專利名稱：一種體外檢測(cè)人和動(dòng)物中存在環(huán)狀顆粒和惡性腫瘤的方法及探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥檢測(cè)，更具體地說(shuō)涉及測(cè)定一種能夠可靠地指示癌細(xì)胞存在的腫瘤標(biāo)志物的方法及探針。
癌癥是以細(xì)胞生長(zhǎng)失控以及非正常細(xì)胞擴(kuò)散為特征的一大類疾病。如果這種擴(kuò)散沒(méi)有被控制或阻止，它將導(dǎo)致死亡。然而，如能做到早期檢測(cè)和及時(shí)治療，許多癌癥是可以治愈的。1988年僅在美國(guó)就有大約985，000人被診斷患有癌癥。同一年中美國(guó)有大約494，000人，全世界約有4，000，000人將死于這種疾病。
僅在美國(guó)，由于較早的診斷、及時(shí)的治療以及適當(dāng)?shù)谋O(jiān)護(hù)，大約有174，000人得到了挽救。對(duì)癌癥的早期檢測(cè)極大地提高了治愈的可能性。對(duì)限于局部的癌進(jìn)行檢查，對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程中的腫瘤盡可能早地做出診斷，是使用更有效的治療方法和提高治愈率的必要保證。外科手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療都需要做治療后的監(jiān)控以確保全部殘留的惡性生長(zhǎng)物已被消除。
在過(guò)去的15年中，已發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤相關(guān)的蛋白，其中一些已被當(dāng)做腫瘤標(biāo)志物。許多這一類的標(biāo)志物只是與特定的腫瘤相聯(lián)系。因此，它們的存在可用以準(zhǔn)確地檢測(cè)與之相關(guān)的那些腫瘤。由于這類標(biāo)志物比腫瘤本身更容易被鑒定，所以標(biāo)志物使得更早、更可靠地檢出腫瘤成為可能。一些已了解得比較清楚的腫瘤標(biāo)志物有(a)用于結(jié)腸、肺、胃和胰(腺)癌的癌胚抗原(CEA);(b)用于睪丸和肝癌的甲胎蛋白(AFP);和(c)最近被認(rèn)可的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物(CA-549)。
已鑒定出一種與上述那些腫瘤標(biāo)志物不同的通用標(biāo)志物。這種在電鏡下呈亞顯微環(huán)狀顆粒(RSP)的標(biāo)志物由癌細(xì)胞釋放到周圍組織或體液中，而正常細(xì)胞則不釋出可測(cè)量的該標(biāo)志物。RSP也被稱為小體(Prosome)、蛋白小體(Proteasome)、微顆粒(miniparticles)、LAMP、大顯像點(diǎn)(mareropain)、RNA蛋白脂質(zhì)和環(huán)狀微顆粒，已發(fā)現(xiàn)各種各樣的人體腫瘤和其它哺乳動(dòng)物腫瘤以及惡性細(xì)胞系都釋出這種RSP。體外與體內(nèi)研究證明，惡性細(xì)胞釋放RSP是癌發(fā)生過(guò)程的一個(gè)特征，它與物種、腫瘤類型或腫瘤在機(jī)體中的位置無(wú)關(guān)。并且，這種標(biāo)志物的釋放與腫瘤負(fù)荷量成比例而且是在根據(jù)臨床癥狀做出復(fù)發(fā)診斷之前4～6個(gè)月釋出。因此，RSP是一種不同于其它腫瘤標(biāo)志物的通用標(biāo)志物。這樣，可以將RSP用于在早期檢查任何癌癥的存在，這給治愈癌癥的前景帶來(lái)了極大的希望。用RSP還可以對(duì)癌癥病人的治療效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)。血清中RSP水平的降低可以作為治療成功的一個(gè)標(biāo)志。由于迄今所試驗(yàn)過(guò)的惡性細(xì)胞在組織培養(yǎng)中都釋出RSP，而且用致癌因子處理使組織培養(yǎng)的細(xì)胞惡性化后，惡變細(xì)胞也產(chǎn)生出RSP，因此，RSP也可用做為一組新的鑒定致癌因子的短期測(cè)試系統(tǒng)的終點(diǎn)。
早期研究得到了一種測(cè)定RSP中DNA組分的熒光檢測(cè)法。這種技術(shù)被成功地應(yīng)用于從陰道沖洗液中檢查婦女宮頸癌。在美國(guó)專利3，798，131中，Rounds等人公開(kāi)了這項(xiàng)技術(shù)，即將熒光染料與RSP中的DNA組分結(jié)合，然后通過(guò)測(cè)量增強(qiáng)的發(fā)射光(熒光強(qiáng)度)作為對(duì)RSP含量的間接測(cè)量。遺憾的是，如用這種方法定量測(cè)定各種不同體液中的RSP，則必須對(duì)這一技術(shù)加以調(diào)整以符合一些如稀釋度和不同體積等變量。此外，即使僅用這種熒光檢測(cè)法做定性測(cè)定，也需要專門的設(shè)備。所以它不適于現(xiàn)場(chǎng)使用、更不用說(shuō)家庭使用，它也不能配置于試劑盒中供醫(yī)生診斷所使用。
大約在1970年Donald Rounds博士對(duì)RSP腫瘤標(biāo)志物首次作為一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子做了描述，它是在三種不同的人惡性細(xì)胞系(由宮頸癌衍生的HeLa;來(lái)自鼻咽癌的KB細(xì)胞系;以及源于結(jié)腸腺體癌的CMP)的條件培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的。這三種細(xì)胞系分泌一種相同的因子，它調(diào)節(jié)正常人體皮膚成纖維細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。在低濃度下，它刺激細(xì)胞分裂;在高濃度下，它抑制細(xì)胞分裂;在更高濃度時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種來(lái)自三種惡性細(xì)胞系的因子，在抗原性方面是相同的。
雖然有關(guān)RSP在活機(jī)體中的功用還有很多方面是未知的，但該因子的物理與生化性質(zhì)已得到鑒定。應(yīng)用超離心與電鏡技術(shù)已證明，該因子由呈環(huán)狀表形的顆粒構(gòu)成。電子顯微照片顯示，這些環(huán)狀顆粒由6～7個(gè)亞單位組成，它們是單環(huán)的，偶然地也有四個(gè)環(huán)疊在一起的，從側(cè)面看象一個(gè)長(zhǎng)方形顆粒。環(huán)狀顆粒的直徑為10～12nm，每100μg蛋白中含有3～5μgDNA和8～15μgRNA。未發(fā)表的用脂溶性染料做的研究也提示了有脂類存在，但這一點(diǎn)還未經(jīng)鑒定。在迄今所報(bào)道的所有生物體中，范圍包括細(xì)菌、酵母、植物、海膽、昆蟲(chóng)、兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類和哺乳類(包括人類)，RSP的大小、形狀以及亞基數(shù)目都是相同的。RSP是一種高分子量的核蛋白，具有多種催化性的蛋白酶活性。它的沉降系數(shù)是20S，分子量為650～750kDa，含有13個(gè)分子量為21～31kDa、等電點(diǎn)為3～10的不同的多肽。它們還有一個(gè)由70～80個(gè)核苷酸組成的RNA組分以及一個(gè)較小的DNA組分。細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中都發(fā)現(xiàn)有RSP。它們被惡性細(xì)胞釋放到胞外。有報(bào)道，RSP降解胞內(nèi)蛋白，調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)譯和tRNA前體的加工，并且具有氨酰tRNA合成酶活性。有報(bào)道，它們與熱休克蛋白和特定的小RNA相聯(lián)系。根據(jù)這些報(bào)道，顯然這些顆粒在多種細(xì)胞內(nèi)過(guò)程中起著某種重要的作用。
