專利名稱：鑒定丙型肝炎病毒類型的方法以及用于此方法的試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鑒定丙型肝炎病毒(HCV)類型，本發(fā)明尤其涉及使用新的類型依賴性肽類化合物鑒定HCV的方法。
背景技術：
已知病毒性肝炎是由五種不同的、已知為肝炎甲、乙、丙、丁和戊型病毒所引起的。HAV是RNA病毒，它不會引起長期臨床癥狀，HBV是DNA病毒，HDV是依賴性病毒，沒有HBV的存在它不能感染細胞，HEV是水生病毒。Houghton等人在歐洲公開專利388,232中最先發(fā)現和鑒定出作為非甲非乙型肝炎(NANBH)病因的HCV。這導致公開了它們在鑒別HCV中可用作免疫試劑的大量一般性和特異性多肽。例見Choo et al，(1989)Science，244359-362；Kuo et al.(1989)Science，244362-364；and Houghton et al.(1991)Hepatology，14381-388。HCV是引起與輸血相關的肝炎的主要病因。
歐洲公開專利318,216和388,232中表征了HCV的原型分離物。本文所用的術語“HCV”包括新近分離的NANBH病毒種，術語“HCV-1”是指上述出版物中所述的病毒。
自最初鑒定HCV以來，已經鑒定出了至少六種不同的病毒類型并被命名為HCV-1至HCV-6。(Cha et al.(1992)Proc.NaH.Acad.Sci.USA，897144-7148。)在這些類型中有大量的亞型，感染患者的病毒類型會影響到臨床預后并對不同治療產生反應。(Yoshiokaet al.(1992)Hepatology，16293-299)。根據HCV感染最嚴重的臨床結果是肝細胞癌這一事實，對確定感染患者的是何種類型HCV是有用的。
最近使用的確定病毒類型的方法是基因定型即分離病毒RNA，并通過聚合酶鏈反應(PCR)測定不同片段的序列。此方法不僅費力又費時，而且對在不允許保存RNA的條件下貯存的樣品或者來自病毒效價不夠大的患者中的樣品是不適用的。通過免疫分析或血清定型來鑒定HCV類型的方法將是有用的。
用來篩選血液和診斷患者的最新方法是免疫測定法，免疫測定法使用含有足夠量共有抗原決定基的HCV-1抗原以識別抗其它類型HCV的抗體。免疫測定法不能區(qū)分不同類型HCV的感染。本發(fā)明的公開本發(fā)明包括通過基因型和血清型鑒定各種HCV之類型的組合物和方法，此組合物包括編碼抗原決定基的類型特異性抗原決定基核酸、類型-簇特異性抗原決定基核酸以用作探針，并包括與編碼抗原決定基核酸的側面區(qū)域互補的核酸以用作引物。
本發(fā)明一方面是鑒定HCV類型的方法，包括下列步驟提供得自個體的含抗體樣品；在允許抗原-抗體結合的條件下將樣品與類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基相接觸；并確定樣品中的抗體是否與抗原決定基結合。
本發(fā)明另一方面涉及鑒定HCV類型的方法，其步驟包括提供得自個體的含抗體樣品；在允許抗原-抗體結合的條件下將樣品與第一類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基相接觸；在允許抗原-抗體結合的條件下將樣品與第二類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基相接觸；并確定樣品中的抗體是否與第一或第二抗原決定基結合。
本發(fā)明的另一方面涉及含有類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基的多肽。此多肽得自于HCV基因組的三個不同區(qū)域。一套多肽包括得自HCV核心區(qū)域的類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基。第一套多肽發(fā)現于HCV-1氨基酸殘基67和84之間以及其它類型HCV的同源區(qū)域。本文所用氨基酸殘基的縮寫如下A，丙氨酸；I，異亮氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；F，苯丙氨酸；P，脯氨酸；W，色氨酸；V，纈氨酸；N，天冬酰胺；C，半胱氨酸；Q，谷氨酰胺；G，甘氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；Y，酪氨酸；R，精氨酸；H，組氨酸；K，賴氨酸；D，天冬氨酸；和E，谷氨酸。
由核心區(qū)域衍生的具體氨基酸殘基序列以及由其衍生的亞型如下1.PEGRTWAQ，亞型1a或1b。2.STGKSWGK，亞型2a或2b。3.SEGRSWAQ，亞型3a或4。
另一套多肽包括得自HCV非結構區(qū)域4(NS4)的類型特異性抗原決定基。此第二套多肽發(fā)現于HCV-1氨基酸殘基1689-1718之間以及其它類型HCV的同源區(qū)域。
具體氨基酸殘基序列以及由其衍生的型或亞型如下1.CSQHLPY，亞型1a。2.CASHLPY，亞型1b。3.CASRAAL，亞型2a或2b。
另一套多肽包括得自丙型肝炎病毒非結構區(qū)域5(NS5)的類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基。此套多肽發(fā)現于HCV-1氨基酸殘基2281-2313之間以及其它類型丙型肝炎病毒的同源區(qū)域。
具體的氨基酸殘基序列以及由其衍生的型或亞型如下1.PDYEPPVVHG，亞型1a。2.PDYVPPVVHG，亞型1b。3.PDYQPATVAG，亞型2a。4.PGYEPPTVLG，亞型2b。5.FAQASPVW， 亞型1a。6.FPPQALPIW， 亞型1b。7.FPQALPAW， 亞型2a。8.FPPQALPPW， 亞型2b。
