專利名稱：用至少一個(gè)檢測(cè)參數(shù)篩選具有特定特征值群體的細(xì)胞或生物體的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及一種通過篩選具有特定特征值的細(xì)胞或生物體群體進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法和裝置。該方法和裝置具有研究、診斷或工業(yè)用途。具體地說，本發(fā)明直接提供了一種用至少一個(gè)檢測(cè)參數(shù)和已結(jié)合了特定的單克隆抗體的微球，通過除去一些群體和/或一些子群體的方式，對(duì)重疊的群體或其子群體、生物體和由幾部分組成的白血球或其子群體進(jìn)行分析的手段。
本發(fā)明還涉及同樣用篩選具有選擇特征值的細(xì)胞和生物體群體進(jìn)行計(jì)數(shù)的、具有研究、診斷、醫(yī)療或工業(yè)用途的一種分析儀和幾種自動(dòng)分析方法。具體地說，本發(fā)明所述的自動(dòng)分析儀和分析方法把電子技術(shù)、光學(xué)技術(shù)和所選的生物分子(如抗體)的特異性獨(dú)創(chuàng)性地結(jié)合起來，對(duì)細(xì)胞和生物體進(jìn)行篩選并進(jìn)行有針對(duì)性的計(jì)數(shù)，從而能對(duì)細(xì)胞和生物體的組成成份進(jìn)行分類，并能確定細(xì)胞和生物體的表現(xiàn)型，以及血癌、淋巴瘤和穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞的類型。
美國(guó)Coulter Electrohics Inc.of Hialeah Florida生產(chǎn)的A型庫(kù)特計(jì)數(shù)器(Coulter Counter Moodel A)能做為一種自動(dòng)血球計(jì)數(shù)器成功地對(duì)人體外周血樣進(jìn)行全血球自動(dòng)的常規(guī)檢驗(yàn)。儀器中的粒子探測(cè)電子系統(tǒng)的工作原理已由Wallace H.Coulter在美國(guó)專利US2656508(1953年10月20日批準(zhǔn))中披露。完全根據(jù)這種庫(kù)特電子檢測(cè)原理工作的粒子分析儀中避免使用昂貴而又容易出問題的光學(xué)敏感元件或激光器件。
現(xiàn)已對(duì)這種庫(kù)特檢測(cè)原理進(jìn)行完善和發(fā)展，并推出許多更為精益求精的儀器，如S型庫(kù)特計(jì)數(shù)器(COULTER COUNTER Moodel S)。這些儀器借助專門的計(jì)算機(jī)程序能檢測(cè)全血球參數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，能進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)及其形態(tài)測(cè)定，能進(jìn)行紅血球(RBC)形態(tài)測(cè)定，能解釋正常血樣和反常血樣。
庫(kù)特粒子電子檢測(cè)原理采用了一個(gè)小孔直流饋電的孔檢測(cè)電路(aperture sensing circuit)。該類粒子傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，特別結(jié)實(shí)可靠，受到美國(guó)乃至全世界眾多采用COULTER COUNTER類自動(dòng)分析儀的臨床實(shí)驗(yàn)室的稱贊。1970年批準(zhǔn)的Wallace Coulter和Walter Hogg的美國(guó)專利US3502974對(duì)這種基本的孔檢測(cè)電路又做了進(jìn)一步改進(jìn)。除采用這種標(biāo)準(zhǔn)的直流孔供電方式外，為檢測(cè)分類用的其它參數(shù)，還施加了一個(gè)高頻孔徑電流。高頻孔徑電流產(chǎn)生了一個(gè)反映血球的內(nèi)部電導(dǎo)及體積的信號(hào)。由直流孔徑電路同時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)是一個(gè)常見的直流放大信號(hào)，該信號(hào)主要指示了細(xì)胞的體積。用一高速除法電路實(shí)現(xiàn)射頻信號(hào)幅度和直流脈沖幅度的除法運(yùn)算，所得的商通常稱為“渾濁度”，它反映了細(xì)胞體積及內(nèi)阻。在1970年批準(zhǔn)的Wallace Coulter和Walter Hogg的美國(guó)專利US3502973中對(duì)該原理進(jìn)行了進(jìn)一步的描述。這個(gè)參數(shù)可用于細(xì)胞分類系統(tǒng)。一個(gè)單獨(dú)的孔或者由兩個(gè)相互獨(dú)立的孔構(gòu)成的一對(duì)孔都能用于這種用途。
在信號(hào)對(duì)產(chǎn)生時(shí)，對(duì)比信號(hào)對(duì)的數(shù)值，就可以對(duì)不同群體進(jìn)行分類。該信號(hào)對(duì)中一個(gè)是粒子體積測(cè)量值，另一個(gè)是細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)或渾濁度測(cè)量值。通常用稱為散布曲線或散點(diǎn)圖的二維曲線圖來表示這類數(shù)據(jù)對(duì)。紐約州紐約市的John Wiley & Sons公司1979年出版的由Melamel Melaney和Medelsohn所編的“血球流動(dòng)計(jì)數(shù)和分類”(Flow Cylometry and Sorting)一書中第371頁(yè)對(duì)這種圖進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。
圖5A示意了一正常血樣的數(shù)值散布圖。圖中每個(gè)點(diǎn)代表了一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞?；€以上的高度值表示細(xì)胞的相對(duì)體積，圖中點(diǎn)離開垂直基線向右的距離表示相對(duì)渾濁度。正常白血球(WBC)散布圖(已將血樣中的紅血球去除)中有三群體，表明可以根據(jù)這些細(xì)胞的大小和內(nèi)部構(gòu)造的內(nèi)在差別將這些細(xì)胞分為三個(gè)不同的群體。如果需要的話，可以用適當(dāng)?shù)碾娐穼?duì)這幾個(gè)群體的每一個(gè)計(jì)數(shù)。可以根據(jù)這些內(nèi)在差別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。
以前的庫(kù)特粒子電子檢測(cè)原理的專利申請(qǐng)都是先進(jìn)行紅血球計(jì)數(shù)，然后再進(jìn)紅血球其它參數(shù)的復(fù)雜的測(cè)定工作，然后從整個(gè)外周血樣中除去紅血球，只要除去紅血球的過程不顯著影響待測(cè)的剩余白血球的群體性質(zhì)，就可以進(jìn)行白血球群體測(cè)定了。為此而研制了許多紅血球溶解劑。雖然這些試劑行之有效，用途廣泛，但用于下面的白血球測(cè)定時(shí)仍不盡令人滿意。
以前的單用直流體積法或?qū)?yīng)不同角度進(jìn)行光散射的白血球流動(dòng)分析法表明血樣中有三群白血球，它們分別對(duì)應(yīng)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒性白細(xì)胞。粒性白細(xì)胞又包括嗜中性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞三個(gè)群體，可以對(duì)一些血樣的嗜曙紅細(xì)胞的濃度做出粗略但卻有用的估計(jì)。用這種方法測(cè)出的第五個(gè)重要群體的量很小。采用特殊的熒光技術(shù)可以證明，嗜曙紅細(xì)胞也被作為一個(gè)明顯群體觀測(cè)。
這些熒光技術(shù)已用于庫(kù)特公司生產(chǎn)的流動(dòng)式血球計(jì)數(shù)器(如EPICS類流動(dòng)血球計(jì)數(shù)器)上。這類儀器采用的原理是使細(xì)胞在一陽(yáng)極(sheath)流確定的園筒形液流中流動(dòng)，這些細(xì)胞在流動(dòng)過程中排成一列，逐個(gè)通過一束激光，用來自這些細(xì)胞的散射光信號(hào)和/或熒光信號(hào)可能對(duì)這些細(xì)胞的群體進(jìn)行分類。對(duì)帶有吸收染料或熒光染料的染色細(xì)胞還可能進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞群體分類。R.C.Leif等在“臨床化學(xué)”(Clinical Chemistry)第23卷(1977年)第1492-98頁(yè)中還進(jìn)一步講敘了多參數(shù)自動(dòng)分析的儀器和熒光染料的發(fā)展情況。由于這些技術(shù)的進(jìn)步，使我們已能同時(shí)對(duì)白血球進(jìn)行群體分類到四種。這四種白細(xì)胞分別是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和“粒性白細(xì)胞”(嗜中性白細(xì)胞和嗜堿性白細(xì)胞)。
更新的血液學(xué)分析儀器把光散射技術(shù)和細(xì)胞的過氧化物酶染色(用吸收性染料)技術(shù)結(jié)合起來，把白血球分成五種區(qū)別類別。此外，把染料及特異反應(yīng)性生物分子(如單克隆抗體)結(jié)合起來增加了白血球的類型數(shù)目，還可能對(duì)其進(jìn)行功能性細(xì)分。
本發(fā)明的第一個(gè)原始申請(qǐng)(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?25345，申請(qǐng)日1987年3月13日)公開了一種原理相同的改進(jìn)的全自動(dòng)分析方法和儀器，該申請(qǐng)的名稱是“用于篩選細(xì)胞或生物體以對(duì)具有特定的特征值的群體進(jìn)行計(jì)數(shù)的自動(dòng)分析方法和分析儀”，該原始申請(qǐng)將電子檢測(cè)孔徑原理的采用、用于對(duì)細(xì)胞或生物體的特定群體進(jìn)行鑒定和/或計(jì)數(shù)的特定的生物分子的特異性以及微觀粒子技術(shù)結(jié)合起來。該自動(dòng)分析儀可把特定溶劑和抗體一起應(yīng)用。這些抗體鍵合到可以由多種成分構(gòu)成的極細(xì)的微球或支持物上。
本發(fā)明的第二個(gè)原始申請(qǐng)的美國(guó)入藏號(hào)為285856，申請(qǐng)日為1988年12月16日，名稱為“用于篩選具有特定的特征細(xì)胞和生物體計(jì)數(shù)的方法和裝置”。該申請(qǐng)公開了直接篩選全血或血樣中某些部分的子群體的技術(shù)。
選擇附上細(xì)微顆粒可能使表示至少一個(gè)群體原來位置的參數(shù)發(fā)生改變。細(xì)微顆粒大量加入到某些選定的目標(biāo)群體中，使測(cè)得的體積和/或渾濁度發(fā)生改變，從而使代表一個(gè)群體的點(diǎn)的位置發(fā)生偏移。
用已知其特異性的抗體來涂覆細(xì)微顆粒。涂復(fù)使顆粒能選擇性地吸附那些表達(dá)對(duì)某種抗體特異的抗原的細(xì)胞。這些涂復(fù)細(xì)胞(或稱標(biāo)記細(xì)胞)是顆粒和細(xì)胞的組合物，它們就象新的實(shí)體一樣。可以考慮用這些組合物的混濁度、體積或者混濁度一體積數(shù)組參數(shù)來代表細(xì)胞和顆粒對(duì)獲得信號(hào)總的影響。如果組合物組分的性質(zhì)發(fā)生變化，新的實(shí)體依照最后的影響將移至一個(gè)新位置。將新位置與對(duì)應(yīng)于單獨(dú)細(xì)胞的舊位置相比較，就能夠?qū)@些新實(shí)體或?qū)嶓w組進(jìn)行分類。如果吸附在細(xì)胞上的顆粒是磁性顆粒，那么就象現(xiàn)在采用的那樣，可以用磁鐵來捕獲這些新實(shí)體。如果二者迅速混合，就會(huì)產(chǎn)生出人意料的效果既能完全捕獲一個(gè)群體，同時(shí)又不破壞所研究的細(xì)胞的性能。
利用在此以前提到的直流體積和混濁度參數(shù)固有的獨(dú)特性質(zhì)只能從一個(gè)血樣中對(duì)細(xì)胞的三個(gè)特征群體進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒別。為對(duì)更多的群體進(jìn)行計(jì)數(shù)和檢測(cè)，必須另外采用一些步驟，如采用改進(jìn)的溶解系統(tǒng)。當(dāng)然，這些新的群體是對(duì)應(yīng)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒性白細(xì)胞的三個(gè)基本群體的子群體。原申請(qǐng)中所施行的步驟表明了如何獲得這三個(gè)基本群體的子群體。
采用簡(jiǎn)單的孔徑檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)結(jié)合兩種或更多種生物顆粒的特性，就可以得到代表一給定群體的點(diǎn)聚集中的一個(gè)新的獨(dú)特的位置。群體在點(diǎn)陣圖或散點(diǎn)圖中的這種有選擇性的位置移動(dòng)是可重復(fù)的，因而可用來從三個(gè)基本群體鑒別一個(gè)群體。
通過把各微球逐一地吸附在各選定的細(xì)胞上，可以對(duì)原有的直流體積和混濁度檢測(cè)技術(shù)原來固有的組合做出進(jìn)一步的改進(jìn)。通過對(duì)顆粒表面的涂復(fù)，生物分子和抗體相對(duì)于其它分子的自然屬性(或稱特異性)賦予了這些顆粒以選擇性。表面未給含顆粒的細(xì)胞中的某一個(gè)群體或子群體沒有任何區(qū)別，因而也無法在圖中區(qū)分出它們?？梢杂眠@種方式向欲鑒別、計(jì)數(shù)和研究的某一特定的細(xì)胞群體中加入能選擇吸引該群體的顆粒。向感興趣群體的各種群體有選擇地加入足夠量的選擇性顆粒將引起質(zhì)量、體積和混濁度新的獨(dú)特的重新組合，這將導(dǎo)致該群體的點(diǎn)陣位置發(fā)生偏移。
特定細(xì)胞群體的分離并不引起其它細(xì)胞群體性質(zhì)的本質(zhì)改變。比如，根據(jù)本發(fā)明的方法從全血樣中除去紅血球(RBC)后還可以進(jìn)行T4和/或T8淋巴細(xì)胞的測(cè)定，而這種測(cè)定對(duì)采用前面提到現(xiàn)有的紅血球化學(xué)溶解試劑是不可能實(shí)現(xiàn)的。現(xiàn)已用T4與T8細(xì)胞的數(shù)目比來判斷是否具有免疫缺陷，而這些免疫缺陷則對(duì)應(yīng)著眾多的病毒感染中的幾種(包括愛滋病毒感染)。可以用在細(xì)胞表面設(shè)置特殊受體的方法來把某一群體分成數(shù)個(gè)子群體，對(duì)這些子群體的計(jì)數(shù)可以表明是否將有疾病發(fā)作。比如，幾個(gè)主要類型的白血病病人在病情發(fā)作時(shí)都伴隨著外周血淋巴細(xì)胞的急劇增多。如果迅速增殖的淋巴細(xì)胞子群體帶有T11受體，那么病人是處于免疫系統(tǒng)異常危險(xiǎn)境地。
再者，如果T11陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的子群體是攜帶T4受體，那么病人就將按日本常用的方式分類。由于細(xì)胞上帶有至少兩個(gè)有關(guān)的受體或抗原，因此稱這些細(xì)胞發(fā)生了“重疊”。重疊率是診斷和治療過程中的一個(gè)重要參數(shù)。正常全血樣中群體重疊的一個(gè)例子是CD2和CD8子群體的重疊。群體異常重疊的另一例子發(fā)生在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者上，患者在發(fā)病時(shí)其CD5和CD20子群體發(fā)生重疊。此外，如果T4受體子群體在增殖時(shí)表現(xiàn)為ZH4陽(yáng)性，那么患者不僅容易發(fā)生復(fù)合感染，而且也是急性血癌，同樣因?yàn)門11、T4和ZH4陽(yáng)性細(xì)胞誘發(fā)了抑制過程，功能性地抑制了患者產(chǎn)生抗體的功能。這樣，病人就處于復(fù)合感染的威脅下，必須對(duì)患者同時(shí)做血癌和免疫缺損治療。這些內(nèi)容可參見GANN Monograph on Caser Research第28卷(1982年卷)第13-22頁(yè)K.Takatsuki等人的文章;C.Morimoto等在Coulter Japan Symposium文集上的文章(1984年);C.Morimoto等人在Immunology第134卷(1985年)第3期1508～15頁(yè)上的文章;C.Morimoto等在New England Journol of Medicide第316卷(1987年)第2期67～71頁(yè)上的文章。本發(fā)明也適用于生物體懸浮液的分析，比如用于細(xì)菌和病毒與其它成分混合的懸浮液體系的分析。
本發(fā)明的方法和裝置采用了許多免疫反應(yīng)，比如試劑與生物體或細(xì)胞的反應(yīng)。此外“細(xì)胞”一詞專指動(dòng)物或植物細(xì)胞，這些細(xì)胞或者彼此分開識(shí)別，或者聚集在一塊。細(xì)胞是生物中具有獨(dú)立的功能的單元中最低等的結(jié)構(gòu)聚集體。比如，這些細(xì)胞可以是從組織或血樣中采集的人類紅血球和白血球群體，癌細(xì)胞或其它異常細(xì)胞。生物體僅限于細(xì)菌、病毒和真菌，也可包括一個(gè)底物。本發(fā)明可用于病人的診斷、監(jiān)測(cè)或處理。本發(fā)明專用于消除和移動(dòng)某些群體，以對(duì)那些用其它方法不容易鑒別的群體或子群體進(jìn)行分析。凡是可標(biāo)記的細(xì)胞和生物體都可適當(dāng)?shù)赜帽景l(fā)明的方法和裝置象鑒定人類血球血樣那樣進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)變化的檢測(cè)與底物的情況或有無底物無關(guān)。
本發(fā)明提供了一種由一個(gè)通用分析儀和分析方法，該分析儀和這些分析方法僅僅把最必要的電子技術(shù)和(或)粒子的光檢測(cè)技術(shù)以及特定生物分子的特異性結(jié)合起來，把用于臨床實(shí)驗(yàn)室和有工業(yè)用途的自動(dòng)分析儀的領(lǐng)域的技術(shù)水平推進(jìn)了一大步。對(duì)多種白血球子群體的測(cè)定以及人類外周血中白血球的各個(gè)子群體相互關(guān)系的研究對(duì)人體疾病的醫(yī)學(xué)研究和診斷是非常重要的。這類數(shù)據(jù)用作鑒定和分類疾病(血癌)的篩選工具。用本發(fā)明儀器所能鑒別的異常情況可以在廣闊的研究領(lǐng)域內(nèi)提供與診斷有關(guān)的信息，而不限于白血球群體的檢測(cè)，這點(diǎn)從說明書和附圖等文件中可以看得很清楚。
本發(fā)明最有價(jià)值的特征之一是它僅需采用一個(gè)嚴(yán)格的庫(kù)特檢測(cè)裝置。該裝置工作穩(wěn)定，不需要復(fù)雜而耗資的光學(xué)系統(tǒng)，不過如果需要的話也可采用光檢測(cè)裝置。附加的射頻信號(hào)發(fā)生器和檢測(cè)器所要求的電路是經(jīng)濟(jì)的，且堅(jiān)實(shí)的，可靠的。整個(gè)裝置只需一個(gè)孔徑就行了，不過如果采用第二個(gè)甚至第三個(gè)孔徑將使裝置獲得比較合算的更大的樣品通過率。
下面將敘述一種用于執(zhí)行篩選細(xì)胞或生物體并對(duì)其群體進(jìn)行計(jì)數(shù)以鑒別由細(xì)胞或生物體或其子群體所具有的選定的特性或性質(zhì)的方法和裝置。根據(jù)本發(fā)明可以從一全血樣或從一紅血球和/或白血球的群體已被除去的血樣中，通過從血樣中除去某些群體和/或其子群體的方法對(duì)白血球多個(gè)(或稱五個(gè))有差別類型進(jìn)行測(cè)定，還可以完成淋巴細(xì)胞的各子群體測(cè)定和重疊測(cè)定。
可以再用從血樣中除去一些群體和/或子群體的方法，把一全血樣或其一部分進(jìn)行篩選，以提供所希望的白血球群體分析。通過除去重疊的細(xì)胞或生物體，分別或一起分析細(xì)胞或生物體的各群體或子群體的重疊情況。從血樣中去除或予先去除紅血球群體，不會(huì)明顯影響有關(guān)的白血球群體和其子群體的特征值。
