專利名稱：白血球分析用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在臨床檢查領(lǐng)域中，使用白血球分類裝置將白血球分類計數(shù)時所需的白血球分析用試劑。
臨床檢查領(lǐng)域中，用患者的全血對白血球分類計數(shù)的工作，在診斷各種疾病時是很重要的。
鑒于這種目的，已發(fā)表了許多裝置和方法。
這些裝置是根據(jù)，例如RF信號強度(高頻電阻的變化)、DC信號強度(懸浮粒子和將其懸浮的流體介質(zhì)之間的電導率不同而引起電流變化)、螢光強度、散射強度、吸光度、偏振光解消散射光等的差異，將白血球按細分類集團(淋巴球，單核細胞，嗜中性白細胞，嗜酸性白細胞、嗜堿細胞)進行分類。在白血球分類計數(shù)時，必須溶解紅血球，并對白血球進行前處理，以致可以用上述那些參數(shù)檢測出各種白血球的差異。
因此，例如用溶血劑將白血球收縮成適當大小，同時將特定的細胞染色。作為使用溶血劑將白血球收縮成適當大小的方法，可例舉使用有機羧酸、有機磺酸、酚類的方法(特表平1—502931號公報)、和使用陽離子性表面活性劑的方法(WO 84/02777號)等。此外，作為溶解紅血球以使特定的細胞染色方法，已知有用皂角苷和/或十二烷基硫酸鈉、叔或季銨鹽、乙醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯、戊二烷醛或甲醛，亞烷基乙二醇，生理學的鹽和氯唑黑(Chlorazolblack)的組合物(特開平3—266999號公報)，十二烷基硫酸鈉、甲醛、糖(或糖醇)及緩沖劑組合起來的試劑處理血液后，進行過氧化酶染色的方法(特開昭62—71857號公報)。
在上述的WO 84/03771號和WO84/02777號中，白血球的分類計數(shù)是根據(jù)DC信號強度的不同進行測量，雖然簡便，但仍有只能將白血球分成3類的問題。
此外，可以將白血球分成4類以上的細分類集團的方法中，特開昭62—71857號公報，特開平3—2366999號公報中提出，需要高溫處理和用具有毒性的醛進行固定處理。
在特表平1—502937號公報中公開了，根據(jù)RF信號，DC信號、散射光強度來檢測白血球的方法，但檢測器復雜且裝置大型化，具有價格昂貴的問題本發(fā)明是鑒于以上課題做出的發(fā)明，其目的是提供，不用醛那樣的有毒藥劑，并且，使用價格低廉且構(gòu)造簡單的裝置就能將白血球分類成至少為4種細分類集團的試劑。
按照本發(fā)明的白血球分析用試劑，則可提供由(a)可以溶解紅血球并能使白紅球細胞膜的一部分損傷的足夠量的至少一種離子性表面活性劑和，(b)與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分相結(jié)合從而能在白血球間給予足夠形態(tài)差異的至少一種具有陰離子基團的有機化合物和，(c)非離子表面活性劑和，(d)pH調(diào)整用的緩沖劑組成的白血球分析用試劑。
本發(fā)明的白血球分析用試劑中的離子性表面活性劑，含有陽離子性表面活性劑及兩性表面活性劑中的至少一種。作為陽離子性表面活性劑，優(yōu)選是季銨鹽型表面活性劑或吡啶嗡鹽型表面活性劑，季銨鹽型及吡啶嗡鹽型表面活性劑，可例舉下式表示的總碳數(shù)為9～30的表面活性劑， 或 (式中，R1是碳數(shù)為6～18的烷基或鏈烯基，R2和R3是碳數(shù)為1～4的烷基或鏈烯基，R4是碳素為1～4的烷基及鏈烯基或芐基，X是鹵原子)，作為R1的碳數(shù)為6～18的烷基或鏈烯基，可例舉己基，辛基，癸基，月桂基、十四烷基等，尤其優(yōu)選辛基，癸基、月桂基等直鏈的烷基。作為R2和R3的碳數(shù)為1～4的烷基，鏈烯基，可例舉甲基，乙基，丙基，丁基等，尤其優(yōu)選甲基，乙基，丙基等碳數(shù)為1～3的烷基。作為R4的碳數(shù)為1～4的烷基及鏈烯基，可例舉甲基，乙基，丙基，丁基等，尤其優(yōu)選甲基，乙基，丙基等碳數(shù)為13的烷基。
此外，作為兩性表面活性劑，可例舉下式表示的總碳數(shù)為9～30的兩性表面活性劑， (式中，R1、R2和R3與上述定義相同)。上述離子性表面活性劑的使用量，應該是能溶解紅血球而且能使白血球細胞膜的一部分充分地損傷。具體說，使用量約為30～5000mg/l，較好約為50～3000mg/l，更好約為100～2000mg/l，可以通過表面活性劑的種類來適當調(diào)整。各種表面活性劑的適宜使用量示于表1中。這些表面活性劑可以1種單獨使用，也可1種以上組合使用。