本發(fā)明的另一方面包括編碼所述類型特異性和類型-簇抗原決定基的氨基酸殘基序列的核酸分子。例如，在Southern印跡法或其它DNA識別試驗如美國專利4,868,105和5,124,246中所述的捕捉試驗中，這些核酸分子可用作探針。
本發(fā)明的另一方面包括與編碼類型特異性和類型-簇特異性抗原決定基的核酸序列側翼區(qū)互補的核酸分子。這種核酸分子可用于進行PCR以確定特定的HCV的基因型。附圖的簡述

圖1是血清定型實驗策略的流程圖。圖2是全面的抗原決定基作圖策略的流程圖。圖3是描述HCV1a抗原決定基作圖結果的圖集(Rodney)。圖4是描述HCV2b抗原決定基作圖結果的圖集(Nomoto)。定義“丙型肝炎病毒”或“HCV”是指其致病類型可引起NANBH的病毒種以及由其衍生的減毒類型或缺陷性的干擾顆粒。一般性參見本部分所引用題為“背景技術”的出版物。HCV基因組由RNA組成。含有RNA的病毒自發(fā)突變率相對較高，椐報道每個摻入核苷酸的概率為10-3至10-4數量級。(Fields & Knipe(1986)“FundamentalVirology”(Rowen Press，NY))。由于在RNA病毒中，基因型的異質性和流動性是固有的，因而在HCV種中，有多種型/亞型，可以是有毒性或無毒性的。在文獻中已闡明了不同HCV類型或分離物的增殖、鑒定、檢測和分離。如本文所述，所有核苷酸和氨基酸殘基序列都來源于所述的HCV類型。HCV-1基因組和氨基酸殘基序列的數目描述于Choo et al，(1990)Brit，Med.Bull.，46423-441。本文的公開可允許診斷不同類型。
本文使用的“類型”指的是基因型差異超過約30％的HCVs；“亞型”指的是基因型差異約為10-20％的HCVs，“分離物”指的是基因型差異低于約10％的HCVs。“鑒定類型”指的是將一種類型的HCV與另一種類型的HCV區(qū)分開來。
在國際公開專利WO 93/00365中公開了幾個不同HCV型/亞型的資料，尤其是型或亞型CDC/HCV1(也稱作HCV-1)。來自一種型或亞型的資料，如部分基因組的或氨基酸的序列足以使本技術熟練人員使用一般技術即可分離新型的HCV，例如，接下來將描述篩選幾個不同類型的HCV。利用本文所述的方法和試劑將鑒定得自大量人血清(來自不同的地理區(qū)域)的這些類型。
已推斷出HCV-1基因組RNA的基因組結構和核苷酸序列?；蚪M似乎是含有10,000個核苷酸的單鏈RNA?；蚪M為正鏈，并具有編碼約為3,000個氨基酸之多聚蛋白質的連續(xù)的、轉譯開放閱讀框架(ORF)。在ORF中，大約在氨基末端區(qū)域的第一個四分之一處編碼結構蛋白質，而大多數多聚蛋白質為非結構(NS)蛋白質。與所有熟知的病毒序列相比，在黃病毒科的非結構(NS)蛋白質和瘟病毒科(現在也被當作黃病毒科的一部分)中可觀察到小但是值得注意的共線性同源性。
根據推斷的由HCV-1核苷酸序列編碼的氨基酸殘基以及其它的證據，將被編碼HCV多聚蛋白質的可能蛋白質區(qū)域以及大致的界限示于表1。
表1推斷的區(qū)域 大致的界限(氨基酸數目)C(核殼蛋白) 1-191E1(病毒顆粒外膜蛋白)192-383E2/NS1(外膜蛋白)384-800NS2(功能未知) 800-1050NS3(蛋白酶)1050-1650NS4(功能未知) 1651-2100NS5(聚合酶)2100-3011(末端)這些區(qū)域是不明確的，例如E1-NS2界限約在750-810區(qū)域，NS3-NS4界限約在1640-1650區(qū)域。也有證據表明C的191個氨基酸(aa)譯本是可進一步加工成長度約為170aa的前體，NS2、NS4和NS5蛋白每種都可進一步加工成兩個成熟的蛋白質。
根據不同標準確定不同類型的HCV，例如大約為9,000個核苷酸至約12,000個核苷酸的ORF，編碼大小與HCV-1類似的多聚蛋白質，被編碼的多聚蛋白質與HCV-1有類似的疏水和/或抗原特性，存在與HCV-1保守的共線性多肽序列。
在鑒定HCV類型時，可單獨或聯合使用下述核酸同源性和氨基酸同源性參數。通常如上所述，不同類型的HCV約有70％同源性，而亞型約有80-90％同源性，分離物約有90％同源性。
本文所用的“得自于或衍生于”指定序列的多聚核苷酸是指此多聚核苷酸序列由相應于指定核苷酸序列的至少約6個核苷酸，優(yōu)選至少約為8個核苷酸，更優(yōu)選至少約為10-12個核苷酸，再更優(yōu)選至少約為15-20個核苷酸的序列所組成。“相應”是指與指定序列同源或互補。優(yōu)選地，多聚核苷酸所來自之區(qū)域的序列與HCV基因組特有的序列同源或互補。本領域已知測定核酸序列互補性的雜交技術，例見Maniatis et al.(1982)。另外，已知技術可測定由雜交形成的雙鏈體多聚核苷酸的錯配，包括例如用特異性消化雙鏈體多聚核苷酸中單鏈區(qū)域的如S1的核酸酶消化。典型的DNA序列可能“得自”的區(qū)域包括但不局限于，例如編碼類型特異性抗原決定基的區(qū)域以及非轉錄和/或非轉譯區(qū)域。
所得多聚核苷酸非生理必需地得自于所示核苷酸序列，但可以任何方式產生，包括例如化學合成或DNA復制或反向轉錄或轉錄。另外相應于指定序列的區(qū)域組合也可以用本領域已知的與目的用途相一致的方法來修飾。
類似地，“得自于或衍生于”指定氨基酸或核酸序列的多肽或氨基酸序列是指與此序列編碼的多肽具有相同氨基酸序列的多肽或其部分，其中該部分至少含有3-5個氨基酸，更優(yōu)選至少為8-10個氨基酸，甚至更優(yōu)選至少為11-15個氨基酸，或者是指與此序列編碼的多肽在免疫學上被證明是相同的多肽，此術語也包括由指定核酸序列表達的多肽。
重組或衍生的多肽不一定必需由指定的核酸序列轉譯它可以任何方式產生，包括例如化學合成，或重組表達系統(tǒng)的表達，或從包括突變HCV的HCV中分離。本文所述的多肽一般相對較短因而很容易化學合成。