在70年代中期進(jìn)行的一些早期研究曾證明RSP是由腫瘤組織選擇性地釋出的。把取自肺、結(jié)腸、乳房、皮膚、腎和眼的絞碎的活檢組織置于維持培養(yǎng)基中在體溫下經(jīng)24小時(shí)溫育，有大量RSP釋出;而經(jīng)同樣處理的正常皮膚和舌肌肉組織則沒(méi)有釋出可測(cè)量的RSP。
在用病理范圍從正常到侵襲性癌癥的146例人皮膚活檢組織所做的有關(guān)RSP從溫育活檢組織中釋出的雙育研究中發(fā)現(xiàn)，20例正常皮膚和10例尋常
中沒(méi)有釋出顯著量的RSP，而12/36(33%)的良性腫瘤、皮脂溢性角化病和5/13(38%)的惡變前腫瘤、光化角化病釋出顯著量的RSP。這項(xiàng)研究中還發(fā)現(xiàn)52例基底細(xì)胞癌和15例鱗狀細(xì)胞癌中100%都釋出顯著量的RSP。侵襲性鱗狀細(xì)胞癌的RSP的數(shù)值范圍比非侵襲性基底細(xì)胞癌的RSP數(shù)值范圍要高。
在用人子宮頸活檢組織所做的類似的雙盲研究中觀察到，在取自非正常宮頸假定的正常區(qū)域上的活檢組織中16/21(76%)幾乎沒(méi)有或沒(méi)有可測(cè)量的RSP釋出到維持液中，其它5例組織試樣在24h培養(yǎng)中釋出較低量的RSP。收集在一起的發(fā)育異常和濕龐試樣中10/18(56%)釋出非顯著水平的RSP，另8/18釋出中等量的RSP。與此相對(duì)照，13/14(93%)原位癌和16/16(100%)侵襲性癌試樣中釋出大量的RSP。此外，曾觀察到子宮頸向陰道中釋出RSP。對(duì)陰道沖洗液的分析顯示276/284(97%)正常宮頸不釋出或釋出非顯著量的RSP，對(duì)于115/124(93%)例宮頸不同程度發(fā)育異常的婦女也如此。取自患有原位癌的婦女的試樣顯示17/29(58%)是RSP釋出陰性的。在這中間17/19(89.5%)的婦女年齡在38歲以下，根據(jù)在丹麥進(jìn)行的兩個(gè)15年研究記錄，在這個(gè)年齡組，這種原位癌變的損傷組織不加治療，也有90%能夠恢復(fù)到正常。對(duì)于子宮頸癌的情況，10/10(100%)的陰道沖洗液試樣中出現(xiàn)大量的RSP。
在一項(xiàng)進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，從各種癌細(xì)胞核中提取出的一種核抗原是由“微顆?！苯M成的，這種微顆粒外經(jīng)為11.3nm，內(nèi)徑為2.9nm，含有8個(gè)亞單位并且具有RSP的一般形態(tài)，發(fā)現(xiàn)該抗原存在于膀胱、腦、結(jié)腸、食管、肝、肺、前列腺、皮膚、胃和甲狀腺癌，3種肉瘤和6種惡性來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞系;在17種正常組織、4種良性腫瘤、7種炎癥病和2種正常來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞中沒(méi)有該抗原。
這些有關(guān)人腫瘤細(xì)胞RSP釋放的觀測(cè)結(jié)果，在一項(xiàng)用21種離體哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行的向培養(yǎng)基中釋放RSP的研究中得到了印證。發(fā)現(xiàn)除了一個(gè)細(xì)胞系外，所有細(xì)胞系都釋出了一些RSP(用顯微鏡檢術(shù)可測(cè)定)。因此，RSP似乎是一種普遍存在的現(xiàn)象。然而，所釋出的量依賴于細(xì)胞系的類型或來(lái)源。所有來(lái)源于腫瘤的細(xì)胞(9/9)和受致癌病毒感染的細(xì)胞(3/3)均釋出大量的RSP而，6/10正常來(lái)源的細(xì)胞系釋出很低量的RSP。
腫瘤組織釋出RSP的相對(duì)量似乎與其惡性化程度相關(guān)。這一點(diǎn)在用C3H10T1/2小鼠細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中得到了很好的證明。在一項(xiàng)被廣泛采用的離體測(cè)式方法中，此種細(xì)胞被用來(lái)鑒定致癌物。當(dāng)它暴露于致癌物時(shí)，會(huì)出現(xiàn)可清楚地確定的形態(tài)與生理變化包括(a)無(wú)變化(正常的接觸抑制);(b)Ⅰ型細(xì)胞群邊緣性接觸抑制;(c)Ⅱ型細(xì)胞群，低度接觸抑制;和(d)Ⅲ型細(xì)胞群，不表現(xiàn)接觸抑制。當(dāng)把細(xì)胞植入C3H10T1/2小鼠時(shí)，只有源于Ⅱ型與Ⅲ型細(xì)胞群的細(xì)胞發(fā)展成為惡性腫瘤。正常細(xì)胞與Ⅰ型細(xì)胞群來(lái)源的細(xì)胞不會(huì)形成腫瘤。而且源于Ⅲ型細(xì)胞群的細(xì)胞此源于Ⅱ型細(xì)胞群的細(xì)胞更具惡性，因?yàn)棰笮图?xì)胞在宿主鼠內(nèi)形成更多，更大的惡性腫瘤。已經(jīng)證明只有源于Ⅱ型與Ⅲ型細(xì)胞群的細(xì)胞釋出RSP，而源于正常細(xì)胞和Ⅰ型細(xì)胞群的細(xì)胞則不產(chǎn)生RSP。此外，還證明，在用致癌物，甲基磺酸乙酯處理后僅三周可在C3H10T1/2細(xì)胞的培養(yǎng)基中測(cè)出RSP，而一般的檢測(cè)終點(diǎn)為8周。
另外一項(xiàng)研究證明，雖然維生素A缺乏的倉(cāng)鼠氣管上皮在器官培養(yǎng)中出現(xiàn)鱗狀細(xì)胞化生和生長(zhǎng)過(guò)度，但取自維生素A缺乏的敘利亞倉(cāng)鼠的氣管上皮組織并不釋出RSP。而這一模型很接近地模擬了癌發(fā)生過(guò)程并且已被用于研究癌發(fā)生過(guò)程和維生素A類似物的抗腫瘤特性。當(dāng)把維生素A類似物注入同基因倉(cāng)鼠中時(shí)病灶可轉(zhuǎn)為正常從而不發(fā)生惡變。因此，沒(méi)有RSP釋出準(zhǔn)確地反映了氣管組織實(shí)際上是處于良性狀態(tài)。
有充分的證據(jù)表明RSP釋出量與腫瘤量有定量的關(guān)系，因此具有預(yù)測(cè)意義。把取自一種小鼠黑色素瘤細(xì)胞系的細(xì)胞通過(guò)靜脈內(nèi)注射注入B16F10小鼠后，細(xì)胞在鼠全身形成小腫瘤。這些腫瘤的色素沉著特征可以保證準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)肺組織中的腫瘤數(shù)目，以此作為宿主動(dòng)物中腫瘤量的計(jì)量指標(biāo)。取自注入了黑色素瘤細(xì)胞的小鼠的絞碎的肺組織向培養(yǎng)基釋放的RSP與同一肺組織中所記錄到的腫瘤數(shù)目成比例，再則，在肺形成明顯可見(jiàn)的腫瘤前即已能測(cè)到RSP的釋放。作為RSP釋出與腫瘤量相關(guān)的進(jìn)一步證明，對(duì)8位做了乳房根治術(shù)的乳腺癌患者血清中的RSP水平做了研究。從實(shí)施外科手術(shù)時(shí)起，血清中RSP含量迅速下降，到手術(shù)后第10天降到不可測(cè)出的水平。這些患者血清中RSP水平直到手術(shù)后第32天(本項(xiàng)試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間)一直保持陰性。
