專利名稱：一種用靶向探針技術(shù)檢測高血脂血清的方法
該技術(shù)屬分子生物學(xué)技術(shù)及其在臨床檢測中的應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)國際專利檢索在現(xiàn)有用于膽固醇及高低密度脂蛋白測試法的研制技術(shù)中可歸納為兩類一類是專利Jp 03304800以及專利CN 1048925A為代表的直接顯示法，另一類是以專利Jp 63085357為代表的通過免疫學(xué)手段進行如夾心法、ELISA法它們是利用一種抗體或兩種抗體進行檢測的技術(shù)。上述兩類方法雖已較廣泛的應(yīng)用于血糖尿糖及血液中氨基酸檢測，無論是干法還是濕法都有一個成本昂貴，操作手段繁雜以及對反應(yīng)物不受保護的局限性。
專利Jp 63085357該方法需四步完成，包括四部分內(nèi)容1、血液中apolipoprotein(LDL)滴在檢測試劑的干紙片上；2、采用表面活性劑Triton x-100溶出低密度脂蛋白(LDL)；3、通過免疫學(xué)測定方法檢測血液中低密度脂蛋白；4、血液中低密度脂蛋白的測定方法是檢測高膽固醇血癥的診斷方法。
專利Jp 02163657該方法用于糞便潛血檢測的裝置，是在一個長方形的疏水片上，通過小孔檢測糞便潛血的一個裝置。
專利Jp 03004800該方法是用于定性的膽固醇單項檢測紙，定性用或用水浸出液對紙片上顏色進行定量用。
專利CN 1048925A本方法是采用純化學(xué)偶聯(lián)的方法將下述三部連接成一個整體ABC，其中A為親膽固醇的試劑如脂類、蛋白質(zhì)B為膽固醇酶促產(chǎn)物的顯色劑C為A、B的交聯(lián)劑，C具有連接A和B的雙功能化學(xué)試劑為彌補上述的不足本專利采用靶向探針的技術(shù)在比較短的時間內(nèi)通過微量級檢測達到定量與半定量的檢測效果。無論是干法還是濕法在測試卡的制備上方法簡便成本低廉，檢測手段簡易可行，使用效率高，可為常規(guī)比色法提高效率30倍，即每10-20分鐘內(nèi)可完成30人次檢測。如每人次檢測3個指標(biāo)則90個測試數(shù)據(jù)的高效率為本方法檢測血液中總膽固醇，高低密度脂蛋白的測試手段。
發(fā)明的目的在步入老齡化的人群中，與高脂血、高膽固醇相關(guān)的疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病、腎綜合癥等等，嚴(yán)重危害人們的健康，成為中老年人群中的常見病和多發(fā)病。在1994年美國醫(yī)學(xué)學(xué)會雜志中文版第73卷第3期中指出“國家膽固醇教育規(guī)劃關(guān)于成年人高膽固醇血癥的檢測評估和治療的第二次專項調(diào)查報告”一文中指出；應(yīng)繼續(xù)把低密度脂蛋白視為降低膽固醇的主要目標(biāo)?？梢姼吣懝檀佳Y、低密度脂蛋白的升高是全球關(guān)注的中老年病的危險因素之一，波及面甚廣。為方便中老年人掌握自己的健康，隨時了解治療效果解脫病人看病難、檢測取血量大的困難與病人痛苦，減少病人交叉感染的機會，提高臨床檢測效率則是當(dāng)前急待解決的問題。
為此，本發(fā)明所涉及的技術(shù)及內(nèi)容具有先進性、新穎性，除了能滿足上述要求外，更能為高脂血病人配合醫(yī)務(wù)人員進行飲食治療或藥物治療提供及時的證據(jù)。
發(fā)明的內(nèi)容及方案靶向探針技術(shù)是指該技術(shù)能夠靶向脂蛋白膽固醇酯探測膽固醇，以呈色反應(yīng)顯示血脂濃度的一種技術(shù)，該技術(shù)的實現(xiàn)與制備靶向探針的包被原料及其DRV特性悉悉相關(guān)。即當(dāng)高脂血清與靶向探針相接觸的瞬間，在高濃度膽酸鹽和磷酸鹽的介導(dǎo)下，所完成的脂蛋白膽固醇酯與靶向探針之間疏水基團相互作用過程，過程中脂蛋白膽固醇酯在系列酶的作用下完成并實現(xiàn)了酶促反應(yīng)終產(chǎn)物與探針之間的顯色反應(yīng)。色度的深淺顯示脂蛋白膽固醇含量的高低。
該靶向探針在指示血脂濃度時具有三個特異性結(jié)合過程1、血清中只有脂蛋白膽固醇酯能夠與靶向探針快速結(jié)合；2、被結(jié)合的脂蛋白膽固醇酯能特異性的與系列酶發(fā)生酶促反應(yīng)；3、酶促反應(yīng)的終產(chǎn)物與其能呈選擇結(jié)合的染料結(jié)合并呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，避免了外界環(huán)境的干擾，見圖1、圖2。
