專利名稱：蛋白制品中利凡諾殘留量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種以分光光度法為基礎(chǔ)對(duì)蛋白制品，特別是白蛋白制品中利凡諾殘留含量的檢測(cè)方法。
各種蛋白制品在醫(yī)療中是被大量使用的。采用利凡諾法分離制備蛋白制品，尤其是各種白蛋白制品，簡(jiǎn)單、方便、收率高，并可對(duì)廢血加以有效利用。但由于其所用的利凡諾為對(duì)人體有一定毒性的吖啶類化合物，因此對(duì)利凡諾在蛋白制品中殘留量的檢測(cè)和控制長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所關(guān)注，并為探索更簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的理想檢測(cè)方法仍在不斷努力。其重要的原因之一就在于對(duì)蛋白制品中利凡諾含量檢測(cè)的困難除其本身性質(zhì)不穩(wěn)定，受光照極易分解外，主要還在于其殘留量已屬于極低的痕量范圍，制品中的大量蛋白成分對(duì)檢測(cè)的干擾影響大，因而難于準(zhǔn)確定量檢測(cè)。例如在目前對(duì)蛋白制品中利凡諾殘留量的各種檢測(cè)方法中，《藥學(xué)通報(bào)》1985(8)中介紹了醚提-紫外熒光法;《輸血及血液》1977(1)介紹了乙醇沉淀-比色法等方法，其共同之處在于均需先從制品中分離提取出利凡諾，以排除蛋白成分的干擾。這種分離操作除費(fèi)時(shí)、煩瑣外，對(duì)含量本已極微的利凡諾而言其檢測(cè)誤差的影響是顯然的，因而檢測(cè)的重復(fù)性差，均屬限量檢測(cè)?！斗治鰷y(cè)試通報(bào)》1989.8(6)中介紹了一種熒光比色法，屬于目視比色，檢測(cè)的準(zhǔn)確性會(huì)受人員、環(huán)境等因素影響，屬半定量的分析方法。日本《藥學(xué)雜志》Vol.97(1977)介紹的快速液相層析法，以及其它如熒光分光光度法等方法除需用專門儀器外，也同樣要有為消除蛋白成分干擾影響的分離操作。
分光光度法是一種可用于定量的常用檢測(cè)方法。但由此類蛋白制品的普通分光光度吸收光譜可見，雖然在269.5及364nm等波長(zhǎng)處利凡諾均可有較大的吸收，但蛋白成分同時(shí)也存在較大的干擾吸收，因此無(wú)法直接進(jìn)行定量檢測(cè)。近年來(lái)以分光光度法為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的導(dǎo)數(shù)分光光度法由于在處理多組分和/或強(qiáng)弱吸收相互重疊及消除背景干擾等方面具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，正在被深入研究并在迅速發(fā)展。
本發(fā)明的目的在于提供一種采用導(dǎo)數(shù)分光光度法原理對(duì)蛋白制品中利凡諾殘留量的檢測(cè)方法。
由導(dǎo)數(shù)分光光度法的特性可知，隨著被測(cè)對(duì)象中各組分之間的相互影響不同，可以選用適合的不同階數(shù)的導(dǎo)數(shù)分光光譜進(jìn)行分析，并且各階導(dǎo)數(shù)的分光光譜曲線的振幅D與被測(cè)組分的濃度C之間總存在某種正比關(guān)系的函數(shù)D＝f(C)，因而可用于定量檢測(cè)分析。由利凡諾及蛋白成分通常的分光吸收光譜(即零階導(dǎo)數(shù)光譜)可以看出，在利凡諾有較大吸收峰的330～390nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白成分的吸收曲線基本呈線性(如

圖1)，因此本發(fā)明方法確定選用此波長(zhǎng)范圍的一階導(dǎo)數(shù)分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。由此波長(zhǎng)范圍內(nèi)的相應(yīng)一階導(dǎo)數(shù)分光光譜(如圖2)可見，在利凡諾譜線的一個(gè)振幅范圍內(nèi)，蛋白成分的譜線可有一段呈直線的區(qū)間，且一般多呈與零線趨于平行的狀態(tài)，此段波長(zhǎng)區(qū)間即為本發(fā)明方法所依賴的基礎(chǔ)。