在隨后的一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞向其周圍的培養(yǎng)基中釋出一種RNA一蛋白脂類物質(zhì)，它所具有的特征表明是RSP，癌癥病人的血清中也發(fā)現(xiàn)存在這種物質(zhì)。在99位代表23種癌癥類型的患者血清中都檢出了這種物質(zhì)。作為對(duì)比，在74位分別患有21種非癌疾病的病人的血清中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。8種惡性來(lái)源的細(xì)胞系向其培養(yǎng)基中釋放出大量的此種RNA蛋白脂。該項(xiàng)研究報(bào)道，這種RSP樣的RNA一蛋白脂在癌癥病人血清中的含量與其現(xiàn)有腫瘤數(shù)量成正比關(guān)系。并且在外科手術(shù)切除腫瘤8～10天內(nèi)，RNA-蛋白脂完全消失。這一點(diǎn)證實(shí)了前述對(duì)做了乳房根治術(shù)的婦女所做的觀察結(jié)果。另外，在出現(xiàn)腫瘤再生時(shí)，RNA一蛋白脂的水平在腫瘤臨床表現(xiàn)前10個(gè)月就開(kāi)始上升。
在另外進(jìn)行的一項(xiàng)研究中RSP的釋出與腫瘤誘導(dǎo)作用有關(guān)。用溶于礦物油中的5%二甲基苯并蒽涂抹倉(cāng)鼠頰囊，每周3次連續(xù)5周，百分之百(32/32)處理前的正常頰囊活檢組織不產(chǎn)生顯著量的RSP，涂抹過(guò)3次的(18/18)的試樣也是如此。在第四次涂抹后，5/9(56%)的試樣表現(xiàn)出RSP產(chǎn)量中度上升。經(jīng)過(guò)6次涂抹后收集的9/17(53%)的試樣也是如此。這時(shí)活檢組織表現(xiàn)出基底細(xì)胞有些生長(zhǎng)過(guò)度、角質(zhì)化增強(qiáng)，但沒(méi)有惡變細(xì)胞的跡象。在第七次涂抹(第三周)時(shí)以及在此之后;實(shí)際上所有試樣都釋出大量的RSP(如第七次涂抹時(shí)的18/18;第九次時(shí)的15/15第十二次的8/8;以及第十五次的12/12)，并且RSP的釋出量在第九次涂抹后趨于平穩(wěn)。所有經(jīng)過(guò)處理的倉(cāng)鼠的頰囊和唇上都發(fā)展出充分肯定的癌，而這是在開(kāi)始處理12周后才出現(xiàn)的。這些材料表明經(jīng)過(guò)化學(xué)性轉(zhuǎn)化的活檢組織釋出RSP比組織學(xué)上出現(xiàn)惡變跡象至少提前9周，這提示可以在臨床上利用RSP釋放這個(gè)指標(biāo)鑒定惡變前狀態(tài)或無(wú)癥狀狀態(tài)。
這種在1970年左右被首次描述并被鑒定為環(huán)狀顆粒(RSP)的腫瘤標(biāo)志物已被許多實(shí)驗(yàn)室在惡性組織或細(xì)胞系試樣中觀察到。最新的證據(jù)表明，惡性細(xì)胞產(chǎn)出RSP不同于正常細(xì)胞，惡性細(xì)胞產(chǎn)生的RSP在抗原性方面是特殊的并且是由惡性細(xì)胞大量地釋放到體液中。與此相對(duì)照，正常細(xì)胞不釋出或只釋出非顯著量的RSP。這后一特征使得能夠?qū)λ畜w液進(jìn)行鑒查以找出體內(nèi)隱藏的癌癥。此外，RSP可以在腫瘤復(fù)發(fā)出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前幾個(gè)月被檢出，這一觀察結(jié)果表明，患者體內(nèi)無(wú)癥狀表現(xiàn)的腫瘤能夠在如此早的發(fā)育階段被檢出，這將使得醫(yī)療措施能夠保證高的治愈率。RSP含量與腫瘤負(fù)荷量成比例這一觀測(cè)結(jié)果也表明對(duì)正在接受治療的癌癥病人可以便利地進(jìn)行監(jiān)測(cè)以評(píng)估其治療效果。為了達(dá)到這些目的必須找到一種成本低、簡(jiǎn)單、迅速、靈敏而可靠的檢測(cè)與計(jì)量RSP水平的方法。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種檢測(cè)RSP腫瘤標(biāo)志物的方法和探針作為檢測(cè)癌癥的方法，這種方法成本低、簡(jiǎn)單、使用方便，靈敏而可靠。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)生物體液中存在RSP腫瘤標(biāo)志物的方法和探針。即通過(guò)把體液中的這種標(biāo)志物捕捉到某種基質(zhì)中，然后再?gòu)幕|(zhì)中檢測(cè)RSP的存在。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)癌癥存在的方法和探針，即從帶有惡性細(xì)胞的生物體液中把RSP腫瘤標(biāo)志物捕捉到某種基質(zhì)中然后從基質(zhì)中檢測(cè)RSP的存在，以此作為癌癥存在的指征。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種利用抗RSP抗體從生物體液中捕捉RSP腫瘤標(biāo)志物的方法和探針?？筊SP抗體是從包括單隆抗體、多克隆抗體、親和層析純化抗體及其混合物的抗體組中選擇出來(lái)的。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)探針從生物體液中捕捉RSP到某種基質(zhì)中，然后檢測(cè)這種探針的存在，作為RSP存在的指征的方法和探針。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是從一種生物體液中把RSP腫瘤標(biāo)志物用對(duì)該標(biāo)記物上氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶接受位點(diǎn)有專一性的tRNA捕捉到某種基質(zhì)中。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種從懷疑患有癌癥病人的體液中檢測(cè)RSP腫瘤標(biāo)志物的方法和探針。該方法是利用有顏色反應(yīng)的分子，使之與RSP腫瘤標(biāo)志物直接或間接連接的顯色技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明提供的從可能帶有惡性腫瘤的病人體液中檢測(cè)RSP存在的方法，上述目的都得以實(shí)現(xiàn)。這種方法包括從上述病人體液中捕捉RSP到一種基質(zhì)上以及在這種基質(zhì)中檢測(cè)RSP的存在。只要取得被檢的人或動(dòng)物的體液，把其中的RSP捕捉到一種基質(zhì)中并在該基質(zhì)中檢測(cè)RSP的存在，即可用這種方法檢測(cè)人或動(dòng)物中惡性癌細(xì)胞的存在。根據(jù)本發(fā)明的一種形式，RSP是用單克隆抗體、多克隆抗體、親和層析純化抗體或其混合物中選出的抗RSP抗體從體液中捕捉的，之后，通過(guò)例如顯色技術(shù)檢測(cè)基質(zhì)中RSP的存在。根據(jù)本發(fā)明的另一種形式，RSP是通過(guò)用一個(gè)標(biāo)記的tRNA探針與體液試樣中的RSP接觸，使這種tRNA結(jié)合到RSP標(biāo)志物上的氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)上而被從體液中捕捉，然后檢測(cè)這種在RSP上的合成酶分子。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的形式中，對(duì)RSP的捕捉與檢測(cè)或?qū)|(zhì)中已被捕捉的RSP的檢測(cè)都是用一種對(duì)RSP上氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)專一性的RSP探針完成的。這種探針最理想的是一種結(jié)合分子，它通過(guò)tRNA組分與RSP上的氨酰tRNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)(二核苷酸折疊)連接，并帶有能表現(xiàn)可見(jiàn)顏色的二級(jí)分子。一種較好的探針是由這種結(jié)合分子構(gòu)成的tRNA-光生物素-鏈菌親合素(streptavidin)-堿性磷酸酶。另一種較好的探針的組成是tRNA-光生物素-親合素(avidin)-葡萄糖氧化酶。