優(yōu)點及效果是將靶向探針的完整結(jié)構(gòu)固相于紙片上成為干法的紙卡，以及固相于測定板上成為濕法的測定板為主要技術(shù)路線。是屬領(lǐng)先技術(shù)，亦是填補空白技術(shù)。她區(qū)別于常量的比色法亦區(qū)別于微量的免疫技術(shù)測試卡以及用聚脂和聚胺浸沾的紙卡。
該技術(shù)的特點是將已制備好的能靶向脂蛋白膽固醇酯并能探測膽固醇的探針這樣一個完整結(jié)構(gòu)固相于國產(chǎn)定量濾紙片上或測試板上，靶向探針的制備過程不涉及到化學(xué)反應(yīng)，而血清中脂蛋白膽固醇酯與靶向探針?biāo)尸F(xiàn)的顏色反應(yīng)則純屬生物化學(xué)領(lǐng)域中分子之間的反應(yīng)。她即能方便存放，又能達到保護檢測試劑的良好效果。測試卡及測定板的特點及優(yōu)點是1、體積小輕便，便于存放及攜帶；2、無試劑外溢，不污染環(huán)境；3、使用方便，簡化操作手續(xù)，適于臨床檢測及家用測試；4、本方法(干、濕法)屬微量測定，三個測試指標(biāo)需6-50微升指血，檢測時需血量少，減少病人痛苦及交叉感染的機會；5、測程短效果高，每人次需時10-20分鐘(干法)單位時間內(nèi)濕法比常規(guī)法提高約30倍的效率；6、該方法中干法可為醫(yī)生提供保守治療和藥物治療的證據(jù)，適于家用。
實施例實施例1濕法可用于定量的靶向探針測定板的制備方法1、靶向探針的制備方法1.1探針組成于每平方厘米測定板加入31μl-100μl，含有下述試劑成份的混合液磷酸鹽 維持pH為7.7 0.04-0.09μmoL4氨基安替比林 0.07-0.20μmoL膽酸鈉鹽 0.42-0.93μmoL酚(重蒸的)0.49-1.09μmoL膽固醇脂肪酶 0.1160-0.2480I、U膽固醇氧化酶 0.0558-0.1240I、U過氧化物酶0.6975-1.5500I、U1.2、將1.1中所示探針內(nèi)含物與麥醇溶蛋白以E1cm280nm·1％近似于0.7的濃度按(3-1)∶(0.01-3)的比例逐滴混合于4-8℃低溫下，通過200γpm轉(zhuǎn)速的20分鐘攪拌，完成靶向探針的制備。控制乙醇濃度為10-40％。
1.3、取出上述靶向探針均勻的鋪到測定板上冷凍干燥完成固相制備。
1.4、探針?biāo)妙伾?氨基安替比林也可使用各種隱性顏料等如隱性孔雀緣，隱性結(jié)晶紫，熒光標(biāo)記物，放射性標(biāo)記物。
2、低密度脂蛋白沉淀片每平方厘米紙片上加入5μl-PVS(Polyvinylphyrolidonesolution)pH6-8，(PVP與磷酸緩沖液PBS的比為(5-10)∶100)混合沉淀劑冷凍干燥-10℃—-20℃。
3、高密度脂蛋白沉淀片每平方厘米紙片上加入10μl PTA(Phosphotungstie acid)和Mg與混合物，二者的比為9.7(m mol)∶0.4(mol)并冷凍干燥溫度為-70℃—-20℃。
4、紅血球過濾片采用國產(chǎn)微孔濾膜孔徑0.3—0.80μ，將指血滴到此濾片上，紅血球被隔到膜上，血清透過膜。
5、測試板的組裝分二部分5.1、分別將低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的沉淀片上各蓋一個0.3-0.80μ直徑的微孔濾膜，做為得到除掉低高密度脂蛋白的及紅血球的血清的裝置。
5.2、定量量取實施例5.1裝置所處理過的血清，溫度37℃5分鐘，于靶向探針測試板上。
5.3、處理過的血清樣品通過420-500nm濾光片進行比色測定與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比較確定血樣中脂蛋白含量。
6、測試卡及測試板上選用血清量為2-10μl血清。
實施例2干法半定量靶向探針測定卡的制備方法1、靶向探針制備方法同實施例1中的1.1和1.2，只不過在1.3中將濕法的測定板改成1平方厘米的國產(chǎn)定量濾紙紙片做為固定靶向探針的支持物。
2、低密度脂蛋白沉淀片制備方法同實施例1中23、高密度脂蛋白沉淀片制備方法同實施例1中34、紅血球過濾片制備方法同實施例1中45、測試卡的組裝實施例3靶向探針與兔紅細胞膜的親和作用按實施例1中制備的靶向探針與兔紅血球碎片于4℃溫度下或室溫下放置，可見到兔紅血球碎片與靶向探針的親和現(xiàn)象。