從一個(gè)血樣中至少基本貧化一個(gè)白血球群體子群體，然后至少將該群體和子群體的分析結(jié)果同貧化白血球群體的情況相比較，以確定白血球群體的至少一個(gè)特征值。從一樣品中至少扣除一個(gè)白血球群體子群體，然后對(duì)樣品中扣除的被分析的部分和原來的那部分并比較，以確定用其它方法不容易得到的白血球群體的百分率。然后，分別從樣品的不同部分貧化各白血球子群體，并將結(jié)果同原來樣品的情況進(jìn)行分析和比較，以確定抗原在至少兩個(gè)白血球子群體中的重疊情況。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)從至少具有白血球群體和/或子群體的一全血樣中的至少一部分中獲得至少一個(gè)白血球群體分析結(jié)果的方法，該方法的特征在于通過對(duì)所述全血樣的至少第一部分進(jìn)行分析，以確定至少一個(gè)帶有所述的全血樣特征的白血球群體或子群體，至少?gòu)乃龅娜獦拥牡诙糠种谢旧县毣辽僖粋€(gè)白血球群體或子群體;對(duì)所述的全血樣的第二部分進(jìn)行分析，以確定至少一個(gè)所述的第二部分的白血球群體或子群體特征值，對(duì)所述的兩個(gè)分析過的特征值進(jìn)行比較，以確定至少所述全血樣品一個(gè)白血球群體或子群體百分率。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一個(gè)從一至少具有白血球群體和/或其中的子群體的全血樣中的至少一部分中獲得至少一個(gè)白血球群體分析結(jié)果的裝置，其特征在于用于對(duì)所述全血樣的至少第一部分進(jìn)行分析，以確定至少一個(gè)所述的全血樣品的白血球群體或子群體特征組件;用于從所述的全血樣的至少第二部分中基本上貧化至少一個(gè)白血球群體或它的子群體的組件;用于對(duì)所述的全血樣的第二部分進(jìn)行分析，以得到至少一個(gè)帶有所述的第二部分白血球群體或子群體特征的組件;用于對(duì)所述的兩個(gè)分析過的特征進(jìn)行比較，以確定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體百分率的組件。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一個(gè)從其中至少帶有白血球群體的一個(gè)全血樣的至少一部分中提高和獲得至少一個(gè)白血球群體或白血球群體子群體的分析結(jié)果方法，其特征在于對(duì)所述的全血樣的至少一個(gè)第一部分進(jìn)行分析，以確定至少一所述的全血樣的白血球群體或子群體特征值;從所述的全血樣中的第二部分減去至少一個(gè)白血球群體或白血球群體子群體，因?yàn)樵摪籽蛉后w或其子群體會(huì)遮蔽對(duì)所要求的白血球群體或白血球群體的子群體的分析結(jié)果;對(duì)所述的全血樣的第二部分進(jìn)行分析，以確定所述的第二部分有關(guān)的白血球群體或白血球群體的子群體特征值;對(duì)所述的兩個(gè)分析過的特征值進(jìn)行比較，以確定所述的全血樣品有關(guān)的至少一個(gè)所希望白血球群體或白血球群體的子群體百分率。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一個(gè)用于從其至少帶有白血球群體的一個(gè)全血樣的至少一部分中獲得至少一個(gè)白血球群體或白血球群體子群體的分析結(jié)果并放大該結(jié)果的裝置，其特征在于用于對(duì)所述的全血樣的至少第一部分進(jìn)行分析，以確定至少一個(gè)所述的全血樣的白血球群體或白血球群體子群體特征的組件;用于從所述的全血樣中的至少第二部分中減去至少一個(gè)白血球群體或白血球群體子群體的組件，因?yàn)樵摪籽蛉后w或白血球群體子群體會(huì)遮蔽所希望的白血球群體或白血球群體子群體的分析結(jié)果;用于對(duì)所述的全血樣的第二部分進(jìn)行分析，以確定至少一個(gè)所述的第二部分的有關(guān)的白血球群體或白血球群體子群體特征值的組件;用于對(duì)所述的兩個(gè)分析過的特征值進(jìn)行比較，以確定所述全血樣的至少一個(gè)所希望的白血球群體或白血球群體子群體的百分率的組件。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一個(gè)從一至少具有兩個(gè)子群體的全血樣中的至少一部分中得到至少兩個(gè)白血球子群體中重疊群體的百分率的方法，其特征在于對(duì)所述的全血樣的至少第一部分進(jìn)行分析，以確定所述全血樣的至少一個(gè)的白血球群體特征值;從所述的全血樣中的至少第二部分中基本貧化所述的白血球子群體的至少第一子群體;對(duì)所述的全血樣的第二個(gè)貧化的部分進(jìn)行分析，以確定所述的白血球群體或第一子群體的至少一個(gè)特征值;從所述的全血樣中的至少一個(gè)第三部分中基本上貧化所述的白血球子群體中的至少一個(gè)第二部分;對(duì)所述的全血樣的第三個(gè)貧化部分進(jìn)行分析，以確定所述的白血球群體或第二子群體的至少一個(gè)特征值;對(duì)上述的三個(gè)分析得來的特征值進(jìn)行比較，以確定所述全血樣的兩個(gè)白血球子群體的抗原的重疊率。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一個(gè)從一至少具有兩個(gè)子群體的全血樣中的至少一部分中得到至少兩個(gè)白血球子群體中重疊群體的百分率的裝置，其特征在于具有對(duì)所述的全血樣的至少第一部分進(jìn)行分析，以確定至少一個(gè)所述的全血樣的白血球群體的特征值組件;具有從所述的全血樣中的至少第二部分中基本貧化所述的白血球子群體的至少第一子群體的組件;具有對(duì)所述的全血樣的第二個(gè)貧化部分進(jìn)行分析，以確定所述的白血球群體或所述第一子群體的至少一個(gè)特征值的組件;具有從所述的全血樣中的至少第三部分中基本上貧化掉所述的白血球子群體中的至少第二部分的組件;具有對(duì)所述的全血樣的第三個(gè)貧化部分進(jìn)行分析，以確定所述的白血球群體或第二子群體的至少一個(gè)特征值的組件;具有對(duì)上述的三個(gè)分析得來的特征值進(jìn)行比較，以確定所述全血樣的兩個(gè)白血球子群體的抗原的重疊率的組件。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例將在下面一一列出。參見說明書的附圖，其中

圖1～13為申請(qǐng)?zhí)?25345的本申請(qǐng)的第一個(gè)原申請(qǐng)所述實(shí)施例的示意圖。
圖1是原申請(qǐng)中一個(gè)細(xì)胞群體分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖2是原申請(qǐng)中第二種分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖3示出了一種相應(yīng)于圖1和圖2中原申請(qǐng)的一種特殊的分析儀的實(shí)施例;
圖4是原申請(qǐng)中另一種分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖5A和5B是根據(jù)與圖2和3所示的系統(tǒng)相似的分析儀的原型機(jī)所得到的一組結(jié)果繪制的一個(gè)散點(diǎn)圖;
圖6是原申請(qǐng)中第四種分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖7是原申請(qǐng)中第五種分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖8A和8B，9A和9B，10A和10B，11A和11B是根據(jù)與圖6和7所示系統(tǒng)相似的一種原型分析儀系統(tǒng)所得到的一系列結(jié)果繪制的散點(diǎn)圖;
圖12是原申請(qǐng)中第六種分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖13是根據(jù)與圖12所示系統(tǒng)相似的一種原型分析儀系統(tǒng)所得到的一組結(jié)果得出的散點(diǎn)圖;
圖14-26D是申請(qǐng)?zhí)枮?85856的本申請(qǐng)的第二個(gè)原申請(qǐng)所述實(shí)施例的示意圖;
圖14是原申請(qǐng)所述的一個(gè)有關(guān)白血球群體子群體分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖15是原申請(qǐng)所述的另一個(gè)有關(guān)白血球群體子群體分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖16是相應(yīng)于圖14和15的原申請(qǐng)所述的一個(gè)有關(guān)一種特殊的分析儀的實(shí)施例的示意圖;
圖17A和17B是根據(jù)與圖3和16所示系統(tǒng)相似的一種原型分析儀系統(tǒng)所得到的一組結(jié)果得出的散點(diǎn)圖;
圖18A是應(yīng)用與圖16所示系統(tǒng)相似的一種原型分析儀系統(tǒng)得到的L.M和G群體的散點(diǎn)圖，圖18B是根據(jù)與圖16所示相似的一種原型分析儀系統(tǒng)得到的L、M和B群體的散點(diǎn)圖;
圖19A-D，20A-D和21A-D是不同患者的血樣中CD4，CD8，CD2和CD20子群體的散點(diǎn)圖;
圖22A是一與圖18A中散點(diǎn)圖相似的散點(diǎn)圖，圖22B是表明E和N群體發(fā)生偏移的散點(diǎn)圖，圖22C是表明E、N和CD4群體發(fā)生偏移的散點(diǎn)圖;
圖23A-D是表明用使一個(gè)微球與有關(guān)的白血球子群體鍵合，并使第二微球鍵合到第一個(gè)微球的方式獲得的白血球子群體的直接分析結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖24A-C為表明用于原申請(qǐng)的偏移分析中的微球粒度大小的影響的散點(diǎn)圖;
圖25A-D是采用原申請(qǐng)的技術(shù)同時(shí)分析兩白血球子群體結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖26A-D是相同種群體關(guān)于不同參數(shù)的散點(diǎn)圖;
圖27-46用于說明本發(fā)明的實(shí)施例;
圖27是本發(fā)明中有關(guān)一種單檢測(cè)參數(shù)白血球群體子群體分析儀的實(shí)施例的示意框圖;
圖28為相應(yīng)于圖27的本發(fā)明中一種特殊的分析儀的實(shí)施例的示意圖;
圖29A-D是采用與圖27和28所示的裝置相似的一種原型分析儀系統(tǒng)和一種直流檢測(cè)參數(shù)得到的一組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖30A-D是采用一射頻檢測(cè)參數(shù)得到的與圖29A-D結(jié)果相同的散點(diǎn)圖;
圖31A-D是采用與圖27和28所示裝置相似的一種原型分析儀系統(tǒng)和一直流檢測(cè)參數(shù)得到的第二組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖32A-D是采用一射頻檢測(cè)參數(shù)得到的與圖31A-D相同的結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖33-36是用一個(gè)光檢測(cè)參數(shù)所得結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖37為一種能增強(qiáng)子群體或遮蔽群體信號(hào)的白血球群體子群體分析的示意框圖;
圖38A-E為采用與圖27和37中相似的一種原型分析儀系統(tǒng)和一射頻檢測(cè)參數(shù)得到的一組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖39A-E為采用一種直流檢測(cè)參數(shù)得到的另一組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖40A-E為采用一種射頻檢測(cè)參數(shù)得到的同一組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖41A-E為采用兩種檢測(cè)參數(shù)得到的一組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖42A-G和圖43A-G為分別對(duì)兩種有關(guān)的異常血樣采用不同的檢測(cè)參數(shù)得到的結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖44為本發(fā)明中用于細(xì)胞的重疊率分類測(cè)定的一種白血球子群體分析實(shí)施例的示意框圖;
圖45A-D和46A-D為采用與圖27和44中相似的一種原型分析儀系統(tǒng)和直流檢測(cè)參數(shù)所得的兩組結(jié)果的散點(diǎn)圖;
圖1-13描述了申請(qǐng)?zhí)枮?25345的第一個(gè)原申請(qǐng)的實(shí)施例。
參見圖1，申請(qǐng)?zhí)枮?25345的原申請(qǐng)所述的一個(gè)細(xì)胞群體分析方法和裝置的第一個(gè)實(shí)施例用(10)來表示。分析儀(10)中包括一生物樣品(12)，該樣品至少含有第一組活的生物細(xì)胞(圖中未示出)，這些細(xì)胞或者處于一全血樣中，或者來自一全血樣。生物樣品(12)中的這些細(xì)胞將包括于某一進(jìn)行定量和/或定性分析或測(cè)定的生物反應(yīng)。樣品(12)可包括一緩沖溶液，那些細(xì)胞就加入其中。
把樣品(12)經(jīng)管路(14)與來自管路(18)的至少一種試劑(16)相混合。然后紅血球(RBC)被一根據(jù)其功能命名的紅血球分離裝置(20)從混合液中分離出。用裝置(20)從混合物中分離出紅血球的方式有幾種。紅血球可被試劑(16)中的一種溶劑溶解。申請(qǐng)?zhí)枮?30911，申請(qǐng)日為1987年12月10日，名稱為“用于從全血樣中分離、鑒定和/或分析全血樣的白血球的方法和試劑系統(tǒng)”的專利申請(qǐng)中公開了一種可用于此處的一種溶劑和一種猝滅劑。該申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?25303、申請(qǐng)日為1987年3月13日、名稱相同的專利申請(qǐng)的一份后續(xù)申請(qǐng)，這兩份申請(qǐng)可供參考。試劑(16)可以是或包括許多磁性微球，每個(gè)磁性微球帶有一個(gè)對(duì)與微球鍵合的紅血球特異的抗體(圖中未示出微球)。在本實(shí)施例中，對(duì)紅血球特異的抗體用的就是申請(qǐng)?zhí)枮?99，489、申請(qǐng)日為1985年11月19日、名為“用于分離人類外周血中白血球回收的單克隆抗體和回收使用所述的單克隆抗體的方法”的專利申請(qǐng)中公開的那種單克隆抗體。該份申請(qǐng)可供參考。試劑(16)也可包括一種緩沖溶液，該緩沖溶液或者可替代樣品緩沖溶液，或者是與之無關(guān)的另一種緩沖溶液。試劑(16)還可以是優(yōu)選的紅血球溶劑和對(duì)紅血球特異的微球的組合物。
一旦紅血球被從混合物中基本上分離出去，將一部分混合物通過管路(24)輸入白血球分析器(22)中。白血球分析器(22)至少可以對(duì)混合物中的白血球進(jìn)行計(jì)數(shù)，它可以測(cè)量白血球的體積，渾濁度等參數(shù)中的某一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。分析器(22)的結(jié)果經(jīng)線(28)輸入到比較器(26)中。
把紅血球貧化的混合物的第二部分經(jīng)管路(32)送至一白血球子群體減去裝置(30)。從混合物中減去白血球可以有幾種方法?？梢园岩恍в幸粋€(gè)對(duì)某個(gè)白血球子群體特異的單克隆抗體鍵合微球加入混合物中，非磁性微球可以與白血球鍵合，從而改變細(xì)胞總的混濁度或體積參數(shù)，或者說使之偏移。磁性微球也能與白血球鍵合，然后可以用磁場(chǎng)將白血球從混合物中分離出來。
將白血球子群體已被除去的混合物經(jīng)管路(36)送至白血球子群體分析器(34)，或者其一個(gè)或多個(gè)參數(shù)發(fā)生變化。分析器(34)可能與分析器(22)完全相同。把分析器(34)得出的結(jié)果經(jīng)線(38)送到比較器(26)中。然后比較器(26)把來自分析器(22)的結(jié)果同來自分析器(34)的修正過的結(jié)果進(jìn)行比較，以確定選定的白血球群體的至少一個(gè)特征值，比如一特定范圍內(nèi)白血球的數(shù)目。
參見圖2，原申請(qǐng)所述的細(xì)胞群體分析方法和裝置的第二個(gè)實(shí)施例一般用(40)來表示。分析儀(40)中包括一個(gè)生物樣品(42)，該樣品也至少含有一第一組活的生物細(xì)胞(圖中未示出)，這些細(xì)胞或者處于一全血樣中，或者來自一全血樣。生物樣品(42)中的這些細(xì)胞包括在某一進(jìn)行定量和/或定性測(cè)定和分析的生物反應(yīng)。樣品(42)也可包括一緩沖溶液，那些細(xì)胞就加入其中。
樣品(42)經(jīng)管路(44)與來自管路(48)的至少一種試劑(46)相混合。在分析儀(40)中，紅血球被一根據(jù)其功能命名的紅血球分離和白細(xì)胞移位裝置(50)從混合物中除去，裝置(50)還同時(shí)改變或移動(dòng)至少一個(gè)白血球子群體中的至少一個(gè)特征值。如上所述，紅血球分離裝置(50)從混合物中分離出去的幾種方法與前面裝置(20)所列舉的方法相同。同時(shí)，在混合物的同一部分中，白血球通常與非磁性微球相鍵合，使細(xì)胞的結(jié)果的混濁度和/或體積參數(shù)發(fā)生改變或者偏移。
將已去除紅血球并且白血球子群體已發(fā)生偏移的混合物經(jīng)管路(54)送至分析器(52)。分析器(52)與分析器(22)基本上相同。分析儀(40)能直接對(duì)某一選定的白血球群體或白血球子群體的至少一個(gè)特征值進(jìn)行快速直接分析。
在圖3中，原申請(qǐng)中有關(guān)一個(gè)按第一分析儀(10)和第二分析儀(40)所采用的方法工作的分析儀裝置的特殊實(shí)施例一般用(56)來表示。
儀器(56)中只示出了一種特定的計(jì)數(shù)裝置，不過可以根據(jù)原申請(qǐng)的原理對(duì)其做出不勝枚舉的改變。此外，圖中只示出了儀器(56)的功能性細(xì)節(jié)，而這類實(shí)施例在結(jié)構(gòu)上可能有許多方法來實(shí)現(xiàn)。
儀器(56)包括一個(gè)吸液泵機(jī)構(gòu)(58)，用該泵可將有關(guān)的生物樣品如樣品(12)或(42)吸進(jìn)儀器(56)中。吸液泵(58)經(jīng)管線(60)與取樣閥(62)相連，閥(62)又與樣品探頭(63)相連。圖中的溶劑泵(64)可包括溶劑，比如試劑(18)或(46)的一部分，并且泵(64)經(jīng)管路(66)與閥(62)相連。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候閥(62)和泵(58)可把樣品(12)或(42)并經(jīng)泵(64)與溶劑一起吸入。
然后，把試劑混合物或生物樣品本身經(jīng)排液管路(68)送入混合裝置(70)中?；旌涎b置(70)包括一混合容器(72)，樣品或試劑就送入混合容器(72)中。到此處分析儀(10)和(40)的工作過程已有區(qū)別，因此下面將分別說明。
就分析儀(10)的情形而言，如果紅血球已被來自泵(64)的溶劑溶解，那么當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后將猝滅劑或固定劑從裝置(74)中經(jīng)管路(76)加入到容器中?？梢栽谌萜?72)中將溶劑和樣品混合，以促進(jìn)該反應(yīng)的進(jìn)行，這個(gè)功能用(78)來表示。
申請(qǐng)?zhí)枮?25337、申請(qǐng)日為1987年3月13日，名稱為“用于小體積樣品快速混合以加快生物反應(yīng)的方法和裝置”的專利申請(qǐng)公開了一種適用于此處的混合裝置(70)的細(xì)節(jié)，該申請(qǐng)可供此處參考。通過采用混合裝置(70)，反應(yīng)速度大大提高，而有關(guān)細(xì)胞的性質(zhì)并不象采用提高反應(yīng)溫度的方法那樣容易明顯受損。此外，反應(yīng)時(shí)間通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于1分鐘，一般為15秒左右或者更短，這就使大容量自動(dòng)分析儀(50)能進(jìn)行快速分析。
然后，把被猝滅的試劑，該試劑被來自裝置(20)的溶劑去除的紅血球，沿管路(80)送至保持容器(82)，在這種情況下容器(82)將混合物中第二部分存儲(chǔ)起來，而混合物中的第一部分將從容器(82)沿管路(84)被送至白血球分析器(86)(即分析器22)。根據(jù)Wallace H.Coulter在美國(guó)專利US 2656508中公開的計(jì)數(shù)技術(shù)和大小測(cè)量技術(shù)(這些技術(shù)已體現(xiàn)在專利受讓人Coulter電子公司制成的各種商用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上)，分析器(86)可以有很多種結(jié)構(gòu)類型。
分析器(86)通常包括一個(gè)流動(dòng)檢測(cè)器或測(cè)試容器(88)。容器(88)包括一個(gè)有孔(92)從其中穿過的傳感器(90)。容器(88)還包括第一部分(94)，該部分中有一與其中流體相接觸的第一電極(96)。
容器中部分(94)和電極(96)通過孔(92)與容器中第二空間(98)相通，空間(98)中第二電極(100)。
電極(96)和(100)經(jīng)電抗線(102)和(104)與一射頻/直流源和檢測(cè)電路(106)相連。電路(106)既與電極(96)和(100)之間的一直流或低頻電流(或信號(hào))相耦合，又與電極(96)和(100)之間的一高頻信號(hào)相耦合。
低頻信號(hào)用于檢測(cè)一細(xì)胞穿過孔(92)引起的信號(hào)脈沖的幅度。高頻信號(hào)用于獲得同一細(xì)胞穿過孔(92)時(shí)產(chǎn)生的混濁度電信號(hào)。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hogg在受讓人庫(kù)特電子公司(Coulter Electronics，Inc.)所持有的美國(guó)專利US3502974及隨后幾篇專利及非專利出版物中講敘了如何測(cè)量細(xì)胞的混濁度電信號(hào)。原申請(qǐng)?zhí)枮?68008、申請(qǐng)日為1986年10月21日、現(xiàn)申請(qǐng)?zhí)枮?21654、名稱為“用于測(cè)量粒子阻抗和電抗的粒子分析儀”的美國(guó)專利申請(qǐng)中公開了一種可用于此處的專用電路，該專利申請(qǐng)可供參考。
電路(106)產(chǎn)生的反映被檢測(cè)細(xì)胞的信號(hào)沿一直流信號(hào)線(108)和一射頻信號(hào)線(110)傳到一比較器(112)中(該比較器與比較器(26)相似)。比較器(112)能夠?qū)牡谝徊糠?即白血球子群體未被扣減的那部分)產(chǎn)生的信號(hào)存儲(chǔ)起來，以供與下面將要講到的從第二部分產(chǎn)生的信號(hào)相比較用。
分析器(86)包括一陽(yáng)極(Sheath)流裝置，其作用是用眾所周知的方式使探測(cè)器(88)中的細(xì)胞集中。陽(yáng)極(Sheath)流可由一射流系統(tǒng)(114)來提供。該系統(tǒng)通過線(116)和(118)以眾所周知的方式與探測(cè)器(88)相連。反應(yīng)樣品混合物可通過一引導(dǎo)管路(120)流入探測(cè)器(88)，并從探測(cè)器(88)中出來，經(jīng)排液管(122)流入廢液池(124)。