重組或衍生的多肽在其序列中可包括一個或多個氨基酸或非天然氨基酸類似物。將氨基酸類似物插入序列中的方法是本領域已知的，本領域熟練人員已知它可包括一個或多個標記。在美國專利5,194,392中可發(fā)現對類似物和“mimotopes”的詳細描述。
肽類似物包括保留了鑒定HCV類型之能力的它的缺失、增加、取代或修飾。優(yōu)選的“取代”是有保守性的那些，即其中的殘基被普遍型相同的另一個殘基所置換。很容易理解，自然生成的氨基酸可再被分成酸性、堿性、中性和極性、或中性和非極性氨基酸，而且被編碼的氨基酸中有三個是芳香族的。通常優(yōu)選的是，與天然抗原決定基不同的被編碼多肽含有經取代的氨基酸密碼子，它來自與所置換的氨基酸相同的組，因此通常堿性氨基酸Lys，Arg和His是可以互換的；酸性氨基酸Asp和Glu是可以互換的；中性極性氨基酸Ser，Thr，Cys，Gln和Asn是可以互換的；非極性脂肪族氨基酸Gly，Ala，Val，Ile和Leu相互之間的關系是保守的(但是由于大小的關系，Gly和Ala更密切相關，Val，Ila和Leu更密切相關)，芳香族氨基酸Phe，Trp和Tyr是可以互換的。盡管脯氨酸為非極性中性氨基酸，但由于其對構象的影響而表現出困難，用脯氨酸取代或取代脯氨酸是不優(yōu)選的，除非可得到相同或相似的構象結果。顯示保守性變化的極性氨基酸包括Ser，Thr，Gln，Asn；較低程度的為Met。另外，Ala，Gly和Ser盡管被劃分至不同的種類，但它們似乎仍可以互換，Cys也可分到此組中，或者劃分為極性中性氨基酸。
還應說明如果多肽是合成制備的，也可用非基因編碼的氨基酸來取代，另外的殘基包括例如式H2N(CH2)nCOOH的ω氨基酸，其中n為2-6。這些是中性、非極性氨基酸，這與肌氨酸(Sar)，t-丁基丙氨酸(t-BuA)，t-丁基甘氨酸(t-BuG)，N-甲基Ile(N-MeIle)和正亮氨酸(Nle)一樣。例如苯基甘氨酸可取代被芳香族中性氨基酸Trp，Tyr或Phe；瓜氨酸(Cit)和蛋氨酸亞砜(Mso)是極性的但也是中性的，環(huán)己基丙氨酸(Cha)是中性和非極性的，磺基丙氨酸是酸性的，鳥氨酸(Orn)是堿性的，如果一個或多個這些殘基被羥脯氨酸(Hyp)取代則可保留賦予脯氨酸殘基特性的構象。
本文所用的術語“重組多聚核苷酸”意思是指根據其來源或操作來分的基因組、cDNA、半合成或合成來源的多聚核苷酸所述多聚核苷酸(1)與天然相關的多聚核苷酸的全部或部分不相關，(2)與非天然相連接的多聚核苷酸相連接，或(3)并不是天然產生的。
本文所用的術語“多聚核苷酸”是指任何長度的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的核苷酸聚合物形式。此術語僅指分子的一級結構，因此此術語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA，它也包括已知的修飾形式，例如本領域已知的標記物形式，甲基化形式，“帽結構”，用類似物取代一個或多個天然產生的核苷酸，核苷酸間的修飾，例如那些具有不帶電荷鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的，那些含有懸而未決部分的，例如包括但不局限于核酸酶、毒素、抗體、信號肽和多聚-L-賴氨酸的蛋白質，那些具有嵌入劑(如吖啶、補骨脂素等)的，那些含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的，那些含有烷化劑的，那些具有經修飾鍵(例如α端基異構核酸等)的以及多聚核苷酸的未修飾形式。本文所述的多聚核苷酸相對較短，因此最容易化學合成。
“純化”的多肽是指處于實質上已除去其它多肽之狀態(tài)下的多肽，即在組合物中它最低約占重量的50％(所需多肽/組合物中總的多肽)，優(yōu)選最低約占70％，甚至更優(yōu)選所需多肽最低約占90％，而不用考慮組合物中的非蛋白質物質。純化病毒多肽的技術是本技術中已知的，在本技術中對純化的抗體有類似的限定。
本文所用的“抗原決定基”指多肽的抗原決定部位。一個抗原決定基可含有3個或更多的確定抗體結合位點的氨基酸。通常，一個抗原決定基由至少5個氨基酸組成，有時由至少8個氨基酸組成?？乖瓫Q定基的作圖方法是本領域熟知的。
本文所用的“類型特異性抗原決定基”是指在一種HCV類型中發(fā)現的抗原決定基，“類型-簇特異性抗原決定基”是在多于一種但不是所有的HCV類型中發(fā)現的。例如，可用經HCV1感染的患者的抗體識別一種特定的抗原決定基，但不能用經HCV2感染的患者的抗體識別或有效識別。類似地，可用經HCV-3或HCV-4感染的患者的抗體識別得自HCV-3或HCV-4的類型-簇特異性抗原決定基，但不能用經HCV-1或HCV-2感染的患者的抗體識別。“保守的抗原決定基”是那些能被對所有HCV類型都有特異性的抗體所識別的抗原決定基。
由于抗體識別多肽中所含的特異性抗原決定基，所以多肽與能結合于肽的抗體有“免疫反應性”。通過抗體結合，更具體地可通過抗體結合的動力學，和/或通過使用含有抗體所針對的抗原決定基之已知多肽作為競爭劑而產生結合競爭可測定免疫反應性。測定多肽是否對抗體有免疫反應性的技術是本領域已知的。
本文所用的術語“抗體”是指由至少一個抗體結合位點組成的多肽或多肽組。通過折疊抗體分子的不同區(qū)域以形成內表面形狀和電荷分布與抗原的抗原決定基特征互補的三維結合空間可形成“抗體結合位點”或“結合區(qū)域”，它們可與抗原發(fā)生免疫反應。抗體結合位點可由重和/或輕鏈區(qū)域(分別為VH和VL)形成，它形成了導致了抗原結合的高變異環(huán)。術語“抗體”包括例如脊椎動物的抗體，雜合抗體，嵌合抗體，經改變的抗體，單價抗體，Fab蛋白質和單域抗體。