在本發(fā)明的另一種形式中，提供了一種探針，由單克隆抗體、多克隆抗體、親和層析純化抗體中選出的一個(gè)或多個(gè)抗RSP抗體構(gòu)成，該探針被連接上一個(gè)適于被檢測(cè)的探針標(biāo)記，以此作為RSP腫瘤標(biāo)志物存在的指征。
本發(fā)明的其它目的以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)對(duì)那些精通這種技術(shù)的人來(lái)說(shuō)，將從下面的詳細(xì)說(shuō)明、圖示、范例及附加的權(quán)利要求中得到清楚的了解。
附

圖1以草圖形式說(shuō)明了RSP的氨酰tRNA合成酶受體位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)該位點(diǎn)專一性的RSP探針。
附圖2以草圖形式說(shuō)明了RSP通過(guò)緊接在tRNA探針與RSP上現(xiàn)成的氨酰tRNA合成酶受體位點(diǎn)結(jié)合之前，經(jīng)tRNA預(yù)處理的表面結(jié)合到反應(yīng)容器上。
附圖3以草圖形式說(shuō)明了圖2中的RSP與tRNA探針在其受體位點(diǎn)反應(yīng)后的狀態(tài)。
本發(fā)明所提供的是測(cè)定生物體液中腫瘤標(biāo)志物RSP存在的方法和檢查人或動(dòng)物中癌癥存在的方法，這種方法就是把體液中的RSP腫瘤標(biāo)志物從體液中捕捉到一種基質(zhì)中隨后檢查基質(zhì)中RSP標(biāo)志物的存在以此作為癌癥存在的指征。本發(fā)明的一種優(yōu)選的形式是利用一種抗RSP抗體(rspAb)把體液中的RSP腫瘤標(biāo)志物捕捉到基質(zhì)中。使這種方法成為可能的是rspAb與RSP腫瘤標(biāo)志物之間的親和性，這種親和性導(dǎo)致rspAb與RSP腫瘤標(biāo)志物結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)從體液中捕捉出RSP。本發(fā)明的另一種優(yōu)先選擇的形式是利用一種tRNA探針，它與RSP上的一個(gè)非常專一性的位點(diǎn)(氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn))相結(jié)合。這種探針不僅能夠把體液中的RSP腫瘤標(biāo)志物捕捉到基質(zhì)上，還可以通過(guò)在該探針上加上適當(dāng)?shù)谋阌跈z測(cè)的二級(jí)分子，如表現(xiàn)可見(jiàn)顏色的分子，以檢測(cè)基質(zhì)中RSP的存在。捕捉與檢測(cè)RSP腫瘤標(biāo)志物是檢查人或動(dòng)物體中存在惡性癌細(xì)胞的一種有效、準(zhǔn)確而可靠的方法，這一判斷的直接的認(rèn)識(shí)根據(jù)是，RSP是由癌細(xì)胞向胞外分泌釋出的，因而可在血清或其它體液中檢測(cè)。
抗RSP抗體識(shí)別和鑒定生物體液(如人或動(dòng)物體液)中的RSP并從中捕捉出RSP的能力，以及如何用這一方法檢查人或動(dòng)物體液，(如癌癥病人血清)中惡性癌細(xì)胞，通過(guò)下面的例Ⅰ可以得到清楚的說(shuō)明。實(shí)例Ⅰ的目的是證明抗RSP抗體(rspAb)能夠有效地從癌患者血清中捕捉出RSP。實(shí)例Ⅰ的做法是，通過(guò)親和層析純化技術(shù)從一個(gè)已不再釋出RSP但仍具有抗RSP抗體的過(guò)去的癌癥患者體內(nèi)分離出rspAb。如果這種rspAb能夠起作用，則被捕捉到的RSP將可以用顯色技術(shù)檢測(cè)，如采用一種tRNA探針檢測(cè)系統(tǒng)，這些在下文中將作充分的揭示。
實(shí)例Ⅰ1.親合層析純化程序a)在柱中裝入溴化氰活化的Sepharose 4-B樹(shù)脂，并將RSP聯(lián)結(jié)到樹(shù)脂上。該樹(shù)脂的制備、裝柱以及與抗原(RSP)的聯(lián)結(jié)都按一般的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
b)取自一位過(guò)去的癌癥患者的1ml血清與3ml pH8.5的硼酸鹽緩沖液混合后在環(huán)境溫度下過(guò)柱。所有血清中的rspAb都與柱上的RSP抗原反應(yīng)并與之結(jié)合。用pH7.5的磷酸緩沖鹽水(PBS)將沒(méi)有結(jié)合的血清蛋白從中洗脫。當(dāng)紫外分光光度計(jì)280nm處的光吸收(O.D.)讀數(shù)為0.0時(shí)，停止洗脫。
c)用若干份2ml的4.0M氯化鉀溶液洗脫。每份洗脫液都在紫外分光光度計(jì)280nm處讀數(shù)，結(jié)果如下洗脫液號(hào) O.D1 0.042 0.023 0.024 0.01
d)蛋白(rspAb)含量的逐漸下降說(shuō)明rspAb的大部分是在頭四部分洗脫液中。將這四部分洗脫液倒在一起，裝入一個(gè)截留界限為10，000分子量的透析管中，在4℃下，先對(duì)0.85%的氯化鈉透析18小時(shí)，之后對(duì)pH7.5的PBS進(jìn)行最后2.5小時(shí)透析以除去過(guò)量的鹽。
e)將所得的經(jīng)透析的15ml液體放在一個(gè)帶有PM-10膜的AMICON超濾管中通過(guò)離心濃縮到2.5ml。
f)將這種抗體濃縮物的O.D.與一個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，發(fā)現(xiàn)其含量等于0.1g/ml蛋白質(zhì)。這就是經(jīng)過(guò)親和層析純化的rspAb。
2.利用抗RSP抗體的檢測(cè)系統(tǒng)a)將rspAb施加到一種放置在塑料棒上的硝酸纖維膜(1)上，用血清封閉，然后在室溫下與取自癌癥病人的0.1ml血清反應(yīng)10分鐘。將膜吸干。之后，與tRNA探針檢測(cè)系統(tǒng)反應(yīng)15分鐘(該檢測(cè)系統(tǒng)將在下文中充分描述)。這種分步反應(yīng)過(guò)程可以表示如下ⅰ 將rspAb加于硝酸纖維膜上()/() Ⅰ-rspAbⅱ 膜與含RSP的癌癥病人的血清反應(yīng)()/() Ⅰ-rspAb-RSPⅲ膜上的RSP與tRNA探針混合物反應(yīng)()/() Ⅰ-rspAb-RSP-tRNA＝甲
formazon)這一反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生出特征性的甲
灰-黑色斑點(diǎn)，僅在膜上施加有抗RSP抗體的地方才有。
此例說(shuō)明，RSP被固定在膜上的rspAb從癌癥病人的血清中捕捉出來(lái)。此例還說(shuō)明rspAb被成功地結(jié)合到一種從癌癥病人血清試樣檢測(cè)癌的系統(tǒng)中。
實(shí)例Ⅱ用多克隆抗體可以得到與實(shí)例Ⅰ非常一致的結(jié)果。下面舉例說(shuō)明的是一種從兔中制取多克隆抗體的例證性的程序。
在兔子中產(chǎn)生多克隆抗RSP抗體按下面的方案制備抗RSP抗體，以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出以抗體為基礎(chǔ)的癌檢測(cè)方法。
1.抗原(RSP)純化程序a)制取RSP粗提物取自一位乳腺癌患者的300ml血清與等量的飽和硫酸銨混合，使其中的IgG與RSP沉淀出來(lái)。
b)從上述血清中制取RSP沉淀ⅰ 將沉淀溶解于“標(biāo)準(zhǔn)緩沖液”(50mM Tris-HCl，PH7.5，1mM二硫蘇糖醇，20%V/V甘油以及0.02%W/V疊氮化鈉)中。
ⅱ 將RSP/IgG組分用等體積的飽和硫酸銨重新沉淀。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液重新溶解沉淀然后再進(jìn)行一次重沉淀和再溶解。
ⅲ將溶解的RSP/IgG混合物在截留界限為10，000分子量的透析袋中對(duì)含0.02%疊氮化鈉的磷酸緩沖鹽水(pH7.5)在4℃下透析18小時(shí)。