首先用蛋白對(duì)照液精密配制利凡諾不同含量的混合標(biāo)準(zhǔn)品，并分別測(cè)繪出其330～390nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的一階導(dǎo)數(shù)的分光光譜。在各光譜的上述蛋白成分一階光譜呈直線，且最好為趨于與零線相平行的波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)任意選定兩個(gè)波長(zhǎng)λ1和λ2，并應(yīng)使在各混合標(biāo)準(zhǔn)品的光譜上所選定的λ1和λ2分別保持一致。由與各混合標(biāo)準(zhǔn)品的利凡諾導(dǎo)數(shù)光譜中的λ1和λ2相對(duì)應(yīng)的△A1和△A2之差值D及該光譜所示的利凡諾含量C即可得到表示其D＝f(C)關(guān)系的回歸方程D＝aC+b。此時(shí)將待測(cè)蛋白制品在同樣條件下的該λ1和λ2處的相應(yīng)△A1和△A2之差值D代入該回歸方程，即可定量檢測(cè)出該制品中的利凡諾殘留含量。
選擇上述λ1和λ2時(shí)，在可能的情況下盡量增大其間的波長(zhǎng)距離將有利于提高檢測(cè)精確度?？紤]到各種條件及不同儀器間的差別，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該波長(zhǎng)以λ1＝361±4和λ2＝372±4(nm)為好。
在導(dǎo)數(shù)分光光度法中，選用不同的波長(zhǎng)間隔△λ所得的導(dǎo)數(shù)光譜對(duì)檢測(cè)結(jié)果是有影響的。減小△λ可使分辨率提高，但靈敏度會(huì)相應(yīng)下降，反之，△λ增大，則分辨率雖變小，但靈敏度提高。例如對(duì)本發(fā)明上述方法用△λ分別為2、3、4nm的導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行考察，結(jié)果見表1。由此可見，在本發(fā)明方法中以△λ＝3nm為佳。
由上述內(nèi)容可知，在本發(fā)明方法中由選定的△λ所確定的具體導(dǎo)數(shù)光譜及在光譜中確定了波長(zhǎng)λ1和λ2后，無(wú)論是由混合標(biāo)準(zhǔn)品確定回歸方程，還是使用該回歸方程以求得待測(cè)制品中利凡諾的殘留量，都離不開在該混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)制品中與利凡諾一階導(dǎo)數(shù)光譜中的λ1和λ2相對(duì)應(yīng)的△A1和△A2值。而一旦△λ及λ1和λ2被選定后，此△A1和△A2雖然在自記式分光光度儀器上可直接由其一階導(dǎo)數(shù)光譜中得到，但為進(jìn)一步方便和簡(jiǎn)化操作，也可直接在該混合標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)制品的通常分光光度吸收光譜(即零階導(dǎo)數(shù)光譜)上，分別以λ1和λ2為所選定的△λ的中間波長(zhǎng)，由該△λ各自兩端點(diǎn)波長(zhǎng)處的吸收值A(chǔ)之差得到相應(yīng)的△A。
由此不難看出，本發(fā)明的上述方法除快速、簡(jiǎn)單和對(duì)儀器無(wú)特殊要求外，最大優(yōu)點(diǎn)就在于對(duì)制品無(wú)需作任何分離而直接檢測(cè)，無(wú)疑減少了操作誤差，有利于提高檢測(cè)精度。用精密稱取105℃干燥的利凡諾標(biāo)準(zhǔn)品配制成含量分別為1、2、3、4、5μg/ml的150個(gè)樣品對(duì)本發(fā)明方法作回收率試驗(yàn)，平均回收率99.45%，總變異系數(shù)為3.27%。并且本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性好，對(duì)5批共25個(gè)樣品分別在不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定，其結(jié)果的平均一致率為97.17%，變異系數(shù)為2.67%。對(duì)不同檢測(cè)條件的試驗(yàn)還表明，待測(cè)制品中的蛋白成分濃度及pH值的改變均不致影響檢測(cè)結(jié)果，例如在白蛋白制品中蛋白濃度在5-20%范圍內(nèi)的變化對(duì)本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果幾無(wú)影響，(P＞0.01);在制品允許的pH6.40～7.40范圍內(nèi)的pH改變對(duì)檢測(cè)結(jié)果也無(wú)顯著影響(P＞0.05)。