專利名稱：：具有確定引入的標(biāo)志基團(tuán)和半抗原的低聚載體分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的結(jié)合物，它的制備方法以及這些結(jié)合物作為抗原在免疫學(xué)的檢證方法中或?qū)τ贒NA-診斷的應(yīng)用。在體液，特別是在人血清中免疫球旦白的檢證是應(yīng)用于微生物，特別是病素，如HIV(Humanlmmunodeficiencyvirus，人類免疫缺陷病毒即艾滋病病素)，肝炎病毒等的感染的診斷。特異的免疫球旦白在被檢查樣品中的存在一般是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)與這種特異免疫球旦白起反應(yīng)的抗原來(lái)證實(shí)，在試樣液體中測(cè)定特異免疫球旦白的方法必須是敏感的、可靠的、簡(jiǎn)單和迅速。另一個(gè)免疫學(xué)的方法是競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法，在這種方法中一個(gè)分析物的定性和定量的檢測(cè)可通過(guò)下述方法作到，即一個(gè)與這個(gè)分析物在免疫學(xué)上類似的半抗原和這個(gè)分析物來(lái)競(jìng)爭(zhēng)在一個(gè)受體上的，例如在一個(gè)抗體上的結(jié)合部位，分析物類似物在此一般是以標(biāo)志的形式或者是以在一個(gè)固體相上結(jié)合的形式來(lái)使用。最近幾年日益增多地發(fā)展了以非放射性的標(biāo)志基團(tuán)為基礎(chǔ)的檢證系統(tǒng)，在這些方法中分析物，例如一種特異抗體在被檢查試樣中的存在可以借助光學(xué)的(例如發(fā)光或熒光)，核磁共振-活性的或金屬-沉淀的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)確定。EP-A-O307149公開(kāi)了對(duì)于一個(gè)抗體的一個(gè)免疫試驗(yàn)，在這個(gè)試驗(yàn)中應(yīng)用兩個(gè)重組的多肽作為抗原，其中的一個(gè)是固定在一個(gè)固體相上，和另外一個(gè)攜帶一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)，為了提高檢證的特異性兩個(gè)重組抗原是擠壓在不同的生物體上。EP-A-366673公開(kāi)了在一個(gè)試樣中檢證抗體的一個(gè)方法，在此方法中一個(gè)抗體通過(guò)與一個(gè)提純的標(biāo)志抗原和與相同的提純抗原以一種固體相結(jié)合的形式反應(yīng)來(lái)證實(shí)。并公開(kāi)了例如以人的IgG作為抗原。EP-A-0386713說(shuō)明了一個(gè)抗HIV抗體的一個(gè)檢證方法，是應(yīng)用兩個(gè)固相載體，在兩個(gè)固相載體上固定了不同的HIV-抗原，分別與一個(gè)等分的試樣和一個(gè)標(biāo)志的HIV-抗原接觸，抗體的存在是通過(guò)在這些試驗(yàn)中至少有一個(gè)是陽(yáng)性反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證的。并公開(kāi)了以重組制出的多肽作為HIV-抗原。EP-A-0507586說(shuō)明了一個(gè)特異免疫球旦白免疫學(xué)試驗(yàn)的實(shí)施方法，即一個(gè)試樣與兩個(gè)能結(jié)合這個(gè)免疫球旦白的抗原接觸，其中一個(gè)抗原攜帶著一個(gè)能結(jié)合在一個(gè)固相載體上的基團(tuán)，另一個(gè)抗原攜帶著一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)。標(biāo)志基團(tuán)可以是一個(gè)直接的標(biāo)志基團(tuán)，例如一個(gè)酶，一個(gè)色素原，一個(gè)金屬粒子，或者也可以是一個(gè)間接的標(biāo)志基團(tuán)，亦即帶在抗原上的標(biāo)志基團(tuán)可以與一個(gè)該標(biāo)志基團(tuán)的受體起反應(yīng)，這個(gè)受體又?jǐn)y帶著一個(gè)產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán)。例如熒光素衍生物便是這樣一個(gè)間接的標(biāo)志基團(tuán)，它的受體是一個(gè)抗體，該抗體又與一個(gè)酶相結(jié)合。公開(kāi)的抗原有多肽，例如肝炎B-表面抗原，向這種抗原通過(guò)衍生化導(dǎo)入SH-基，熒光素便是與這些基團(tuán)相結(jié)合的。