表1
也就是，離子性表面活性劑，是相對于白血球能使那些允許后述的有機化物通過程度的細孔打開的溶血力就行，而不需要將細胞裸核化那樣的強溶血力。因此，通常用的陽離子性表面活性劑(例如LTAC，MTAB，CTAC)都可以使用，但為了抑制溶血力，通常是，比使白血球裸核化時所用量少得多的量為適宜。此外，由于僅去除細胞膜的一部分就可以，因此也可使用溶血力小的表面活性劑。表面活性劑的溶血作用在于與疏水基團的碳數(shù)成比例關(guān)系，碳數(shù)越多溶血力越強，因此最好使用溶血力低的，例如DTAB，OTAB等陽離子性表面活性劑或兩性表面活性劑。
本發(fā)明的白血球分析用試劑，除離子性表面活性外，還包括具有與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分相結(jié)合從而在白血球間，提供形態(tài)差異的陰離子基團的有機化合物，即可例舉具有疏水性官能團和酸性官能團(陽離子基團羧基、磺酸基)、而且在水溶液中帶陰電荷，碳數(shù)至少是6以上，通過與白血球結(jié)合而使白血球的形態(tài)變化的物質(zhì)。關(guān)于它的種類，沒有特別的限定，幾乎全部的酸性色素都可以使用。此外，由于沒有必要測定吸光度和螢光強度，還可使用色素以外的有機化合物。作為酸性色素的例子，可以是從下列酸性色素選出的至少一種色素酰胺黑(Amido Black，色號20470)、茜素花青綠F(Alizalin cyanine Green F，色號61570)、酸性綠27(Acid Green27，色號61580)、酸性藍62(Acid Blue 62，色號62045)、直接紅31(Diret Red 31，色號29100)、亮硫化黃素(Brilliant Sulphaflarine，色號56205)、茜素黃R(Allzaline Yellow R，色號14030)、酸性藍129(Acid Blue 129，色號62058)、酸性綠25(Acid Green 25，色號61570)、鉻變素2R(Chromotrope 2R，色號16570)、考馬斯亮藍R—250(Coomassie Brilliant Blue R—250，色號42660)、胭脂紅酸(CarmineAcid色號75470)、考馬斯亮藍G—250(Coomassie Brilliant Blue G—250，色號42655)、淡紅B(Carmoisine B，色號14720)、直接藍86(Direct Blue 86，色號74180)、乙基紅(Ethyl Red即[2—(4—diethy-laminophenylazo)benzoic acid]，色號不明)、副品紅(Para Rosaniline，色號42500)、紫胺R(Violaminc R，色號45190)、酸性黃34(AcidYellow 34，色號18890)、酸性橙51(Acid Orange 51，色號26550)、亮藏花精MOO(Brilliant Crocein MOO，色號27290)、尼基綠(GuineaGreen B，色號42085)、酸性藍29(Acid Blue 29，色號20460)、若丹明B(Rhodamine B，色號45170)、硫氰酸胺B(Sulforhodamine，B，色號45100)、麗絲胺綠B(Lissamine Greem B，色號44090)、酸性藍9(Acid Blue 9，色號42090)、堅牢綠FCF(Fast Green FCF，色號42053)、偶氮胭脂紅B(Azocarmine B，色號50090)、苯胺藍(AnilineBlue，色號42780)、變色綠A(Alphazurine A，色號42080)、茜素紫3R(Alizaline Violet 3R，色號61710)、酸性藍41(Acid Blue 41，色號62130)、バイブリツヒスカ-レツト(Bieblich Scarlet，色號26905)、赤蘚紅B(Erythrosin B，色號45430)、甲基紅(Metyl Red，色號13020)、甲基橙(Methyl Orange，色號13025)、一號橙(Orang1，色號1 4600)此外，作為色素以外的有機化合物例子，可使用具有疏水性官能團和酸性官能團的芳香族有機酸，具有碳數(shù)為6以上的烴和雜環(huán)酸等，具體可例舉，8—苯胺基—1—萘磺酸或其鹽類，6—(對甲苯胺基)—2—萘磺酸或其鹽類，鉻變酸，苯二甲酸，萘磺酸等。這些有機化合物的使用量，可根據(jù)所用的表面活性劑的種類適宜選擇，以50～500mg/l為好，優(yōu)選100～3000mg/l。