另一方面，由于此類制品中利凡諾的存在形式為游離和與蛋白形成結(jié)合物的共存狀態(tài)，為此將配制的白蛋白溶液、利凡諾溶液以及其混合溶液分別用超濾法過濾并分別對(duì)其超濾前后的試液用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本發(fā)明方法對(duì)各種狀態(tài)形式存在的利凡諾均可準(zhǔn)確測(cè)定，即對(duì)制品的檢測(cè)結(jié)果為各種存在形式的利凡諾之總和含量。這更進(jìn)一步表明了本發(fā)明方法是對(duì)蛋白制品中微量存在的利凡諾的一種穩(wěn)定、可靠和準(zhǔn)確的理想定量檢測(cè)方法。
以下介紹作為本發(fā)明上述方法的實(shí)例。
例1將25%的白蛋白對(duì)照品(成都生物制品研究所用低溫乙醇法生產(chǎn)，不含利凡諾，質(zhì)量符合衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn))和利凡諾標(biāo)準(zhǔn)品(mp.245℃，Sigma公司生產(chǎn))分別配成適當(dāng)濃度，以蒸餾水為空白，用PyeUnicamSP8-100型分光光度計(jì)(英國(guó))在320～440nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得到如圖1的普通吸收光譜，其中1為利凡諾吸收曲線，2為白蛋白吸收曲線。同時(shí)再用波長(zhǎng)間隔△λ＝3nm得到相應(yīng)的一階導(dǎo)數(shù)分光光譜如圖2。由在圖2導(dǎo)數(shù)光譜中蛋白譜線呈直線段區(qū)間內(nèi)蛋白譜線上各點(diǎn)的△A值之差比較后確知在360～374nm范圍內(nèi)該蛋白譜線與零線基本平行，并選定其有最大波長(zhǎng)距離的λ1＝361.5nm和λ2＝372.5nm。
用上述白蛋白對(duì)照品和利凡諾標(biāo)準(zhǔn)品精密配制成利凡諾含量分別為1、2、3、4、5μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并分別測(cè)繪其普通分光光度吸收光譜，在△λ＝3nm前提下，分別以上述λ1和λ2為中間波長(zhǎng)，取360和363nm及371和374nm處相應(yīng)的吸收值得到△A1＝A363-A360和△A2＝A374-A371，由各混合標(biāo)準(zhǔn)液的利凡諾濃度C和相應(yīng)圖譜中的D＝△A1-△A2得到D＝f(C)的回歸方程D＝0.263C-0.241(相關(guān)系數(shù)r＝0.9990)。除此方法外，所說(shuō)的△A1和△A2也可由各混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的一階導(dǎo)數(shù)光譜(△λ＝3nm)(如圖3，為島當(dāng)UV-250型分光光度計(jì)自動(dòng)重復(fù)掃描，其所示相同狀態(tài)下的各λ值均相差1nm)中的λ1和λ2直接得到。另取上述利凡諾標(biāo)準(zhǔn)品精密配制成含量分別為1、2、3、4、5、μg/ml的樣品5組共150個(gè)，(每組30個(gè)樣品)用此回歸方程作回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表2。
將含有殘留利凡諾的待測(cè)白蛋白制品的樣品用上述同樣方法和條件制備的如圖1的普通吸收光譜或如圖2、圖3的一階導(dǎo)數(shù)光譜，并由其同樣λ1和λ2處的△A1和△A2所得的D值代入上述回歸方程即可得知該制品中的利凡諾殘留含量。用此方法對(duì)三批待測(cè)樣品中利凡諾殘留量的檢測(cè)結(jié)果與用乙醇沉淀-可見光(λ＝410nm)比色法(對(duì)照方法)檢測(cè)結(jié)果的比較見表3。二者結(jié)果間略有差別，分析原因可能為對(duì)照方法的分離操作的損失或微量蛋白干擾和/或?qū)j(luò)合狀態(tài)利凡諾的檢測(cè)等誤差所致。
由于利凡諾的易光解性，所以本發(fā)明方法操作時(shí)也應(yīng)注意避光。