c)Biogel A-0.5m凝膠過(guò)濾使經(jīng)過(guò)透析的10ml RSP混合物濃縮然后在充填有Biogel A-0.5m樹(shù)脂的4×8cm柱上分級(jí)分離。樹(shù)脂在使用前要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液平衡處理。洗脫下來(lái)的級(jí)分用下文有充分描述的tRNA探針體系檢測(cè)以確定哪一個(gè)級(jí)分中含有RSP組分。
d)羥基磷灰石色譜將含有RSP的級(jí)分合并然后相對(duì)于含有1mM二硫蘇糖醇和20%甘油的25mM的磷酸鉀(pH6.8)在4℃下透析18小時(shí)。經(jīng)透析的RSP混合物被濃縮后在填有25ml羥基磷灰石柱上進(jìn)行分級(jí)分離，該柱預(yù)先用同樣的磷酸緩沖液平衡。用100ml100～150mM的磷酸緩沖液洗脫RSP，用前文提到的tRNA探針體系檢測(cè)洗脫液以確定哪個(gè)級(jí)分中含有RSP組分。
e)DEAE Affi-Gel Blue色譜將含有RSP的級(jí)分收集在一起，然后相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液在4℃下透析18小時(shí)。經(jīng)透析的RSP混合物被濃縮后在裝填有已用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液平衡好的DEAE Affi-Gel Blue的柱上進(jìn)行分級(jí)分離。用50ml標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗柱后，用100～130ml0～0.6M的氯化鉀進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)tRNA探針測(cè)定結(jié)果，將有活性的級(jí)分收集起來(lái)，然后相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，在4℃下透析18小時(shí)。使透析好的RSP在裝有PM-10膜的一個(gè)AMICON管中離心濃縮，根據(jù)紫外分光光度計(jì)280nm處的O.D.讀數(shù)，最終達(dá)到蛋白濃度為5mg/ml。
f)純度標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)純化的RSP在非變性條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定。其結(jié)果是一條單一的特征區(qū)帶，位于600，000～675，000分子量的位置。
2.兔子的免疫
a)多克隆RSP抗血清用改進(jìn)的Winberry與Holten法〔見(jiàn)“Rat Liver Glucose-6-p Dehydrogenase Dletary Regulafion of the Rate of Synthesis”The Journal of Biological Chemistry，Vol.252，No.21，pp 7796-7801(1977)〕制備RSP特異性抗血清。
b)免疫記錄Ⅰ、用100μg免疫原(RSP)懸浮于同體積的完全弗氏佐劑中進(jìn)行初次免疫。皮下多點(diǎn)注射。
Ⅱ、三周間隔Ⅲ、用50μg免疫原懸浮于同體積的不完全弗氏佐劑進(jìn)行第二次免疫。多點(diǎn)皮下注射。
Ⅳ、9～10天間隔Ⅴ、依據(jù)血清試樣中rspAb的含量進(jìn)行試檢性放血或生產(chǎn)性放血。
Ⅵ、14～18天間隔Ⅶ、用50μg免疫原和等體積的不完全弗氏佐劑進(jìn)行第三次免疫。
皮下多點(diǎn)注射。
Ⅷ、9～11天間隔Ⅸ、生產(chǎn)性放血c)rspAb的純化與制備Ⅰ、用蛋白A-瓊脂糖親和色譜法將IgG與其它免疫球蛋白分離開(kāi)。
Ⅱ、將酸洗脫下來(lái)的IgG中和，把280nm處O.D.超過(guò)0.01的級(jí)分收集在一起，然后用一種裝有PM-10膜的AMICON管經(jīng)離心使之濃縮到大約1mg蛋白/ml。
Ⅲ、將經(jīng)純化和濃縮的rspAb制備物在5℃下貯存并加入0.02%W/V的疊氮化鈉保存。這種抗體可用于本發(fā)明中的癌(RSP)檢測(cè)體系。
在本發(fā)明的實(shí)踐中，rspAb可被固定在任何通用的基質(zhì)上，如丙烯酸珠、各類膜、乳膠珠、金屬(如鋼珠、膠體金等)、玻璃表面、各種聚合物表面以及類似物，用以從人或動(dòng)物體液中將RSP捕捉或固定到某一表面上。這些體液的示例有，血清、尿、眼淚、痰、唾液、精液、乳汁還有從可進(jìn)入部位如肺、宮頸、結(jié)腸等處得到的洗出液或源于細(xì)胞或組織的溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)基，等等。被捕捉的RSP可以用任何通用的檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，如熒光標(biāo)記物、放射性同位素、催化酶以及生物或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記體系，或采用探針如針對(duì)RSP的核酸組分研制出的RNA或DNA探針，或者用在申請(qǐng)者的共同待決申請(qǐng)中描述的tRNA探針。例如，依據(jù)本發(fā)明，可將rspAb聯(lián)結(jié)到任何一種通用的檢測(cè)體系中構(gòu)成一種可按本發(fā)明的要求應(yīng)用的探針。比如，它可以被連接上熒光標(biāo)記，如熒光素、若丹明、得克薩斯紅、溴化乙錠、吖啶染料、和同類物，而后用熒光分光計(jì)、熒光顯微鏡或紫外分光光度計(jì)讀數(shù)。另外，還可以使之與任何一種同位素結(jié)合，根據(jù)所用的同位素和檢測(cè)體系的構(gòu)成可以用β或α計(jì)數(shù)器或通過(guò)放射自顯影法加以檢測(cè)。它還可以和生物素或光生物素連接因而能夠用親合素、鏈菌親合素、外親合素(extravldin)等與之相聯(lián)，進(jìn)而可與任何用于標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)體系的酶連接，如葡糖氧化酶、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶等。這些與酶聯(lián)抗體也可與任何終點(diǎn)顏色放大體系一起應(yīng)用，如堿性磷酸酶啟動(dòng)的同時(shí)生成甲
和靛藍(lán)的雙序催化反應(yīng)，等。
探針的基礎(chǔ)是一種分子與另一種分子之間獨(dú)特而專一的親和性。通常用做探針的分子是，抗原∶抗體、雜交的RNA或DNA∶DNA、親合素∶生物素以及A蛋白或G蛋白對(duì)特定免疫球蛋白的親和性。例如rspAb捕捉RSP就是抗原∶抗體親和性的一個(gè)例子。另一類高度專一性的分子親和性是某一酶分子上的受體位點(diǎn)與其作用底物之間的親和性。這種親和性還從未被用來(lái)開(kāi)發(fā)出一種探針，因?yàn)?1)酶底物一般都是小分子，不適于用標(biāo)記物標(biāo)記，(2)酶底物會(huì)很快地被酶轉(zhuǎn)化成某種產(chǎn)物，(3)而該產(chǎn)物又很快地從酶分子上釋放出來(lái)。但是，現(xiàn)在已經(jīng)確知可以利用某些酶/底物親和性，開(kāi)發(fā)出某種探針，如用RSP，在這里不存在上面所列的三種情況。在沒(méi)有鎂離子或ATP存在條件下，RSP中酶組分上的專一性受體位點(diǎn)能夠結(jié)合特定的帶有或不帶有關(guān)連氨基酸的tRNA，這種結(jié)合并不形成可釋放的產(chǎn)物。被結(jié)合的tRNA可以用光生物素標(biāo)記，光生物素使tRNA容易與結(jié)合有鏈菌親合素的堿性磷酸酶結(jié)合。在這樣的探針與RSP上的與其匹配的酶結(jié)構(gòu)選擇性結(jié)合之后，就可以利用堿性磷酸酶/底物反應(yīng)所產(chǎn)生的可見(jiàn)的顏色證明RSP的存在。靛藍(lán)與甲