本發(fā)明的白血球分析用試劑，還含有非離子表面活性劑。作為非離子表面活性劑，沒有特別的限定，一般作為增溶劑使用的幾乎全部的非離子性表面活性劑都可使用。具體說，具有聚氧乙烯乙二醇(POE)、聚丙烯乙二醇(POP)、聚氧乙烯乙二醇—聚丙烯乙二醇(POE—POP)嵌段共聚物作為親水基團的非離子性表面活性劑為適宜。使用1種非離子性表面活性劑時，由于細胞構(gòu)成成分和離子性表面活性劑結(jié)合而形成的不溶化物具有可溶化的效果，與此同時往往出現(xiàn)同時使白血球也溶解的副作用。在這種情況下，最好是將多種非離子性表面活性劑，例如親水基的加聚摩爾數(shù)不同的非離子性表面活性劑組合使用?；蛘撸绻麑⒂H油基結(jié)構(gòu)不同的非離子性表面活性劑組合使用，就可以抑制副作用。使不溶物變成可溶化所必須的非子離子性表面活化劑的量，根據(jù)所用的離子性表面活化劑種類而異，一般為0.5～10g/l，優(yōu)選1～8g/l。
本發(fā)明的白血球分析用試劑，還含有pH調(diào)整用的緩沖劑。作為緩沖劑，使用能將pH保持為一定數(shù)值的物質(zhì)就行，沒有特別的限制，可以使用在規(guī)定的pH±2.0具有pKa的緩沖劑。具體可例舉NES，TRIS，HEPES，琥珀酸，苯二甲酸，檸檬酸緩沖液等。在本發(fā)明中，最好調(diào)至pH5～11的范圍。此時的使用量為5～100mM左右。
作為可在本發(fā)明中使用的醇類，沒有特別的限定，優(yōu)選價廉的在工業(yè)上容易制得的醇類。例如，甲醇，乙醇等的烷醇，苯乙醇，2—苯氧基乙醇等具有芳香環(huán)的醇類等。此時的使用量，當用甲醇時，相對于試劑組合物總量，最佳使用量為5～20％左右，大致的目標是，碳數(shù)每增加1個，使用量最好約為一半。當用2—苯氧基乙醇時，優(yōu)選其使用量為0.05～1％。
作為可在本發(fā)明中使用的金屬鹽類，沒有特別限定，例如以氯化鈉，氯化鉀，氯化鋰等堿金屬鹽為宜。堿金屬鹽，通常不需要，但如后所述，在使用電阻信號進行測定的裝置中，為了進行測定將試料的電導率調(diào)整至適宜值時，都是必需的。此時的堿金屬鹽使用量，最好是使溶液的電導率在5～20mS的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的白血球分析用試劑是由，含有具有與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分結(jié)合以致在白血球間賦予形態(tài)差異所需要的足夠量的至少一種陰離子基團的有機化合物的第1溶液和，含有能溶解紅血球并能使白血球細胞膜的一部分造成損傷的足夠量的至少一種離子性表面活性劑的第2溶液構(gòu)成，第1溶液和第2溶液的至少任何一種含有，最好是兩種中都含有，非離子性表面活性劑，pH調(diào)整用的緩沖劑。和1種溶液構(gòu)成的試劑相同，也可進一步含有醇和金屬鹽。各成分的濃度，在第1溶液和第2溶液混合時，調(diào)整成上述各成分的濃度就行。由于由2種溶液構(gòu)成，因而可提高試劑保存的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的白血球分析用試劑中，特別是用半導體激光的小型分析裝置中，可以很好地進行白血球分類計數(shù)。也就是，由于僅是接受低角和高角前方散射光的2個參數(shù)，很適合在能對白血球分類計數(shù)的裝置中使用，作為分析裝置，沒有特別的限定，例如可用圖21中示出的具有簡單檢測部的裝置。圖21的裝置，具備2角度前方散射光檢測部。即，在圖21的裝置中，在流體室(フロ-セル)CELL的前方，使聚光鏡L2和平行光管透鏡L1介于中間，配置有半導體激光LD。在流體室CELL的后方使并置有射束制動器BS的會聚透鏡介于中間，設置有光電二極管PD。通過這種裝置，可在散射的前方方向的散射光中測定低角度(1～5°)和高角度(5～20°)2種散射光強度，根據(jù)散射光強度之差，就可將白血球分類計數(shù)成至少4種。
