專利名稱：血液成分的檢測方法及用于檢測的物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異地檢測來自人體血液的方法，更詳細地說是涉及能夠從糞便檢測出消化道中微小出血的血液成分的檢測方法，例如用來篩選檢查大腸癌等以及用于檢測的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
檢測人體血液的成分，在多方面都是必要的，特別在醫(yī)療領(lǐng)域其必要性更高。例如眾所周知的，消化道的出血是由各種疾病引起的，特別對消化道的惡性腫瘤，消化道的出血是非常重要的初期癥狀。
檢測消化道出血，診斷消化道惡性腫瘤的方法，現(xiàn)在主要是通過測定糞便中的血液成分、特別是血紅蛋白來進行的。
這種檢測糞便中血紅蛋白的方法有逆受體血球凝集法、膠乳凝集法、金膠體凝集法、酶免疫鑒定法、放射免疫鑒定法。其原理是調(diào)制抗血紅蛋白的抗體，使之發(fā)生血紅蛋白和抗原-抗體反應(yīng)，再用各種方法測定、檢出其結(jié)果。
但是，這種過去使用抗血紅蛋白的抗體的免疫學(xué)檢測方法，作為被檢測物質(zhì)的血紅蛋白，通常要與引起失活的糞便一起提供給檢查，所以隨著溫度和時間的變化血紅蛋白的抗原決定基失活，結(jié)果檢測靈敏度顯著地下降。
特別夏季高溫時，往往引起血紅蛋白的改性或分解，本來是陽性的試樣可能報告出陰性(藤好建史及小山真理子、“基礎(chǔ)和臨床”、免疫便潛血試劑的基礎(chǔ)研究、23(15)、6097-6101，1989)。
而且特別是在血紅蛋白低濃度時，上述失活顯著，這對于具有診斷意義的低濃度檢測造成了困難。
因此，本發(fā)明的目的是提供以下的方法，也就是，即使使用糞便等試樣也不易由于溫度和保存時間受到影響，可以準(zhǔn)確地測定血液成分的方法。
本發(fā)明者對于使用血紅蛋白代替血液成分檢測糞便等中的血液或血液成分的存在進行了精心的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人體紅血球膜帶3糖蛋白(以下簡稱“帶3”)即使在糞便等試樣中也難于失活，而且與特定的紅血球凝集素結(jié)合可以形成復(fù)合物，所以很容易地檢測出，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了使檢體中的帶3和屬于耳霉屬微生物產(chǎn)生的紅血球凝集素進行反應(yīng)，檢測生成的復(fù)合物來確定檢體中血液成分的檢測方法及用于此方法的檢測物質(zhì)。
本發(fā)明中，作為血液成分檢測出的帶3，是紅血球的標(biāo)記，這在文獻中報告(Beppu，M.et al.，J.Biol.Chem.256(6)，3226-3233(1990)，＂Binding of anti-band 3 autoantibody to oxidativelydamaged erythrocytes”等)，它是監(jiān)視紅血球作用的成分。
另一方面，本發(fā)明方法中所使用的耳霉屬微生物所產(chǎn)生的紅血球凝集素(以下稱為“CA”)是屬于耳霉屬，例如由閃表耳霉屬(Conidiobolus lamprauges)和短枝耳霉屬(Conidiobolusnanodes)等微生物產(chǎn)生的人體特異紅血球凝集素，可以和帶3之間相互作用，這方面已有報告(Ishikawa，F(xiàn).et al.，Agric.J.Biol.Chem.45(9)，2105-2110(1981)，＂Action of proteases on humanerythrocyte glycoproteins in relation to hemagglutinationby Conidiobolus chitin-binding agglution＂)，但是使用它檢測的方法尚無人知。
本發(fā)明的方法，因為可以檢測出含在檢測系中血液成分的帶3與CA的復(fù)合體中的帶3，檢測出檢體中人體血液成分，所以只要達到此目的采用任何方式都可以。
作為實施本發(fā)明方法的一個例子可以舉出所謂的夾層法，即將CA作成固相的表面不溶解物，向其中加入試樣及與該帶3特異結(jié)合并標(biāo)記過的抗帶3抗體后，則試樣中的帶3由固相化CA和標(biāo)記的抗帶3抗體成為夾層，通過存在于試樣中的帶3，可以測定試樣中的血液存在或其量。