的同步生成就是這種酶的靈敏的顯色技術(shù)的實(shí)例。
在本方法中，RSP的存在是通過(guò)從接受檢查的個(gè)體收集生物體液試樣來(lái)確定的。但是，與已有的方法不同，用本方法檢測(cè)RSP時(shí)，癌癥屬何類型及用何種體液都無(wú)關(guān)緊要。在取得生物體液后，將其中的RSP用一種從一個(gè)或多個(gè)單克隆抗體、多克隆抗體和親和層析純化抗體中選擇出來(lái)的抗RSP抗體捕捉到某種基質(zhì)中，如實(shí)例Ⅰ和Ⅱ所描述的那樣。之后，基質(zhì)中RSP的存在，最好用下文中介紹的tRNA探針加以檢測(cè)?；蛘?，按照本發(fā)明的另一種形式生物體液中的RSP既用tRNA探針捕捉到基質(zhì)中也用tRNA探針檢測(cè)。
正如圖1圖示說(shuō)明的那樣，tRNA探針是由一種對(duì)RSP腫瘤標(biāo)志物上的氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)專一性的tRNA構(gòu)成。為了以后檢測(cè)的需要，該tRNA上已經(jīng)做了標(biāo)記，如用光生物素。該tRNA探針結(jié)合在RSP的氨酰轉(zhuǎn)移RNA酶反應(yīng)位點(diǎn)上。對(duì)這種由tRNA示蹤的RSP的檢測(cè)通過(guò)光生物素標(biāo)記的tRNA上連接鏈菌親合素并把堿性磷酸酶連接到鏈菌親合素上而變得更為便利。最后，某種顯色劑，如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基藍(lán)四唑反應(yīng)混合物，與tRNA探針上的堿性磷酸酶反應(yīng)顯出具有一定強(qiáng)度的特征性顏色，其強(qiáng)度與生物體液中由癌細(xì)胞釋出的RSP的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。特別是，在這種生物素-鏈菌親合素-堿性磷酸酶體系中出現(xiàn)的藍(lán)/紫色是RSP腫瘤標(biāo)志物存在的指征，因而也是癌存在的指征。通過(guò)所產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)了定量測(cè)定。據(jù)此觀察，一些非惡性細(xì)胞產(chǎn)生的可忽略的或小量的RSP比惡性細(xì)胞產(chǎn)生的RSP要小幾個(gè)數(shù)量級(jí)，通過(guò)直觀的顏色強(qiáng)度比較來(lái)區(qū)分可忽略的與顯著的RSP產(chǎn)生是沒(méi)有困難的。值得注意的是，按照與這里所介紹的tRNA探針?lè)浅Ｒ恢碌臉?gòu)成方式也可以構(gòu)建一種rspAb探針，并且可以象圖1那樣圖示說(shuō)明，只是探針中tRNA組分將代之以一個(gè)rspAb。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體形式中，優(yōu)先利用rspAb把RSP腫瘤標(biāo)志物從生物體液中捕捉出來(lái)，使標(biāo)記并連接上適當(dāng)?shù)亩?jí)分子以便通過(guò)用tRNA-光生物素-鏈菌親合素-堿性磷酸酶探針，如圖1所示，與RSP的反應(yīng)產(chǎn)生可見(jiàn)的顏色。而在另一種具體形式中，用這一tRNA探針代替rspAb完成RSP捕捉同時(shí)也用之檢測(cè)RSP。不論是用rspAb還是用tRNA從體液中捕捉RSP，這一tRNA探針對(duì)于檢測(cè)RSP的存在是最有效的因而都被優(yōu)先選用。例如，在一項(xiàng)盲試(blind study)研究中，使用的是經(jīng)過(guò)充分鑒定的有某一臨床背景的病人的血清，該tRNA探針準(zhǔn)確地鑒定出了71/73的癌血清，靈敏度為97.3%，并且鑒定出53/62的非癌血清，特異性為85.5%。
用tRNA探針檢測(cè)基質(zhì)中RSP的實(shí)例，也即本發(fā)明的一個(gè)具體形式，其中tRNA探針既用于捕捉又用于檢測(cè)RSP。利用從一個(gè)正在接受檢查的病人收集到的血清試樣，把血清加入到預(yù)先包被好的微量滴定板的孔穴中，孔穴的底部與四壁已用tRNA包被。由于tRNA與RSP上氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)之間的親和性，試樣中的任何RSP都會(huì)附著在孔穴表面上。用水或PH7.4的磷酸緩沖鹽水(PBS)沖洗幾次，沖掉孔穴上的血清試樣只保留下結(jié)合到孔穴表面的RSP。根據(jù)本發(fā)明，由連接在一起的tRNA-光生物素-鏈菌親合素構(gòu)成tRNA探針，如圖1所示。取一定量的tRNA探針加入到孔穴中，在那里tRNA分子與RSP上另外的氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)反應(yīng)并與之結(jié)合?？籽ㄖ衪RNA與RSP之間反應(yīng)前與剛經(jīng)過(guò)反應(yīng)的狀態(tài)分別由圖2與圖3說(shuō)明。圖2顯示，RSP連接到預(yù)先覆蓋在孔穴底部上的tRNA上以及還未反應(yīng)的本發(fā)明中的tRNA探針與RSP的反應(yīng)位點(diǎn)連接之前的狀態(tài)。圖3說(shuō)明RSP標(biāo)志物反應(yīng)后的狀態(tài)并且顯示tRNA探針已連接到RSP上現(xiàn)成的反應(yīng)位點(diǎn)上。在tRNA探針連接到RSP受體位點(diǎn)以后，再用水或PBS沖洗掉未反應(yīng)的tRNA探針。到這時(shí)，還需要做的只是提供一種能客觀反映孔穴中RSP數(shù)量的顯示方法。加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基藍(lán)四唑顏色反應(yīng)混合物即可完成這項(xiàng)工作。顯色系統(tǒng)產(chǎn)生出直觀的顏色，其強(qiáng)度范圍依據(jù)孔穴中RSP的濃度可從無(wú)色(即此處沒(méi)有或只有非可測(cè)量的RSP從生物體液中被捕捉出來(lái))到很強(qiáng)的藍(lán)/紫色(即此處有大量的RSP被捕捉)。用分光光度計(jì)可以定量測(cè)定顏色強(qiáng)度。由于給檢測(cè)人員提供的數(shù)值可清楚地說(shuō)明反映癌存在的顏色強(qiáng)度的閾值，這樣評(píng)估RSP檢測(cè)試驗(yàn)的結(jié)果就比較簡(jiǎn)單了。
實(shí)例Ⅲ為了證明(1)這種環(huán)狀顆粒含有第二核苷酸折疊的酶，即它們含有氨酰tRNA合成酶，和(2)其底物，tRNA，選擇性地結(jié)合到受體位點(diǎn)上，進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn)。按照Thompson等人的技術(shù)(Proceedings of National Academy of Science，USA，72669-672，1975)制備了一種針對(duì)蛋白質(zhì)(指那些以核苷酸為底物的酶)的二核苷酸折疊的親和柱，其中含有Affigel Blue(100～200目，BioRad實(shí)驗(yàn)室，Richmond，加卅)。將曾生長(zhǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC3的培養(yǎng)基(已知含有RSP)通過(guò)這種親和柱，然后用pH7.4的PBS洗脫。用Bradford法(Analytic Biochemistry 72248，1976)檢測(cè)2毫升洗脫液中的蛋白質(zhì)含量。當(dāng)所有不帶二核苷酸的蛋白質(zhì)都沖洗下來(lái)后，在柱上加入1mg/ml(4×10-2mM)的tRNA，在隨后的洗脫級(jí)分中可記錄到蛋白質(zhì)含量的顯著增加，這表明tRNA優(yōu)先地結(jié)合到該合成酶分子的二核苷酸折疊上從而使RSP從AffigelBlue柱上解離下來(lái)。除非兩個(gè)條件(存在一個(gè)二核苷酸折疊而它與tRNA具有親和力)同時(shí)存在，否則不會(huì)得到這一結(jié)果。