本發(fā)明的白血球分析用試劑，是在水或水性介質(zhì)中按規(guī)定量含有上述離子性表面活性劑、有機化合物，非離子表面活性劑、緩沖劑，該白血球分析用試劑的使用量，最好是相對于血液試料1體積，其用量為2—100體積。
本發(fā)明的白血球分析用試劑；是由可溶解紅血球并能使白血球細胞膜的一部分損傷的足夠量的至少一種離子性表面活性劑，和具有與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分相結(jié)合以致能在白血球間賦予形態(tài)差異的足夠量的至少一種陰離子基團的有機化合物，和非離子性表面活性劑，和調(diào)整pH用的緩沖劑組成，因而適于用流體檢查計對白血球進行分類計數(shù)。
在本發(fā)明中；①離子性表面活性劑的作用是，溶解全血中的紅血球，損傷白血球的細胞膜，促進有機化合物的細胞膜透過性；②有機化合物的作用是，調(diào)整白血球的形態(tài)信息資料，使它適宜于對白血球分類；③非離子性表面活性劑的作用是，通過離子性表面活性劑和有機化合物的結(jié)合，使產(chǎn)生的不溶物變成可溶化；④緩沖劑的作用是，將試劑組合物的pH保持在一定值。
一般，離子性表面活性劑用于使紅血球溶血，使白血球的細胞膜溶解，并裸核化，通過測定此時的體積信息資料，將白血球3分類的方法，作為簡便的白血球分類法，已被廣泛地使用。然而用這種方法，溶血力過強以致白血球幾乎裸核化，不能將白血球進行細分類形態(tài)的分類。另一方面，在本發(fā)明中，基本與上述方法相同，利用離子性表面活性劑的溶血力來使紅血球溶血，并使對白血球的細胞膜給予損傷。然而本發(fā)明中的細胞阻礙作用，是除去細胞膜的一部分，或許是脂質(zhì)成分的一部分，如果是紅血球則能使血紅蛋白通過，如果是白血球則能使那些允許有機化合物通過程度的細孔打開程度的溶血力，而不是那種使細胞裸核化的強的溶血力。通過這種處理，由于紅血球流出血紅蛋白，使得光幾乎不散射，這樣根據(jù)光學的信息資料，就能區(qū)別出白血球。由于白血球的一部分受損，使得細胞膜的一部分和細胞內(nèi)液流出，因此使得由細胞表面引起的光的散射光顯著減少，于是可獲得更詳細的細胞內(nèi)部的信息資料。
離子性表面活性劑的可溶化性，眾所周知，按表面活性劑的CMC以上的濃度，隨濃度而增加。在以前的方法中，是利用這種表面活性劑的可溶化能使白血球裸核化，而在本發(fā)明中以低濃度使用表面活性劑，因而表面活性劑的可溶化能低，這是以前沒有預期到的這樣，由于離子表面活性劑的正電荷將細胞的陰離子性成分(核、顆粒、RNA等)的負電荷中和，因此不溶化。其結(jié)果是，即使用表面活性劑處理白血球其細胞形態(tài)也幾乎不變化，可得到類似于用醛類固定細胞的細胞形態(tài)保持效果。因此，以使用上述陽離子性表面活性劑的3分類試劑調(diào)制試料時，出現(xiàn)問題的處理時間，處理溫度而引起的變化，在用本發(fā)明試劑時幾乎都不會產(chǎn)生，調(diào)制過的試料在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定。
在本發(fā)明中，由于有機化合物起作用，使白血球細胞內(nèi)的陽離子性成分，例如顆粒(特別是嗜酸性白血球顆粒)、蛋白質(zhì)等不溶化，就可得到與用醛類固定時同樣的效果，或許，相應于陽離子性成分的量，導致在白血球間產(chǎn)生形態(tài)差異，例如散射光的差異。即，由于將細胞內(nèi)陽離子性成分的正電荷中和以致不溶化，阻止向細胞外流出，保持白血球的形態(tài)信息資料，進而使之變化成適于對白血球的形態(tài)進行分類。
在本發(fā)明中，非離子性表面活性劑可使由于離子性表面活性劑和有機化合物結(jié)合而生成的不溶物可溶化。
而且，本發(fā)明中還存在少量的離子性表面活性劑，因此可抑制過度的可溶化作用。