上述的方法中，如下所述，也可以預(yù)先向試樣中添加抗帶3。
即，上述體系中，試樣帶3上的肽部分通過添加抗帶3抗體被識別，另外通過固相化CA用其它方法識別、捕捉帶3的糖鏈部分，進而通過標(biāo)記抗帶3抗體，可以識別與添加的抗帶3抗體最初識別的帶3的肽部分不同處的肽部分，由抗帶3抗體和固相化CA、標(biāo)記的抗帶3抗體所確定的試樣中的帶3高度地被限定，與夾雜在試樣中的多種類糖蛋白難于交叉，所以提高了靈敏度和特異性。
另外，本發(fā)明方法中，除了上述例子外，替換固相化成分和標(biāo)記成分也可以將固相化抗帶3抗體和標(biāo)記CA組合、或固相化成分和標(biāo)記成分與CA之間組合，作為特異的檢測系都是可以的。在這種情況下，為提高靈敏度和特異性，可以采取與上述類似的方法。
作為本發(fā)明的其他方案可以舉出所謂競爭反應(yīng)檢測方法，即試樣中的帶3捕捉在固相上的同時，將預(yù)先準(zhǔn)備的并標(biāo)記過的帶3向固相進行競爭的捕捉，利用后者帶3的標(biāo)記可以知道試樣中血液存在或其量。
作為上述CA和抗帶3抗體的標(biāo)記方法可以使用放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記等的任何一種方法、例如生物素標(biāo)記后，用標(biāo)記后的卵白素檢測方法、不直接標(biāo)記CA、抗帶3抗體，對于這些使用標(biāo)記第二抗體的方法，重要的是只要能檢測出標(biāo)記，對于特異的檢測系統(tǒng)都沒有任何影響。
本發(fā)明中，也可以將抗帶3抗體或CA預(yù)先存在于試樣中，例如采用在采便桿的表面上預(yù)先涂上所需要的可以溶出的抗帶3抗體或CA的方法。
另外，從含有抗帶3糞便等的試樣中可以溶解洗脫出抗帶3的基液有各種緩沖液如醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、TRIS鹽酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、銨緩沖液、硼酸酸緩沖液、碳酸緩沖液等。這些基液的pH值是4-11.5，優(yōu)選的是4.5-8.5。
這些基液中最好添加接近生理食鹽濃度的食鹽，另外作為抗菌劑最好添加0.05-0.5重量％的疊氮化鈉等。進而作為抗體等，蛋白的穩(wěn)定劑最好添加0.05-2.0重量％的牛血清白蛋白等。
本發(fā)明因為是檢測含在人體紅血球膜中帶3的方法，所以溶解紅血球膜后進行檢測更為有效，作為溶解劑可以使用表面活性劑。
作為這些溶解劑，適宜的表面活性劑代表例可以舉出如下，當(dāng)然也不僅限于這些。
十二烷基苯磺酸鈉聚氧化乙烯-異辛基苯基醚(Triton X-100等)
聚氧化乙烯壬基苯基醚(Noident P-40等)聚氧化乙烯山梨糖醇醚(Tween20等)3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸鹽3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷辛酰-N-甲基葡糖酰胺壬酰-N-甲基葡糖酰胺癸酰-N-甲基葡糖酰胺正庚基-β-D-硫代葡糖酰胺正辛基-β-D-硫代葡糖酰胺N，N，-雙(3-D-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺對于這些表面活性劑的添加方法雖然沒有特殊的限制，但是使用上述的緩沖液作為基液時，表面活性劑添加濃度在1重量％以下時更能發(fā)揮效果。
本發(fā)明是使用CA和抗帶3抗體，通過帶3從糞便等試樣中檢測出含有的人體血液成分的檢測方法，特別適用于便潛血的檢測方法。如以后實施例所述，這種方法與以往的使用抗血紅蛋白抗體的便潛血的檢測相比，可以高靈敏度、穩(wěn)定地檢測出便潛血。
以下通過實施例具體地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不受這些實施例的限制。
