層膠中加入尿素，各組份含量為a、重膠液(15-25%)(以20ml總量計，下同)三羥甲基氨基甲烷-乳酸 1.7-5ml尿素 0.5-4g乳酸鈣 0.05-0.15gNNN′N′-四甲基乙二胺 15-40μl30%丙烯酰胺5-8.3ml10%過硫酸銨30-60μlb、輕膠液(10-15%)尿素 0.5-4g30%丙烯酰胺3.3-5ml水 5-6.7ml乳酸鈣 0.05-0.15NNN′N′-四甲基乙二胺 15-40μl10%過硫酸銨30-60μlc、成層膠尿素 0.5-1g30%丙烯酰銨0.5-1ml水 3.2-3.6ml乳酸鈣 0.05-0.1gNNN′N′-四甲基乙二銨 20μl10%過硫酸銨30μl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒別作物種子純度的方法，其特征在于被檢種子在粉碎后進行脫脂，脫脂溶劑可采用丙酮、乙醚等。
全文摘要
一種快速鑒別種子純度的方法，它利用電泳技術(shù)制作被檢種子的蛋白圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)種子的蛋白圖譜比較后求得被檢種子的純度。由于采用了一定濃度一定pH值的Tris—乳酸緩沖液配膠，使其在電場中形成pH梯度膠，從而使蛋白圖譜清晰、準(zhǔn)確。其誤差率較國標(biāo)要求值提高了近3倍，時間由720-3000小時縮短為30小時，檢測成本降低90％。
文檔編號G01N27/447GK1046979SQ9010054
公開日1990年11月14日 申請日期1990年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月2日
發(fā)明者牛戰(zhàn)旗, 尚穎 申請人:河北省農(nóng)產(chǎn)商品質(zhì)量鑒督檢驗站