多肽特異性的抗體和多肽可由本領域熟知的方法制備，例如，通常將多肽懸浮于生理可接受的緩沖液中，與適當佐劑相混合并注射給動物。制備多克隆和單克隆抗體的方法是本領域中已知的，本文中不再詳細描述。
術語“多肽”是指氨基酸的聚合物，而不是指特定長度的產物；因此對多肽的限定中包括多肽，寡肽和蛋白質。此術語不是指或排除了多肽的表達后修飾，例如糖基化，乙?；?，磷酸化等等。此限定中還包括例如，含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，具有經取代鍵的多肽以及本領域已知的自然發(fā)生和非自然發(fā)生的其它修飾。
本文所用的“治療”是指預防和/或治療。
本文所用的“個體”是指脊椎動物，尤其是哺乳動物種中的成員，包括但不局限于動物(例如狗、貓、牛、豬、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、幾內亞豬等等)和靈長類，包括猴、猩猩、狒狒和人。
本文所用的核酸“有義鏈”含有與mRNA序列同源的序列，“反義鏈”含有與“有義鏈”互補的序列。
本文所用的病毒“正鏈基因組”指其中無論為RNA或DNA，其基因組呈單鏈的并編碼病毒多肽。正鏈RNA病毒的例子包括披膜病毒科、冠狀病毒科、反錄病毒科、小RNA病毒科和嵌杯狀病毒科，也包括先前被分到披膜病毒科的黃病毒科，見Fields&Knipe(1986)。
本文所用的“含有身體樣品的抗體“是指個體身體的成分為感興趣抗體的來源。本領域已知含有身體成分的抗體，它包括但不局限于例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、呼吸道的外切面、腸和生殖泌尿道、眼淚、唾液、乳汁、白血細胞和骨髓瘤。
本文所用的“生物樣品”是指分離自個體的組織或液體樣品，包括但不局限于例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚的外切面、呼吸道、腸和生殖泌尿道、眼淚、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、器官。也包括體外細胞培養(yǎng)組分的樣品(包括但不局限于由細胞在培養(yǎng)基中生長而得到的限定培養(yǎng)基，推定為經病毒感染的細胞，重組細胞和細胞成分)。完成本發(fā)明的方式除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用本領域熟練人員已知的分子生物學、微生物學、重組DNA、多肽和核酸合成以及免疫學的常規(guī)技術。這些技術在文獻中已被全面解釋，例見Maniatis.Fitsch&Sambrook，″Molecular CloningA Laboratory Manual″(1982)；″DNA Cloning，Volumes I and II″(D.N.Glover ed.1985)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait ed.，1984)；″Nuclei Acid Hybridization″ (B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；″Transcription and Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney ed.1986)；″Immobilized CellsAnd Enzymes″(IRL Press，1986)；B.Perbal，″A Practical Guide ToMolecular Cloning″(1984)；the series，″Methods in Enzymology″(AcademicPress，Inc.)；″Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells″(J.H.Miller andM.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)，Meth.Enzvmol，Vol.154 and Vol.155 (Wu and Grossman，and Wu，eds.，respectively)，Mayer and Walker，ads.(1987)，″Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology”(Academic Press，London)，Scopes，(1987)”ProteinPurificationPrinciples and Practice″，Second Edition(Springer-Verlag.N.Y.)；and”Handbook of Experimental Immunology”，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。
本文上下文提到的所有專利、專利申請和出版物均并入本文作為參考文獻。
本發(fā)明包括檢測HCV以及鑒定不同類型HCV感染的方法，本發(fā)明也包括用于此方法的多肽和核酸分子。
檢測和鑒定HCV感染類型的方法包括免疫測定法以及核酸鑒定法，后者包括但不局限于Southern印跡分析和聚合酶鏈反應。為了鑒定HCV感染，可在允許抗原-抗體結合的條件下將生物樣品與本文所述的某個多肽一起溫育，并測定樣品中的抗體是否與多肽上存在的抗原決定基結合。免疫測定法和診斷試劑盒含有類型特異性抗原決定基和類型-簇特異性抗原決定基的肽類可用于免疫測定法以檢測生物樣品中HCV抗體的存在，或者病毒和/或病毒抗原的存在。免疫測定法的設計需經大量改變，本領域已知多種形式的改變，免疫測定法需利用至少一種類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基，在一個實施例中，免疫測定法使用了類型特異性抗原決定基和/或類型-簇特異性抗原決定基。