EP-A-0507587公開(kāi)了一個(gè)專門用以檢證IgM抗體的方法，即將試樣與一個(gè)針對(duì)待檢抗體的標(biāo)志抗原和與另一個(gè)同樣針對(duì)待檢抗體并可結(jié)合在一個(gè)固相上的抗原一起孵育。EP-A-0199804和EP-A-0580979公開(kāi)了一個(gè)免疫學(xué)檢證方法，是應(yīng)用用發(fā)光的金屬螯合物基團(tuán)，特別是用釕螯合物基團(tuán)和鋨螯合物基團(tuán)標(biāo)志的抗原。用免疫球旦白作為抗原，這些免疫球旦白是通過(guò)與活性金屬絡(luò)合物反應(yīng)隨機(jī)標(biāo)志的。EP-A-0178450公開(kāi)了金屬螯合物，特別是釕絡(luò)合物，在它上面可以結(jié)合上一個(gè)免疫活性物質(zhì)，例如抗體，這個(gè)結(jié)合是通過(guò)免疫反應(yīng)物質(zhì)與金屬螯合物的統(tǒng)計(jì)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。EP-A-0255534公開(kāi)了一個(gè)發(fā)光免疫測(cè)定法，是應(yīng)用一個(gè)結(jié)合了金屬螯合物的抗原或抗體。這種結(jié)合是通過(guò)例如一個(gè)金屬螯合物-活性酯衍生物與一個(gè)抗體的隨機(jī)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的。WO90/05301公開(kāi)了一個(gè)通過(guò)電化學(xué)發(fā)光的方法來(lái)檢證和定量測(cè)量分析物，是應(yīng)用發(fā)光的金屬螯合物結(jié)合在(i)一個(gè)加入的分析物，(ii)分析物的一個(gè)結(jié)合伙伴或(iii)一個(gè)反應(yīng)部分上，后者可以與(i)或(ii)結(jié)合。發(fā)光測(cè)量通過(guò)將金屬螯合物結(jié)合在激活的和必要時(shí)磁性的微粒上來(lái)完成的。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)水平已知的對(duì)于抗體的免疫學(xué)檢證方法通常是應(yīng)用多肽-抗原，這種多肽-抗原大多數(shù)是通過(guò)重組的DNA-方法來(lái)制備。然而在使用這種多肽-抗原時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。常常有可能是重組多肽只產(chǎn)生一種融合多肽的形式，它的融合部分在試驗(yàn)中可以導(dǎo)致錯(cuò)誤的陽(yáng)性結(jié)果。再者通過(guò)重組壓榨法產(chǎn)生的多肽的試樣液體中常常只有較小的穩(wěn)定性并且傾向于聚集。另一個(gè)缺點(diǎn)是標(biāo)志的基團(tuán)向這種多肽的導(dǎo)入常常是沒(méi)有選擇和再?gòu)?fù)制的可能。此外重組的多肽抗原的制備代價(jià)高，并且免疫學(xué)反應(yīng)在不同價(jià)格的重組多肽中可以出現(xiàn)較大的偏差。當(dāng)利用已知的抗原，應(yīng)用對(duì)敏感性和精確性要求極高的競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法來(lái)檢證濃度極小的分析物如雌(甾)二醇或睪(甾)醇時(shí)，尤其是當(dāng)應(yīng)用以電化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的檢證系統(tǒng)時(shí)，很難以達(dá)到所要求的檢證下限值。因此本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一個(gè)能夠用簡(jiǎn)單的和高效率的方式制備用于免疫試驗(yàn)的抗原的方法，使在現(xiàn)有技術(shù)狀況下所制備的已知抗原的缺點(diǎn)至少可以部分地排除。此外這種方法應(yīng)該能夠使標(biāo)志基團(tuán)選擇性地和可復(fù)制性地導(dǎo)入抗原中這個(gè)問(wèn)題通過(guò)結(jié)合物得到解決，它包含一個(gè)具有最多100個(gè)單體單元的聚合物載體，這個(gè)載體含有結(jié)合在反應(yīng)側(cè)基上的1-10個(gè)半抗原分子和1-10個(gè)標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)，其中單體單元是由氨基酸，核甙酸和肽的核酸選出。