實(shí)例Ⅳ為了證明用光生物素和鏈菌親合素-堿性磷酸酶標(biāo)記的tRNA能夠與結(jié)合在微量滴定板孔穴底部的RSP連接并可以通過(guò)孔穴中的藍(lán)/紫顏色變化而被檢測(cè)，用Mierendorf法(Promega Notes，1988)進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn)。
在底部表面包被了tRNA(見(jiàn)圖2)的Immulon微量滴定板孔穴中加入100μl經(jīng)Amicon centricon30微濃縮器濃縮4倍的前列腺癌細(xì)胞PC3的條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的RSP也已相應(yīng)濃縮了4倍。經(jīng)過(guò)30分鐘后，把孔穴中的培養(yǎng)基倒掉，用PH7.4的PBS沖洗10次。RSP經(jīng)過(guò)與tRNA反應(yīng)即被結(jié)合到孔穴底部。在處理孔穴中加入10μl光生物素標(biāo)記的tRNA，而在陰性對(duì)照孔穴中加入10μl不含tRNA的Tris緩沖液，室溫下反應(yīng)30分鐘，用PBS沖洗孔穴5次。在這一步驟中，tRNA結(jié)合到tRNA酶反應(yīng)位點(diǎn)上(見(jiàn)圖3)而在用不含tRNA的Tris處理的孔穴中，該反應(yīng)位點(diǎn)仍未發(fā)生反應(yīng)。把25μl 0.1mg/ml的鏈菌親合素加到所有孔穴中，在室溫下經(jīng)過(guò)30分鐘后，用PBS沖洗孔穴10次，鏈菌親合素與tRNA上的光生物素結(jié)合而在沒(méi)有tRNA的孔穴中則被洗掉。
在所有孔穴中加入25μl 0.1mg/ml生物素化的堿性磷酸酶。室溫下，經(jīng)過(guò)30分鐘后，用PBS沖洗孔穴10次。在這一步中，生物素-堿性磷酸酶分子被連接到孔穴底部與RSP相連的光生物素標(biāo)記的tRNA上的鏈菌親合素上。這一步使探針完全構(gòu)成(見(jiàn)圖1)。在沒(méi)有tRNA的孔穴中堿性磷酸酶被洗掉。
最后，在每個(gè)孔穴中加入100μl5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)/硝基藍(lán)四唑(NBT)顏色反應(yīng)混合物。在45～60分鐘內(nèi)顯色。用tRNA處理過(guò)的RSP表觀出強(qiáng)的藍(lán)/紫色反應(yīng)，而陰性對(duì)照不出現(xiàn)著色。
這項(xiàng)研究明確證實(shí)RSP具有一個(gè)tRNA專一性反應(yīng)位點(diǎn)，并且上面介紹的這種tRNA探針會(huì)與RSP結(jié)合并準(zhǔn)確地檢出RSP。因此，這一探針為檢測(cè)人與動(dòng)物中的癌病提供了一種極好的方法。
另一種合乎需要的RSP檢測(cè)方法是用一種第二抗RSP抗體(rspAb2)，它與RSPrspAb連接，后者是用rspAb捕捉體液中的RSP而形成，已如前述。在這一檢測(cè)方法中，形成了一種固態(tài)基質(zhì)-rspAbRSPrspAb2夾心結(jié)構(gòu)，其中rspAb2的作用是使這種夾心分子串聚集或沉淀。將沉淀用干凈的聚碳酸酯過(guò)濾器濾出，然后與標(biāo)準(zhǔn)色板相比較而測(cè)出沉淀的量，色板由外加RSP的樣品制作而得，或者用一種差示反射分光計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。一種可選用的固態(tài)基質(zhì)是有色(黑色)乳膠珠，它依賴血清中RSP的量產(chǎn)生出濃淡不同的顏色。下面列舉一個(gè)該方法的實(shí)例a)將rspAb連接到羰化的黑色乳膠珠(O)上即＝O-rspAbb)O-rspAb與被檢血清在微量離心管中反應(yīng)一段時(shí)間之后，從血清中離心出這些乳膠珠。用PBS沖洗幾遍，每次沖洗后離心取出乳膠珠。所產(chǎn)生的反應(yīng)是癌血清＝O-rspAbRSP非癌血清＝O-rspAbc)經(jīng)過(guò)反應(yīng)的乳膠珠在微量離心管中與rspAb2反應(yīng)一段時(shí)間后，從反應(yīng)混合物中離心取出，沒(méi)有結(jié)合的分子按如b)所述方法沖洗掉。
所產(chǎn)生的反應(yīng)是癌血清＝O-rspAbRSPrspAb2(沉淀)非癌血清＝O-rspAb (無(wú)沉淀)d)用一個(gè)干凈的聚碳酸酯濾膜過(guò)濾并進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有沉淀物的乳膠珠穿過(guò)膜而有沉淀的乳膠珠-抗體RSP抗體聚合物則不能透過(guò)。因此，無(wú)沉淀的乳膠珠能夠很容易地與沉淀分離開(kāi)。
雖然上文介紹的方法中采用的是有色乳膠珠，但是應(yīng)該意識(shí)到也可以利用有色的沉淀、熒光沉淀或放射性沉淀，在rspAb2上標(biāo)記上適當(dāng)?shù)姆肿?如任何色澤深的粒子如甲
、碳等;熒光分子如若丹明、得克薩斯紅、溴化乙錠、熒光素等;以及同位素如125I、3H、14C、等)。上述方法與體系的另一種變通形式是rspAb不必連到一個(gè)固態(tài)基質(zhì)上，可以用一個(gè)抗rspAb抗體把rspAbASPrspAb2或簡(jiǎn)單地，把rspAbASP反應(yīng)的分子從血清中沉淀出來(lái)。本文前面所提到的任何一種指示體系都可以用于這類抗體中的任何一種。此外，沖洗、過(guò)濾以及定量方法均可與上文所述相同。
盡管對(duì)于RSP的生化性質(zhì)尚未全部搞清，但是可以預(yù)料構(gòu)成RSP的每一個(gè)區(qū)段都具有氨酰tRNA酶活性，催化某一特定的氨基tRNA氨基酸結(jié)合。因此，任何tRNA與tRNA組合都可用于構(gòu)建本發(fā)明中的探針。此外，用做探針和用于預(yù)處理反應(yīng)容器表面的tRNA可以是相同的也可以是不同的tRNA。而且，除了生物素-鏈菌親合素-堿性磷酸酶外顯然也可以用其他常用的檢測(cè)體系容易地構(gòu)建探針。例如，tRNA可以連接到熒光素、若丹明、得克薩斯紅、溴化乙錠和吖啶染料等熒光標(biāo)記物上，然后用熒光分光光度計(jì)、熒光顯微鏡或紫外分光光度計(jì)測(cè)定。tRNA也可以連接上任何放射性同位素并根據(jù)所用的同位素種類采用β或γ計(jì)數(shù)器或放射自顯影方法加以檢測(cè)。此外，雖然在所介紹的體系中顯色反應(yīng)在容器的液相中進(jìn)行可表現(xiàn)出最佳的靈敏度，但是RSP-tRNA探針檢測(cè)體系也適用于固態(tài)基質(zhì)，如各種膜、玻璃、各種多聚物表面、乳膠珠和紅血細(xì)胞(在凝集試驗(yàn)中)以及金屬如膠體金或其它酶體系如以酸性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶和脲酶為基礎(chǔ)的體系。
工業(yè)上的可應(yīng)用性本發(fā)明的方法與探針可廣泛地用于普查早期癌癥;為正在接受治療的病人提供一種簡(jiǎn)單的監(jiān)查體系;為查找環(huán)境與工業(yè)致癌物提供一種大大改進(jìn)的方法。更為重要的，也許是有可能利用這一方法把RSP探針裝進(jìn)成套試劑盒里，為醫(yī)生提供一種快速、靈敏、可靠而價(jià)廉的手段，在常規(guī)體檢中或在化療和放療后癌癥病人的治療過(guò)程中檢測(cè)個(gè)體體液中的RSP。如果在一個(gè)外表健康的個(gè)體中出現(xiàn)陽(yáng)性檢查結(jié)果，則應(yīng)進(jìn)行復(fù)查。如果第二次檢查確證有RSP存在，就可以做深入的檢查(如核磁共振成像)以對(duì)體內(nèi)腫瘤定位和鑒定。這時(shí)將建議采用某種治療程序除去或催毀惡變組織而RSP又可以用來(lái)監(jiān)測(cè)治療是否成功。