當(dāng)混合物的第一部分在分析器(86)中分析時(shí)，第二部分暫時(shí)存儲(chǔ)在容器(82)中，此時(shí)用來自沖洗管路的(126)的液體清洗或沖刷混合器(72)，沖刷液經(jīng)廢液管(128)流出。一旦容器被沖洗完畢，第二部分就沿管路(130)被送回容器(72)。與裝置(30)的情形相似，通過管路(134)、閥(136)和一容器管路(138)加入來自裝置(132)的白血球微球，把白血球子群體去掉。
用混合機(jī)構(gòu)(78)使白血球微球與第二部分相混合。如果白血球是非磁性球，將反應(yīng)混合物同鍵合了白血球的微球一起經(jīng)管路(80)、容器(82)和管路(84)送入分析器(84)(即分析器34)。第二部分在分析器中的分析過程與第一部分相似，然后把分析結(jié)果在比較器(112)(即比較器26)中進(jìn)行比較。第二部分中至少有一種白血球子群體的細(xì)胞參數(shù)發(fā)生了變化，比如細(xì)胞的混濁度受與白血球子群體相鍵合的微球影響發(fā)生了變化。由此得到的變化了的結(jié)果將在以后進(jìn)行分析。
如果白血球微球是磁性微球，那么當(dāng)混合過程正進(jìn)行時(shí)和/或混合完以后，可以用一磁場(chǎng)或一磁鐵(140)將鍵合到微球上白血球分離出。磁場(chǎng)可由電磁裝置提供，也可由一相對(duì)于容器(72)作物理運(yùn)動(dòng)的磁鐵(140)來提供。該磁場(chǎng)能捕獲與磁性微球相鍵合的白血球子群體。然后，用前述的方式把沒有鍵合的白血球子群體的第二部分經(jīng)管路(80)、容器(82)和管路(84)送入分析器(86)(該分析器與分析器(34)相似)。
然后，準(zhǔn)備儀器(56)，使之能夠接受用于下一個(gè)分析的樣品。探頭(63)可以用一探頭沖淋機(jī)構(gòu)(142)來清洗，各管路、容器(72)和(82)可用常規(guī)方法沖刷清洗。對(duì)隨后的樣品混合物的每次分析都自動(dòng)快速地得到。對(duì)各樣品混合物的分析的間隔期在分鐘數(shù)量級(jí)，或者更短。
分析儀(56)的工作過程與分析儀(40)相似。工作時(shí)，將帶有白血球溶劑/試劑(46)的反應(yīng)混合物和樣品(42)連同來自裝置(132)的非磁性白血球微球在容器(72)中混合，非磁性白血球微球同白血球的一個(gè)子群體相鍵合。把猝滅劑(74)加入反應(yīng)混合物中，然后沿管路(80)、容器(82)和管路(84)送入白血球分析器(86)，供分析用(分析器(86)與分析器(52)相似)。
如果不使用溶劑，那么另一個(gè)方案是在分析儀(10)和(40)的某一個(gè)中，將樣品(12)或(42)經(jīng)閥(62)送入混合器(70)，這中間不涉及任何溶劑。就這種情形而言，可以采用來自紅血球微球庫(kù)(144)的結(jié)合了一個(gè)對(duì)紅血球特異的抗體的磁性微球?qū)⒓t血球去除。然后，將混合物經(jīng)管路(146)送至閥(136)，再經(jīng)管路(138)送入容器(70)。該過程中不用任何溶劑，鍵合后的紅血球混合后的磁性分離是用與上述同磁球鍵合的白血球分離方式基本相同的方法用磁鐵(140)來完成的。
此外，在第二種提高反應(yīng)速度的情況中，采用的是樣品同紅血球溶劑以及紅血球磁球的反應(yīng)混合物。然后，用上述方法將反應(yīng)混合物的各組份充分混合，溶劑是猝滅劑，用磁鐵或電磁場(chǎng)去除紅血球鍵合體，再如上所述對(duì)白血球進(jìn)行分析。
參見圖4，原申請(qǐng)中所述的有關(guān)一種細(xì)胞群體分析方法和裝置的另一個(gè)實(shí)施例一般用(148)表示。分析儀(148)包括一生物樣品(150)，該樣品又包括至少第一組活的生物細(xì)胞(如一全血樣中或來自一全血樣的細(xì)胞)。樣品(150)也可包括一種緩沖溶液，細(xì)胞就加入到這種緩沖溶液中。
樣品(150)經(jīng)管路(152)與沿管路(156)而來的至少一種試劑(154)相混合。然后按上述方法用一根據(jù)功能命名的紅血球分離裝置(158)將紅血球分離出。將紅血球已去除了的反應(yīng)混合物沿管路(160)送入一白血球分析器(162)。將分析器(162)得出的結(jié)果經(jīng)線(166)送入一比較器(164)，得出一個(gè)表明白血球中對(duì)應(yīng)于單核細(xì)胞M、淋色細(xì)胞L和粒性白細(xì)胞G的三個(gè)區(qū)別類型的結(jié)果。
然后將混合物經(jīng)管路(170)送至一根據(jù)功能命名的嗜中性白血球(N)分離裝置(168)?？梢杂萌缟纤龅姆绞酵ㄟ^位移或改變一個(gè)參數(shù)(如混濁度)，或用磁去除方式把嗜中性白血球從混合物中除去。在這個(gè)例子中使用的那個(gè)對(duì)嗜中性白血球特異的抗體，即原申請(qǐng)?zhí)枮?68306、申請(qǐng)日為1986年12月8日、現(xiàn)申請(qǐng)?zhí)枮?38864、名稱為“對(duì)嗜中性白血球特異的單克隆抗體”的美國(guó)專利申請(qǐng)中公開的那種單克隆抗體。
然后將嗜中性白血球已被去除、或者參數(shù)發(fā)生位移的混合物經(jīng)管路(174)送入另一白血球分析器(172)。將分析器(172)得出的結(jié)果經(jīng)線(176)送入比較器(164)。分析器(172)得出的結(jié)果獲得白血球中有四種不同類型，其中兩種對(duì)應(yīng)于單核細(xì)胞M和淋巴細(xì)胞L，不過由于嗜中性白血球已被除去或者其參數(shù)發(fā)生了位移，結(jié)果還得到另外還存在兩種對(duì)應(yīng)于嗜曙紅細(xì)胞E和嗜堿細(xì)胞B的區(qū)別類型。然后，比較器(164)對(duì)來自分析器(162)和(172)兩個(gè)分析結(jié)果進(jìn)行比較，比較結(jié)果構(gòu)成了白血球的五種區(qū)別類型。特別需要說明的是，粒性白血球數(shù)減去嗜堿細(xì)胞數(shù)和嗜曙紅細(xì)胞數(shù)得到的就是被去除的嗜中細(xì)胞數(shù)。
現(xiàn)在參照?qǐng)D5A和5B與分析器(148)相似的原型分析法從一全血樣中得到的兩組散點(diǎn)的示意圖。生物樣品(150)是體積為20微升的全血樣品。將20μl樣品與40μl已鍵合了對(duì)紅血球特異的抗體的磁性微球相混合，再與140μl的緩沖溶液混合，就制成了反應(yīng)劑(154)。將反應(yīng)混合物攪拌混合15秒，再在裝置(158)中的一磁場(chǎng)中放置10秒。然后用分析器(162)對(duì)紅血球已被去除了的混合物進(jìn)行分析。分析結(jié)果中，圖5A的散點(diǎn)圖表明L計(jì)數(shù)值為45.6(1)，M計(jì)數(shù)值為5.6(2)，G計(jì)數(shù)值為48.7(3)。
然后，把混合物同10μl已鍵合了對(duì)嗜中性白血球特異的抗體的磁性微球在裝置(168)中進(jìn)行混合，攪拌混合時(shí)間為30秒，然后把混合物移至一磁場(chǎng)中放置10秒。然后把嗜中性白血球已被去除了的混合物送入分析器(176)，得到散點(diǎn)5B。該圖表明L計(jì)數(shù)值為81.0(1)，M計(jì)數(shù)值為0.6，E值為11.0(3)，B值為1.8(4)。然后比較器(164)得出白血球五種區(qū)別類型的計(jì)數(shù)值分別為L(zhǎng)計(jì)數(shù)值45.6，M值5.6，N值41.6，E值6.0，B值1.2。這個(gè)結(jié)果與用標(biāo)準(zhǔn)的白血球顯微分析法(該方法采用Wvight著色劑對(duì)載片上的樣品進(jìn)行著色處理)所得到的計(jì)數(shù)值L為44.0，M為3.4，N為45.0，E為6.1，B為0.4)相對(duì)應(yīng)。
圖6是原申請(qǐng)中有關(guān)一種細(xì)胞群體分析方法和裝置的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例的示意圖，該實(shí)施例在圖中一般用標(biāo)號(hào)(178)來表示。分析儀(178)包括一生物樣品(180)。該樣品中含有至少一個(gè)第一組活的生物細(xì)胞，同時(shí)該樣品也可能包括一緩沖溶液。
樣品(180)經(jīng)管路(182)與來自管路(186)的反應(yīng)劑(184)結(jié)合。將混合物中的第一部分經(jīng)管路(188)送到一根據(jù)功能命名的紅血球和嗜中性白血球分離裝置(190)，該過程原理如圖所示。用前述方法將紅血球和嗜中性白血球分離出或使之移位，然后把第一部分經(jīng)管路(192)送入白血球分析器(194)。
由此就可以從分析器(194)中得到一個(gè)結(jié)果，再把該結(jié)果沿線(196)送至比較器(198)。該結(jié)果包括上面提到的白血球的四個(gè)區(qū)別類型(即單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞)的情況。
同時(shí)，把樣品(180)和試劑(184)組成的混合物的第二部分經(jīng)管路(200)送至根據(jù)功能命名的紅血球分離裝置(202)，再把紅血球已被去除了的混合物經(jīng)管路(204)送至另一個(gè)白血球分析器(206)，把分析器(206)得出的結(jié)果經(jīng)線(208)送入比較器(198)。分析器(206)的結(jié)果直接地包括上述的白血球的M、L和G三種區(qū)別類型。比較器(198)對(duì)分析器(194)和(206)的結(jié)果作出比較，給出白血球的五個(gè)區(qū)別類型的情況。
圖7中，(210)表示一種采用了分析器(178)的方法和裝置的特殊的分析裝置的實(shí)施方案。圖中也只示出了特殊的計(jì)數(shù)部件，不過同分析儀(56)一樣，分析儀(210)也可以具有很多種結(jié)構(gòu)。
儀器(210)包括一吸入清洗機(jī)構(gòu)(212)，該機(jī)構(gòu)經(jīng)管路(216)與取樣閥(214)相連。閥(214)包括一樣品探頭(218)，它能吸入所需的生物樣品，如樣品(180)。稀釋劑輸送泵(220)經(jīng)管路(222)通向閥(214)，該泵能在需要時(shí)提供稀釋樣品(如一全血樣)所需的稀釋劑。然后將混合物的第一部分經(jīng)管路(224)和(226)送入第一混合裝置(228)。同時(shí)，把混合物的第二部分經(jīng)管路(224)和(230)送入第二混合裝置(232)中。
混合器(228)(與裝置(190)類似)與另一個(gè)同裝置(202)類似的混合器(232)基本相同，下面先介紹混合器(228)?；旌掀?228)包括一混合容器(234)，混合物的第一部分就送入到該容器中?；旌掀?228)的構(gòu)成可以采用上述的所有方案，必要時(shí)還可包括一輸送紅血球溶解的溶劑輸入管路(236)。
如果采用溶劑，混合物在圖中示出功能的裝置(238)中混合后，將猝滅劑經(jīng)猝滅管路(240)加入混合物。同時(shí)，將其上已鍵合了對(duì)嗜中性白血球特異的抗體的適當(dāng)?shù)拇判曰蚍谴判晕⑶驈奈⑶蛟?242)、經(jīng)管路(244)送入容器(234)。如果對(duì)嗜中性白血球或紅血球采用的是磁性微球，那么需用磁鐵(246)或一磁場(chǎng)去除與磁性體結(jié)合的細(xì)胞。
然后將混合和猝滅(需要時(shí)才這樣做)后的混合物經(jīng)管路(248)，通過閥(250)和管路(252)送入白血球分析器(254)(即分析器(194))。分析器(254)即分析器(86)，此外不再對(duì)其作詳細(xì)說明。分析器(254)中也包括一檢測(cè)容器(256)，容器中有一通孔(258)，混合物和細(xì)胞就從該孔通過。陽(yáng)極(Sheath)流射流系統(tǒng)(260)與容器(256)相連。如前所述，用一射頻/直流源和檢測(cè)電路(262)檢測(cè)細(xì)胞發(fā)出的信號(hào)，將該電路的輸出送入比較器(264)。
同時(shí)，將混合物的第二部分送入混合容器(266)中。在第二部分混合物中，只去除紅血球(即象裝置(202)的功能)，紅血球是由經(jīng)管路(268)送入容器(266)的紅血球溶劑去除的。將溶劑同樣品混合，再加入來自猝滅劑管路(270)的猝滅劑，此外，也可用已鍵合了對(duì)紅血球特異的抗體的磁性微球去除紅血球，這些微球從微球源(272)經(jīng)管路(274)被送入容器(266)中。在(276)處完成對(duì)微球的混合過程，然后用磁鐵(278)去除與磁性體結(jié)合的紅血球微球。
然后把紅血球已被去除了的混合物經(jīng)管路(280)送至閥(250)，再經(jīng)管路(252)送入分析器(254)，以得到上述結(jié)果?；旌掀?228)和(232)分別具有適用的沖淋管路(282)和(284)以及廢液管路(286)和(288)，并共用一個(gè)探頭沖淋器(290)，以便在吸入下一個(gè)樣品或正準(zhǔn)備分析的樣品前清洗分析儀(210)。
圖8A和8B是用與分析儀(178)所采用的相似的分析方法從一全血樣得到的結(jié)果的散點(diǎn)圖。在本例中，20μl的全血樣形成樣品(180)，用40μl其上已結(jié)合了對(duì)紅血球特異抗體的磁性微球同140μl緩沖溶液混合，形成了反應(yīng)試劑(184)。把混合物的一部分在裝置(202)中攪拌混合20秒，然后置入一磁場(chǎng)中10秒。然后在分析器(206)中對(duì)紅血球已被去除了的混合物進(jìn)行分析，就得到了圖8A的散點(diǎn)圖。該圖表明L的計(jì)數(shù)值為29.4(1)，M為8.1(2)，G為62.4(3)。
同時(shí)，將同一混合物的另一部分同10μl已結(jié)合了對(duì)嗜中性白血球特異的抗體的磁性微球相混合，以在裝置(190)中去除紅血球和嗜中性白血球?；旌衔锏幕旌线^程進(jìn)行30秒，然后把它在磁場(chǎng)中放置10秒。然后，分析器(194)對(duì)嗜中性白血球和紅血球已被去除了的混合物進(jìn)行分析得到圖8B所示的散點(diǎn)圖。該圖表明L的計(jì)數(shù)值為73.5(1)，M為21.7(2)，E為3.4(3)，B為1.4(4)。比較器(198)對(duì)兩組計(jì)數(shù)值進(jìn)行比較，得出白血球的五個(gè)區(qū)別類型的計(jì)數(shù)值分別是L為29.4，M為8.0，N為60.8，E為1.2，B為0.6。再進(jìn)行一次顯微對(duì)照，得出的數(shù)值分別是L為29.4，M為5.0，N為65.0，E為1.0，而B值小于1.0。
圖9A和9B表示與圖8A和8B相似的白血球的五個(gè)區(qū)別類型例子的結(jié)果的散點(diǎn)圖。用相應(yīng)于圖8A和8B的相同的步驟分析20μl的全血樣，得到的散點(diǎn)9A表明各子群體的計(jì)數(shù)值是L計(jì)數(shù)值為35.4(1)，M為14.6(2)，G為50.0(3);散點(diǎn)9B表明L計(jì)數(shù)值為66.4(1)，M為25.0(2)，E為6.6(3)，B為2.0(4)。最后得出白血球五個(gè)區(qū)別類型的計(jì)數(shù)值為L(zhǎng)為35.4，M為14.6，N為45.5，E為3.5和B為1.1。該組數(shù)據(jù)可以與顯微計(jì)數(shù)數(shù)值L為36，M為11，N為49，E為3和B為1相比較。
圖10A和10B表示與圖8A、8B和9A、9B相似的白血球的五個(gè)區(qū)別類型例子的結(jié)果的散點(diǎn)圖，不過此例中使用了溶劑。在這個(gè)例子中，把20μl的全血樣與80μl的緩沖溶液以及240μl上面提到過的對(duì)紅血球優(yōu)選的溶劑相混合?；旌衔锘旌蠒r(shí)間為6秒，然后向混合物中加入猝滅劑。確定時(shí)間周期很重要，因?yàn)榛旌衔镏羞z留的未被猝滅的溶劑要經(jīng)過大約10秒后會(huì)開始影響白血球的重要性質(zhì)。對(duì)紅血球已被去除了的混合物進(jìn)行分析，就可以得到如圖10A所示的散點(diǎn)圖，該圖表明了L的計(jì)數(shù)值為25.7(1)，M為9.6(2)，G為65.0(3)。
混合物的第二部分包括該全血樣第二個(gè)20微升樣品，使之與120μl的緩沖溶液及10μl已帶有對(duì)嗜中性白血球特異的抗體的鍵合其上的磁性微球，經(jīng)30秒混合后在一磁場(chǎng)中放置10秒。然后向嗜中性白血球已被去除了的混合物中加入對(duì)紅血球優(yōu)選的溶劑，并在猝滅前混合6秒。得到的散點(diǎn)圖10B表明L的百分計(jì)數(shù)值為74.6(1)，M為21.6(2)，E為2.9(3)，B為0.8(4)。最后得出白血球的五個(gè)區(qū)別類型的百分計(jì)數(shù)值為L(zhǎng)為25.6，M為9.6，N為63.5，E為1.06，和B為0.3。此外，顯微對(duì)比結(jié)果表明L的計(jì)數(shù)值為29.4，M為5.0，N為65.0，E為1.0，B小于1。
圖11A和11B表示與圖10A和10B相似的白血球的五個(gè)區(qū)別類型的散點(diǎn)圖結(jié)果的另一個(gè)例子。把一全血樣品分成兩個(gè)樣品，用相應(yīng)于圖10A和10B的相同步驟對(duì)它們同時(shí)進(jìn)行分析。圖11A的散點(diǎn)圖表明L計(jì)數(shù)值為31.9(1)，M為17.6(2)，G為50.4(3)。圖11B的散點(diǎn)圖表明L計(jì)數(shù)值為67.1(1)，M為24.1(2)，E為7.6(3)，B為1.2(4)。所得的白血球的五個(gè)區(qū)別類型結(jié)果的計(jì)數(shù)值分別為L(zhǎng)為31.9，M為11.4，N為46.0，E為3.6和B為0.7。與之相比，顯微計(jì)數(shù)值為L(zhǎng)為36，M為11，N為49，E為3，B為1。
在圖12中，一般用(292)表示原申請(qǐng)中有關(guān)一種細(xì)胞群體分析方法和裝置的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施例。分析儀(292)包括一生物樣品(294)，該樣品又包括至少一第一組活的生物細(xì)胞，必要時(shí)還包括一種緩沖溶液。
樣品(294)通過管路(296)同來自管路(300)的至少一種試劑(298)相混合。在分析儀(292)中的功能性裝置(302)中，按一定順序或同時(shí)地去除紅血球，并使嗜中性白血球移位。用(304)表示去除紅血球的功能，用(306)表示移動(dòng)嗜中性白血球或稱使之移位的功能，由此表明上述過程是同時(shí)地或按順序地進(jìn)行的。紅血球的去除可以如上所述，用磁鐵(或磁場(chǎng))或用溶劑或者把二者組合起來的方式來完成。去除嗜中性白血球或使之移位是通過向混合物中加入具有對(duì)已鍵合了對(duì)嗜中性白血球特異的抗體的微球來實(shí)現(xiàn)的。
一旦紅血球已被去除，嗜中細(xì)胞發(fā)生移動(dòng)或移位，將得到的混合物通過管路(308)送入分析器(310)。在這種情況下，嗜中性白血球距嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞類型移位足夠遠(yuǎn)，于是就直接得到了白細(xì)胞的五個(gè)區(qū)別類型M、L、E、B和N。分析器(292)的功能可以由裝置(56)和(210)中的任何一個(gè)或由其變型來執(zhí)行。
圖13為由分析器(292)直接得出白血球的五個(gè)區(qū)別類型的一個(gè)例子的散點(diǎn)結(jié)果示意圖。在這個(gè)例子中，生物樣品(294)為10μl的全血樣，試劑(298)為10μl已鍵合有對(duì)嗜中性白血球特異的抗體的非磁性微球同100微升緩沖溶液相混合，并在分裝置(306)中混合了30秒后得到的混合物。再向所在的混合物中加入10μl對(duì)紅血球優(yōu)選的溶劑，在分裝置(304)中混合6秒，然后向其中加入猝滅劑。然后分析器(310)對(duì)紅血球已被去除、嗜中性白血球已經(jīng)移位了的混合物進(jìn)行分析，得到圖13所示的散點(diǎn)圖。該圖給出直接計(jì)數(shù)值L為29.6，M為13.6，N為52.2，E為3.4和B為1.6。與之相比，顯微計(jì)數(shù)法卻只得出L為35，M為5，N為56，E為4，無B值。在這個(gè)特定的例子中，該全血樣同時(shí)由Coulter Electronics，Inc.生產(chǎn)的一臺(tái)通用的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分析，得到的計(jì)數(shù)值為L(zhǎng)為29，M為11.1以及G為59.9(G中包括了N.E和B)。
參照?qǐng)D14-26D，圖14-26D為申請(qǐng)?zhí)?85856的第二個(gè)原申請(qǐng)的實(shí)施例示意圖。
圖14中，一般用(320)來代表第二個(gè)原申請(qǐng)中有關(guān)一種白血球群體子群體分析方法和裝置的第一個(gè)實(shí)施例。分析儀(320)中包括在全血樣中或來自一全血樣的生物樣品(322)，樣品中含有至少一個(gè)第一組活的生物細(xì)胞(圖中未示出)，包括至少一個(gè)白血球群體，該群體又具有至少一個(gè)可限定的子群體。用于此處的白血球子群體為那些能被特定的單克隆抗體結(jié)合的一白血球群體的子群體。世界衛(wèi)生組織(Wold Heath Organization)和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)(International Immunology Society)現(xiàn)已對(duì)單克隆抗體制訂了一個(gè)命名法，對(duì)單克隆抗體根據(jù)分化群(CD)命名法來命名。該命名法對(duì)每一種細(xì)胞或細(xì)胞群體規(guī)定了一個(gè)特殊的特異性，對(duì)該CD群限定了一個(gè)對(duì)之特異的單克隆抗體。僅對(duì)本例子所涉及的用途而言，在下列各例子中采用了四種CD群CD4，CD8，CD2和CD20。表1列舉了一些單克隆抗體的CD名稱、特異性和一些商品來源。
表1分化群(CD) 抗體(商品來源)b特異性CD2(gp50)aT11(Coulter) E Rossette受體OK T11(Ortho);
Leu5a(BD)CD4(gp56) T4(Coulter) 助劑/誘導(dǎo)劑OK T4a(Ortho);
Leu3a(BD)CD8(gp32-33) T8(Coulter) 細(xì)胞毒/抑制劑TOK T8(Orther);
Leu2a(BD)CD20(gp35) Bl(Coulter) 除血漿細(xì)胞、BLeu 16(BD) 細(xì)胞瘤、骨髓瘤細(xì)胞和一些非T全細(xì)胞以外的所有的B細(xì)胞。
agp-以千道爾頓為單位的糖蛋白分子質(zhì)量;