使用抗原決定基測定類型特異性或類型-簇特異性抗體的存在從而可將多肽用于鑒定HCV類型。此多肽也適用于產生類型或類型-簇特異性抗體，它們隨后可用于區(qū)分不同類型HCV的免疫測定法。
此多肽衍生于HCV基因組的三個不同區(qū)域，一套多肽包括得自HCV核心區(qū)域的類型或類型-簇特異性抗原決定基，另一套多肽包括得自HCV非結構區(qū)域4(NS4)的類型或類型-簇特異性抗原決定基，另一套多肽包括得自丙型肝炎病毒非結構區(qū)域5(NS5)的類型或類型-簇特異性抗原決定基，此套多肽發(fā)現于HCV-1氨基酸殘基2281-2313之間以及其它類型丙型肝炎病毒的同源區(qū)域。
此多肽適用于一種或多種HCV類型的免疫測定法。在允許抗原-抗體結合的條件下將樣品與一種或多種含類型-簇特異性抗原決定基的多肽相接觸，并測定樣品中的抗體是否與抗原決定基結合即可測定一種類型。
在區(qū)分特定類型HCV的免疫測定法中，從個體中得到生物樣品，在允許抗原-抗體結合的條件下將樣品與第一種類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基相接觸，在允許抗原-抗體結合的條件下將樣品與第二種類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基相接觸，并測定樣品中的抗體是否與第一或第二抗原決定基結合。含有類型和/或類型-簇特異性抗原決定基的許多多肽都可重復這些步驟。
典型地，抗-HCV抗體的免疫測定法包括篩選和制備懷疑含有抗體的檢測樣品，如生物樣品，然后在允許抗原-抗體復合物形成的條件下將樣品與類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基一起溫育，然后檢測這種復合物的形成。適當的溫育條件是本領域中熟知的。免疫測定法可以不受限制地為不均一或均一的形式，并可以是一般的或競爭性的形式。
在不均一的形式中，類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基典型地與固體支持物結合以促使溫育后多肽與樣品的分離?？梢允褂玫墓腆w支持物的例子包括但不局限于硝酸纖維素(例如以膜或微量孔的形式)，聚氯乙烯(例如為紙片或微量孔)，聚苯乙烯乳膠(例如為小珠或微量滴定板)、聚偏氟乙烯(已知為Immulon)、重氮化紙、尼龍膜、活性小珠和Protein A珠。例如在不均一的形式中可使用Dynatech Immulon1或Immulon2微量滴定板或0.25英寸的聚苯乙烯小珠(Precision Plastic Ball)。典型地，從檢測樣品中分離出含有類型特異性抗原決定基或類型-簇抗原決定基的固體支持物后，在檢測結合抗體之前要經洗滌，一般的和競爭性的形式都是本領域已知的。
在均一的形式中，將檢測樣品與溶液形式的類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基一起溫育，例如它可處于能加速任何抗原-抗體復合物形成的條件之下，這些測定法的一般的和競爭性的形式都是本領域已知的。
在標準形式中，可直接監(jiān)測形成抗體-類型或類型-簇特異性抗原決定基復合物的HCV抗體的量。通過測定可識別抗-HCV抗體上之抗原決定基的經標記抗-異種(例如抗-人)抗體是否因復合物的形成而結合即可實現此目的。在競爭性的形式中，通過監(jiān)測對復合物中已知數量的標記抗體(或其它競爭性配體)結合的競爭性作用可推導出樣品中HCV抗體的量。
在抑制檢測中，測定抗體與含有不同類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基多肽的結合能力。將抗體先暴露于含有一種類型或類型-簇HCV的抗原決定基的多肽中，再暴露于含有另一種類型或類型-簇HCV的抗原決定基的多肽中，對其它類型或類型-簇HCV也可重復此過程。
所形成的含有抗-HCV抗體的復合物(或者在競爭性檢測中，競爭性抗體的量)可通過依賴于實驗方案的大量已知技術中的任何一種來測定。例如，使用抗異種Ig與標記物(如酶標記物)復合的偶聯物可檢測復合物中未被標記的HCV抗體。
在典型的免疫測定法中，在允許抗原-抗體復合物形成的條件下，將檢測樣品，典型地為生物樣品與含有一種或多種類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基的多肽一起溫育?？梢允褂貌煌姆绞?，例如可使用“三明治測定法”，其中與固體支持物結合的抗體同檢測樣品一起溫育；洗滌；與第二、經標記的分析物抗體一起溫育；重新洗滌支持物。通過測定第二抗體是否與支持物結合可檢測分析物。在可為不均一的或均一的競爭性檢測中，通常將檢測樣品與抗體一起溫育，還需溫育經標記的競爭性抗原，這兩者可相繼地或同時地進行。本領域中熟知這些和其它的實驗形式。
在免疫測定法中可使用直接抗類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基的抗體以檢測攜有導致NANBH的HCV的患者以及被感染的供血者中的病毒抗原，而且這些抗體對檢測急性期供血者和患者十分有用。
免疫測定法可使用例如直接抗類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基的單克隆抗體，結合直接抗一種病毒抗原的抗原決定基的單克隆抗體、直接抗不同病毒抗原的抗原決定基的單克隆抗體，直接抗相同病毒抗原的多克隆抗體，或者直接抗不同病毒抗原的多克隆抗體。實驗方案可根據例如競爭、或直接反應、或三明治類型測定。實驗方案也可使用例如固體支持物或免疫沉淀法。大多數測定法包括使用經標記的抗體或多肽；標記物可為但不局限于酶的、熒光的、化學發(fā)光的、放射性的或染料分子。擴增探針信號的測定法也是已知的；其例子為利用生物素和親和素的測定法以及經酶標記和介導的免疫測定法，如ELISA測定法。
