專(zhuān)利名稱(chēng)：徑向色譜柱用弱陽(yáng)離子型介質(zhì)的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分子有機(jī)聚合物的合成方法，具體地說(shuō)是提供一種用作徑向色譜柱填料的以短纖維與甲基丙烯酸和甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行共聚接枝，直接合成制得CM型弱陽(yáng)離子交換介質(zhì)的方法。
隨著生物工程的日益發(fā)展，特別是對(duì)生物大分子的分離與純化傳統(tǒng)的色譜技術(shù)已遠(yuǎn)不能適應(yīng)當(dāng)今發(fā)展的需要，在80年代中期推出了徑向色譜柱的新技術(shù)。它克服了傳統(tǒng)色譜技術(shù)在大規(guī)模處理時(shí)不便放大、色譜填料易造成生物樣品失活等缺點(diǎn)，采用了全新的概念-徑向流動(dòng)技術(shù)，它是膜分離技術(shù)與色譜分離原理的結(jié)合，可以在較小床層高度時(shí)獲得較大處理容量，而且還可以達(dá)到較大流速，其最大優(yōu)點(diǎn)還在當(dāng)保持柱徑不變，而只增加柱長(zhǎng)時(shí)，可按比例增加樣品處理量，即線性放大。因此徑向色譜新技術(shù)是一種較理想的生物工程大規(guī)模初級(jí)分離純化的工具。在徑向色譜技術(shù)中除了在結(jié)構(gòu)上作了某些革命性的改進(jìn)以外，所用的填料介質(zhì)也必須作相應(yīng)的改進(jìn)和發(fā)展，特別是適用于生物大分子分離純化的色譜填料。其中一種分離蛋白質(zhì)以及其它不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)的色譜介質(zhì)是纖維素離子交換介質(zhì)。纖維素的非特異性吸附較小，有合適的孔徑結(jié)構(gòu)，它通過(guò)酯化、醚化、氧化等方法，把交換基團(tuán)引入纖維素骨架上而制備成纖維素離子交換介質(zhì)。但這幾種方法只能在不破壞纖維素結(jié)構(gòu)的情況下得到很有限的交換容量，使得相應(yīng)柱子的柱容量很小，給這類(lèi)介質(zhì)在徑向色譜柱中應(yīng)用帶來(lái)困難。此外，又發(fā)展一種新的離子交換交聯(lián)多糖凝膠作介質(zhì)。它是一種葡聚糖改性物，交換基團(tuán)通過(guò)醚鏈引入到葡聚糖鏈中的葡萄糖單元上。它表現(xiàn)為非常低的非特異性吸附，被認(rèn)為是理想的生化分離介質(zhì)。然而凝膠的孔徑與它的溶漲性質(zhì)有關(guān)，低交聯(lián)高溶漲介質(zhì)可以獲得較高的交換容量但強(qiáng)度非常小，只能經(jīng)受很小壓力;高交聯(lián)低溶漲的介質(zhì)能獲得強(qiáng)度提高，但容量和孔徑會(huì)很快降低，所以不可能獲得一種具有適當(dāng)強(qiáng)度同時(shí)又有較高交換容量的多糖凝膠。將上述兩種組份融合起來(lái)，其中一種是穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的半鋼性組分，另一種是帶有離子交換基團(tuán)的軟聚合物組分，經(jīng)合成可產(chǎn)生一代新的離子交換介質(zhì)-混合型凝膠。例如美國(guó)專(zhuān)利USP 4，663，163號(hào)采用含離子交換基團(tuán)(DEAE，QAE、SP等)的甲基丙烯酸衍生物與甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行共聚，隨后再與纖維素交聯(lián)合成混合型凝膠離子交換介質(zhì)。但是含離子交換基團(tuán)的甲基丙烯酸衍生物合成困難，介格較貴，因此限制了該方法的應(yīng)用。此外，含CM(羧甲基)離子交換基團(tuán)的弱陽(yáng)離子型離子交換介質(zhì)還未看見(jiàn)到報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是提供一種合成適于生物大分子的分離純化處理采用的徑向色譜柱填料CM型離子交換介質(zhì)的方法，該合成方法利用的原料易得，反應(yīng)條件易控制，同時(shí)交換容量大。
本發(fā)明的CM型離子交換介質(zhì)的合成方法是利用上述混合型凝膠的合成原理，并同時(shí)考慮到合成介質(zhì)的后期成膜工藝，以纖維素(短纖維)作為剛性組分，以甲基丙烯酸和甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯共聚作為聚合物組分合成離子交換介質(zhì)。具體的合成方法按下步驟(1)以甲基丙烯酸和甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行共聚反應(yīng)合成聚合物;
(2)纖維素與聚合物進(jìn)行接枝反應(yīng)直接制得CM型離子交換介質(zhì)，其化學(xué)反應(yīng)如下