b Coulter-Coulter集團(tuán)的Coulter免疫分部(在弗羅里達(dá)州的Hialeah)BD-Becton-Dickinson免疫細(xì)胞計(jì)系統(tǒng)Ortho-Ortho診斷系統(tǒng)(在新澤西州的Rariton)
生物樣品(322)的細(xì)胞將參與一定量和/或定性分析或測(cè)定的生物反應(yīng)。樣品(322)可包括一緩沖溶液，細(xì)胞就加入到該溶液中。
樣品(322)通過管路(324)同來自管路(328)的至少一種試劑(326)相混合。分析儀(320)中由一個(gè)根據(jù)功能命名的紅血球分離和白血球子群體偏移裝置(330)，把紅血球從混合物中去除，并且把至少一個(gè)白血球子群體的至少一個(gè)特征值按一定順序或同時(shí)地改變或者使之偏移。同第一個(gè)原申請(qǐng)所述的情況一樣，裝置(330)從混合物中去除紅血球的方式有多種，比如所述裝置(20)功能時(shí)所列舉的那些方式。在混合物的同一部分中，至少有一個(gè)白血球子群體被同時(shí)地或按順序結(jié)合在具有對(duì)該子群體特異的單克隆抗體的白血球微球上，由此改善(改變或稱偏移)了所得到的細(xì)胞的混濁度和/或體積參數(shù)。
然后將紅血球已被去除、白血球子群體已發(fā)生偏移的混合物經(jīng)管路(34)送入分析器(332)中。分析器(332)與分析器(22)基本相同。有關(guān)的白血球子群體一般敘述為有關(guān)白血球群體的百分率。這樣分析儀(320)能對(duì)一白血球群體的一個(gè)選定的子群體的至少一個(gè)特征值直接進(jìn)行快速分析。分析儀(320)可以用在被偏移的白血球子群體未被數(shù)目更多的其它細(xì)胞所遮掩的場(chǎng)合，或者雖被遮掩，但由于白血球子群體的這些被偏移的細(xì)胞的數(shù)量占了總數(shù)中相當(dāng)大的比例，因而能夠?qū)⑦@些細(xì)胞辨認(rèn)出來的那些場(chǎng)合。
在圖15中，一般用(340)來代表第二個(gè)原申請(qǐng)中有關(guān)一種白血球群體子群體分析方法和裝置的第二個(gè)實(shí)施例。分析儀(340)中包括一全血樣中或來自一全血樣的生物樣品，樣品中含有至少一個(gè)第一組活的生物細(xì)胞(圖中未示出)，包括至少一個(gè)白血球群體，該群體又具有至少一個(gè)子群體。再使生物樣品(342)的細(xì)胞參加一定量和/或定性測(cè)定或分析的生物反應(yīng)。樣品(342)可包括一緩沖溶液，細(xì)胞就加入到該溶液中。
樣品(342)經(jīng)過管路(344)與來自管路(348)的至少一種試劑(346)結(jié)合。分析儀(340)中由一根據(jù)功能命名的紅血球分離和白血球子群體偏移裝置(350)把紅血球從混合物中去除，并且按一定順序或同時(shí)地改變至少一個(gè)白血球子群體的至少一個(gè)特征值或使之偏移。如前所述，裝置(350)從混合物中去除紅血球的方式有多種，比如敘述裝置(20)功能時(shí)所列舉的那些方式。在混合物的同一部分中，至少有一個(gè)白血球子群體被同時(shí)地或按順序鍵合在微球上，由此改善(改變或稱偏移)了所得到的細(xì)胞的混濁度和/或體積參數(shù)。
同時(shí)，(或者按照一定順序)，將至少一個(gè)白血球群體或子群體從混合物中除去。除去白血球群體或子群體的目的在于使有關(guān)的白血球子群體不至被這個(gè)群體遮蔽。白血球群體的去除過程可優(yōu)先考慮用磁力法在白血球群體與磁性微球(包括一鍵合在微球上、對(duì)白血球群體特異的單克隆抗體)鍵合后來完成。
然后將紅血球和白血球群體已被除去、白血球子群體已經(jīng)偏離的混合物經(jīng)管路(354)送入分析器(352)。分析器(352)也與分析器(22)基本相同。
圖16中，用(360)代表第二個(gè)原申請(qǐng)中一分析裝置的一個(gè)特殊的實(shí)施例，該實(shí)施例能夠施行第一分析儀(320)和第二分析儀(340)所采用的方法。
儀器(360)與儀器(56)類似，其中只示出了一種特殊的計(jì)數(shù)方式，不過可以根據(jù)第一原申請(qǐng)的原理對(duì)其中的細(xì)節(jié)做出多不勝舉的變化。此外，圖中只詳細(xì)指出儀器(360)的功能，而該裝置的結(jié)構(gòu)卻可以用多種方式構(gòu)成。
儀器(360)包括一吸入泵機(jī)構(gòu)(362)，用該泵把有關(guān)的生物樣品如樣品(322)和(342)吸入儀器(360)中。吸入泵(362)經(jīng)管路(364)與取樣閥(366)相連，該閥又與樣品探頭(368)相連。溶劑泵(370)包括了溶劑(如試劑(326)或(346)的一部分)，并通過管路(372)與閥(366)相連。需要時(shí)閥(366)和泵(362)能把生物樣品(322)或(342)以及來自泵(370)的溶劑一同吸入。不過，最好生物樣品(322)或(342)與溶劑分開加入。
然后把試劑混合物或生物樣品本身經(jīng)輸料管路(374)送入混合裝置(376)中?；旌涎b置(376)包括一混合容器(378)，樣品或試劑就被送入該容器，分析儀(320)和(340)的工作過程僅有細(xì)微的差別，下面一同敘述這兩部件。
裝置工作時(shí)，如果紅血球已被來自泵(370)的溶劑溶解，那么當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將從裝置(380)經(jīng)管路(382)而來的猝滅劑或固定劑加入混合物，去除紅血球的反應(yīng)就完成了。也可象敘述(384)功能那樣在容器(378)中混合溶劑和樣品，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。
去除紅血球之前(或之后，或在此過程中)，白血球發(fā)生偏移。在分析儀(340)中，一個(gè)白血球群體或子群體也被除去。白血球子群體的偏移是通過將來自裝置(386)的特殊的白血球微球經(jīng)管路(388)、閥(390)和容器管路(392)加入容器中而進(jìn)行的。混合機(jī)構(gòu)(384)將白血球微球同混合物或樣品進(jìn)行混合。
用在此處的混合裝置(376)的結(jié)構(gòu)與混合裝置(70)基本相同。反應(yīng)速度因采用混合裝置(376)而大大提高，同時(shí)有關(guān)細(xì)胞的性能并設(shè)象提高反應(yīng)溫度造成的那樣被明顯地破壞。此外，反應(yīng)通常在幾分鐘之內(nèi)就能完成，反應(yīng)時(shí)間一般為兩分鐘或更短。這就使自動(dòng)的大容量分析裝置(360)能進(jìn)行快速分析。
然后在分析器(320)中，用猝滅劑(如來自裝置(20))猝滅已除去紅血球和修改了的白血球子群體的反應(yīng)劑經(jīng)管路(394)送入分析器(396)(即分析器322)中。根據(jù)Wallace H.Coulter在美國(guó)專利US2656508中公開的計(jì)數(shù)和粒度測(cè)量技術(shù)，可以把分析器(396)做成許多類型，該類分析器現(xiàn)已用在專利受讓人Coulter Elctronics，Inc.所生產(chǎn)的許多種商用的血球計(jì)數(shù)器中。
如前所述，分析器(396)一般包括一個(gè)流動(dòng)傳感器或檢測(cè)容器(398)。容器(398)包括一個(gè)傳感器(400)，其中有一個(gè)通孔(402)。容器(398)中有一第一部分(404)，其中有一第一電極(406)直接與其中的流體接觸。
容器中第一部分(404)和電極(406)通過孔(402)與容器的第二部分(408)相通，(408)中有一第二電極(410)。電極(406)和(410)通過反應(yīng)線(412)和(414)與一射頻/直流源和檢測(cè)電路(416)相連。電路(416)與電極(406)和(410)之間的一個(gè)直流、低頻電流或信號(hào)或者一個(gè)高頻信號(hào)相連。
可以用該低頻信號(hào)來檢測(cè)細(xì)胞通過孔(402)產(chǎn)生的信號(hào)脈沖的幅度，用該高頻信號(hào)得到同一細(xì)胞通過孔(402)時(shí)產(chǎn)生的渾濁(opacity)度電信號(hào)。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hoff在美國(guó)專利US3502974以及受讓人Coulter電子公司所持有的之后的幾份專利及幾篇文章中公開了測(cè)量細(xì)胞渾濁度電信號(hào)的方法。申請(qǐng)?zhí)枮?21654的專利申請(qǐng)公開了一種可用于此處的特殊電路，該申請(qǐng)可供此處參考。
把電路(416)檢測(cè)出的由被測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)通過一直流信號(hào)線(418)和一射頻信號(hào)線(420)送入一與比較器(26)相似的比較器(422)中。
分析器(396)包括一陽(yáng)極(Sheath)流動(dòng)裝置，該裝置能用公知的方式把細(xì)胞聚集在檢測(cè)器(398)中。該陽(yáng)極流可由一射流系統(tǒng)(424)來提供，該系統(tǒng)通過兩條線(426)和(428)以公知方式與檢測(cè)器(398)相連。樣品反應(yīng)混合物可經(jīng)引導(dǎo)管(430)進(jìn)入檢測(cè)器(398)中，并可由檢測(cè)器(398)經(jīng)排液管(432)進(jìn)入廢液容器(434)中。
每次測(cè)試完成以后，混合器(378)都用來自沖洗管路(436)的液體清洗或噴淋，廢液經(jīng)廢液管路(438)排出。一旦清洗完容器(378)，就以把另一個(gè)樣品或樣品的其它部分送入儀器(360)。
在分析儀(340)中，工作過程與分析儀(320)基本相同，不同之處只是加入了白血球群體或子群體磁性微球。在混合過程中或混合后就可以用磁場(chǎng)或磁鐵(440)把已鍵合在微球上的白血球子群體除去。具體地說，可以用電磁鐵裝置或用使磁鐵(440)相對(duì)于容器(378)做機(jī)械運(yùn)動(dòng)的方式形成該磁場(chǎng)，以捕獲鍵合在磁球上的白血球子群體。然后用上述的方法把已去除了鍵合在磁珠上的白血球子群體的混合物經(jīng)管路(394)送入一與分析儀(320)相似的分析器(396)中，以獲得分析結(jié)果。
然后清洗儀器(360)，使之準(zhǔn)備接受用于下次分析的下一個(gè)樣品，可以用探頭沖淋機(jī)構(gòu)(442)清洗探頭(368)，各管路和容器(378)也可用常用的方法進(jìn)行清洗。隨后的樣品混合物每次分析以一個(gè)快速和自動(dòng)方式獲得，樣品混合物的分析之周期約為五分鐘或更短。
如果不采用溶劑方案，那么在分析儀(320)和(340)的任一個(gè)中可以不采用任何溶劑把樣品(322)或(342)經(jīng)閥(366)送入混合器(376)中。在這種情況下可以用來自紅血球微球裝置(444)的已鍵合了對(duì)紅血球特異的抗體的微球，用磁力將紅血球除去，然后把混合物經(jīng)管路(446)送至閥(390)，再經(jīng)管路(392)送入容器(376)中。雖然沒有用溶劑，仍然可在混合后用磁鐵(440)將結(jié)合在磁性微球上的紅血球除去。去除方式與上述的用磁力法除去結(jié)合在微球上的白血球的方式基本相同。
此外，還有一種提高反應(yīng)速度或反應(yīng)效率的方法，即把樣品的反應(yīng)混合物與紅血球溶劑及紅血球磁球的混合物一起使用，可以象上述方式那樣，混合反應(yīng)混合物，用猝滅劑猝滅，用磁力法除去與微球鍵合的紅血球，然后對(duì)白血球進(jìn)行分析。
圖17A和17B示出了采用與儀器(360)相似的一種原型分析儀從一全血樣中得到的散點(diǎn)圖中兩組結(jié)果，其中去除了兩個(gè)白血球群體并直接對(duì)T8子群體進(jìn)行分析。T8子群體是帶有受體或抗原的細(xì)胞或生物體，對(duì)T8特異的抗體就結(jié)合在受體或抗原上。圖中用T+8代表這些細(xì)胞或生物體，而那些沒有攜帶受體或抗原(對(duì)T8特異的抗體就結(jié)合在這些受體和抗原上)的細(xì)胞或生物體則用T-8來表示。在這些例子中，生物介質(zhì)(342)是用混合器(376)混合的20微升全血樣品。在圖17A和17B兩圖中，將20微升的全血樣(即介質(zhì)(342))與40微升已鍵合了對(duì)紅血球特異的抗體的磁性微球相混合，再與120微升緩沖溶液及10微升已鍵合了對(duì)嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞特異的抗體的磁性微球相混合，再與30微升緩沖溶液相混合，這樣就制成了試劑(346)。申請(qǐng)?zhí)枮?68618，申請(qǐng)日為1987年6月3日，名稱為“對(duì)嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞的一個(gè)共同的測(cè)定位置特異的單克隆抗體”的美國(guó)專利申請(qǐng)中公開了對(duì)嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞特異的抗體的一個(gè)典型的例子，該申請(qǐng)可作參考。
適用的磁性微球可有許多種，在本例中用的是Seradyn.Inc.of Indianapolis，Indiana出售的直徑為0.7微米，重量體積比為10%的固體聚苯乙烯磁性微球。然后將反應(yīng)混合物在混合器(376)中混合10秒，再在磁鐵(440)的磁場(chǎng)中放置15秒，然后用分析器(396)對(duì)得到的除去了紅血球、嗜曙紅細(xì)胞和嗜中性白血球的混合物進(jìn)行分析。圖17A就是得到的散點(diǎn)圖A。
采用同樣的步驟，向12.5微升的緩沖溶液中加入12.5微升已鍵合了對(duì)T8特異的抗體的非磁性微球，得到試劑(346)。圖17B的散點(diǎn)圖就是用該試劑(346)得到的。T8特異的抗體是Coulter Immunology Division of CoulterCorporation以商標(biāo)COUTER CLONE出售的。適用的非磁性微球也有許多種，在本例中用的是直徑為1.78微米，重量體積比為8%的固態(tài)表面活性劑單硫酸酯聚苯乙烯乳膠微球(Surfactant free sulfated polystyrenelatex microspheres)，是由Interfacial Dynamics of portland Oregon出售IDC微球。
加入T8微球使鍵合的CD8細(xì)胞移位區(qū)域B，通過比較圖17A和17B的散點(diǎn)圖可以看到它們已經(jīng)彼此分開，可以對(duì)它們進(jìn)行鑒別和計(jì)數(shù)。在圖17A中CD8細(xì)胞淹沒在剩余的白血球中。在圖17B中，已將嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞從散點(diǎn)圖中除去，否則它們會(huì)遮蔽對(duì)移位的CD8細(xì)胞的鑒別。圖17A表示了嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞的去除過程，而圖17B接著清楚地表明CD8鍵合細(xì)胞正從A區(qū)移向B區(qū)。此處的緩沖溶液可以用Sigma Chemical Company of st.Louis，Missouri出售的磷酸鹽緩沖溶液。
圖18A是進(jìn)一步表明用分析器(352)得到的單核細(xì)胞(M)、淋巴細(xì)胞(L)和粒性白血球(G)群體位置的常規(guī)的散點(diǎn)圖或稱三參數(shù)矩形圖。正如從圖17B所見的那樣，由于沒有除去粒性白血球，代表移位的白血球子群體的B區(qū)被數(shù)量大得多的粒性白血球遮蔽住。圖18B是嗜曙紅細(xì)胞和嗜中性白血球。去除后剩余的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞白血球群體的散點(diǎn)示意圖。雖然嗜堿細(xì)胞仍然會(huì)部分地遮蔽有關(guān)區(qū)域，但由于它們的數(shù)量(百分率)只占白血球群體的很小的一部分，因此不會(huì)明顯影響所需要的子群體的計(jì)算結(jié)果(即百分率)。不過，如果需要也可把嗜堿性細(xì)胞的影響從子群體百分率中扣除掉。
圖19A-D、20A-D、21A-D是對(duì)從三個(gè)不同患者身上分別抽取的血樣的CD2、CD4、CD8和CD20白血球子群體直接子群體分析所得結(jié)果的示意圖。就每個(gè)子群體的情況而言，將28微升全血樣品同20微升鍵合有對(duì)嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞特異的抗體的磁性微球(重量體積比為2.5%)相混合。此外，也將鍵合有相應(yīng)的單克隆抗體、用于相應(yīng)的白血球子群體的非磁性微球同樣品相混合。分別被T4、T8、T11或B1細(xì)胞涂覆的各種微球的量都是40微升(單位體積的每種溶液中微球重量都是1%)。分別將每種成份齊全的混合物(如帶有T8的N和E微球)同一磷酸鹽緩沖溶液(即PH為7.2到7.4的1%的牛血清蛋白)相混合，配成總體積為150微升的溶液。分別把每種混合物在容器(378)中用混合器(376)混合2分鐘，再放入磁場(chǎng)(440)中1分鐘。在這些例子中，按順序用上面提到的溶劑除去紅血球。過程是，先加入白血球微球，然后用來自溶劑源(370)的300微升的溶劑溶解去除紅血球。所用的溶劑可以是Coulter電子公司出售的Erythrolyse溶解試劑。然后用來自源(380)的120微升猝滅劑(如還是Coulter電子公司出售的一種白血球保護(hù)劑Stabilyse)猝滅該混合物，再將此混合物送入分析器(396)進(jìn)行分析。
每個(gè)散點(diǎn)圖中右側(cè)的框(1)分別代表有關(guān)白血球子群體。圖中所示的框1、2、3等看上去(或者自然而然地)都與有關(guān)白血球群體或子群體相適應(yīng)。
用通用的血球計(jì)數(shù)器對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行比較。下面就給出了用本發(fā)明的方法(移位法SHIET)與流動(dòng)血球計(jì)數(shù)器法(CYT)對(duì)三個(gè)樣品所作的用百分率表示的比較結(jié)果。
T4(圖19A) T8(圖19B) T11(圖19C) B1(圖19D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者樣 51 52 18 22 82 76 15 13品1，T4(圖20A) T8(圖20B) T11(圖20C) B1(圖20D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者樣 53 54 32 29 89 83 6.5 7.00品2，T4(圖21A) T8(圖21B) T11(圖21C) B1(圖21D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者樣 46 46 24 18 86 81 11 10品3，圖22A也示出了分析器352得到的M、L和G細(xì)胞群體正常散點(diǎn)圖或稱3參數(shù)位置圖。沒有去除N和E時(shí)，CD4細(xì)胞被這些細(xì)胞群體遮蔽住。如圖22B所示，用對(duì)N和E特異的單克隆抗體微球把N和E移至區(qū)域1(即框1)，CD4群體看上去也被移至區(qū)域2(框2)，在圖22A中該區(qū)域被N和E所遮住。在該例子中，對(duì)應(yīng)于圖22C，將28微升全血樣品與50微升直徑為2.2微米的微球(微球上鍵合了對(duì)N和E特異的單克隆抗體)，以及50微升鍵合有對(duì)T4特異的單克隆抗體的微球和22微升稀釋劑相混合。圖22B除沒有T4微球和稀釋劑為72微升外與圖22C基本相同，圖22A除沒有任何微球和稀釋劑為122微升外也與圖22C相同。
圖23A-D示意了采用大量與有關(guān)的白血球子群體相鍵合的微球?qū)Π籽蜻M(jìn)行直接分析的情況。圖23A和23B分別是用0.8微米非磁性微球使帶有T4白血球子群體和T11白血球子群體的L群體的每個(gè)發(fā)生移位散點(diǎn)圖。從圖23A和23B中可以看出，這個(gè)白血球群體偏移量還不夠大，還無法區(qū)分各白血球子群體。圖23C、23D都是具有T4和T11白血球子群體L群體的散點(diǎn)圖，其中分別用0.8微米和2.2微米同T4白血球子群體和T11白血球子群體相鍵合的方式使T4白血球子群體和T11白血球子群體發(fā)生偏移。通過使山羊抗鼠IgG抗體附著在2.2微米微球上方式使0.8微米微球結(jié)合在2.2微米微球上，該山羊抗鼠IgG抗體與T4或T11抗體相結(jié)合，并通過它與0.8微米微球結(jié)合。
圖24A-C表示與有關(guān)的白血球子群體結(jié)合的非磁性微球粒度大小的影響。在這個(gè)例子中，將28微升全血樣品同10微升鍵合有對(duì)N和E特異的抗體的磁性微球(單位體積溶液中微球重2.5%)和40微升鍵合有對(duì)T8特異的抗體的非磁性微球(單位體積溶液中微球重1%)相混合。所用的T8微球有兩種大小，以表明其對(duì)散點(diǎn)圖中群體偏移的影響。再加入一種緩沖溶液，配成150微升體積的混合物，將混合物攪拌混合2分鐘，再在磁場(chǎng)中放置1分鐘。將所得到的N和E已被去除了的混合物用溶劑進(jìn)行溶解，以去除紅血球，然后進(jìn)行分析。圖24A中有一未附著在微球上的對(duì)照白血球子群體，一個(gè)鍵合在2.2微米非磁性微球上的T8白血球子群體，以及一個(gè)鍵合在3.0微米非磁性微球上的T8白血球子群體。圖中所標(biāo)的寬度和高度表示探測(cè)信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖24B是表明3.0微米微球與T8白血球子群體鍵合造成T8偏移的一個(gè)散點(diǎn)示意圖，而圖24C是表明2.2微米微球與T8白血球子群體鍵合造成T8偏移的一個(gè)散點(diǎn)示意圖。對(duì)不同的微球，分析得出的T8白血球子群體的百分率分別是20.9和19.3。圖24B表明，較大的微球明顯地產(chǎn)生一更為清晰的散點(diǎn)分布。