本發(fā)明進一步包括編碼所述類型特異性抗原決定基和類型-簇特異性抗原決定基的氨基酸殘基序列的核酸分子。例如這些核酸分子在Southern印跡法或如美國專利4,868,103和5,124,246所述捕捉測定法的其它DNA識別測定法中可用作探針。
通過表達HCV cDNAs對抗原作圖所做研究表明大量含有這些cDNAs的克隆表達了多肽，此多肽對表現為NANBH之個體的血清有免疫反應性。單個的多肽對所有血清都沒有免疫反應性。這些多肽中的五個免疫原性很強，因為在很多不同病人的血清中都可檢測到這些多肽中HCV抗原決定基的抗體，盡管檢測中的重疊尚不完全，因此在不同克隆中編碼的多肽的免疫原性結果可表明HCV感染的有效檢測系統(tǒng)也包括使用抗原決定基系列，此系列中的抗原決定基可被構建成一種或多種多肽。不同抗原決定基的測定可以相繼地或同時地進行。
適于免疫診斷并含有適當經標記試劑的試劑盒是通過在適當容器中裝入適當物質構成的，這些物質包括含有類型特異性抗原決定基和類型-簇特異性抗原決定基的本發(fā)明多肽或者直接抗類型特異性抗原決定基和類型-簇特異性抗原決定基的抗體，以及實施此測定法所需的其余試劑和物質，以及一套合適的測定方法說明。
本發(fā)明進一步包括與編碼類型特異性抗原決定基和類型-簇特異性抗原決定基核酸序列的側翼區(qū)域互補的核酸分子，這種核酸分子可用于進行PCR以測定特殊HCV的基因型。
應指出在HCV基因組中有可變的和高變異性的區(qū)域；因此這些區(qū)域中的同源性有望比整個基因組中的同源性明顯要低一些。
本領域已知測定核酸和氨基酸序列同源性的技術。例如可直接測定氨基酸序列并與本文提供的序列相比較，另外還可測定推斷的HCV基因組物質的核苷酸序列(通常通過cDNA中間體)，也可測定本文編碼的氨基酸序列并與相應區(qū)域相比較。
上述討論和例子僅為闡明本發(fā)明，本領域普通的技術人員會認識到本發(fā)明還能以其它方式完成，本發(fā)明僅參照權利要求而被限定。
實施例1比較各種不同類型HCV的主要抗原決定基比較不同類型和亞型的HCV不同區(qū)域之間氨基酸殘基的同源性，HCV亞型如Simmonds系統(tǒng)發(fā)育分析所述。氨基酸序列的編號對應于原型HCV-1序列中所述編號。(Choo et al)。表2表明NS4區(qū)域類型特異性抗原決定基和類型-簇特異性抗原決定基和保守的主要抗原決定基氨基酸殘基同源性的百分數，表3表明NS5區(qū)域的兩種類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基之間氨基酸殘基的同源性。表4表明核心區(qū)域保守的主要抗原決定基和類型特異性抗原決定基氨基酸殘基同源性的百分數。
表2不同HCV亞型之間的氨基酸同源性(％)

表3不同HCV亞型之間的氨基酸同源性(％)

表4不同HCV亞型之間的氨基酸殘基的同源性(％

實施例2肽的合成合成了兩套多肽，第一套設計成可進行HCV-1抗原決定基的作圖，第二套設計成可測定在抗原決定基作圖研究中鑒定出的哪一個抗原決定基包含類型特異性抗原決定基。在第一套多肽中，通過跨越完整HCV-1多聚蛋白質(3011個氨基酸殘基)的Mimotopes可合成六十四套重疊八肽(2份)。
根據Geysen(1990)，J.Trop.Med.Pub.Health，21523-533，和Nerrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.，852149-2154所述的方法可制備第二套多肽。
在第二套多肽中，選擇四個抗原區(qū)域用以類型特異性抗原決定基的合成，這些區(qū)域表示HCV-1核心NS4，NS5中非保守性序列以及HCV亞型1b，2a，3a和類型4中的其相應序列的主要抗原決定基。核心序列選自氨基酸殘基67-88的較不保守的區(qū)域，NS4區(qū)域的序列選自氨基酸殘基區(qū)域1689-1718，選自NS5的序列來自氨基酸殘基區(qū)域2281-2313和2673-2707 。
實施例3生物樣品為了測定多肽區(qū)分不同類型HCV特異性抗體的效力，從包括美國東海岸和西海岸、日本、西歐國家、南歐國家和南非的世界不同地區(qū)的24個慢性NANBH患者中得到抗血清，如Cha et al.(1992)Proc.Netl.Acad.Sci.USA，897144-7148中所述進行病毒RNA的分離，cDNA合成，PCR擴增，DNA測序和寡核苷酸探針雜交。
實施例4抗原決定基作圖為了測定HCV的哪個區(qū)域含有抗原決定基，無論是類型特異性的還是保守的，需對完整的HCV-1多聚蛋白質進行抗原決定基作圖，所用方法基本如圖2所列。
用跨完整HCV-1多聚蛋白質(3011個氨基酸)的Mimotopes合成64套(2份)重疊八肽，選擇40個樣品系列用以抗原決定基作圖和簇分析，這些樣品包含25個美國HCV抗體活性樣品，9個日本HCV活性樣品和6個HCV無活性陰性對照樣品。使用標準ELISA方法進行免疫測定。
鑒定主要抗原決定基的標準基于抗體對這些抗原決定基反應的頻率和強度(效價)，結果示于圖3和4。
實施例5肽衍生的酶聯免疫吸附測定法為確定使用實施例2中所述多肽的最適免疫測定法，可運行兩種獨立類型的多肽衍生的酶聯免疫吸附測定(ELISA)，并比較其結果，第一種類型的ELISA是Nunc MaxiSorbTM，肽類簡單地吸附于其上；第二種類型使用了Nunc Covalink NHTM，多肽共價連接于其上，通過加入碳二亞胺可啟動羧酸和胺之間酰胺鍵的形成，為減少水解作用，可通過在上述連接步驟中加入N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)來制備活性酯。
