專利名稱：免疫學(xué)檢測肝炎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測肝炎病毒等生物活性分子樣品的放射性免疫分析方法，它包括固相試劑的制備、放射性標(biāo)記溶液的制備和自檢標(biāo)準(zhǔn)液的制備。
放射免疫分析(RIA)技術(shù)中以固相放射免疫分析(SPRIA)最為優(yōu)異。靈敏度高，特異性強(qiáng)，對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測的靈敏度達(dá)到1ng/ml的水平;操作簡便，適合醫(yī)院臨床、一般生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)和防疫系統(tǒng)的應(yīng)用。有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)可參閱美國專利4514509、中國專利88106425和《原子能科學(xué)技術(shù)》1981年第2期204頁。固相放射免疫分析的不足之處是免疫結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間較長，致使檢測時(shí)間長，一般檢測一次的時(shí)間需要2-3小時(shí)。其檢測步驟包括1、將樣品加入試管中;
2、將固相試劑(包被有抗原或抗體的塑料圓珠)也加入試管中;
3、將試管置45℃水浴中保溫1.5小時(shí);
4、用蒸餾水清洗塑料圓珠;
5、再加入用放射性標(biāo)記的抗原或抗體溶液;
6、再置45℃水浴中保溫1小時(shí);
7、再清洗塑料圓珠;
8、將塑料圓珠移入測量管中，測量放射性計(jì)數(shù)。
固相免疫反應(yīng)的時(shí)間長是由其反應(yīng)方式造成的。固相放射免疫分析中，固相試劑既是結(jié)合部分(B)與游離部分(F)的分離劑，同時(shí)又參與免疫結(jié)合反應(yīng)。而這種結(jié)合反應(yīng)又必須在固液兩相之間的界面處才能發(fā)生，因此決定完成結(jié)合反應(yīng)的主要因素有1、發(fā)生免疫反應(yīng)的兩個(gè)分子結(jié)合的時(shí)間;
2、發(fā)生免疫反應(yīng)的兩個(gè)分子在發(fā)生結(jié)合前相互接觸(碰撞)的機(jī)會;
3、液相中的分子轉(zhuǎn)移到固液界面的時(shí)間。
前兩種因素主要由發(fā)生反應(yīng)的兩種免疫劑分子本身的活性和濃度所決定，這主要采用提高免疫試劑質(zhì)量來改善反應(yīng)速度。而現(xiàn)有技術(shù)中忽略了第三個(gè)對反應(yīng)速度起決定性的因素。
本發(fā)明的目的在于設(shè)法加快液相中分子移動到固液界面的速度來加速免疫結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間，從而提供一種快速檢測肝炎病毒等生物活性分子的固相放射免疫分析的新方法。
本發(fā)明的內(nèi)容現(xiàn)結(jié)合對反應(yīng)的機(jī)理分析描述于下決定液相中分子移動速度的主要因子是1、溶液的粘度，粘度越大其分子的移動速度越慢;
2、固液相界面及液相內(nèi)部的分子分布的不均一性，即濃度差，濃度差越大，越容易促進(jìn)其運(yùn)動;
3、液相中運(yùn)動分子的形狀和運(yùn)動能量。
本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的，綜合解決上述三個(gè)影響液相中分子運(yùn)動速度的原因，配制一種加速劑。加速劑由減小粘度的化學(xué)試劑(減小粘度劑)和加速沉淀的化學(xué)試劑(加速沉淀劑)組成。
本發(fā)明也為了減小非特異性結(jié)合吸附，提高檢測的靈敏度和特異性，在加速劑中還加入減小非特異性結(jié)合的化學(xué)試劑。
本發(fā)明利用可使免疫試劑沉淀的一類物質(zhì)改變液相中免疫試劑的局部濃度，加速其向固液相界面移動的速度。
本發(fā)明利用可降低血清粘度的試劑以減小免疫分子運(yùn)動的阻力。
本發(fā)明利用表面活性劑一類物質(zhì)以減少免疫劑分子在固相表面的非特異吸附。
以下給出加速劑的三個(gè)最佳配方1、(NH4)2SO4∶15%，吐溫-20∶0.5%，其余為0.05M，PH7.4的PBS。
2、PEG∶4-10%，吐溫-20∶0.1-1%，其余為0.05M，PH7.4的PBS。
3、三氯醋酸∶2-5%，吐溫-20∶0.1-1%，其余為0.05M，PH7.4的PBS。
本發(fā)明用于固相放射免疫分析技術(shù)中組裝實(shí)用的檢測試劑盒，現(xiàn)以組裝新的檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)為例來說明本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用一、試劑盒的組成1、抗-HBs(McAb)包被珠，即固相試劑;
2、125I-抗-HBs(McAb)液，即放射性標(biāo)記溶液;