圖25A-D表示根據(jù)第二個(gè)原申請(qǐng)對(duì)兩個(gè)白血球子群體同時(shí)進(jìn)行直接分析的情況。在這個(gè)例子中，把28微升全血樣品同10微升鍵合有對(duì)N和E特異的抗體的磁性微球、52微升緩沖溶液和40微升鍵合有對(duì)T8特異的抗體的3微米非磁性微球相混合，然后攪拌混合2分鐘。再把此混合物在磁場(chǎng)中放置1分鐘，然后用溶劑溶解得到的N和E已被除去的混合物以去除紅血球，再對(duì)混合物進(jìn)行分析。圖25A中有一未附著在微球上的對(duì)照白血球子群體樣品，一個(gè)鍵合在2.2微米非磁性微球上的T4子群體的讀數(shù)，一個(gè)鍵合在3.0微米非磁性微球上的T8子群體的讀數(shù)，該圖表明兩個(gè)偏移了的白血球子群體已經(jīng)分離。圖25B為鍵合在2.2微米微球上的T4白血球子群體偏移至區(qū)域A的散點(diǎn)分析圖，圖25C為鍵合在3.0微米微球上的T8白血球子群體偏移至區(qū)域B的散點(diǎn)分析圖。圖25D為T4和T8白血球子群體偏移至各自的區(qū)域A和B的散點(diǎn)分析圖，這樣就可以對(duì)T4和T8子群體進(jìn)行同時(shí)分析。
圖26A-D四個(gè)不同的散點(diǎn)圖用不同的參數(shù)示出了L、M和G三個(gè)群體。雖然前面的例子只用渾濁度比DC(RF/DC)來描述，但實(shí)際上可用任何兩個(gè)不同的參數(shù)來構(gòu)成散點(diǎn)圖。圖26A表示只用RF/DC構(gòu)成的散點(diǎn)圖，圖26B則用了渾濁度/RF，圖26C用渾濁度/(DC-RF)，圖26D則用前述的渾濁度/DC。此外，雖然采用的是DC/RF或RF/DC，但只要兩信號(hào)能彼此分開，由于兩信號(hào)的頻譜位置和/或相位的不同，采用任何兩個(gè)頻率都行。渾濁度是一個(gè)優(yōu)選的參數(shù)，因?yàn)樗巧漕l信號(hào)的歸一化形式。正如圖26A-D所清楚表明的那樣，可以根據(jù)需要改變數(shù)據(jù)的圖象。DC是所檢測(cè)的細(xì)胞或生物體體積的函數(shù)，而RF是所檢測(cè)的細(xì)胞或生物體的內(nèi)導(dǎo)和體積的函數(shù)。
圖27-46示出了本發(fā)明的實(shí)施例。
在圖27中，一般用500來表示對(duì)細(xì)胞(如具有多個(gè)區(qū)別類型的細(xì)胞)進(jìn)行分類的方法和裝置的第一個(gè)實(shí)施例。裝置或分析儀(500)包括一生物樣品(502)，該樣品含有至少一個(gè)第一組活的生物細(xì)胞(圖中未示出)，包括一全血樣品中或來自一全血樣的至少兩個(gè)白血球群體。
生物樣品(502)的細(xì)胞將參加一定量和/或定性測(cè)定或分析的生物反應(yīng)。生物樣品(502)可包括一緩沖溶液，細(xì)胞就加入到該溶液中。
生物樣品(502)經(jīng)管路(504)同來自管路(508)的至少一種試劑(506)混合。在分析儀(500)的一紅血球分離裝置(510)中，紅血球從混合物中分離出。和第一個(gè)原申請(qǐng)的情況一樣，從裝置(510)中去除紅血球的方式可以有許多種，如裝置(20)所列舉的。
將分離出紅血球后的混合物第一部分經(jīng)一個(gè)管路(514)輸送白血球分析器(512)。這樣就獲得一個(gè)對(duì)生物樣品(502)的總的或整個(gè)群體標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ帐侄?。分析?512)可以是和分析器(86)相同的分析器，也可以是一個(gè)光敏分析器，例如在1987年3月13日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮镹o25442的以及在1987年12月4日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮镹o129954的名稱為“由幾部分組成的利用光的散射技術(shù)的差動(dòng)分析儀器”的申請(qǐng)，這兩份專利申請(qǐng)文件包括在參考文件里。這個(gè)單獨(dú)的檢測(cè)參量可以是電子學(xué)的，例如射頻或直流信號(hào)，也可以是光信號(hào)，例如中間角度(median angle)的光散射或者任何其它所希望的光參量。
將混合物的第二部分經(jīng)管路(518)輸送到N分離裝置(516)，通過加入上面鍵合有特定N抗體的適宜的磁性微球的方法將N分離出，在這個(gè)例子中所用的特定N抗體是在1986年12月8日申請(qǐng)的原申請(qǐng)?zhí)枮镹o168306，現(xiàn)申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)枮镹o938864的名稱為“單克隆抗體對(duì)嗜中性血球的測(cè)定”，這篇文件包括在參考文件中。為了把磁鍵合的細(xì)胞從混合物中分離出去，如前所述，可以利用磁鐵或磁場(chǎng)，將分離出N后的剩余的混合物經(jīng)管路(520)，輸送到分析器(512)。然后將對(duì)這部分混合物分析的結(jié)果在比較器(522)中同第一部分混合物的分析結(jié)果相比較，從而得到在生物樣品(502)中N的百分率。
將第三部分混合物經(jīng)管路(526)輸送到N和E分離器(524)，通過把上面鍵合有N和E特定抗體的合適的微型磁球加入的方法，在1987年6月3日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮镹o068618、名稱為“單克隆抗體對(duì)嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞的共同決定子部位的專一性的專利申請(qǐng)描述了這樣的N和E特定抗體的例子，這篇專利申請(qǐng)文件也包括在參考文件中。分離的鍵合在同一的或分離的磁性微球上的N和E特定的抗體還可以在適當(dāng)?shù)牡胤交蜓兄频膱?chǎng)合下應(yīng)用。將分離出Ns和Es后的剩余混合物經(jīng)管路(528)輸送到分析器(512)，將這部分混合物的分析結(jié)果在比較器(522)中與第一部分和第二部分混合物的結(jié)果相比較，從而獲得Es和Ms在生物樣品(520)中的百分率。
將第四部分混合物經(jīng)管路(532)輸送到L和N分離裝置(530)，通過把上面鍵合有L和N特定抗體的適當(dāng)磁性微球加入的方法去掉L和N，其中的N特定抗體可以是上述參考文件中的N特定抗體，也可以是其它適合的抗體，其中的L特定抗體可以是研制的L特異性抗體或者是由Coulter公司Coulter免疫學(xué)分部銷售的名稱為T11和2H4特異抗體的組合物，這兩種特異抗體把所有的L結(jié)合在一起。將分離出L和N后的剩余的混合物經(jīng)管路(534)輸送到分析器(512)，然后可以把對(duì)這部分混合物的分析結(jié)果同其它各部分混合物的結(jié)果相比較，從而獲得到B和L在生物樣品(502)中的百比率。
這樣，分析儀(500)完成了細(xì)胞的單一分類，例如N利用管路即通道(514)和(518)，E和/或N和/或M利用管路(514)、(518)和(526)，而全部五部分的白血球的區(qū)分利用所有的四個(gè)管路。分析儀器500)的一個(gè)最重要的特性是只用單個(gè)的分析參量就可分析混合物，例如這個(gè)參量可以是一個(gè)電參量，也可以是一個(gè)光的參數(shù)。其它的組合可以利用，但是在每種情況下只用單一的檢測(cè)的參量或特性是為完成本發(fā)明的分類所必需的。
圖28說明了一個(gè)把方法和裝置分析儀(500)結(jié)合在一起的分析儀器的實(shí)施例，由總的代號(hào)(540)來代表這個(gè)儀器。這個(gè)儀器(540)包括吸氣泵機(jī)構(gòu)(542)，它用于將感興趣的生物樣品(例如樣品502)抽到儀器(540)中，這個(gè)吸氣泵機(jī)構(gòu)(542)經(jīng)管路(544)連接到與取樣器(548)相連接取樣閥(546)上。生物樣品(502)經(jīng)管路(550)和多通閥(551)輸送到分開的通道(514)、(518)、(526)和(532)中。
現(xiàn)在來描述第一通道(514)，樣品部分被輸送到容器(552)中，這個(gè)容器可以是一個(gè)混合容器，為了除去紅血球?qū)悠泛驮噭┹斔偷皆撆撝?。例如利用溶?lyse)，通過把適合的溶劑加到紅血球上，使紅血球在容器(552)中溶解，最好使紅血球和溶劑攪拌混合，在反應(yīng)完成后，把猝滅劑或固定劑送到容器(552)。
在這里可以利用的適合的混合裝置的具體細(xì)節(jié)已由1987年3月13日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)朜o25337，名稱為“用于促進(jìn)生物反應(yīng)的小體積快速混合的方法和裝置”中所表述，這篇專利申請(qǐng)包括在參考文件中。通過利用混合器，使反應(yīng)速度大大加快，而對(duì)細(xì)胞的重要的性質(zhì)并沒有明顯的損害，例如在可能引起反應(yīng)溫度升高的情況下也能這樣。而且這個(gè)反應(yīng)通常是在比一分鐘小得多的時(shí)間內(nèi)完成的，通常是在15秒或更短的時(shí)間內(nèi)完成，這樣，就能使大容積分析儀器(540)進(jìn)行自動(dòng)快速分析。
溶解去掉紅血球后的猝滅的反應(yīng)混合物經(jīng)過管路(554)輸送到多通閥(556)，或者直接經(jīng)管路(560)輸送到白血球分析器(558)中。分析器(558)根據(jù)計(jì)數(shù)和測(cè)定大小的技術(shù)的不同可以有得多種物理上的型號(hào)，這些技術(shù)由Wollance.H.Coulter在美國(guó)專利No 2656508中，這份專利是關(guān)于作為包括在一些商品化的血液細(xì)胞計(jì)數(shù)量中的利用光或電子檢測(cè)技術(shù)的，這個(gè)產(chǎn)品的受讓人是Coulter.Electronics Inc.。
分析器(558)一般包括一個(gè)流量檢測(cè)器即檢測(cè)容器(562)，容器(562)包括一個(gè)具有通孔的傳感器(564)，容器(562)包括裝有與容器的流體相接觸的第一電極(568)的第一部分(566)，容器的部分(566)和電極(568)可以經(jīng)檢測(cè)孔和在里面裝有第二電極(572)的容器的第二部分(570)相連通。
電極(568)和(572)經(jīng)電抗性的導(dǎo)線與射頻/直流電源和檢測(cè)電路(574)相連接。電路(574)可以連接在電極(568)和(572)之間的直流、或低頻電流(或信號(hào))，也可又連接高頻信號(hào)。
這個(gè)低頻信號(hào)用于檢測(cè)被通過檢測(cè)孔的細(xì)胞所產(chǎn)生的脈沖信號(hào)的大小，這個(gè)高頻信號(hào)同樣可以用作單一參量或者和低頻信號(hào)一起，以便獲得通過檢測(cè)孔的同一細(xì)胞的光渾濁度。
細(xì)胞光渾濁度測(cè)量方法由Wallace H.Coulter和Walter.R.Hogg在美國(guó)專利No3502974和其后的幾篇專利以及受讓人Coulter.Electronics Inc的出版物中所公開。在這里可以利用的一個(gè)具體電路由原申請(qǐng)?zhí)?68008名稱為“用于測(cè)量顆粒的抗體和反應(yīng)性的粒子分析器”中所公開，這篇申請(qǐng)是在1986年10月21日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮镹o 921654，，現(xiàn)在被批準(zhǔn)的美國(guó)專利號(hào)為No 4791355的后續(xù)申請(qǐng)，它也包括在參考文件中。
由電路(574)根據(jù)檢測(cè)的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)一個(gè)直流信號(hào)線(576)和/或射頻信號(hào)線(578)饋送到比較器(580)(類似于比較器26)中，這個(gè)比較器(580)可以存儲(chǔ)由第一部分混合物(即沒有紅血球群體或減去子群體)產(chǎn)生的信號(hào)，以便同從后序的幾個(gè)部分混合物得到的結(jié)果相比較，這將在后面描述。
分析器(558)可以包括在檢測(cè)器(562)中一個(gè)陽(yáng)極(Sheath)流集中細(xì)胞，這是公知的技術(shù)。這個(gè)陽(yáng)極流可以由一個(gè)射流系統(tǒng)(582)來提供，該射流系統(tǒng)用公知的技術(shù)同檢測(cè)器相配合。分析器(558)已經(jīng)對(duì)結(jié)合射頻和直流分析電路做了說明，這僅作為一個(gè)例子。為了獲得本發(fā)明的幾個(gè)部分的白血球群體或子群體的特性，僅需要利用單一的檢測(cè)參量(電的或光的)在電檢測(cè)的情況下，這個(gè)參量可以是直流也可以是射頻信號(hào);利用光學(xué)檢測(cè)時(shí)(未描述)，也只用單一的參量，例如需要用一個(gè)中間角度光散射。這樣一維檢測(cè)簡(jiǎn)化了儀器(540)的結(jié)構(gòu)，還可降低儀器的成本。
樣品混合物的第二部分通過閥(551)經(jīng)管路(518)輸送到N分離裝置(516)，分離裝置(516)包括一個(gè)混合器或容器(584)，混合容器(584)經(jīng)管路(518)把第二部分混合物輸送到那里。混合器(584)可以包括上述的所有任選部件例如包括一個(gè)為供紅血球溶解的溶劑輸入管路。
如使用細(xì)胞溶解溶劑，在(586)中完成混合之后(其功能已經(jīng)說明)、經(jīng)過猝滅管路提供猝滅劑，同時(shí)或者相繼經(jīng)管路(590)從微型球源(588)向容器(584)供給微球，借助這些上面結(jié)合有特異抗體的適合的磁性微球?qū)分離出去，然后利用磁鐵(592)或磁場(chǎng)分離出靠磁力結(jié)合在微型磁球上的細(xì)胞，然后混合和猝滅后的混合物經(jīng)管路(520)通過閥(556)和管路(560)輸送到白血球分析器(558)按如前所述的方法進(jìn)行分析。去掉N后的分析過的混合物的結(jié)果在比較器(580)中被比較，從而測(cè)定出在樣品(502)中的N的百分率。
樣品(502)的第三部分混合物經(jīng)管路(550)和閥(551)，再經(jīng)管路(526)輸送到N和E的分離裝置(524)中，分離裝置(524)包括一個(gè)混合容器(594)。在這第三部分混合物中，用紅血球細(xì)胞溶劑去掉紅血球，然后送到容器(594)，在該溶劑和樣品部分混合后，再經(jīng)猝滅管路進(jìn)行猝滅，N和E被鍵合有N和E特異抗體的磁性微球或結(jié)合在微型磁球上的抗體分離出，這些微球經(jīng)管路(598)由微球源輸送到容器(594)中。這些微球在(600)中完成混合過程，然后這些結(jié)合有N和E的微球在(602)中被分離出。被分離出N和E后的混合物經(jīng)管路(528)輸送到閥(556)，然后經(jīng)管路(560)輸送到分析器(558)中，以便獲得上面提及的結(jié)果。
這個(gè)儀器可以利用前兩個(gè)通道(514)和(518)測(cè)定N的百分率，或者根據(jù)需要利用前三個(gè)通道(514)、(518)和(526)獲得N和E的百分率和/或M的百分率。為了進(jìn)一步獲得白血球群體或子集群體的特征值，可將樣品混合物(502)的第四部分經(jīng)管路(550)和閥(551)，再經(jīng)管路(532)輸送到L和N分離裝置(530)，并且通過例如在容器(604)中溶解的方法將紅血球分離出去，而L和N則通過把L和N鍵合到有L和N的特異抗體的微型磁球或結(jié)合有特異抗體的微型磁球上來分離出L和N，這些磁性微球是經(jīng)管路(608)從微球源(606)輸送到混合容器(604)中的。這些微球在(610)中完成混合，接著在(612)中將靠磁力結(jié)合L和N的微球被磁場(chǎng)分離出。
分離出L和N的混合物經(jīng)管路(534)輸送到閥(556)，再經(jīng)管路(560)輸送到分析器(558)，以便獲得上面提及的結(jié)果。利用其它幾個(gè)通道的組合，可以獲得L和/或B的百分率，這樣達(dá)到完成確定完整的五部分的白血球的數(shù)量上區(qū)別程度，從而獲得了N、E、M、L和B的百分率。混合器包括適合的沖洗管路和廢物排放管路，儀器(540)可以包括一個(gè)取樣管的沖洗管(614)，以便在抽取下一個(gè)分析的樣品或下一個(gè)樣品部分之前清洗儀器(540)。此外，根據(jù)需要樣品(502)可以經(jīng)管路(618)從源稀釋。
結(jié)合在方法和分析器(500)裝置里的唯一的一個(gè)管路系統(tǒng)實(shí)施例已經(jīng)描述過了，但是，本專利申請(qǐng)中的類似實(shí)施例可以根據(jù)各種方案進(jìn)行補(bǔ)充，例如分析儀器(540)可以在許多布置中實(shí)現(xiàn)。例如，分析器(540)可以包括一個(gè)單通道，象通道(518)，而樣品的每一部分可以順序地通過分離裝置(516)，以便使相應(yīng)的一個(gè)白血球群體或幾個(gè)群體從每一個(gè)部分樣品中分離出，這正如前面對(duì)這些分離通道所描述的那樣。
現(xiàn)在參看附圖29A-D和附圖30A-D，圖中示出了兩組一維散射譜的由幾部分組成的特征值結(jié)果，這個(gè)結(jié)果是從一個(gè)全血液樣品中獲得的，是對(duì)類似于分析儀器(540)采用標(biāo)準(zhǔn)分析的方法而完成的試驗(yàn)，在每種情況下生物樣品為28微升全血液樣品，對(duì)于在第一通道(514)使用的部分樣品，該樣品同122μl緩沖液相混合，這部分樣品用300μl紅血球最合適的細(xì)胞溶劑溶解(見上面在容器(552)的引證)，這部分樣品被溶解4秒種，然后在經(jīng)管路(554)、閥(556)和管路(560)輸送到分析器(558)之前用120μl猝滅劑猝滅。在圖29和30中示出了了利用一維電檢測(cè)參量的分析結(jié)果，為獲得圖29A-29D中的數(shù)據(jù)采用的是直流信號(hào)，為獲得圖30A-30D中的數(shù)據(jù)(為比較用)采用的射頻信號(hào)，其中所用的試樣是同一個(gè)樣品部分，測(cè)量是在同樣的時(shí)間內(nèi)在分析器(558)中完成的。在圖29A中得到兩個(gè)明顯的的可區(qū)分的數(shù)據(jù)峰(620)和(622)，在圖30A中得到兩個(gè)明顯可區(qū)分的數(shù)據(jù)峰(624)和(626)，峰(620)和(624)表示樣品中的L和B的百分率;峰(622)和(626)代表了樣品中的N，E和M的百分率。顯然在一維的條件下，不需要處理，這些單個(gè)的百分率在同一數(shù)據(jù)峰里被競(jìng)爭(zhēng)的細(xì)胞所掩蔽，如上面參考的申請(qǐng)中所述，這至少在為了區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)而用于大于某一個(gè)參量的場(chǎng)合下，對(duì)某些細(xì)胞來說沒有問題的。
在第二通道(518)中，將28μl的全血樣品部分同40μl上結(jié)合有N特異抗體的磁性微球相混合，然后在容器(584)中同82μl緩沖液相混合，將這部分樣品混合攪拌60秒鐘，再按通道(514)中采用的溶解和猝滅操作，再在分離出N后的混合物經(jīng)管路(520)、閥(556)和管路(560)輸送到分析器(558)之前將這部分樣品放在磁場(chǎng)(592)中30秒鐘。這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果如圖29B中的兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(628)和(630)所示，以及如圖30B中的兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(632)和(634)所示，峰(628)和(632)和峰(620)和(624)分別仍是同一個(gè)峰，盡管它們?cè)跇悠分械陌俜致尸F(xiàn)在比較大一些。另一方面峰(630)和(634)代表了分離出N后的E和M的百分率，數(shù)據(jù)峰(630)和(634)分別與數(shù)據(jù)峰(622)和(626)比較后，就測(cè)定出在全血樣品中N的百分率。
緊接著，或任何包括基本上同時(shí)的順序，第三部分28μl的樣品被輸送到第三通道(526)并同20μl的帶有E和N的特異抗體的磁性微球或在上面結(jié)合有這二種抗體的磁性微球攪拌混合。然后，在(594)容器中同102μl的緩沖液相混合，這部分樣品被攪拌混合30秒鐘，然后按照和在通道(514)中相同的方式溶解和猝滅，再在這個(gè)分離出N和E后的混合物經(jīng)管路(528)、閥(556)和管路(560)輸送到分析器(558)之前，放在磁場(chǎng)(602)中30秒鐘。在圖29C中又得到兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(636)和(638)，在圖30C中得到數(shù)據(jù)峰(640)和(642)，峰(636)和(640)和峰(620)和(624)分別對(duì)應(yīng)同一成分結(jié)果。另一方面數(shù)據(jù)峰(638)和(642)在同數(shù)據(jù)峰(622)和(626)比較后代表了在全血樣品中的M的百分率。再使數(shù)據(jù)峰(638)和(642)同數(shù)據(jù)峰(630)和(634)相比較，就可測(cè)定出E在全血樣品中的百分率。
第四部分28μl樣品被輸送到第四通道(532)中同70μl的上面鍵合有CD2特定抗體磁性微球和50μl上面結(jié)合有CD45R的特定抗體的磁性微球在容器(604)中攪拌混合，這部分樣品經(jīng)攪拌混合2分鐘，然后放在磁場(chǎng)(612)中30秒鐘，將剩余的混合物經(jīng)管路(646)轉(zhuǎn)移到一個(gè)存儲(chǔ)容器(644)中。這個(gè)存儲(chǔ)容器看來是必需的，因?yàn)楦鶕?jù)上述提到的名稱T11和2H4和N特定的抗體所采用的特定抗體，在同時(shí)采用時(shí)可能會(huì)相互干擾。目前還不清楚這是由于這些特定抗體引起的，還是由細(xì)胞本身的性質(zhì)引起的。一旦分離出結(jié)合有細(xì)胞的T11和2H4后的混合物輸送到容器(644)后，就要用除去磁場(chǎng)來清洗容器(604)，以便清除上面結(jié)合有CD2和CD45R細(xì)胞群的微型磁性球。