例2各標(biāo)準(zhǔn)品及其配制同例1，并用同樣方法在島津UV-120-02型分光光度儀用λ1＝360.5、λ2＝371.5(nm)及△λ＝3nm的相應(yīng)△A值可得到另一回歸方程D＝0.002455C+0.00275，相關(guān)系數(shù)r＝0.9996。用此回歸方程作回收率試驗(yàn)，平均回收率(n＝15)99.594%，變異系數(shù)1.8187%，檢測(cè)效果滿意。
表權(quán)利要求
1.一種以分光光度法為基礎(chǔ)對(duì)蛋白制品中利凡諾殘留量的檢測(cè)方法，其特征在于先用蛋白對(duì)照液精密配制利凡諾不同含量的混合標(biāo)準(zhǔn)品，并分別測(cè)繪其一階導(dǎo)數(shù)分光光譜，在各光譜圖的330～390nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)蛋白成分譜線呈直線段的區(qū)間中任意選定一同一波長(zhǎng)λ1和另一同一波長(zhǎng)λ2，由各混合標(biāo)準(zhǔn)品利凡諾導(dǎo)數(shù)光譜中與λ1和λ2相對(duì)應(yīng)的△A1和△A2之差值D及該光譜所示的利凡諾的含量C得到D=f(C)的回歸方程D=aC+b，然后將待測(cè)蛋白制品在同樣條件下得到的該λ1和λ2波長(zhǎng)處的相應(yīng)△A1和△A2之差值D代入上述回歸方程，即可得到其中所含利凡諾的殘留量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說(shuō)的在波長(zhǎng)λ1與λ2所在區(qū)間內(nèi)的蛋白成分一階導(dǎo)數(shù)分光光譜線以與零線趨于平行的直線形式為好。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說(shuō)的測(cè)繪各導(dǎo)數(shù)分光光譜及與所使用的各△A相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)間隔均為△λ＝3nm。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的方法，其特征在于所說(shuō)的波長(zhǎng)λ1和λ2分別為361±4和372±4(nm)。
5.如權(quán)利要求1至3之一所述的方法，其特征在于所說(shuō)的波長(zhǎng)λ1和λ2由各混合標(biāo)準(zhǔn)品的導(dǎo)數(shù)光譜確定后，與各混合標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)制品的利凡諾導(dǎo)數(shù)光譜上在λ1和λ2處相應(yīng)的△A1和△A2可以在其各自相應(yīng)的普通分光光度吸收光譜中分別以λ1和λ2為該導(dǎo)數(shù)光譜所用波長(zhǎng)間隔△λ的中間波長(zhǎng)時(shí)該△λ的兩端點(diǎn)波長(zhǎng)處相應(yīng)的吸收值A(chǔ)之差得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是用一階導(dǎo)數(shù)分光光度法檢測(cè)蛋白制品中利凡諾殘留量的方法。先用蛋白對(duì)照液精密配制不同利凡諾含量的混合標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)繪其一階導(dǎo)數(shù)分光光譜，在其中蛋白譜線呈直線段的區(qū)間內(nèi)任選兩波長(zhǎng)，由與此兩波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的利凡諾譜線上的ΔA之差值D及該標(biāo)準(zhǔn)品利凡諾含量C得到回歸方程D＝aC+b，將待測(cè)制品以同樣條件和方法所得的D值代入方程即得其利凡諾的殘留含量。
文檔編號(hào)G01N21/25GK1074038SQ9211199
公開日1993年7月7日 申請(qǐng)日期1992年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月20日
發(fā)明者余蓉, 劉文芳 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所