實施例1使用酶標(biāo)記抗帶3抗體和CA，檢測糞便中帶3的檢測方法(1)帶3的離析精制將添加抗凝固劑的人的O型血液200ml，用320Xg離心10分鐘，分離血漿。將沉渣懸浮在含有1mM EDTA及5mM 2-巰基乙醇、0.03mM苯甲磺酰氟的200ml的0.05mM磷酸緩沖液(pH7.3)中，用1mM NaOH調(diào)節(jié)成pH7.5后，在4℃下緩慢攪拌18小時。用10,000Xg離心分離1小時，將沉渣懸浮在用1M NaOH調(diào)節(jié)成pH12的冰水中，在4℃下緩慢攪拌30分鐘。
用10,000Xg離心分離30分鐘，將沉渣懸浮在含有1％癸基硫酸鈉、2mM EDTA及0.04mM 2-巰基乙醇的40mM TRIS鹽酸緩沖液(pH7.4)，在4℃下放置1小時后回到室溫。
將該溶液通過用上述緩沖液平衡了的瓊脂糖6B(法爾馬西亞社制)柱(2cmΦ×98cm)，以在280nm的吸光度作為指標(biāo)，收集餾分。帶3在血型糖蛋白A之前溶出。
(2)對于帶3的多細胞株抗體的制作將帶3以4mg/ml溶解在生理鹽水中，將其1ml以2周時間間隔，在兔子的背部皮下進行8次注射。最后，在皮下注射后第3周采血，得到抗帶3抗血清。
將該抗帶3抗血清，加入到0.2M NaCl的20mM TRIS鹽酸緩沖液(pH8.3)平衡了的蛋白質(zhì)A瓊脂糖CL-4B(法爾馬西亞社制)柱(1cmΦ×14cm)中，用相同的緩沖液將該柱洗脫，收集餾分。洗脫直到280nm的吸光度回到標(biāo)準(zhǔn)線為止。
接著，用0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3.0)將該柱洗脫，直到280nm的吸光度回到標(biāo)準(zhǔn)線為止，收集餾分，貯存此吸光度下含有蛋白質(zhì)的餾分，且對于10mM磷酸緩沖液(pH7.5)進行透析。
得到的抗體，用歐克塔尼法(オクタロニ-法)，對于來自人體的紅血球帶3是特異的(以下，將本抗體簡稱“抗帶3抗體”)。
(3)抗帶3抗體的酶標(biāo)記將西洋山萮菜過氧化酶(以下，簡稱“HRPO”；西格馬化學(xué)社制)，用以下方法與抗帶3抗體結(jié)合。
將HRPO，以15mg/m1溶解在10mM醋酸緩沖液(pH4.5)中，向其中加入偏(meta)過碘酸鈉，使最終濃度達到33mM，在25℃下，將混合物培養(yǎng)15分鐘。將混合物通過用上述醋酸緩沖液平衡了的Sefdex G-25(法爾馬西亞社制)柱(1cmΦ×14cm)，收集洗脫出的茶色餾分。該餾分就是活性化HRPO。
用上述醋酸緩沖液將該活性化HRPO餾分的最終濃度調(diào)節(jié)成1mg/ml，向其中加入抗帶3抗體(上述抗帶3抗體是在50mM碳酸緩沖液中(pH9.5)調(diào)節(jié)成4mg/ml物質(zhì))，而后在室溫下培養(yǎng)4小時。
向該混合物加入硼氫化鈉，使最終濃度達2.6mM，使反應(yīng)穩(wěn)定，在4℃下將其反應(yīng)30分鐘。向其中加入丙酮，使最終濃度達0.2％(v/v)，停止硼氫化鈉的反應(yīng)，制成HRPO標(biāo)記抗帶3抗體。
(4)CA的配制將閃表耳霉CBS153，56的菌株接種在含有乳糖1％、胨0.5％、醇母浸汁0.3％及麥芽浸汁0.3％的0.05M磷酸緩沖液(pH7.0)5ml的內(nèi)徑16mm的試管中，在120rpm的往復(fù)式試驗管振蕩機上，在27℃下培養(yǎng)3天。接著將該培養(yǎng)液5ml接種在注有100ml上述組合液的500ml容量的帶凸緣振蕩燒瓶中，在120rpm的旋轉(zhuǎn)式振蕩機上，進一步在27℃下培養(yǎng)5天。
用濾紙過濾該培養(yǎng)液，過濾出菌體，將得到的濾液3000ml，在冰中一邊冷卻一邊加入固體硫銨直到75％飽和后，在低溫下放置一晝夜。以10,000Xg通過20分鐘的離心收集析出的沉淀物，將其溶解到0.05M磷酸緩沖液(pH6.0)，該緩沖液透析一晝夜。將生成的不溶性物質(zhì)，以10,000Xg通過20分鐘離心除去，得到上清液142ml。
將該溶液通過用上述緩沖液平衡了的CM-Sefdex C-50(西格馬化學(xué)社制)柱(2cmΦ×98cm)，收集用上述緩沖液0.05-0.5M的梯度法洗脫的餾分，確認作為CA的紅血球凝聚活性。將該餾分67ml，吸附在用1M食鹽-0.05M磷酸緩沖液(pH6.0)平衡了的結(jié)合β-N-乙酰-D-葡萄糖胺的瓊脂糖4B(法爾馬西亞社制)柱(1cmΦ×14cm)上，用相同緩沖液洗凈柱后，在用0-0.36M的N-乙酰-D-葡萄糖胺溶液的梯度法洗脫的餾分內(nèi)，將梯度最開始的部分作為CA精制標(biāo)品。