本發(fā)明中，醇類不一定是必需的，但如果添加它，以下各點會更有效果。由于醇類具有選擇性地增強離子性表面活性的作用，因此，即使是低濃度的離子性表面活性劑也能使細胞膜損傷。而且，醇類還有使細胞中含的蛋白質(zhì)變性，而具有不溶化的作用。因此，通過使用醇類，給損失細胞質(zhì)和顆粒等的細胞帶來的損傷為最小，但卻能獲得細胞膜損傷。因此，具有保持散射光等的光學差異的效果。而且，還有促進紅血球溶解的作用。因此，在肝硬變等疾病中，雖然很難使其紅血球膜溶解，在這種情況下如果添加醇類，則可使難溶解的紅血球溶解，但卻能抑制白血球的損傷。這被認為是，醇類可能是以與離子表面活性劑不同的機理來損害紅血球的細胞膜。
實施例本發(fā)明的白血球分析用試劑的最佳組成，如下所示。
實施例1離子表面活性劑 100～500mg/l8—苯胺基—1—萘磺酸Mg鹽(有機化合物)2g/l
BC30TX(非離子性表面活性劑聚氧乙烯(30)十六烷醚日光テミカルズ(株)) 1g/lHEPES 10mM甲醇 100ml/lNaOH 使pH為7.0時的量作為離子性表面活性劑，使用各種濃度的各種表面活性劑的情況下，將上述組成的試劑1ml和血液30μl混合，30秒后用流體檢查計測定前方低角散射光和前方高角散射光。
在

圖1～4中示出，作為離子性表面活性劑，使用溴化癸基三甲基銨(DTAB)750mg/l，氯化月桂基三甲基銨500mg/l、溴化十四烷基三甲基銨500mg/l，溴化十六烷基三甲基銨100mg/l的結(jié)果。圖中，L表示淋巴細胞，M表示單核細胞，N表示嗜中性白細胞及嗜堿細胞，E表示嗜酸性白細胞。使用任何一種離子性表面活性劑，都可得到大致相同的散布圖象，并能對白血球分類計數(shù)。
實施例2DTAB(陽離子性表面活性劑) 1.5g/l有機化合物0.3～3g/lDC 30TX(非離子性表面活性劑，日光ケミカルズ(株))1g/l檸檬酸50mM
甲醇 100ml/lNaOH 使pH為7.5時的量作為有機化合物，使用各種濃度的各種化合物的情況下，將上述組成的試劑1ml和血液30μl混合，30秒后用流體檢查計測定前方低角散射光和前方高角散射光。
在圖5～8中示出，作為有機化合物，使用茜素紫3R，3g/l；變色綠A，0.3g/l；尼基綠B，0.3g/l；茜素黃—R，3g/l時的結(jié)果，使用任何一種有機化合物都可獲得大致相同的散布圖象，并能對白血球分類計數(shù)。
實施例3DTAB 1.5g/l亮藏光精MOO(有機化合物) 1g/lHEPES 10mMHCO50(非離子性表面活性劑聚氧乙烯(50)硬化蓖麻油、日光ケミカルズ(株)) 4g/l醇類 適當量NaOH 使pH為7.0時的量使用各種濃度的各種醇的情況下，將上述組成的試劑1ml和血液30μl混合，30秒后用流體檢查計測定前方低角散射光和前方高角散射光。
圖9～12中示出，作為醇類，使用甲醇100ml/l，乙醇500ml/l，異丙醇25ml/l 2—苯氧基乙醇2.5ml/l時的結(jié)果。添加醇時，使用任何一種醇，都能使紅血球充分地收縮，因而能計數(shù)白血球，可獲得大致相同的散布圖象，可將白血球分類計數(shù)。
實施例4DTAB 1.5g/l8—苯胺基—萘磺酸Mg鹽(有機化合物)2g/lHCO50(非離子性表面活性劑、日光ケミカルズ(株))4g/l緩沖劑 10mM2—苯氧基乙醇2.5ml/lNaOH 適當量為了變化pH，作為緩沖劑，使用各種緩沖劑的情況下，將上述組成的試劑1ml和血液30μl混合，30秒后用流體檢查計測定前方低角散射光和前方高角散射光。
圖13中示出使用MES(pH5.5)時，圖1 4中示出使用HEPES緩沖液(pH7.0)時，圖15中示出TRIS緩沖液(pH 8.5)時的結(jié)果。隨著pH的上升，白血球的散射光強度有降低的傾向，但可以對白血球進行分類計數(shù)。
實施例5DTAB 1.0g/l8—苯胺基—萘磺酸Mg鹽(有機化合物) 1.5g/lBC—25TX(非離子性表面活性劑聚氧乙烯(25)十六烷基醚、日光ケミカルズ(株))30g/lHEPES 10mM甲醇 100ml/lNaOH 使pH為7.0時的量將上述組成的試劑1ml和血液30μl混合，30秒后用流體檢查計測定前方低角散射光和前方高角散射光。
圖16中示出，為了使得由于細胞構(gòu)成成分和離子性表面活性劑的結(jié)合而形成的沉淀物可溶化，使用BC—25TX3.0g/l作為非離子性表面活性劑時的結(jié)果。圖16中可看出，不僅有沉淀物的可溶化效果，同時對白血球也有影響，白血球中，嗜酸性白細胞以外的白血球W收縮了，不能進行4分類。