第一種類型的ELISA所用的微量滴定板可按下述進行。將多肽置于Nunc MaxiSorbTM微量滴定板的孔中，每孔含100μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，其中多肽濃度為1μg/孔。在室溫下使多肽吸收過夜，然后用不含有去污劑的PBS將微量滴定板洗滌四次，再用220μlSuperlock(Pierce)將孔后覆蓋1小時，然后不需進一步洗滌而抽吸小孔并真空干燥。
按下述進行測定，在含有100μl5％脫脂牛奶的小孔中加入5μl血清樣品，在37℃下溫育1小時，然后用含0.05％吐溫的PBS洗滌小孔五次，使用經辣根過氧化物酶(Jackson Laboratories)標記的親和純化的山羊抗人IgG偶聯物測定人抗體對多肽的結合水平。在150mMNaCl，PBS，5％馬血清(熱變性)中將偶聯物先稀釋至5％IgG，將100μl偶聯物置于小孔中，在37℃下溫育1小時，在室溫下用PBS/吐溫和OPD[鄰苯二胺-2HCl，每份顯色劑緩沖液一片(檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖的0.02％H2O2)；Sigma]洗滌小孔五次，達30分鐘，測定492nm和620nm處的吸光率(Abs)。The cut off wasdetermined from 200 random(normal)samples where sevenstaudard deviations from the mean or about 0.45。
第二種類型ELISA所用的微量滴定板按下述進行，將多肽置于Nunc MaxiSorbTM微量滴定板的小孔中，每孔含50μl水，其中多肽濃度為10mg/孔。向多肽中加入25μl0.1M的NHS(sulfo-N-hydrosucinimide，Pierce)和25μl0.1M的EDC[1-乙基-3(3-二甲氨基丙基碳二亞胺)Sigma]，在震動臺上于室溫下混合30分鐘，然后將整個內容物加入52ml冰冷的0.1M碳酸鈉中，pH8.6。用100μl此混合物覆蓋微量滴定板的小孔，再在4℃下孵育30分鐘，用PBS/0.1％曲通X-100將小孔洗滌四次，然后用Superblock處理滴定板，并按上述進行測定。
所得結果示于下列表5-14。

表6不同HCV類型的抗原決定基血清定型分析序列區(qū)域NS4(1689-1718)樣品描述肽/EIA 不同HCV依賴于類型的序列信號/終止類型的肽(I)受雇供血者樣品SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIcp402-10(1a)SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIcp402-11(1b)SGRPAVIPDREVLYQFDEMEECASHLPYIcp402-12(2a)NQRAVVAPDKEVLYEAFDEMEECASRAALIcp402-13(2b)NDRVVVAPDKEILYEAFDEMEECASKAALI* ** *受雇供血者樣品fF25910(1a) 5.54 cp402-10(1a)9.71 cp402-11(1b)8.28 cp402-12(2a)6.63 cp402-13(2b)6.87 godC100 ELISA(1a)PDREVLY與共同的抗原決定基1a，1b，2a&2b反應KI(II)與類型特異性抗原決定基反應的樣品FF25931 5.74cp402-10(1a)7.43cp402-11(1b)8.89cp402-12(2a)14.5 cp402-13(2b)7.25oodC100 ELISA(1a)PDREVLY與共同的抗原決定基1a，1b，2a&2b反應KI
表10 HCV核心、NS4和NS5區(qū)域主要的類型特異性抗原決定基概要核心區(qū)域主要的保守抗原決定基類型特異性抗原決定基保守的抗原決定基(15—45)(67—04)(67—84)TNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY HCV-1a&1b-PEGRTWAQ PGYPWP(1a，1b，2a，2b，3a)LLPRRGPRLG(HCV-1) HCV-2a&2b-STGKSWGKHCV-3Aor4-SEGRSWAQ F(4)NS4區(qū)域主要的保守抗原決定基類型特異性抗原決定基保守的抗原決定基(1925-1935)(1689-1718) (1689-1718)RGNIIVSPTIIYV(HCV-1 ) HCV-1a—CSQHLPY PDREVLY(1a，1b)HCV-1b—CASHLPYKI(2a，2b)HCV-2a&2b-CASRAALKNS5區(qū)域保守的抗原決定基 類型特異性抗原決定基(2288-2294)(2281-2313)WARPDYNHCV-1a&1b-PDYEPPVVHGVHCV-2a—PDYQPATVAGHCV-2b—PGYEPPTVLGHCV-1a—FAQALPVWHCV-1b，2a&2b—FPPQALPIWAp保守的抗原決定基(2673-2707)RGENCGYRRCRASGVLTT-HCV-1a KGAQCGYRRCRASGVLPT-HCV-3a*K QT HCV-1b，2aK QS HCV-3b KGQSCGYRRCRASGVFTT-HCV-2b*
實施例6抑制檢測進行抑制檢測是為了測定肽是否互相競爭與抗體結合，已合成了來自不同類型HCV序列核心NS4和NS5區(qū)域的三套短多肽，這些多肽覆蓋了氨基酸1689-1695，1696-1702和1711-1917的序列區(qū)域。在樣品中加入10μg上述多肽，于37℃下溫育1小時，再進行上述ELISA測定即可進行抑制檢測。如果發(fā)現抗體結合的抑制超過50％，則可認為多肽是抑制性的，所得結果示于下列表15。