然后，將結(jié)合N的磁性微球在容器(604)中分離，這些磁性微球可以由另外一個(gè)源(未示出)提供，而不是由源(606)提供的。這個(gè)分離操作是先將這些40μl的上面結(jié)合有N特定抗體的磁性微球保持在磁場(chǎng)(612)中，然后將緩沖液排放出去。另一方面這個(gè)混合物可能被調(diào)節(jié)，因而該緩沖液被作為混合物的一部分來利用，或者是利用磁性微球的濃縮的體積以及該溶液不需利用。然后，這部分樣品從容器(644)經(jīng)管路(648)返回容器(604)，同上面結(jié)合有N特定抗體的微型磁球攪拌混合，再按在通道(514)所述的方法溶解和猝滅，然后在分離出所有L和N后的混合物經(jīng)管路(534)、閥(556)和管路(560)輸送到分析器(558)之前，再次放在磁場(chǎng)中保持30秒鐘，試驗(yàn)結(jié)果如圖29D中兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(650)和(652)和圖30D中的兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(654)和(656)所示。峰(650)和(654)僅代表B，因?yàn)長(zhǎng)已經(jīng)全部被分離出去。因?yàn)長(zhǎng)約占正常的全血液樣品的30%，所以，使原來在樣品中占約19%的B增強(qiáng)一個(gè)非常明顯的數(shù)據(jù)峰(即數(shù)據(jù)的總數(shù))，因?yàn)镹在以前就從峰(652)和(656)中分離開，而N原本占樣品的60%，所以使B峰值進(jìn)一步增強(qiáng)，因此，現(xiàn)在的B約占剩余的B、M和E細(xì)胞的10%。
實(shí)際計(jì)算百分率按下述方法進(jìn)行用兩個(gè)峰值(利用圖29A-29D作為例子)的總的數(shù)據(jù)去除一個(gè)數(shù)據(jù)峰(該峰值的細(xì)胞計(jì)數(shù))來計(jì)算出數(shù)據(jù)峰的細(xì)胞數(shù)目
1.)M%-從通道(526)測(cè)定的結(jié)果〔(峰1(620))(峰1(636))〕××峰2(638)2.)M+E%-從通道(518)測(cè)定的結(jié)果〔峰1(620)(峰1(628))〕××峰2(630)＝M+E%3.)E%＝M+E%-M%4.)N%＝〔峰2(622)〕-M+E%5.)B%-從通道(532)測(cè)定的結(jié)果〔峰2(630)(峰2(652))〕××〔峰1(650)〕＝B1%B1%××〔(峰1(620))(峰2(628))〕＝B%6.)L%＝〔峰1(620)〕-B%根據(jù)在圖29和30中所示出的數(shù)據(jù)，從射頻和直流數(shù)據(jù)的計(jì)算結(jié)果在表Ⅱ中給出表Ⅱ通道 直流 射頻峰1 峰2 峰1 峰2514 28.1 71.9 30.3 69.7518 74.4 25.6 74.1 25.9526 83.8 16.2 83.4 16.6532 10.9 90.1 10.0 90.0整個(gè)五個(gè)部分N、L、M、E和B的從直流和射頻數(shù)據(jù)峰值計(jì)算出的百分率的差別也計(jì)算出來，為了驗(yàn)證的目的，把這些差別和光檢測(cè)儀器的測(cè)定結(jié)果比較過，如在美國(guó)的No025442號(hào)申請(qǐng)中所敘述的。
表Ⅲ五部分的差別光 直流 射頻N61.58 N62.2 N59.1L28.50 L26.9 L29.1M6.27 M5.4 M6.0E3.10 E4.3 E4.6B0.56 B1.2 B1.2現(xiàn)在參看圖31A-D和圖32A-D，這些圖中示出了第二個(gè)兩組一維由多部分特征結(jié)果所組成的散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖是從第二組全血樣品中測(cè)得的。在每種情況下的生物樣品都是28μl全血樣品，按照相應(yīng)于圖29和31的所述的每個(gè)通道予備的這個(gè)樣品在容器(552)中的第一通道(514)中溶解猝滅，然后輸送到分析器(558)，通過一維電參量檢測(cè)獲得的結(jié)果示在圖31和32中。為了獲得31A-31D中的數(shù)據(jù)采用的是直流信號(hào)，為了獲得32A-32D中的數(shù)據(jù)(用于比較)采用射頻，所用的是同一樣品，并且是在同一時(shí)間在分析器(558)中測(cè)量的。在圖31A出現(xiàn)兩個(gè)明顯可區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)峰(658)和(660)，在圖32A中出現(xiàn)數(shù)據(jù)峰(662)和(664)。峰(658)和(662)代表了L和B在樣品中的百分率，峰(660)和(664)代表了N、E和M的百分率，同樣是在一維沒有進(jìn)一步處理的情況下，單個(gè)的百分率被在同一數(shù)據(jù)峰的競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞所掩蔽。
在第二通道(518)中，第二部分全血樣品同上結(jié)合有N特定抗體的磁性微球在容器(584)中混合，攪拌溶解和猝滅，在分離出N后的混合物輸送到分析器(558)之前放在磁場(chǎng)(592)中。在圖31B中得到兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(666)和(668)，而在圖32B中得到兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(670)和(672)。峰(666)和(670)和峰(568)和(662)是同一個(gè)峰，盡管在樣品中它們的百分率是比較大的。另一方面峰值(668)和(672)代表了分離出N后的E和M的百分率，然后可以把數(shù)據(jù)峰(668)和(672)分別同數(shù)據(jù)峰(660)和(664)相比較，以便測(cè)定N在全血樣品中的百分率。
下一個(gè)或在任何一個(gè)包括基本上同時(shí)的順序中，第三部分樣品輸送到第三通道(526)中，然后容器(594)中同帶有E和N特定抗體或上面結(jié)合有這兩個(gè)抗體的磁性微球攪拌混合，溶解和猝滅后，在分離出N和E后的混合物后輸送到分析器(558)之前放在磁場(chǎng)(602)中。結(jié)果在圖31C又是兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(674)和(676)，在圖32C中是兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(678)和(680)。峰(674)和(678)和峰(658)和(662)的作用是相同的，而數(shù)據(jù)峰(676)和(680)在同數(shù)據(jù)峰(660)和(664)比較以后代表了在全血樣品中M的百分率。把數(shù)據(jù)峰(676)和(680)同數(shù)據(jù)峰(668)和(672)比較以后，可以確定出在全血樣品中E的百分率。
第四部分樣品被輸送到第四通道(532)中，然后在容器(604)中同上面鍵合有CD2特定抗體的磁性微球和上面結(jié)合有CD45R特定抗體的磁性微球攪拌混合后，放在磁場(chǎng)(612)中，再將剩余的分離過的混合物輸送到存儲(chǔ)容器(644)。
將上面結(jié)合有N特定抗體的磁性微球保持在磁場(chǎng)(612)中，然后將緩沖液排出去，這樣就完成了在容器(664)中對(duì)N結(jié)合的磁性微球的分離。在這部分樣品經(jīng)管路(648)從容器(644)清洗之后，返回到容器(604)，并同上面結(jié)合有N特定抗體的磁性微球攪拌混合，溶解和猝滅，接著在L和N全部分離出后的混合物輸送到分析器(558)之前，這部分樣品再放在磁場(chǎng)(612)中。結(jié)果是在圖31D中得到兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(682)和(684)，而在圖32D中得到兩個(gè)數(shù)據(jù)峰(686)和(688)。峰(682)和(686)只代表B，因?yàn)槿康腖已經(jīng)分離出，從而使B增強(qiáng)為一個(gè)很明顯的數(shù)據(jù)峰(即數(shù)據(jù)的總量)。B因?yàn)镹在以前就被從峰(684)和(688)中除去，因此也從剩余的樣品中分離出而得到增強(qiáng)。
實(shí)際的百分率的計(jì)算可根據(jù)下述方法(和以前相同)來完成，通過把數(shù)據(jù)峰(在峰中的細(xì)胞記數(shù))被兩個(gè)峰的總的數(shù)據(jù)去除而得到計(jì)算出的數(shù)據(jù)峰的值(利用圖31A-31D作為例子)1.)M%-來自通道(526)測(cè)定的結(jié)果〔峰1(658)(峰2(674))〕××峰2(676)＝M%2.)M+E%-來自通道(518)測(cè)定結(jié)果〔峰1(658)(峰2(666))〕××峰2(668)＝M+E%3.)E%＝M+E%-M%4.)N%＝峰2(660)-M+E%5.)B%-來自通道(532)的測(cè)定結(jié)果〔峰2(668)(峰2(684))〕××〔峰1(682)〕＝B1%B1%××〔峰1(658)〕〔峰1(666)〕＝B%6.)L%＝〔峰1(658)〕-B%
根據(jù)圖31和32中所給出的數(shù)據(jù)，對(duì)射頻和直流數(shù)據(jù)的計(jì)算值列在表Ⅳ中。
表Ⅳ直流 射頻通道 峰1 峰2 峰1 峰2514 24.0 76.0 26.0 74.0518 63.3 36.7 62.6 37.4526 76.0 24.0 75.2 24.8532 10.6 89.4 9.7 90.3在N，L，M，E和B百分率中的整個(gè)五部分的差值，根據(jù)直流和射頻峰值曾被計(jì)算過，再同一個(gè)光檢測(cè)儀器的結(jié)果相比較(為了核查的目的)，正如在美國(guó)No 025442的專利申請(qǐng)中所述。
表Ⅴ 五部分的差值光 直流 射頻N60.37 N62.1 N58.5L24.70 L22.4 L24.3M8.60 M7.6 M8.6E5.12 E6.3 E6.9B1.18 B1.6 B1.7利用直流數(shù)據(jù)峰的計(jì)算如下1.)M%＝24.0/76.0×24.0＝7.62.)M+E%＝24.0/63.0×36.7＝13.93.)E%＝(13.9)-(7.6)＝6.34.)N%＝(76.0)-(13.9)＝62.1
5.)B%＝36.7/89.4×10.6＝4.44.4×24.0/63.3＝1.66.)L%＝24.0-1.6＝22.4在圖29-32中的數(shù)據(jù)峰利用一個(gè)單一的電子檢測(cè)的參量(用直流信號(hào)或射頻信號(hào))曾經(jīng)被描繪過，渾濁度沒有說明過，但是如果需要也可以利用，因?yàn)槿缜笆龅闹绷?射頻信號(hào)。也可以利用一個(gè)單一的光檢測(cè)參數(shù)，例如中間角(median angle)光散射的結(jié)果，如在圖33-36所示。
現(xiàn)在參看圖33，細(xì)胞分類M、L、N和S借助兩個(gè)參量散射和電的數(shù)量(electricalvolume)來明顯分開。B在這個(gè)數(shù)據(jù)圖中是模糊不清的，然而在一維的情況下，在圖34中示出的同一散射數(shù)據(jù)又引起M使L模糊不清或反之，這正如在數(shù)據(jù)峰(690)中所看到的那樣。在數(shù)據(jù)峰(692)中所給出的N、E以及在數(shù)據(jù)峰(693)中給出的E和圖33中代表的是同樣的數(shù)據(jù)。
解決在峰(690)中這個(gè)模糊不清問題的一種方法是將M分離出去。目前是用脫機(jī)或予先準(zhǔn)備的工作模式可以完成的分離出M的操作，因?yàn)樵谑褂肅D14特定抗體(例如由Coulter Immunology Divisio of Coulter Corporation出售的MOZ)時(shí)M分離出的速度是緩慢的。例如，將400μl的全血樣品同200μl的百分之2- 1/2 上面結(jié)合有CD14特定抗體的磁性微球的溶液混合，當(dāng)這些磁性微球保存在磁場(chǎng)中時(shí)，這些磁性微球首先要通過把其中的流體分離出去實(shí)現(xiàn)分離。然后將該樣品加入使這混合物慢慢地混合，例如搖動(dòng)30分鐘后，再放入磁場(chǎng)中約5分鐘，此后這個(gè)分離出M后的混合物按照前述的操作在儀器(540)中進(jìn)行分析。這個(gè)數(shù)據(jù)為了比較起見又用兩維的方式，在圖35中給出，從圖中可以清楚地看出和圖33相比M已經(jīng)被貧化了，這樣就放大了剩余的白血球群體的數(shù)據(jù)。
在圖36中示出了一維散射結(jié)果特性，仍然獲得兩個(gè)特征峰(694)和(696)。峰(694)是從數(shù)據(jù)峰(690)把M分離出之后得到的，僅留下L的結(jié)果，峰(696)和數(shù)據(jù)峰(692)是相同的。峰(697)和峰(693)是相同的，峰(696)和(697)都是因?yàn)閺倪@部分樣品中分離出M而得到提高。雖然沒有具體說明，這個(gè)分離出M的樣品混合物是按照在峰(694)所說明的方法得到的，為了完成L的子群體的分析可以進(jìn)一步說明，如下所述。
雖然在說明分析儀(500)時(shí)是用四個(gè)分開的通道來作為例子的，但是用四個(gè)通道僅僅是為了提高本發(fā)明的分類方法的速度。本發(fā)明也可以用一個(gè)單一的通道來實(shí)驗(yàn)，這時(shí)不同部分的生物樣品(502)是被按順序處理的。
圖37示出了一個(gè)為了增強(qiáng)所要分類的在數(shù)量上小的或模糊的群體的測(cè)定結(jié)果的方法和儀器的分析器的實(shí)施例，該分析器用總的代號(hào)700來代表，本發(fā)明的這個(gè)方法和儀器可以用于測(cè)量含量少的群體，例如B或者子群體L。分析儀700包括一個(gè)生物樣品702，該樣品至少包括第一組活的生物細(xì)胞(未示出)，例如這些細(xì)胞可以在全血液樣品或從全血液樣品中取出的。如果是要對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行分類，那么這個(gè)樣品(702)至少包括B細(xì)胞群體和至少包括白血球群體，例如L細(xì)胞，通常樣品(702)應(yīng)至少包括所有白血球群體，然而如前面所述，各個(gè)群體或它們的子群體可以在離線或在予準(zhǔn)備步驟中分離。如果分類是對(duì)白血細(xì)胞的子群體進(jìn)行，則這個(gè)樣品(702)應(yīng)至少包括具有至少一可確定子群體的白血細(xì)胞群體。
首先描述B細(xì)胞的分類，B細(xì)胞在整個(gè)白血細(xì)胞群體中是數(shù)量很少的群體，其數(shù)量通常低于百分之一，顯然，把使B細(xì)胞模糊的白血細(xì)胞分離出去，將會(huì)增強(qiáng)B的分析和分類結(jié)果，因?yàn)檫@樣會(huì)使B相對(duì)增大很多，而剩余白血球的相當(dāng)可觀的部分作為其它的白血球的群體被排除出去，很明顯這種增強(qiáng)辦法對(duì)重要的數(shù)量少的或測(cè)定結(jié)果模糊不清的細(xì)胞群體是正確的。
在分析B細(xì)胞群體時(shí)用了單一的一維一個(gè)檢測(cè)量或一個(gè)參量，例如將在下面描述的在圖38中的射頻的結(jié)果，B因在單一的峰(704)中的L遮蔽變得模糊不清，L約占總的白血細(xì)胞群體的30%，而B就是僅僅L和B在一起也只占約3%。因此，為了更明確地分析和分類B，L應(yīng)整個(gè)地或基本上全部從樣品中分離出去。
樣品(702)經(jīng)管路(706)、與經(jīng)管路(710)來的至少一個(gè)試劑(708)相混合。紅血球在紅血球分離裝置(712)中通過前述方法之一分離出來，當(dāng)紅血球被分離出之后，所得到的混合物第一部分經(jīng)管路(714)輸送到白血球分析器(716)，這個(gè)白血球分析器可以是和上述的相同的，或者是對(duì)上述的分析器做些小的改變后的分析器。這個(gè)單個(gè)檢測(cè)參量可以是電的，例如射頻或直流信號(hào)，也可以是光的，例如散射或任何其它所希望的光參量。
這個(gè)混合物的第二部分經(jīng)管路(718)輸送到L分離裝置(720)，在此處L細(xì)胞結(jié)合到磁性微球上，這些磁球上包含有L特定的單克隆抗體或者在其上面鍵合有這些抗體。這至少帶有剩余B細(xì)胞的剩余混合物經(jīng)管路(722)輸送到白血球分析器(716)，這兩部分的分析結(jié)果經(jīng)饋線(726)輸入給比較器(724)，比較這兩個(gè)分析結(jié)果，從而測(cè)定樣品(702)中B的百分率。用這種方法獲得B從占該樣品混合物的1%-3%變?yōu)榇篌w上在第一特征峰(704)的到基本上百分之一百，從而提供了準(zhǔn)確的分析和特征值。用類似的方法，當(dāng)著所選擇的CD或其它白血球群體組是比較小的情況下，可以把全部的或某些剩余的L分離出去，以便增強(qiáng)對(duì)重要的剩余的CD組的分析效果。
接下來描述一個(gè)或幾個(gè)白血球群體的子群體進(jìn)行的分析和分類，這些子群體例如是CD2、CD4或CD8白血球群體的子群體。樣品(702)又將至少包括富有生命的生物細(xì)胞的第一類(未說明)，例如在全血樣品中或從全血樣品來。樣品(702)仍應(yīng)至少包括白血球群體的子群體，至少包括一個(gè)其他遮蔽的白血球群體或子群體;而樣品通常包括所有的白血球群體。
樣品(702)仍輸送到紅血球分離裝置(712)，然后第一部分經(jīng)管路(714)輸送到白血球分析器(716)。第二部分將被用于測(cè)定例如CD2組，例如，而這樣第二部分應(yīng)同磁性微球混合，這些磁球包括有結(jié)合在其上面CD2特定抗體，例如是Coulter Immunaloy Division of Coulter Corporation出售的T11。分離出CD2細(xì)胞后的剩余混合物應(yīng)經(jīng)管路(722)輸送到白血球分析器(716)。將這兩個(gè)分析結(jié)果在比較器(724)比較，從而提供對(duì)CD2組細(xì)胞的特征做所要求的描述。
分析儀(700)的操作可利用所需要的相應(yīng)的通道在儀器(540)上完成。當(dāng)需要時(shí)，或者在一個(gè)多通道儀器上，也可以仍在一個(gè)單通道儀器上按順序地完成。
現(xiàn)在參看圖38-38E，根據(jù)圖中示出的以一維散射圖的形式描繪的特性結(jié)果來測(cè)定CD4、CD8和CD2子群體，這是利用類似于分析儀器(540)中使用的一種標(biāo)準(zhǔn)方法來完成的。每種情況下生物樣品都是28μl全血樣品，樣品同122μl的緩沖液混合，以便對(duì)在通道(714)(它可以是儀器(540)中的通道(514))用作對(duì)照樣品。為了獲得圖38A-E中的特征曲線，利用了一維電子檢測(cè)參量(在這里是射頻信號(hào))的結(jié)果。這部分樣品同300μl的紅血球上面引證的(例如在容器(552)中)優(yōu)選的溶劑溶解4秒鐘，接著在輸送到分析器(716)(例如分析器(558)之前用120μl的猝滅劑猝滅。在圖38A中獲得到兩個(gè)明顯可區(qū)分的特征峰(704)和(728)的結(jié)果，峰(704)包括B和L以及它們的所有子群體作為一個(gè)單個(gè)峰。B的百分率是很小的。以至它對(duì)所要求分析的子群體沒有影響，但是，如果需要的話B的數(shù)據(jù)可以扣除。
將第二部分全血樣品28μl和50μl的在上面不結(jié)合有任何L和L子群體的特定抗體的磁性微球以及72μl緩沖液相混合，這樣就完成了第二個(gè)對(duì)照。樣品按前述操作經(jīng)溶解和猝滅后輸送到分析器(716)。獲得到在圖38B中兩個(gè)特征峰(730)和(732)。特征峰(730)和(732)與特征峰(704)和(728)是基本上相同的，因此，看來作為雜質(zhì)的磁性微球?qū)Ψ治鼋Y(jié)果沒有任何不良的影響。
將第三部分試樣28μl輸送到通道(718)(它可以是儀器(540)中的通道(518)、(526)和(532)中的任何一個(gè))同50μl上面鍵合有CD4的特定抗體磁性微球和72μl緩沖液相混合，其中的CD4特定抗體可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T4。這部分樣品混合攪拌60秒鐘后，按前述方法經(jīng)溶解、猝滅，在該分離后CD4子群體后的混合物輸送到分析器(716)之前放在磁場(chǎng)中30秒鐘。得到在圖38C中的兩個(gè)特征峰(734)和(736)，特征峰(734)代表不含CD子群體的L百分率，然后，將峰(734)和峰(704)在比較器(724)中比較后就可獲得在該樣品中CD4子群體的百分率。
還是為了進(jìn)行檢測(cè)和估價(jià)的目的，將相同的血液樣品按上述方式分析以便獲得四組特征峰，其中的一個(gè)描繪在圖38A-E中，在每組中的特征峰基本上是相同的，因此可以只用數(shù)據(jù)的單一組。將四組的特征數(shù)據(jù)取平均就可以計(jì)算出這些結(jié)果。所計(jì)算出的CD4子群體的百分率為45.7，為了驗(yàn)證的目的將它同檢測(cè)儀器的結(jié)果相比較，例如同從Coulter Corporation購(gòu)買的EPICSB流動(dòng)細(xì)胞計(jì)算器的測(cè)定結(jié)果相比較，該儀器的測(cè)定的百分率為47.6。
第四部分28μl樣品被輸送到通道(718)同50μl上面粘結(jié)有CD8特定抗體磁性微球和72μl緩沖液相混合，這個(gè)CD8特定抗體可以用Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T8。這部分樣品按照前述的方法攪拌混合、溶解和猝滅后放入磁場(chǎng)中，將分離出CD8子群體后的混合物輸送到分析器(716)，其測(cè)定結(jié)果由圖38D中的兩個(gè)特征峰(738)和(740)表示，特征峰(738)代表不含CD8子群體的L，將特征峰(738)和特征峰(704)在比較器(724)中比較，可以獲得CD8子群體的百分率為25.0，為了驗(yàn)證此結(jié)果的可靠性，同光檢測(cè)儀器的結(jié)果進(jìn)行了比較，該儀器的檢測(cè)結(jié)果為26.0。
第五部分28μl樣品被輸送到通道(718)中同50μl的上面鍵合有CD2特定抗體的磁性微球和72μl緩沖液相混合，CD2特定抗體可以用Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T11。仍然按照前述的方法將這部分樣品攪拌混合、溶解和猝滅，然后放入磁場(chǎng)中。將分離出CD2子群體后的混合物輸送到分析器(716)。這個(gè)測(cè)定結(jié)果由圖38E中的兩個(gè)特征峰所示，特征峰(702)代表不含CD2子群體的L的含量，將特征峰(742)同特征峰(704)在比較器(724)中比較就可獲得CD2子群體在樣品中的百分率，經(jīng)計(jì)算得出的CD2子群體的百分率為82.7，為了使這個(gè)結(jié)果同光檢測(cè)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的結(jié)果相比，給出后者測(cè)定出的百分率為79.0。