此處，作為非離子性表面活性劑，將BC—25TX用量降低為2.0g/l，作為補償，如果添加聚氧乙烯硬化蓖麻油的HCO—60(日光ケミカルス(株)、聚氧乙烯的加聚摩爾數(shù)為60)1.0g/l，如圖17所示，沒有沉淀物生成，從而獲得能將白血球4分類的良好的散布圖象。
實施例6DTAB 1.5g/l8—苯胺基—1—萘磺酸Mg鹽(有機化合物) 2g/lHCO—50(非離子性表面活性劑，日光ケミカルズ(株))4g/lPEN4630(非離子性表面活性劑聚氧乙烯(30)聚氧丙烯(6)2—癸基—十四烷基醚，日光ケミカルズ(株)) 1g/l苯二甲酸 50mM2—苯氧基乙醇 2.5ml/lNaOH 使pH為5.5時的量NaCl 30mM將上述組成的試劑1ml和血液30μl混合，30秒后用流體檢查計測定。
圖18中示出，為了測定大小方面的信息資料而測定前方低角散射光，為了測定形態(tài)方面的信息資料而測定前方高角散射光的結(jié)果。圖19中示出，根據(jù)特開平5—34251中記載的為了用可測定電阻信號的流體檢查計測定大小方面信息資料的電阻式測定原理，來測定體積，和為測定形態(tài)方面的信息資料而測定側(cè)方散射光的結(jié)果。
實施例7[第1溶液]8—苯胺基—1—萘磺酸NH4鹽(有機化合物)3.0g/lHCO—50 5.0g/lPEN 4630 1.3g/l苯二甲酸 2.5g/l琥珀酸2Na·6H2O 13.5g/l2—苯氧基乙醇2.5g/lNaOH 將pH調(diào)至5.3時的量NaCl 2.9g/l[第2溶液]在第1溶液的成分中，代替8—苯胺基—1—萘磺酸NH4鹽，加入DTAB6.9g/l，其它成分和濃度均與第1溶液相同。
用第1溶液1ml將血液33μl稀釋后，添加第2溶液0.2ml，于35℃反應20秒后用流體檢查計測定前方低角散射光和前方高角散射光。測定結(jié)果示于圖21。像上述那樣作為二種溶液結(jié)構(gòu)也能將白血球很好地進行分類。
上述試劑組合物，是基于電阻式測定原理進行測定，因此可以通過添加氯化鈉將其組分調(diào)制成適于測定試料的導電率的最佳值。
使用任何測定參數(shù)都能明確地使白血球分類計數(shù)。
本發(fā)明的白血球分析用試劑，基本上是由1種水溶液組成，由于該試劑組合物可以調(diào)制成只需要將本發(fā)明試劑和血液試料混合的簡單工序就能進行白血球分類計數(shù)，因此只需測定2種散射光信號就能使白血球分類，從而可采用構(gòu)造簡單的裝置。
而且，由于不使用醛之類的危險試劑，因而可安全操作地進行血液試料的分類計數(shù)。
以下簡單說明附圖。
圖1是表示，在本發(fā)明涉及的白血球分析用試劑中，作為離子性表面活性劑，使用氯化癸基三甲基銨時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖2是表示，在本發(fā)明涉及的白血球分析用試劑中，作為離子性表面活性劑，使用氯化月桂基三甲基銨時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖3是表示，在本發(fā)明涉及的白血球分析用試劑中，作為離子性表面活性劑，使用溴化十四烷基三甲基銨時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖4是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為離子性表面活性劑，使用氯化十六烷基三甲基銨時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖5是表示，在涉及在本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為有機化合物，使用茜素紫3R時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖6是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為有機化合物，使用變色綠A時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖7是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為有機化合物，使用尼基綠B時