實施例4靶向探針的另一制備途徑按實施例1中取麥醇溶蛋白與戊二醛與熒光抗體的比例為(0.5-2.5)∶(0.5-5.0)∶(0.1-1.5)的比例進行順序逐滴混合后于室溫下放置2-4小時，完成標(biāo)記熒光抗體靶向相應(yīng)抗原的探針。


圖1靶向探針與血清脂蛋白膽固醇酯結(jié)合前照片(顯微鏡放大10×10)圖2靶向探針與血清脂蛋白膽固醇酯結(jié)合后照片(顯微鏡放大10×10)
權(quán)利要求
1.一種用靶向探針技術(shù)檢測高血脂血清的方法，其特征在于所述方法包括靶向探針的制備、低密度脂蛋白沉淀片、高密度脂蛋白沉淀片、紅血球過濾片選擇、測試板的組裝等；1)在每平方厘米測定板加入31μl-100μl試劑，此試劑為下述成份的混合液，磷酸鹽 維持pH為7.7 0.04-0.09μmoL4氨基安替比林0.07-0.20μmoL膽酸鈉鹽 0.42-0.93μmoL酚(重蒸的) 0.49-1.09μmoL膽固醇脂肪酶 0.1160-0.2480I、U膽固醇氧化酶 0.0558-0.1240I、U過氧化物酶 0.6975-1.5500I、U將上述探針內(nèi)含物與麥醇溶蛋白以E1cm280nm·1％為近似于0.7的濃度按(3-1)∶(0.01-3)的比例在4-8℃溫度下逐滴混合，然后在4-8℃溫度下用200γpm轉(zhuǎn)速攪拌20分鐘，完成靶向探針的制備；取出上述靶向探針物質(zhì)將其均勻的鋪到測定板或紙片上冷凍干燥，完成固相制備；2)低密度脂蛋白沉淀片的制備在每平方厘米紙片上加入5μlPVS(PolyVinylphyrolidoneSolution)(PVP與磷酸鹽緩沖液PBS混合沉淀劑)在-10℃—-20℃冷凍干燥；3)高密度脂蛋白沉淀片的制備在每平方厘米的紙片上加入10μlPTA(phosphotungstic acid)和Mg++混合物，在-10℃—-20℃下冷凍干燥；4)紅血球過濾片的選擇采用國產(chǎn)微孔濾膜孔徑在0.30-0.80μ做為血清透過膜；5)測試板的組裝分別將低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的沉淀紙片上各蓋一個0.3-0.8μ直徑的微孔濾膜，做為除掉低、高密度脂蛋白的及紅血球的血清的裝置；然后定量量取經(jīng)上述裝置處理過的血清放入在靶向探針測試板上溫育37℃5分鐘；將上述溫育后的血清于420-500nm濾光片下進行比色測定，測定后與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比較確定血樣中脂蛋白膽固醇的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1、1)中所述，其特征在于靶向探針內(nèi)含物與麥醇溶蛋白混合時乙醇濃度控制在10-40％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、3)中所述，其特征在于PVP與PBS的比為(5-10)∶100，pH6-8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向探針技術(shù)，其特征是適用于制備多種測試卡及測定板，例如測定血糖，尿糖等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向探針技術(shù)，其特征是適用于制備各種外敷貼片制劑，例如硝酸甘油貼片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向探針技術(shù)，其特征是適用于制備口服緩釋片劑及檢測用的藥物片劑。
全文摘要
一種用靶向探針技術(shù)檢測高血脂血清的方法靶向探針是通過探針包被物與血清中脂蛋白膽固醇酯之間在高鹽的介導(dǎo)實現(xiàn)的，疏水相互作用，探針與脂蛋白膽固醇酯的特異性結(jié)合完成的。之后在系列酶的作用下，酶促反應(yīng)終產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，呈色的深度顯示血脂的含量。本檢測分濕法及干法兩種，干法為半定量法適于家用，亦可為臨床治療手段提供證據(jù)。濕法為微量定量法，適于臨床化驗用。
文檔編號G01N33/49GK1114421SQ95104968
公開日1996年1月3日 申請日期1995年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月17日
發(fā)明者王素云 申請人:北京大學(xué)