利用一維電子檢測(cè)參量對(duì)CD4、CD8和D2子群體的其它子群體的分析結(jié)果示在圖39A-E和圖40A-E中。圖39A-E是利用直流參量得到的，而圖40A-E是利用射頻參量得到的，這兩個(gè)結(jié)果是用相同的樣品部分在同一時(shí)間內(nèi)完成的。
這部分樣品按在圖38A-E所述基本上相同的方法在輸送到分析器(716)之前已經(jīng)按順序經(jīng)溶解和猝滅。在圖39A和40A的情況下只加緩沖液，而在圖39B和40B的情況下除了加緩沖液外還加不帶有L和L子群體抗體的磁性微球同該樣品相混合，對(duì)這個(gè)不帶磁性微球的對(duì)照測(cè)定出如圖39A中的特征峰(746)和(748);在圖40A中產(chǎn)生特征峰(750)和(752)。特征峰(746)和(750)代表在樣品中的L和B的含量。不帶磁性微球的對(duì)照結(jié)果在圖39的特征峰(746)、(748)和圖40A的特征峰(750)和(752)。峰(746)和(750)代表在樣品中的L和B的結(jié)果。有對(duì)照磁性微球與樣品混合，而用磁場(chǎng)從中去掉磁性微球，所得結(jié)果在圖39B的特征峰(754)和(756)以及圖40B的特征峰(758)和(760)示出。
將第三部分全血樣品與50μl上面鍵合有CD4特定抗體的磁性微球相混合，這個(gè)混合物在輸送到分析器(716)之前被攪拌混合、溶解、猝滅，并放在磁場(chǎng)中分離出CD4子群體。這個(gè)直流信號(hào)分析結(jié)果為在圖39C中的特征峰(762)和(764)，而射頻信號(hào)分析結(jié)果為在圖40C中的特征峰(766)和(768)，在比較特征峰(746)和(762)的同時(shí)比較特征峰(756)和(766)，從而獲得在樣品中CD4子群體的百分率。
在圖39和圖40中的那些特征峰是從由同一個(gè)全血樣品中的三個(gè)分開的樣品組之一測(cè)得的，將這些特征峰取平均就可得到結(jié)果。在CD4的情況下，從直流信號(hào)測(cè)得的百分率是57.0，從射頻信號(hào)測(cè)得百分率是57.1，而由光檢測(cè)流動(dòng)血球計(jì)數(shù)計(jì)測(cè)得的百分率為54.6。
為了對(duì)CD8子群體進(jìn)行分析，將第四部分全血樣品與上面鍵合有CD8子群體的特定抗體的50μl磁性微球相混合，在這個(gè)混合物輸送到分析器(716)之前，這部分樣品經(jīng)攪拌混合、溶解、猝滅后放入磁場(chǎng)中，以便從該混合物中分離出CD8子群體。直流信號(hào)分析結(jié)果為在圖39D中的兩個(gè)特征峰(770)和(772)，而射頻信號(hào)分析結(jié)果為在圖40D中示出的兩個(gè)特征峰(774)和(776)。
在把特征峰(746)和(770)比較的同時(shí)比較特征峰(750)和(774)，以便獲得在樣品中CD8子群體的百分率。在CD8的情況下，根據(jù)直流參量測(cè)得的結(jié)果是17.4，根據(jù)射頻參量測(cè)得的百分率是18.6，根據(jù)光檢測(cè)流動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測(cè)得的百分率是17.7。
為了獲得CD2子群體的分析結(jié)果，將第五部分全血樣品與50μl上面鍵合有CD2子群體特定抗體磁性微球相混合。這部分樣品在經(jīng)攪拌、溶解、猝滅和放在磁場(chǎng)中把混合物中的CD2子群體分離出去之后輸送到分析器(716)。直流參量的測(cè)定結(jié)果為在圖39E中的兩個(gè)特征峰(778)和(780)，而射頻參量的分析結(jié)果為在圖40E中的兩個(gè)特征峰(782)和(784)。
在把特征峰(746)和(778)比較的同時(shí)比較特征峰(750)和(782)，以便獲得CD2子群體在樣品中的百分率，對(duì)于CD2來說，根據(jù)直流參量測(cè)定的百分率為79.6，根據(jù)射頻參量測(cè)定的百分率為79.3，而根據(jù)光檢測(cè)流動(dòng)血球計(jì)數(shù)計(jì)的測(cè)定結(jié)果為74.7。
利用一維電子檢測(cè)參量可以獲得涉及關(guān)于圖37-40中的B和L子群體的分析結(jié)果，除可以利用光檢測(cè)參量外，還可以利用兩個(gè)和更多個(gè)檢測(cè)參量，例如在圖41A-E中所示的結(jié)果。
這部分樣品利用和為獲得在圖38-40中的特性而采用的相同的處理方法來處理，圖41A和41B分別示出了不帶磁性微球的對(duì)照和同磁性微球相結(jié)合的對(duì)照測(cè)量結(jié)果，這些磁性微球在分析之前被分離出去。這些對(duì)照正規(guī)的三部分矩形圖來說明，用圖說明L，M和G。
CD4的貧化示于圖41C中，在CD4的子群體的磁貧化之后，將剩余的L群體可以用對(duì)照L群體相比較，以便測(cè)定CD4的子群體的百分?jǐn)?shù)，測(cè)定出的CD4子群體的百分率是59.4，為了和光檢測(cè)流動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀的檢測(cè)結(jié)果相比，給出了該血球計(jì)數(shù)儀的測(cè)定結(jié)果為54.6。
CD8的貧化示于圖41D中，在CD8子群體磁貧化之后，可以將剩余的L子群體同對(duì)照L群體相比較，可以測(cè)定CD8子群體的百分率。所測(cè)定的CD8子群體的百分率是15.8，為了便于同光檢測(cè)流動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀相比較，給出了用該細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量的結(jié)果為17.7。
CD2的貧化示于圖41E中，在CD2子群體的磁貧化之后，可以把剩余的L群體同對(duì)照L群體相比較來測(cè)定CD2子群體的百分率，測(cè)得的CD子群體的百分率82.2，然后與同光檢測(cè)流動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀結(jié)果相比較，該血球計(jì)數(shù)儀測(cè)得的百分率為74.7。
從上面的分析結(jié)果可以清楚地看到，因?yàn)榘袻的各個(gè)子群體的百分率加起來的和總計(jì)大于100，所以說明了有一些子群體發(fā)生重疊?！爸丿B”一詞在這里是用來指明“一定的細(xì)胞，細(xì)胞的群體，細(xì)胞的子群體或形成體至少包括兩個(gè)所關(guān)心的受體或抗體”，重疊可以作為一個(gè)疾病診斷和處置中的一個(gè)重要的參量，將在下面進(jìn)一步說明。
至此所有有關(guān)的特性都會(huì)遇到什么樣的全血樣品才稱為是“正常”的問題。正常一詞在這里是指明一個(gè)全血樣品基本上沒有受感染，例如癌、疾病等感染。
圖42和43列舉了對(duì)兩個(gè)反常全血樣品分析的結(jié)果。繪出圖42A-G的第一個(gè)樣品經(jīng)過分析用幾種不同的方式分析和顯示。圖42A和42B描繪了一個(gè)全血樣品的兩個(gè)不同的二維檢測(cè)矩形圖，其中一個(gè)圖是用光檢測(cè)的，另一個(gè)圖是用電子檢測(cè)的，這個(gè)血的樣品未經(jīng)任何處理，顯然對(duì)于正常的血樣的L、M和G組，例如象在圖41A所示那樣，是整個(gè)模糊不清的，并且剛好有一個(gè)不可鑒別的特征組。
在圖42C和42D中示出了對(duì)反常的全血樣品進(jìn)行兩種不同的處理后所測(cè)得的不同結(jié)果，對(duì)于圖42C，是200μl的該血樣品同200μl在上面鍵合有N和E特定抗體的磁性微球混合，這個(gè)混合物經(jīng)攪拌混合、溶解、猝滅和保存在磁場(chǎng)中，另一方面將剩余的部分分離出后輸送到分析器中，這時(shí)在分析器的混合物不含有鍵合其上的N和E細(xì)胞，顯然反常細(xì)胞的主要部分已經(jīng)被分離出去，因?yàn)樵趫D42C中的圖形比圖42B中的圖形變得更加界限分明。
在第二種處理中，將200μl該樣品同200μl在上面只鍵合有N特定抗體的磁性微球相混合，雖然一些細(xì)胞已經(jīng)分離出，表明那些細(xì)胞已鍵合到N抗體上了，但是反常細(xì)胞的重要部分仍然留下來，這從矩形圖的頂部可以明顯地看出，由此看來是出現(xiàn)了某些反常細(xì)胞或疾病細(xì)胞鍵合到N+E抗器上。這種類型的貧化處理可以用于對(duì)特定的疾病的診斷和處理。
圖42A-D中的特征矩形圖是利用二維檢測(cè)得到的，同樣的信息可以利用單一的檢測(cè)參量來獲得，例如一個(gè)象繪制在圖42E-42G中的一維電子檢測(cè)參量。這個(gè)一維檢測(cè)參數(shù)在這里為直流參量，在對(duì)沒有經(jīng)任何處理的樣品進(jìn)行分析時(shí)，得到的是在圖42E中繪出的矩形圖。這個(gè)單一的特征峰和在遠(yuǎn)離該矩形圖右側(cè)的特征明顯地表明是一反常血液樣品。
仍然利用和上述的關(guān)于圖42C和42D中采用的相同的處理，實(shí)際上，一維檢測(cè)特性是和兩維檢測(cè)特征在同一時(shí)間產(chǎn)生的。這個(gè)分析儀器可以是如上所述的包括多個(gè)檢測(cè)參量或者是只包括一個(gè)單一的檢測(cè)參量的。同樣要將N和E鍵合的細(xì)胞分離出以后，再獲得圖42F中的矩形圖，該矩形圖同樣說明了大多數(shù)反常細(xì)胞已經(jīng)被分離出去，在圖42G中的矩形圖說明了有相當(dāng)可觀數(shù)量的反常細(xì)胞沒有被分離出去。
對(duì)第二個(gè)反常全血樣品的分析結(jié)果圖示在圖43A-G中，其中對(duì)未經(jīng)處理樣品的分析結(jié)果為在圖43A和圖43B中的二維矩形圖，顯然，一個(gè)正常全血樣品的圖樣在圖中是看不到的。由儀器繪出的圖43B的矩形圖與離線繪制的矩形圖43C相比較，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)圖沒有明顯的不同。28μl的部分樣品是離線制備的或在繪制圖43C之前制備的。
將一部分樣品進(jìn)行CD5子群體貧化，然后分析這部分樣品，得到圖43D中的矩形圖。將28μl部分全血樣品同122μl上面鍵合有CD5特定抗體的磁性微球相混合，其中用的CD5抗體可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T1。這個(gè)混合物經(jīng)攪拌混合、溶解、猝滅后保持在磁場(chǎng)中以便分離出CD5鍵合細(xì)胞。這樣就把反常細(xì)胞的主要部分分離出去，這一點(diǎn)可以通過把圖43B或43C同圖43D比較中發(fā)現(xiàn)。在圖43A-D是用二維檢測(cè)參量繪制的，而在圖43E-G中的同一特征是用一維矩形圖作出的。
對(duì)繪出圖43E所用的在線樣品或繪出圖43F所用的離線樣品都沒有進(jìn)行過處理，但繪出圖43G所用的樣品中的CD5子群體經(jīng)貧化處理。
正如前面所討論的重疊的細(xì)胞群體不僅對(duì)診斷是重要的，對(duì)治療血液疾病也是重要的，例如某些未成熟的細(xì)胞表現(xiàn)出既是CD4受體也是CD8受體。但是，如果利用電子檢測(cè)參量或最低數(shù)目的光參量或者它們簡(jiǎn)單的組合時(shí)，是不能獲得細(xì)胞子群體重疊的百分率的分析結(jié)果的。例如在某些光檢測(cè)儀器中，為了獲得重疊數(shù)據(jù)有三個(gè)檢測(cè)參量被利用，即利用正前方光散射和90°的光散射以及熒光參量。在正常全血樣品中重疊群體的例子是CD2和CD8子群體。在CLL(慢性淋巴細(xì)胞白血病)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)反常子群體的重疊，在CLL疾病情況中CD5和CD20子群體發(fā)生重疊。
現(xiàn)在參見圖44，圖中用參考數(shù)字800代表一種完成細(xì)胞重疊分類的方法和裝置的第一個(gè)實(shí)施例。這個(gè)儀器即分析儀(800)包括一個(gè)生物樣品(802)，該樣品至少包括第一組活的生物細(xì)胞(未示出)，至少包括兩個(gè)重疊的白血球群體或子群體，例如在全血樣品中或從全血樣品中分離出來的。
生物樣品(802)的這些細(xì)胞處于在定量和/或定性測(cè)定或分析過程的生物反應(yīng)中。生物樣品(802)可以包括該細(xì)胞加入到其中的緩沖液。
生物樣品(802)經(jīng)管路(804)同至少一個(gè)經(jīng)管路(808)輸入的試劑(806)相混合。在分析儀(800)中，紅血球在紅血球分離裝置(810)中從該混合物中分離出，如在第一個(gè)在先的申請(qǐng)中所指出的那樣，將紅血球從裝置(810)中分離出去可以用幾種方法，例如在分離裝置(20)中所列舉的方法。
分離出紅血球后的第一部分混合物經(jīng)管路(814)輸送到白血球分析器(812)。這樣就得到了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)即獲得了一個(gè)整個(gè)的或生物樣品(802)的全部的白血球群體的對(duì)照。分析器(812)可以和分析器(86)相同，也可以是一個(gè)光檢測(cè)分析器，例如在1987年3月13日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)No 025442，和在1987年12月4日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)No 129954，名稱為“利用光散射技術(shù)的多部分差別分析裝置”，這二篇申請(qǐng)包括在參考文件中，單一的檢測(cè)參量可以是電的，例如射頻或直流的，也可以是光的，例如中間角度(median angle)光散射或者任何其它所希望的光參量。
混合物的第二部分經(jīng)管路(818)輸送到“X”分離裝置(816)，分離裝置(816)把第一個(gè)(細(xì)胞“X”的)重疊群體分離出。X被分離出或者通過加入適合的上面鍵合有特定抗體的磁性微球的辦法來貧化。根據(jù)前面的描述，利用磁鐵或磁場(chǎng)，用磁力將鍵合的細(xì)胞從混合物中分離出去。經(jīng)過分離出X后的剩余混合物經(jīng)管路(820)輸送到分析器(812)。將分離出“X”后的混合物的分析結(jié)果在比較器(822)中同第一部分混合物的分析結(jié)果相比較，就得到了在生物樣品(802)中的X的百分率。
第三部分混合物經(jīng)管路(826)輸送到第二分離裝置(824)，分離裝置(824)把第二重疊的Y細(xì)胞群體分離出。Y被通過加入適當(dāng)?shù)纳厦骀I合有Y特定抗體磁性微球分離出，把分離出Y后的剩余混合物經(jīng)管路(828)輸送到分析器(812)，把分離出Y后的混合物分析結(jié)果在比較器(822)中同第一和第二部分混合物的分析結(jié)果相比較就可以驗(yàn)證，在生物樣品(802)中X和Y群體是否重疊，其條件是X和Y群體或群體比率是通常已知的數(shù)值或者是被貧化的X和Y群體的總和大于100%。這個(gè)操作證明X和Y群體重疊。
在大多數(shù)情況下，第四部分混合物經(jīng)管路(832)輸送到分離裝置(830)，分離器(830)把X和Y群體(X+Y)都分離出去。X和Y通過加入適宜的上面鍵合有X和Y特定抗體的磁性微球的方法來分離出。分離出X和Y后的剩余混合物經(jīng)管路(834)輸送到分析器(812)，可以把分離出“X”+“Y”后的混合物的分析結(jié)果同其它部分的混合物的分析結(jié)果相比較而得到X和Y群體在生物樣品(802)中的重疊百分率。
可見利用管路或通道(814)、(818)和(826)，分析儀(800)可以完成單一重疊分類而利用整個(gè)四個(gè)管路，它完成的完全重疊百分率分類。分析儀(800)的重要特點(diǎn)是只用一個(gè)單一的分析參量就可以分析混合物。例如一電參量或一光參量。幾個(gè)參量的結(jié)合也可利用，但是在每種情況下，只用單一的檢測(cè)參量或者特征就可完成本發(fā)明的重疊分類。這個(gè)分析結(jié)果也可以利用多個(gè)檢測(cè)參量來獲得。
在這里沒有列舉出包括在分析儀(800)的方法和裝置中的具體的分析儀器的實(shí)施例，而這樣的儀器可以是儀器(540)，此外本發(fā)明的重疊方法和裝置可以在儀器(540)上唯一的單通道上完成，也可以在單通道儀器上完成(未說明)。
參看圖45A-45D，圖中示出了一組一維散射圖的重疊特征結(jié)果，這些圖是利用類似于儀器(540)中的標(biāo)準(zhǔn)方法和關(guān)于儀器(800)的描述從全血樣品中測(cè)得的結(jié)果。在每種情況下所用的生物樣品都是28μl全血樣品，利用第一通道(814)將該樣品同122μl緩沖液相混合。這部分樣品用上面引證的300μl紅血球的優(yōu)選溶劑溶解4秒鐘，然后用120μl猝滅劑猝滅，然后再輸送到分析器(812)中。
用一維電子檢測(cè)參量(直流)對(duì)這部分的分析所得到特征圖如圖45A中的頻率曲線圖所示，在圖中出現(xiàn)兩個(gè)可清楚分辨的特征峰(836)和(838)。其中特征峰(836)代表了在樣品中的L和B的百分率，而峰(838)代表了N、E和M的百分率。
接著要對(duì)該樣品進(jìn)行處理，按上述的方法首先進(jìn)行X細(xì)胞群體貧化，然后再進(jìn)行Y細(xì)胞群體的貧化處理。在這種情況下，X群體是L的CD2子群體，而Y群體是L的CD20子群體。將樣品第二部分輸送到分離裝置(816)中，在這里用60μl上面鍵合有CD2特定抗體的磁性微球同這部分樣品混合、攪拌、溶解、猝滅，然后放在磁場(chǎng)中分離出CD2子群體。然后將剩余的混合物輸送到分析器(822)中，分析結(jié)果如在圖45B中的兩個(gè)特征峰(840)和(842)所示。特征峰(840)代表剩余的L，將它在比較器(822)中同峰(836)比較而得到在樣品中CD2子群體的百分率。
將第三部分樣品輸送到分離裝置(824)，在這里用50μl上面鍵合有CD20特定抗體的磁性微球同這部分樣品混合、攪拌、溶解、猝滅，然后放在磁場(chǎng)中分離出CD20子群體。分離出CD20后的剩余混合物被輸送到分析器(822)中，分析結(jié)果如在圖45C中所示的兩個(gè)特征峰(844)和(846)。其中峰(844)代表剩余的L的含量，將峰(844)同峰(836)相比較后，可以得到在樣品中CD20子群體的百分率。
如果CD2和CD20子群體百分率的相對(duì)比值的正常值是已知的，就可以有充分根據(jù)地鑒別這些子群體是重疊的。此外，如果兩個(gè)子群體的百分率相加的總和大于100，那么顯然也表明這兩種子群體是重疊的。在少量的百分率重疊情況下，為了驗(yàn)證子群體確實(shí)是重疊的，重要的是獲得重疊的子群體的百分率。而為了獲得重疊百分率需要進(jìn)行進(jìn)一步的貧化操作。
將第四部分樣品輸送到分離裝置(830)，在這里同上面鍵合有CD2特定抗體的磁性微球和上面鍵合有CD20特定抗體的磁性微球相混合，以便分離出CD2和CD20子群體，將經(jīng)CD2和CD20貧化處理過的剩下混合物輸送到分析器(822)中，在圖45D中得到兩個(gè)特征峰(848)和(850)，特征峰(848)還代表剩余的L的含量，將特征峰(848)同特征峰(836)比較，可以獲得被CD20和CD2特定抗體分離出后的子群體的百分率，將這個(gè)結(jié)果同單個(gè)的CD2和CD20的結(jié)果相比較，就可以獲得可能存在的重疊的百分率。
精確的重疊百分率按下面公式計(jì)算Ⅰ.子群體“A”(CD2)(a) ((特征峰838))/(特征峰842) ×(特征峰840)＝A′(b) ((特征峰836-A′))/(特征峰836) ＝%子群體A(CD2)Ⅱ.子群體“B”(CD20)(a) ((特征峰838))/(特征峰846) ×(特征峰844)＝B′
(b) (特征峰836)-B′)/(特征峰836) ＝%子群體B(CD20)Ⅲ.子群體“A+B”(CD2+CD20)(a) ((特征峰838))/(特征峰850) ×(特征峰848)＝A+B(b) (特征峰836-(A+B))/(特征峰836) ＝子群體A+B的%Ⅳ.重疊部分〔子群體“A”+子群體“B”〕-子群體〔“A”+“B”〕＝重疊結(jié)果(對(duì)從兩個(gè)分開制備的樣品所測(cè)得的結(jié)果取平均的)列在表Ⅵ中表Ⅵ峰 相對(duì)百分率 峰 相對(duì)百分率對(duì)照 836 35.7 838 64.3CD2 840 7.1 842 92.6CD20 844 33.6 846 66.4CD2+CD20 848 3.5 850 96.5表Ⅵ 4的相對(duì)百分率是總的百分率為100的兩個(gè)峰的百分率。計(jì)算出的CD2百分率為86.2，CD20百分率為8.9，而CD2+CD20的百分率為93.5。因此重疊百分率為(86.2+8.9)-93.5＝1.6。
為了得到在圖46A-D中的CD2和CD8子群體的重疊百分率，要將第二個(gè)樣品作貧化處理，再將該樣品的第一部分輸送到通道(814)，為了獲得在圖46A中所示的對(duì)照特征，樣品沒有經(jīng)貧化處理，這個(gè)特征歸結(jié)為兩個(gè)明顯分開的特征峰(852)和(854)，特征峰(852)代表樣品中的L和B的百分率。
將第二部分樣品按在通道(818)中前述的方法進(jìn)行CD2子群體貧化處理，在圖46B中得到兩個(gè)特征峰(856)和(858)，代表剩余L的特征峰(856)同對(duì)照峰(852)相比較，而獲得在樣品中CD2子群體的百分率。
將第三部分樣品在通道(826)中對(duì)CD8子群體進(jìn)行貧化處理，測(cè)得如圖46C中的兩個(gè)特征峰(860)和(862)。將特征峰(860)同外照峰(852)相比較而得到CD8子群體在樣品中的百分率。
將第四部分樣品在通道(832)中對(duì)CD2+CD8子群體進(jìn)行貧化處理，測(cè)得如圖46D中所示的兩個(gè)特征峰(864)和(866)，將特征峰(864)和對(duì)照峰(852)相比較而獲得在樣品中CD2+CD8的子群體的百分率。