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖8是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為有機化合物，使用茜素黃—R時的前方低角散射光度強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖9是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為醇類，使用甲醇時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖10是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為醇類，使用乙醇時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖11是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為醇類，使用異丙醇時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖12是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為醇類，使用2—苯氧基乙醇時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖13是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為緩沖劑，使用MES時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖14是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為緩沖劑，使用HEPES時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖15是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為緩沖劑，使用TRIS時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖16是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為非離子性表面活性劑，使用BC—25TX時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖17是表示，在涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑中，作為非離子性表面活性劑，組合使用BC—25TX和HCO—60時的前方低角散射光強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖18是表示，涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑的前方低角散射強度和前方高角散射光強度的散布圖。
圖19是表示，涉及本發(fā)明的白血球分析用試劑的基于電阻式測定原理的體積和側(cè)方散射光強度的散布圖。
圖20是表示對用白血球分析用試劑處理過的試料進行測定時所用裝置的示意圖。以下是圖中符號說明。L 淋巴細胞M 單核細胞N 嗜中性細胞及嗜堿細胞E 嗜酸性白細胞CELL 流體室L1 平行光管透鏡L2 聚光鏡L3 會聚透鏡BS 射束制動器PD 光電二極管W 嗜酸性白細胞以外的白血球
權(quán)利要求