為了使早期檢出癌活性和準(zhǔn)確監(jiān)控癌癥治療成為可能，人們盼望有一種簡(jiǎn)單、易于使用的體外診斷試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)對(duì)患者體內(nèi)任何地方的致癌活性。一旦認(rèn)識(shí)到至少5百萬(wàn)有癌癥病史的人每季度要接受檢查，每年還有幾百萬(wàn)新被診斷的和活動(dòng)性癌癥病例要檢查，對(duì)一種快速、有效的診斷試驗(yàn)的需求程度就變得很明顯了。另外，用生物體液檢查取代目前所使用的令人不舒服的通常是很麻煩的巴氏涂片試驗(yàn)，將會(huì)鼓勵(lì)現(xiàn)在勉強(qiáng)做檢查的婦女們接受至少每年一次的RSP檢查，這更證明了對(duì)這樣一種檢查方法的需要以及這種方法的實(shí)用性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物體液中環(huán)狀顆粒(RSP)存在的方法，它包括以下步驟a、從所述體液中把RSP腫瘤標(biāo)志物捕捉到一種基質(zhì)中；以及b、檢測(cè)所述基質(zhì)中RSP腫瘤標(biāo)志物的存在。
2.一種檢測(cè)人與動(dòng)物中癌癥存在的方法，它包括以下步驟a、從被檢人或動(dòng)物身上取一份體液試樣;b、在所述體液試樣中把環(huán)狀顆粒(RSP)腫瘤標(biāo)志物捕捉到一種基質(zhì)上;以及c、檢測(cè)所述基質(zhì)上RSP腫瘤標(biāo)志物的存在。
3.一種如在權(quán)利要求1或2中所申述的方法，其中所說(shuō)的在所述液體中捕捉RSP腫瘤標(biāo)志物的步驟包括使所述RSP與一種抗RSP抗體(rspAb)連接，所述抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、親和層析純化抗體，及其混合物所組成的抗體組。
4.一種如權(quán)利要求1或2中所申述的方法，其中所說(shuō)的在所述液體中捕捉RSP腫瘤標(biāo)志物的步驟包括在至少不存在鎂離子與ATP兩者之一的條件下，使轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)特異性地連接到所述標(biāo)志物上的氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)上。
5.一種如權(quán)利要求3或4中所申述的方法，其中所說(shuō)的檢測(cè)RSP腫瘤標(biāo)志物存在的步驟包括產(chǎn)生可見(jiàn)顏色作為這種RSP腫瘤標(biāo)志物存在的一個(gè)指征。
6.一種如權(quán)利要求5所申明的方法，包括使至少一種顯色反應(yīng)分子與RSP腫瘤標(biāo)志物直接或間接地連接以產(chǎn)生所說(shuō)的可見(jiàn)顏色。
7.一種如權(quán)利要求3所申明的方法，其中所說(shuō)的檢測(cè)RSP腫瘤標(biāo)志物存在的步驟包括，在至少?zèng)]有鎂離子和ATP兩者之一存在的條件下，使轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)特異性地連接到所述標(biāo)志物上的氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶的反應(yīng)位點(diǎn)上并通過(guò)檢測(cè)tRNA的存在作為RSP腫瘤標(biāo)志物存在的指征。
8.一種如權(quán)利要求4或7所申明的方法，其中所說(shuō)的tRNA有至少一個(gè)有顯色活性的二級(jí)分子與之相連接，以產(chǎn)生可見(jiàn)顏色指示RSP腫瘤標(biāo)志物存在。
9.一種如權(quán)利要求8所申明的方法，它包括使有顯色活性的二級(jí)分子與一種顯色劑反應(yīng)以形成一種可鑒別的顏色指示RSP腫瘤標(biāo)志物存在的步驟。
10.一種如權(quán)利要求8所申明的方法，其中所述tRNA通過(guò)與所述標(biāo)志物反應(yīng)而連到所述標(biāo)志物上，tRNA探針包括tRNA和至少一個(gè)有顯色活性的二級(jí)分子以產(chǎn)生可見(jiàn)顏色作為RSP腫瘤標(biāo)志物的指征。
11.一種如權(quán)利要求10所申明的方法，其中所述tRNA探針包括連接好的分子串tRNA-光生物素-鏈菌親合素-堿性磷酸酶。
12.一種如權(quán)利要求11所申明的方法，包括使所述RSP-連接的tRNA探針與5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基藍(lán)四唑反應(yīng)混合物反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)/紫色指示RSP腫瘤標(biāo)志物存在的步驟
13.一種如權(quán)利要求3所申明的方法，其中所說(shuō)的檢測(cè)RSP腫瘤標(biāo)志物的步驟包括使一個(gè)第二抗RSP抗體(rspAb2)與RSP∶rspAb相連接，rspAb2選自由單克隆抗體、多克隆抗體、親和層析純化抗體及其混合物組成的抗體組。
14.一種與RSP選擇性結(jié)合從而使其在生物體液中的存在易于檢測(cè)的探針，它包括有一個(gè)適于與所述標(biāo)志物連接的第一探針成分以及一個(gè)與所說(shuō)的第一探針成分相連的探針標(biāo)記，所說(shuō)的探針標(biāo)記的存在適于被檢測(cè)作為RSP腫瘤標(biāo)志物存在的指征。
15.一種如權(quán)利要求14所申明的探針，其中所述第一探針成分包含一個(gè)抗RSP抗體，所述抗RSP抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、親和層析純化抗體及其混合物組成的抗體組。
16.一種如權(quán)利要求14所申明的探針，其中所述第一探針成分包括對(duì)所說(shuō)標(biāo)志物上的氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶反應(yīng)位點(diǎn)有專一性的tRNA。
17.一種如權(quán)利要求14、15或16所申明的探針，其中所述第一探針成分是直接或間接地與至少一個(gè)有顯色活性的適于產(chǎn)生作為RSP腫瘤標(biāo)志物存在指征的可見(jiàn)顏色的二級(jí)分子相連接。
18.一種如權(quán)利要求17所申明的探針，其中所述的探針標(biāo)記包括連接的分子串tRNA-光生物素-鏈菌親合素-堿性磷酸酶。
19.一種如權(quán)利要求14、15或16所申明的探針，其中所述第一探針成分與適于產(chǎn)生作為RSP腫瘤標(biāo)志物存在指征的熒光二級(jí)分子直接或間接相連。
20.一種如權(quán)利要求14、15或16所申明的探針，其中所述第一探針成分與一個(gè)用于指示RSP腫瘤標(biāo)志物的存在的放射性同位素直接或間接相連。
全文摘要
一種體外檢測(cè)環(huán)狀顆粒(RSP)腫瘤標(biāo)志物的存在和檢測(cè)人與動(dòng)物存在癌癥的方法與探針包括從含有癌細(xì)胞的生物體液中把這種標(biāo)志物捕捉到一種基質(zhì)上以及檢測(cè)基質(zhì)中RSP腫瘤標(biāo)志物的存在以此作為癌癥存在的指征。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1058099SQ90107618
公開(kāi)日1992年1月22日 申請(qǐng)日期1990年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1990年7月13日
發(fā)明者羅伯特·R·圭雷羅 申請(qǐng)人:Amdl有限公司