表151.SQHLPY CHIEN-101 NS4區(qū)域 1712-17171a2.ASRAAL CHIEN-102 1712-17172a3.ASKAAL CHIEN-103 1712-17172b4.PDREVLY CHIFN-104 1696-19721a，1b，2a5.PDYRPPVVHG CHIEN-105 NS5 區(qū)域2304-23131a6.PDYQPATVAG CHIEN-106 2304-23132a7.FAQALPVWCHIEN-107 2281-22881a8.FPPQALPPW CHIEN-108 2281-22882b9.STGKSWGKCHIEN-109 核心 71-782a&2b10. SEGRSWAQCHIEN-110 核心 71-784
實施例7鑒定HCV臨床樣品的類型將上述表16中所示的類型或類型-簇特異性抗原決定基用于實施例5中的ELISA測定以檢測13個得自非甲、非乙型肝炎患者臨床樣品(10個受雇供血者，3個與輸血相關的慢性非甲、非乙型肝炎患者)。表17列出了這些測定的結果，測定每個臨床樣品與相應于表示不同類型特異性或類型-簇特異性抗原決定基的所給區(qū)域(aa67-84，1689-1718或2281-2313)的十二個不同肽的反應性。每個樣品給出了與每種定型肽的不反應性(NR)、反應微弱性(WR)或反應性(R)三種反應結果。這些結果預測出每個樣品的HCV基因型與由PCR測定的、右邊一欄所示的HCV基因型相關。表17
權利要求
1.鑒定丙型肝炎病毒類型的方法，包括下列步驟a)提供生物樣品；b)在允許第一抗原決定基-抗體復合物形成的條件下，將樣品與含有至少一個抗原決定基的第一試劑相接觸，此抗原決定基選自對第一類型丙型肝炎病毒特異性的第一類型特異性抗原決定基和對第一類型丙型肝炎病毒簇特異性的第一類型-簇特異性抗原決定基；和c)測定樣品中第一抗原決定基-抗體復合物的存在。
2.根據權利要求1的方法，進一步包括下列步驟d)在允許第二抗原決定基-抗體復合物形成的條件下，將樣品與含有第二抗原決定基的第二試劑相接觸，此第二抗原決定基選自對第二類型丙型肝炎病毒特異性的第二類型特異性抗原決定基和對第二類型丙型肝炎病毒簇特異性的第二類型-簇特異性抗原決定基；和e)測定樣品中第二抗原決定基-抗體復合物的存在。
3.根據權利要求1或2的方法，其中在測定步驟中，測定是通過競爭性試驗、三明治試驗、免疫熒光測定、放射性免疫測定或酶聯免疫吸附測定來進行的。
4.根據權利要求1、2或3的方法，其中至少一個類型特異性或類型-簇特異性的抗原決定基得自丙型肝炎病毒的核心區(qū)域、丙型肝炎病毒的非結構4區(qū)域或丙型肝炎病毒的非結構5區(qū)域。
5.根據權利要求4的方法，其中至少一個抗原決定基位于丙型肝炎病毒-1(HCV-1)的氨基酸殘基67和84，1689和1718或2281和2313之間，或位于其它丙型肝炎病毒類型的同源區(qū)域。
6.鑒定丙型肝炎病毒類型的方法，包括下列步驟a)提供生物樣品；b)在允許第一抗原-抗體復合物形成的條件下，將樣品與含有至少一個對第一抗原決定基特異性之抗體的第一試劑相接觸，此第一抗原決定基選自對第一類型丙型肝炎病毒特異性的第一類型特異性抗原決定基和對第一類型丙型肝炎病毒簇特異性的第一類型-簇特異性抗原決定基；和c)測定樣品中第一抗原-抗體復合物的存在。
7.根據權利要求6的方法，進一步包括下列步驟d)在允許第二抗原-抗體復合物形成的條件下，將樣品與含有對第二抗原決定基特異性之抗體的第二試劑相接觸，此第二抗原決定基選自對第二類型丙型肝炎病毒特異性的第二類型特異性抗原決定基和對第二類型丙型肝炎病毒簇特異性的第二類型-簇特異性抗原決定基；和e)測定樣品中第二抗原-抗體復合物的存在。
8.根據權利要求6或7的方法，其中在測定步驟中，測定是通過競爭性試驗、三明治試驗、免疫熒光測定、放射免疫測定或酶聯免疫吸附測定來進行的。
9.根據權利要求6、7或8的方法，其中第一抗原決定基是得自丙型肝炎病毒核心區(qū)域、丙型肝炎病毒非結構4區(qū)域或丙型肝炎病毒非結構5區(qū)域的類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基。
10.根據權利要求9的方法，其中第一抗原決定基位于丙型肝炎病毒-1(HCV-1)的氨基酸殘基67和84，1689和1718，或2281和2313之間，或位于其它丙型肝炎病毒類型的同源區(qū)域。
11.具有相應于丙型肝炎病毒之類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基之氨基酸殘基序列的多肽。
12.根據權利要求11的多肽，其中第一抗原決定基是得自丙型肝炎病毒核心區(qū)域，非結構區(qū)域4或非結構區(qū)域5的類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基。
13.根據權利要求12的多肽，其中第一抗原決定基位于丙型肝炎病毒-1(HCV-1)的氨基酸殘基67和84，1689和1718或2281和2313之間，或位于其它丙型肝炎病毒類型的同源區(qū)域。
14.核酸分子，含有由丙型肝炎病毒基因組編碼的核苷酸序列，其相應于得自丙型肝炎病毒的類型特異性抗原決定基或類型-簇特異性抗原決定基之氨基酸殘基序列。
15.根據權利要求14的核酸分子，其中抗原決定基得自丙型肝炎病毒核心區(qū)域，丙型肝炎病毒非結構區(qū)域4或丙型肝炎病毒非結構區(qū)域5。
全文摘要
本發(fā)明提供了鑒定丙型肝炎病毒類型的方法以及用于此方法的組合物。
文檔編號G01N33/576GK1125982SQ94192560
公開日1996年7月3日 申請日期1994年5月9日 優(yōu)先權日1993年5月10日
發(fā)明者D·Y·錢, G·郭 申請人:奇龍公司