1.白血球分析用試劑，它由以下物質(zhì)組成(a)能溶解紅血球并使白血球的細胞膜的一部分損傷的足夠量的至少一種離子性表面活性劑；和(b)具有與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分相結(jié)合以致在白血球間給予形態(tài)差異的足夠量的至少一種陰離子基團的有機化合物，和(c)非離子性表面活性劑，和(d)pH調(diào)整用緩沖劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白血球分析用試劑，其中，還含有醇類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的白血球分析用試劑，其中，還含有金屬鹽類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的白血球分析用試劑，其中，離子性表面活性劑是下式表示的總碳數(shù)為9～30的陽離子性表面活性劑中的至少一種 或 (式中，R1是碳數(shù)為6～18的烷基，鏈烯基；R2和R3是碳數(shù)為1～4的烷基、鏈烯基；R4是碳數(shù)為1～4的烷基、鏈烯基或芐基，X是鹵原子)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的白血球分析用試劑，其中，離子性表面活性劑是下式表示的總碳為9～30的兩性表面活性劑中的至少一種， (式中，R1，R2和R3和上述定義相同)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項所述的白血球分析用試劑，其中，有機化合物是碳數(shù)至少為6以上，并具有疏水性官能團和陰離子基團，并且在水溶液中帶負電荷，與白血球結(jié)合，因而能使白血球的形態(tài)變化的物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的白血球分析用試劑，其中，有機化合物是選自8—苯胺基—1—萘磺酸或其鹽類，6—(對甲苯胺基)—2—萘磺酸或其鹽類，鉻變酸，苯二甲酸、萘磺酸或酸性色素中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項所述的白血球分析用試劑，非離子性表面活性劑是具有選自聚氧乙烯乙二醇，聚丙烯乙二醇或聚氧乙烯乙二醇—聚丙烯乙二醇嵌段共聚物的化合物中至少一種作為親水基團的非離子性表面活性劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8所述的白血球分析用試劑，其中，它含有2種以上的權(quán)利要求8所述的非離子性表面活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9所述的白血球分析用試劑，其中，離子性表面活性劑的使用濃度約為30～5000mg/l。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～10所述的白血球分析用試劑，其中，有機化合物的使用濃度約為50～5000mg/l
12.根據(jù)權(quán)利要求1～11所述的白血球分析用試劑，其特征在于，它是由含有具有與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分相結(jié)合以致在白血球間賦予形態(tài)差異所需的足夠量的至少一種陰離子基團的有機化合物第1溶液，和含有能溶解紅血球并能給白血球的細胞膜的一部分造成損傷的足夠量的至少一種離子性表面活性劑的第2溶液構(gòu)成，第1溶液和第2溶液的至少任何一種中含有非離子性表面活性劑，pH調(diào)整用緩沖劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及白血球分析用試劑，它是由(a)可溶解紅血球并使白血球細胞膜的一部分損傷的足夠量的至少一種離子性表面活性劑和，(b)具有與白血球內(nèi)的陽離子荷電成分相結(jié)合以致在白血球間給予形態(tài)差異的足夠量的至少一種陰離子基團的有機化合物和，(c)非離子性表面活性劑和，(d)pH調(diào)整用緩沖劑組成。由于基本上是由1種水溶液組成，該試劑組合物可以調(diào)制成只需要將本發(fā)明試劑和血液試料混合的簡單工序就能進行白血球分類計數(shù)，因此只需測定2種散射光信號就能使白血球分類，從而可采用構(gòu)造簡單的裝置。而且不使用醛之類的危險試劑，可安全操作進行分類計數(shù)。
文檔編號G01N33/49GK1127886SQ94119539
公開日1996年7月31日 申請日期1994年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月22日
發(fā)明者坂田孝, 森川隆, 內(nèi)橋欣也, 橋本智美 申請人:東亞醫(yī)用電子株式會社