這些數(shù)據(jù)列舉在表Ⅶ中表Ⅶ峰 相對(duì)百分率 峰 相對(duì)百分率對(duì)照 852 30.3 854 69.7CD2 856 9.0 858 91.0CD8 860 22.1 862 77.9CD2+CD8 864 7.6 866 92.4計(jì)算得到的CD2的百分率為77.3，CD8的百分率是34.7，以及CD2+CD8的百分率是81.1。因此重疊的百分率是(77.3+34.7)-81.1＝30.9。
雖然本發(fā)明的方法和裝置是結(jié)合利用全血樣品來描述的，但是可能有那樣的情況，需要利用包含紅血球的群體和/或不包含白血群體后的樣品。顯然，紅血球仍需分離出，但是，是在本發(fā)明的裝置里面、還是在外部進(jìn)行這種分離是有爭(zhēng)議的。這樣的分離或制備可以用多種常規(guī)手段在外面進(jìn)行，例如利用溶解劑、密度或離心技術(shù)，如象菲克爾水溶性聚蔗糖(ficol)，葡聚糖，血沉檢查層(buffyloat)等，在利用本發(fā)明的自動(dòng)分析器時(shí)，為了快速和完整地對(duì)樣品進(jìn)行分析，最好是利用全血樣品。
利用上述技術(shù)中的光參量可以改進(jìn)和變動(dòng)本發(fā)明，樣品12，42，150，180，294，322和342可以包括全血，包括有細(xì)胞的人體液或其它的包括構(gòu)成身體的流體，例如細(xì)菌、病毒和真菌。確定的微球的體積是指出用單位稀釋液的微球的重量來表示。雖然樣品的數(shù)量例如對(duì)于一個(gè)全血樣品采用的是20μl的量級(jí)，但是這僅是作為一個(gè)例子。根據(jù)需要也可以用比較小的或比較大的樣品體積，例如對(duì)于特殊的儀器或技術(shù)可以用象約2μl小體積的樣品來分析，雖然在某些例子中是按順序完成的，但是這些操作步驟也可以同時(shí)完成，同時(shí)進(jìn)行分析要求儀器利用最不復(fù)雜儀器組件。因此，不難理解，在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明在實(shí)際上不限于已經(jīng)描述的實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種獲得來自全血樣品至少一部分的至少一種白血球群體分析結(jié)果的方法，該全血樣品至少含有白血球群體和/或子群體，其特征在于分析該全血樣品的至少第一部分來測(cè)定該全血樣品的至少一種白血球群體或子群體的特征值；從全血樣品的至少第二部分貧化至少一種白血球群體或子群體；分析該全血樣的所述第二部分，以測(cè)定所述第二部分的至少一個(gè)白血球群體或子群體的特征值；比較所述的兩個(gè)分析的特征值，確定該全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體的百分率。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于把所述第二部分白血球群體或子群體除去，是通過提供一種磁性微球，該微球鍵合有對(duì)所述白血球群體或子群體特異的單克隆抗體，把所述磁性微球與所述樣品混合，以鍵合所述白血球群體或子群體，用一個(gè)磁場(chǎng)吸引所述磁性微球，在所述磁性微球約束在所述磁場(chǎng)中時(shí)，除去所述樣品的剩余的至少一部分，這些就除去了所述白血球群體或子群體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在分析所述第二部分樣品前，從所述第二部分白血球群體或子群體中至少除去嗜中性細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于從所述全血樣品的至少第三部分除去至少兩個(gè)白血球群體或子群體;分析所述全血樣品的第三部分，確定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體特征值;以及比較所述的三個(gè)分析的特征值，確定所述全血樣品的至少兩個(gè)白血球群體或子群體的百分率。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于除去所述第三部分白血球群體或子群體，是通過提供一種鍵合有對(duì)所述白血球群或子群體特異的單克隆抗體的磁性微球，把所述磁性微球與所述樣品混合，以結(jié)合所述白血球群體或子群體，在所述磁性微球約束在一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)時(shí)，除去所述樣品剩余的至少一部分，從而除去所述白血球群體或子群體。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于在分析所述的第三部分之前，從所述第三部分白血球群體中至少除去嗜中性細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)群體。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于在分析所述的第三部分之前，從所述的第三部分白血球群體中至少除去淋巴細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于從所述全血樣品的至少第四部分中至少除去兩種白血球群體或子群體;分析所述全血樣品的所述第四部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體特征值;比較至少所述四個(gè)分析的特征值，確定所述全血樣品的至少三個(gè)白血球群體或子群體的百分率。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于比較至少四個(gè)分析白血球群體特征值，計(jì)算或確定所述全血樣品的至少嗜曙紅細(xì)胞，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的白血球群體的百分率，完成五部分白血球的區(qū)分。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述全血樣品包括一紅血球群體，從所述樣品中除去紅血球群體對(duì)有關(guān)的所述白血球群體的至少一種群體的相關(guān)定性和/或定量無明顯的有害影響。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用一個(gè)電參數(shù)，用電子儀器分析所述部分。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用一個(gè)光參數(shù)，光學(xué)分析所述部分。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于比較所述的兩個(gè)分析的特征值，確定至少一個(gè)白血球群體的至少兩個(gè)子群體的百分率。
14.一種用于從一個(gè)全血樣品的至少一部分中得到至少一個(gè)白血球群體分析法的裝置，該全血樣品至少含有白血球群體和/或子群體，其特征在于，包括用于分析所述全血樣品的至少第一部分，以測(cè)定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體特征值的組件(514、512、552、558);用于從所述全血樣品的至少第二部分基本上貧化掉其中的至少一個(gè)白血球群體或子群體的組件(516);用于分析所述全血樣品的所述第二部分，測(cè)定所述第二部分的至少一個(gè)白血球群體或子群體的特征值的組件(520、512、558);用于比較所述的兩個(gè)分析的特征值，確定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體的百分率。
15.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于用于除去所述第二部分白血球群體或子群體的所述組件包括用于提供鍵合有對(duì)所述白血球群體或子群體特異的單克隆抗體的磁性微球的部件(588);用于把所述磁性微球與所述樣品混合，以結(jié)合所述白血球群體或子群體的部件(586);以一個(gè)磁場(chǎng)吸引所述磁性微球的部件(592);用于除去所述白血球群體或子群體的部件(520)，這種除去是當(dāng)所述磁性微球約束在所述磁場(chǎng)內(nèi)時(shí)除去所述樣品的剩余的至少一部來實(shí)現(xiàn)的。
16.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于還包括在分析所述第二部分之前，從所述的第二白血球群體或子群體中至少除去嗜中性白血球群體的組件。
17.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于還包括用于從所述全血樣品的至少第三部分中除去至少兩個(gè)白血球群體或子群體的組件(524);用于分析所述全血樣品的所述第三部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或子群體的特征值的組件(512，558);用于比較所述三個(gè)分析的特征值，確定所述全血球的至少兩個(gè)白血球群體或子群體的百分率的組件(522、580)。
18.如權(quán)利要求17所述的裝置，其特征在于用于除去所述第三部分白血球群體或子群體的所述的組件包括提供鍵合有對(duì)所述白血球群體或子群體有特異性的單克隆抗體的磁性微球的部件(596);用于把所述磁性微球與所述樣品混合結(jié)合所述白血球群體或子群體的部件(600);在所述磁性微球吸引在一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)時(shí)，除去所述樣品的剩余的至少一部分，來除去所述的白血球群體或子群體的部件(528)。
19.如權(quán)利要求17所述的裝置，其特征在于還包括在分析所述的第三部分之前，從所述的第三部分白血球群體中至少除去嗜中性白血球和嗜曙紅細(xì)胞群體的組件。
20.如權(quán)利要求17所述的裝置，其特征在于還包括在分析所述的第三部分之前，從所述的第三部分白血球群體中至少除去淋巴細(xì)胞和嗜中性白血球群體的組件。
21.如權(quán)利要求17所述的裝置，其特征在于還包括從所述全血樣品中除去至少兩個(gè)白血球群體或子群體的組件(530);用于分析所述全血樣品的所述第四部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一白血球群體或子群體特征值的組件(534，512，588);用于比較至少所述的四個(gè)分析的特征值，確定所述全血樣品的至少三個(gè)白血球群體或子群體的百分率的組件(522，580)。
22.如權(quán)利要求21所述的裝置，其特征在于還包括用于比較至少四個(gè)分析的白血球群體特征值，以計(jì)算或確定所述全血樣品的至少嗜曙紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和嗜中性白血球群體的百分率的組件。
23.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于所述全血樣品包括一紅血球群體，并且包括一用于從所述樣品除去該紅血球群體，而對(duì)有關(guān)所述白血球群體至少一個(gè)的有關(guān)定性和/或定量無明顯的有害影響的裝置。
24.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于還包括用單一電參量進(jìn)行電學(xué)分析所述部分的組件。
25.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于還包括用單一光參量對(duì)所述部分進(jìn)行光學(xué)分析的組件。
26.如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于還包括用于比較所述的兩個(gè)分析的特征值，確定至少一個(gè)白血球群體的至少兩個(gè)子群體的百分率。
27.一個(gè)對(duì)一全血樣品至少一部分中，增強(qiáng)和獲得至少一種白血球群體或白血球群體的子群體分析的方法，在該全血樣品中至少有白血球群體，其特征在于分析所述全血樣品的至少第一部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體或白血球群體的子群體的特征值;從所述全血樣品的至少第二部分中除去至少一白血球群體或白血球群體的子群體，那個(gè)白血球群體或白血球群體的子群體遮蔽要分析的白血球群體或白血球群體的子群體的分析結(jié)果;分析所述全血樣品的所述第二部分，測(cè)定所述第二部分有關(guān)至少一個(gè)所需要的白血球群體或白血球群體的子群體的特征值;以及比較所述的兩個(gè)分析得的特征值，確定所述全血樣品的有關(guān)的至少一個(gè)所需要的白血球群體或白血球群體的子群體的百分率。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，把所述第一部分白血球群體或白血球群體的子群體分離出去;提供一鍵合有對(duì)所述白血球群體或白血球的子群體有特性的單克隆抗體的磁性微球，把所述磁性微球與所述樣品混合，以鍵合所述白血球群體或白血球群體的子群體，在吸引所述磁性微球到一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)的同時(shí)，分離出所述樣品剩余的至少一部分，從而除去了所述的白血球群體或白血球群體的子群體。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，在分析所述第一部分之前，從所述第一部分白血球群體中至少除去淋巴細(xì)胞群體，從而獲得所述全血樣品嗜堿性細(xì)胞群體百分率。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于在分析所述第一部分之前，從所述全血樣品的所述第一部分中至少除去一個(gè)所關(guān)心的白血球群體的子群體，以獲得所述全血樣品的有關(guān)的白血球群體的子群體百分率。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于所述的全血樣品包括一紅血球群體，從所述樣品中除去該紅血球群體，對(duì)所關(guān)心的所述白血球群體或子群體中至少一個(gè)的定性和/或定量無明顯的有害影響。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于用單一的電參量，用電學(xué)分析所述部分。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于用單一的光參量，用光學(xué)分析所述部分。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于用至少兩個(gè)檢測(cè)參量分析所述部分。
35.一種用于增強(qiáng)和獲得從一個(gè)全血樣品的至少一部分中的至少一種白血球群體或白血球群體子群體分析結(jié)果的裝置，該全血樣品至少包含有白血球群體，其特征在于包括用于分析所述全血樣品的至少第一部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一白血球群或白血球群體子群體的特征值的組件(512，558);用于從所述全血樣品的至少第二部分除去至少一白血球群體或白血球群體子群體的組件(516)，這些白血球群體或白血球群體的子群體遮蔽所要求分析的白血球群體或白血球群體子群體的分析結(jié)果;用于分析所述全血樣品的所述第二部分，測(cè)定所述第二部的有關(guān)至少一個(gè)所要求的白血球群體或白血球群體子群體的特征值的組件(512，558);用于比較所述兩個(gè)分析的特征值，確定所述全血樣品的有關(guān)所述至少一個(gè)所要求白血球群體或白血球群體子群體的百分率的組件(522，580)。
36.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于用于除去所述第一部分白血球群體或白血球群體子群體的組件包括一提供磁性微球，該微球鍵合有對(duì)所述白血球群體或白血球群體子群體特異的單克隆抗體的部件;用于把所述磁性微球與所述樣品混合，鍵合所述白血球群體或白血球群體子群體的部件(586);以及在吸引所述磁性微球到一磁場(chǎng)中時(shí)，把所述樣品的剩余的至少一部分除去，從而除去所述白血球群體或白血球群體的子群體的部件(584)。
37.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于，還包括在分析所述第一部分之前，從所述第一部分白血球群體中至少除去淋巴細(xì)胞群體，從而獲得所述全血樣品的嗜堿性細(xì)胞群體百分率的組件。
38.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于，還包括在分析所述第一部分之前，從所述全血樣品的至少第一部分中除去有關(guān)的至少一個(gè)白血球群體子群體，從而獲得所述全血樣品的有關(guān)的所述白血球子群體百分率的組件。
39.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于，所述全血樣品中包括一紅血球群體，還包括一用于從所述樣品中除去紅血球，而對(duì)至少有關(guān)的所述白血球群體或子群體一個(gè)相關(guān)的定性和/或定量無明顯的有害影響的部件。
40.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于，還包括用單一電參量電分析所述部分的組件。
41.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于，還包括用單一光參量光學(xué)分析所述部分的組件。
42.如權(quán)利要求35所述的裝置，其特征在于還包括用至少兩個(gè)檢測(cè)參數(shù)分析所述部分的組件。
43.一個(gè)從一全血樣品至少一部分中獲得至少兩個(gè)白血球子群體的重疊群體的百分率的方法，該全血樣品至少有兩個(gè)白血球子群體，其特征在于分析所述全血樣品的至少第一部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一個(gè)白血球群體的特征值;從所述全血樣品的至少第二部分基本上貧化掉所述白血球子群體的至少第一個(gè);分析所述全血樣品的所述貧化過的第二部分，測(cè)定所述白血球群體或所述第一子群體的至少一個(gè)特征值;從所述全血樣品的至少第三部分中基本上貧化掉所述白血球子群體的至少第二個(gè);分析所述全血樣品的所述貧化過的第三部分，測(cè)定所述白血球群體或所述子群體的至少一個(gè)特征值;以及比較所述三個(gè)分析的特征值，確定所述白血球樣品的所述兩個(gè)白血球子群體的抗原重疊。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于從所述全血樣品的至少第四部分中基本貧化掉至少兩個(gè)所述第一和第二白血球子群體，測(cè)定所述白血球群體或所述第一和第二白血球子群體的至少一個(gè)特征值;以及比較所述四個(gè)分析的特征值，確定所述全血樣品的所述兩個(gè)白血球子群體的重疊抗原的百分率。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于用單一電參量電分析所述部分。
46.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于用單一光參量光學(xué)分所述部分。
47.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于用至少兩個(gè)檢測(cè)參量分所述部分。
48.一種從一全血樣品至少一部分中獲得至少兩個(gè)白血球子群體的重疊群體的百分率的裝置，該全血樣品至少有兩個(gè)白血球子群體，其特征在于包括用于分析所述全血樣品至少第一部分，測(cè)定所述全血樣品的至少一白血球群體特征值的組件(512，558);用于從所述全血樣品的至少一第二部分中基本上貧化所述白血球子群體的至少第一個(gè)的組件(516);用于分析所述全血樣品的所述第二貧化部分，測(cè)定所述白血球群體或所述第一子群體的至少一個(gè)特征值的組件(512，558);用于從所全血樣品的至少第三部分中基本上貧化掉所述白血球子群體的至少第二個(gè)的組件(524);用于分析所述全血樣品的所述第三貧化部分，測(cè)定所述白血球群體或所述第二子群體的至少一個(gè)特征值的組件(512、558);以及用于比較所述的三個(gè)分析特征值，確定所述全血樣品的所述兩個(gè)白血球子群體的抗原重疊的組件(522、580)。
49.如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征在于還包括用于從所述全血樣品的至少第四部分中基本上貧化掉至少所述第一和第二白血球子群體兩者，測(cè)定所述白血球群體或所述第一或第二白血球子群體的至少一個(gè)特征值的組件(530);以及用于比較所述四個(gè)分析特征值，確定所述全血樣品的所述兩個(gè)白血球子群體的重疊抗原的百分率的組件。
50.如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征在于還包括用于只用單一電參量電學(xué)分析所述部分的組件(522、580)。
51.如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征在于還包括用于僅用單一光參量光分析所述部分的組件。
52.如權(quán)利要求48所述的裝置，其特征在于還包括用于至少用個(gè)檢測(cè)參量分所述部分的組件。
全文摘要
一種自動(dòng)和快速地對(duì)至少一種選定的細(xì)胞群體或生物體例如一全血樣品或其部分白血球群體和其至少一個(gè)子群體進(jìn)行彌補(bǔ)，計(jì)算和/或分析的方法和裝置。制備一定體積含WBC的生物介質(zhì)，至少對(duì)一些選定的生物細(xì)胞特異或最佳的至少一試劑放入樣品中，并快速混合一短時(shí)間，一多路血球分析器通過至少貧化-WBC子群體，以單一檢測(cè)參量測(cè)量，通過除去一個(gè)或多個(gè)遮蔽的WBC子群體，也可獲得一所要的WBC群體子群體或WBC子群體重疊的百分率。
文檔編號(hào)G01N15/10GK1050771SQ9010392
公開日1991年4月17日 申請(qǐng)日期1990年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月14日
發(fā)明者托馬斯·魯塞爾, 卡洛斯·M·羅杰昆斯, 康斯坦斯·瑪莉·海杰克, 華萊士·H·科特 申請(qǐng)人:科特電子公司