(5)CA的固相化將CA2μg/ml溶液(0.1mol TRIS鹽酸緩沖液；pH8.4)各150μl分注在微板的各孔中，在4℃下放置一晝夜，吸附在表面上進行固相化(不溶化)。
(6)糞便試樣的制作將人體血液8.0μl混合在健康人大便2g中，作成試樣。取之約1/4即0.5，與健康人便1.5g混合，即稀釋4倍，作成試樣2。進而，以相同方法再稀釋4倍，作成試樣3(稀釋16倍)。另外，以完全不含血液的作為空白試樣，作成試樣4。
其結(jié)果，加入的血液量對于糞便1g來說，是4，1，0.25ml的3階段及0。
(7)試樣溶解液的制作制成含有1％氚核(Triton)×100(西格馬化學(xué)社)、0.1％疊氮化鈉、0.1％牛血清白蛋白及0.9％氧化鈉的0.1mol/l TRIS鹽酸緩沖液(pH8.0)，各2ml分注在試管中作成試樣溶解液。
(8)試樣的采取及試樣液的調(diào)制將采取便桿分別插入到各試樣中，約采取10mg，將試樣分散到試樣溶解液2ml中，進行溶解，在37℃下使其反應(yīng)5分鐘，作成便試樣液。
(9)測定將上述(5)的固相化CA板，用0.1mol TRIS鹽酸緩沖液(pH8.4)洗凈后，將用(8)采取的便試樣液，各100μl加入到各孔穴中。進而，各加入50μl 0.5mol醋酸緩沖液(pH4.5)，在37℃下反應(yīng)1小時，捕集到試樣液中的帶3。
用0.1mol磷酸緩沖液(pH6.8)，充分地洗凈各孔穴后，各加入150μl HRPO標(biāo)記抗帶3抗體溶液(HRPO標(biāo)記抗帶3抗體，以1μg/ml溶解在含有2％牛血清白蛋白的0.1mol磷酸緩沖液(pH6.1)中的溶液)，在37℃下反應(yīng)1小時。
接著再用0.1mol磷酸緩沖液(pH6.8)充分洗凈，各加150μl基值溶液(含有0.03％鄰苯二胺、0.01％過氧化氫的0.05M醋酸緩沖液(pH4.5)，在37℃下反應(yīng)30分鐘。各加入50μl的4M鹽酸，停止反應(yīng)，用分光光度計(科羅納制微板閱讀式)，在492nm和630nm的2波長下測其發(fā)光。用此方法，大便試樣中1-3中的帶3對于空白試樣顯示的吸光度均在0.5以上，明顯地是陽性。
比較例1使用抗血紅蛋白抗體的便潛血的檢測方法(以往方法)(1)抗人體血紅蛋白抗體致敏膠乳試劑的配制在5％羧基化聚乙烯膠乳10ml中，加入1mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺10ml，一邊攪拌一邊反應(yīng)20分鐘。離心分離后棄掉上清液。在沉淀的膠乳中加入等容的0.01mol/l-硼酸緩沖液，攪拌均勻后重復(fù)2次離心分離，除去上清液的操作，最后加入10ml上述緩沖液進行再分散。
在10ml該膠乳(濃度5％)中，添加用對于兔子免疫的精制人體血紅蛋白A。制成的抗人體血紅蛋白抗體(兔子Ig G、濃度5mg/me)7ml，一邊緩慢地攪拌一邊反應(yīng)5小時。離心分離后棄掉上清液。在沉淀的膠乳中加入含有0.1％牛血清白蛋白的0.01mol/l-硼酸緩沖液(pH8.0)10ml，進行攪拌，重復(fù)2次離心分離除去上清液的操作，進而加入上述緩沖液10ml，進行攪拌，得到膠體濃度1％的抗人體血紅蛋白抗體致敏膠乳試劑。
(2)免疫學(xué)的膠乳凝聚反應(yīng)在載玻片血清反應(yīng)板上，各加100μl用實施例1(8)制作的便試樣液，加入25μl上述的膠乳試劑，進行混合攪拌5分鐘后用肉眼觀察凝聚圖象，其結(jié)果，可看到試樣1及試樣2的凝聚圖象，但對于試樣3及試樣4，沒有看到凝聚圖象，與本發(fā)明方法相比，明顯地靈敏度變差。綜合實施例1與比較例1的結(jié)果，如表1所示表1

其中，-...便潛血陰性(以往方法，凝聚反應(yīng)陰性、在發(fā)明方法中，對于空白試樣，吸光度0.4以下)+...便潛血陽性(以往方法，凝聚反應(yīng)陽性、在發(fā)明方法中，對于空白試樣，吸光度0.5以上)實施例2本發(fā)明方法與以往方法比較將實施例1(7)的試樣1、試樣2、試樣3及試樣4(試樣空白)，分別在37℃下培養(yǎng)6天，每天用實施例1的本發(fā)明方法及比較例1的以往方法測定血液的存在，并進行比較。其結(jié)果如表2所示。
表2