3、陰性對照血清，即自檢標(biāo)準(zhǔn)液;
4、陽性對照血清，即自檢標(biāo)準(zhǔn)液;
5、加速劑。
二、測定步驟1、將陰性對照、陽性對照和樣品各100ml分別加入各自的試管中，接著加入125I-抗-HBs(McAb)50ml和加速劑50ml，充分混勻后加入1顆抗-HBs(McAb)包被珠。
2、45℃的水浴中培育15-30分鐘。
3、用蒸鎦水洗滌包被珠后，將包被包轉(zhuǎn)入測量管，測定各管的放射性計(jì)數(shù)。
本發(fā)明還可用于組裝檢測乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝E抗原(HBaAg)、乙肝E抗體(HBeAb)和乙肝核心抗體(HBcAb)等試劑盒。
現(xiàn)將用本發(fā)明的新方法的測量結(jié)果與用現(xiàn)有方法的測量結(jié)果比較于下1、特異性對15份陰性標(biāo)準(zhǔn)液作對照測量，無一例陽性，說明符合標(biāo)準(zhǔn)。
S/N值為對標(biāo)準(zhǔn)陰性的對比值，超過2.1為陽性。
2、靈敏度要求測出1ng/ml的含量為符合標(biāo)準(zhǔn)。
3、精密度要求變異系數(shù)C.V.＜15%為符合標(biāo)準(zhǔn)，對新老方法在批內(nèi)各作10個(gè)數(shù)據(jù)現(xiàn)法1346、1102、1403、1501、1356、1347、1402、1293、1357、1421、C.V.＝7.74%新法1012、986、1124、1038、1121、896、1104、1082、925、1210、C.V＝9.26%從以上對比可見，本發(fā)明的測量結(jié)果與現(xiàn)有方法的測量結(jié)果相一致。主要技術(shù)指標(biāo)均符合要求。在檢測HBsAg的應(yīng)用中，與現(xiàn)有技術(shù)相比，除了減少標(biāo)記物的用量外，更為突出的優(yōu)點(diǎn)有1、簡便現(xiàn)有方法的操作為兩步，新方法只需1步，減少操作，縮短時(shí)間;
2、快捷現(xiàn)有方法要溫育兩次，共需150分鐘，新法只需15分鐘，增快10倍;完成整個(gè)測定現(xiàn)有方法至少需要3小時(shí)，而新法在半小時(shí)內(nèi)可出結(jié)果;
3、統(tǒng)一操作步驟，便于實(shí)現(xiàn)自動化，即，在應(yīng)用本發(fā)明后，固相放射免疫分析中的夾心法和競爭法等，其操作均可統(tǒng)一為一種模式，這樣，既便于操作者又便于實(shí)現(xiàn)自動化。
權(quán)利要求
1.一種放射性免疫學(xué)檢測肝炎的方法，包括固相試劑的制備，放射性標(biāo)記溶液的制備和自檢標(biāo)準(zhǔn)液的制備，本發(fā)明的特征在于加入一種設(shè)法加速液相中分子移動到固液相界面速度的加速劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的加速劑由減小粘度的化學(xué)試劑和加速沉淀的化學(xué)試劑組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的加速劑還包括減小免疫分子在固相表面的非特異吸附的表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的加速劑的配方為(NH4)2SO4∶15%，吐溫-20∶0.5%，其余為0.05M，PH7.4的PBS。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的加速劑的配方為PEG4-10%，吐溫-20∶0.1-1%，其余為0.05M，PH7.4的PBS。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的加速劑的配方為三氯醋酸∶2-5%，吐溫-20∶0.1-1%，其余為0.05M，PH7.4的PBS。
全文摘要
一種檢測肝炎病毒等生物活性分子樣品的放射性免疫分析方法。為了加速檢測試劑中液相分子移動到固液相界面的速度，在包括固相試劑、放射性標(biāo)記溶液和自檢標(biāo)準(zhǔn)液的檢測試劑中還加入一種加速劑。加速劑由減小粘度劑、加速沉淀劑和表面活性劑組成。本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，能加速免疫結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)快速檢測的目的，由原來的3小時(shí)縮短到半小時(shí)。本發(fā)明可組裝實(shí)用的檢測試劑盒，能檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb等病毒。
文檔編號G01N33/576GK1058273SQ91105699
公開日1992年1月29日 申請日期1991年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月19日
發(fā)明者王京 申請人:王京