上述反應(yīng)1、2中，反應(yīng)溶液控制在PH為4～7范圍內(nèi)，其PH值以稀鹽酸進(jìn)行調(diào)解，反應(yīng)溫度控制在50～80℃下，反應(yīng)只少進(jìn)行0.5小時(shí)，為使反應(yīng)物充分的進(jìn)行共聚和接枝反應(yīng)提高接枝率，反應(yīng)時(shí)間控制在0.5～4小時(shí)為宜。纖維素的用量應(yīng)當(dāng)過(guò)量，反應(yīng)物按(重量)纖維素∶甲基丙烯酸∶甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯＝40～10∶10～5∶1同時(shí)為加快共聚反應(yīng)速度，反應(yīng)1進(jìn)行可加入引發(fā)劑，如采用偶氮二異丁腈或過(guò)硫酸銨與硫代硫酸鈉，引發(fā)劑的加入重量為反應(yīng)物的1～5%。下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明的合成反應(yīng)給予進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)例1 CM型弱陽(yáng)離子交換介質(zhì)的制備于裝有攪拌器，溫度計(jì)及冷凝器的250ml三口燒瓶中，加水約100ml，升溫到70℃，加入約2克短棉纖維，充分?jǐn)嚢杈鶆?，隨后加入甲基丙烯酸與甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯的混合物10ml，其混合比例為6∶1，攪拌5分鐘后，再加入含過(guò)硫酸銨和硫代硫酸鈉各0.5克的混合液10ml，保溫70℃反應(yīng)在3小時(shí)。反應(yīng)后用大量水沖洗，再用丙酮或乙醇洗去纖維素表面殘余物，于真空烘箱烘干制得介質(zhì)。該介質(zhì)纖維素的接枝率＞40%，按常規(guī)方法測(cè)試其離子交換當(dāng)量＞2.5mmol/g。
實(shí)例2，填充CM型離子交換介質(zhì)徑向色譜柱應(yīng)用利用實(shí)例1所合成的CM型離子交換介質(zhì)填充成徑向色譜柱用于人血漿分離純化實(shí)驗(yàn)。將徑向色譜柱用10mMPH6.3PBs溶液充分平衡后上10倍稀釋人血漿2000ml(即200ml原漿)，用平衡緩沖液充分洗滌后，用鹽梯度洗脫，蛋白總回收率在90%以上。
實(shí)例3，填充CM型離子交換介質(zhì)徑向色譜柱應(yīng)用2利用實(shí)例2的徑向色譜柱用于登革病毒單克隆抗體與乙型肝炎單克隆抗體的分離純化。將徑向色譜柱用0.2M醋酸緩沖液PH5.5充分平衡，1升培養(yǎng)物上清上樣，洗去未吸附蛋白，然后用2.2MTrls-HClPH8.0緩沖液洗脫，可得50%純度單抗。徑ELIS檢測(cè)，未吸附物中無(wú)單抗，單抗全部在PH8.0洗脫峰中，再?gòu)搅蛩岢恋砑兌瓤蛇_(dá)90以上，4℃保存數(shù)月，活性穩(wěn)定。
由上述實(shí)例，本發(fā)明合成方法可以方便地制備徑向色譜柱用弱陽(yáng)離子(CM)型離子交換介質(zhì)。其合成反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，易于控制，且交換容量大。使用這種介質(zhì)填充制備的徑向色譜柱適用于對(duì)生物大分子進(jìn)行分離和初步純化，樣品處理量大、速度快、操作簡(jiǎn)便，樣品活性保持較高，所以特別適用于體積大，含量低的生物工程大規(guī)模發(fā)酵后的產(chǎn)品的分離純化。
權(quán)利要求
1.一種徑向色譜柱用弱陽(yáng)離子CM型離子交換介質(zhì)的合成方法，其特征在于是采用以甲基丙烯酸與甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行共聚反應(yīng)得到聚合物再與纖維素進(jìn)行接枝反應(yīng)的過(guò)程；共聚接枝反應(yīng)在50～80℃，PH值4～7范圍內(nèi)進(jìn)行。
2.按照權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于自聚反應(yīng)中可加入引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈或過(guò)硫酸銨與硫代硫酸鈉，引發(fā)劑加入量為反應(yīng)物重的1～5%。
全文摘要
一種徑向色譜柱用弱陽(yáng)離子CM型離子交換介質(zhì)的合成方法，是采用以甲基丙烯酸與甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行共聚，再與纖維素進(jìn)行接枝反應(yīng)過(guò)程。該合成反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、易于控制，且交換容量大。使用這種介質(zhì)填充制備的徑向色譜柱適用于對(duì)生物大分子進(jìn)行分離和初步純化，樣品處理量大、速度快、操作簡(jiǎn)便、樣品活性保持較高，所以特別適用于體積大、含量低的生物工程大規(guī)模發(fā)酵的產(chǎn)品的分離純化。
文檔編號(hào)G01N30/38GK1072421SQ91106299
公開(kāi)日1993年5月26日 申請(qǐng)日期1991年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月20日
發(fā)明者張青, 李彤, 張玉奎, 孫愛(ài)民, 吳麗華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所