其中，-...便潛血陰性(以往方法中，凝聚反應(yīng)陰性、在發(fā)明方法中，對于空白試樣，吸光度0.4以下)+...便潛血陽性(以往方法，凝聚反應(yīng)陽性、在本發(fā)明方法中，對于空白試樣，吸光度0.5以上)以上結(jié)果表明，在以往方法中，在37℃下培養(yǎng)時，即使可檢測血紅蛋白只能檢測出一天左右的，但用本發(fā)明方法，通過帶3可延長高靈敏度地檢測時間，即使連續(xù)地保持37℃的情況下，也可充分長時間地進行檢測。
如以上詳細說明那樣，只要按照本發(fā)明的檢測方法，由于利用CA，可特異地、高靈敏度地、穩(wěn)定地檢測出帶3，所以從因血紅蛋白的存在，而難確認血液存在及其量的糞便、消化系統(tǒng)內(nèi)容物、懷疑有血液存在的物品等試樣中，可以定性或定量地，精確地檢測出如消化道出血、大便潛血等。
權(quán)利要求
1.檢體中血液成分的檢測方法，其特征是使檢體中的人體紅血球膜帶3糖蛋白和耳霉屬微生物所產(chǎn)生的紅血球凝集素反應(yīng)，檢測出含在所生成復(fù)合物中的該帶3糖蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢體中血液成分的檢測方法，其中是使用固相化了的由耳霉屬微生物所產(chǎn)生的紅血球凝集素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢體中血液成分的檢測方法，其中是使用固相化了的對于人體的紅血球膜帶3糖蛋白的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任何一項所述的檢體中血液成分的檢測方法，其中是通過和紅血球膜帶3糖蛋白特異結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)進行含在復(fù)合物中該帶3糖蛋白的檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢體中血液成分的檢測方法，其中和紅血球膜帶3糖蛋白特異結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)是對于標(biāo)記了人體紅血球膜帶3糖蛋白的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢體中血液成分的檢測方法，其中和紅血球膜帶3糖蛋白特異結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)是標(biāo)記了的由耳霉屬微生物所生的紅血球凝集素。
7.通過和標(biāo)記了的紅血球膜帶3糖蛋白的競爭反應(yīng)來進行的權(quán)利要求1或2所述的檢體中血液成分的檢測方法。
8.檢測檢體血液成分用的檢測物質(zhì)，其特征是含有以下的成分(a)及(b)(a)固相化了的由耳霉屬微生物產(chǎn)生的紅血球凝集素。(b)對于標(biāo)記了的人體紅血球膜帶3糖蛋白的抗體。
9.檢測檢體血液成分用的檢測物質(zhì)，其特征是含有以下的成分(a)及(b)(a)標(biāo)記了的由耳霉屬微生物產(chǎn)生的紅血球凝集素。(b)對于固相化了的人體紅血球膜帶3糖蛋白的抗體。
10.檢測檢體血液成分用的檢測物質(zhì)，其特征是含有以下成分(a)及(6)(a)固相化了的由耳霉屬微生物產(chǎn)生的紅血球凝集素。(b)標(biāo)記了的由耳霉屬微生物產(chǎn)生的紅血球凝集素。
全文摘要
檢體中血液成分的檢測方法，其特征是使檢體中的人體紅血球膜帶3糖蛋白和耳霉屬微生物產(chǎn)生的紅血球凝集素(CA)反應(yīng)，檢測出含在所生成復(fù)合物中的該帶3糖蛋白。按照本檢測方法，由于利用了CA可以特異地、高靈敏度、穩(wěn)定地檢測出帶3，所以從因血紅蛋白的存在，而難確定人體血液的存在和量的糞便、消化道內(nèi)容物等試樣中，可以定性或定量地，精確地檢測人體血液成分。
文檔編號G01N33/53GK1139484SQ94194701
公開日1997年1月1日 申請日期1994年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月28日
發(fā)明者富山哲雄, 成田雅, 小番健志, 成田重雄 申請人:愛詩愛詩制藥株式會社