通過(guò)將本發(fā)明的結(jié)合物(含有1-10個(gè)半抗原分子和一定數(shù)目的標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán))作為抗原應(yīng)用在一個(gè)免疫學(xué)檢證方法中，使人驚異的是在與已知的單體和多體的抗原相比較，檢證下限值降低的同時(shí)可以達(dá)到一個(gè)明顯提高的敏感性和精確性。除此之外本發(fā)明的結(jié)合物可以很簡(jiǎn)單的方式通過(guò)固相合成。例如肽-固相合成而獲得。對(duì)此，單體單元，例如氨基酸衍生物，總是可以裝在預(yù)定的位置上，單體單元是與一個(gè)半抗原分子或與一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)或者與一個(gè)固體相結(jié)合基團(tuán)衍化出來(lái)的。此外在固相合成結(jié)束后在存在有帶有自由官能團(tuán)的單體的載體鏈部位可以附加選擇性的引入半抗原或標(biāo)志基團(tuán)或者是固體相結(jié)合基團(tuán)。因此將半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或者是固體相結(jié)合基團(tuán)準(zhǔn)確而又可復(fù)制地引入結(jié)合物已成為可能。在結(jié)合物上的單個(gè)基團(tuán)之間的距離可以準(zhǔn)確的確定和必需時(shí)也可以變化。通過(guò)對(duì)結(jié)合物上標(biāo)志基團(tuán)的距離的選擇可以使信號(hào)熄滅保持在極小。從而使信號(hào)的強(qiáng)度與標(biāo)志基團(tuán)的數(shù)目成正比增加。并且標(biāo)志基團(tuán)的一個(gè)確定的空間方向，例如在螺旋形的載體，有助于改善信號(hào)的強(qiáng)度。尤其是在螺旋載體，例如單股的或特別是雙股的核酸中，標(biāo)志基團(tuán)之間的距離則總計(jì)為3-6或/和13-16個(gè)單體單元。構(gòu)成結(jié)合物主鏈的聚合載體分子其長(zhǎng)度最大為100個(gè)單體單元優(yōu)選3-80個(gè)單體單元，特別優(yōu)選是5-60個(gè)單體單元。單體單元是由氨基酸，核甙酸和肽的核酸選出。優(yōu)選的是聚合載體包含一個(gè)由氨基酸構(gòu)成的肽鏈，優(yōu)選是一個(gè)直線的肽鏈。載體也可以包含一個(gè)由核甙酸或核甙酸類似物構(gòu)成的核酸鏈，在其反應(yīng)的側(cè)基上結(jié)合有半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或者固體相結(jié)合基團(tuán)。這種核酸鏈可以是單股的或者是雙股的。在雙股的核酸載體常常發(fā)現(xiàn)標(biāo)志基團(tuán)的信號(hào)強(qiáng)度提高，例如在熒光標(biāo)志基團(tuán)中量子收率改善。此外聚合載體可以由肽核酸(PNA)構(gòu)成。肽核酸包含一個(gè)聚酰胺主鏈，它由相同或不相同的下式單體單元構(gòu)成。(CH2)k-CHR-N[CO-(CH2)i-L]CH2-(CH2)m-NH-CO-，其中L是由氫，苯基，自然存在的核鹼和非自然存在的核鹼構(gòu)成的組中選出，R’是由氫和自然和非自然存在的氨基酸、優(yōu)選是α-氨基酸側(cè)鏈組中選出，k和m分別為0或1，i是獨(dú)立的0至5。半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)可以結(jié)合在肽核酸的核堿-或/和氨基酸側(cè)鏈上。肽核酸和它的制備在WO92/20703有說(shuō)明。在這里將其公開(kāi)內(nèi)容并入。在肽核酸情況下載體可以是單股或是雙股的。特別優(yōu)選的是帶有至少一個(gè)PNA-股，例如一個(gè)PNA-股和一個(gè)核酸股，例如一個(gè)DNA-股的雙股的載體。結(jié)合物含有1-10個(gè)半抗原分子，優(yōu)選1-6個(gè)半抗原分子和特別優(yōu)選的是1或2個(gè)半抗原分子。而半抗原優(yōu)選是具有100-2000Da分子量的免疫學(xué)反應(yīng)分子。這種半抗原分子以例如由藥理學(xué)活性物質(zhì)選出，例如抗生素，鴉片制劑，安非他明，巴比妥類，細(xì)胞抑制藥(例如慶大霉素，妥布霉素，萬(wàn)古霉素等)，撲熱息痛，水楊酸鹽，苯妥因，奎寧和奎寧衍生物，茶鹼等，激素和代謝產(chǎn)物如甾醇，膽酸，性激素(例如雌(甾)二醇，雌(甾)三醇，睪(甾)酮，黃體酮，孕烯醇酮和它們的衍生物)，腎上腺皮質(zhì)激素類(例如皮質(zhì)(甾)醇，皮質(zhì)(甾)酮，可的松和它們的衍生物)，卡烯內(nèi)酯和卡烯內(nèi)酯-甙(例如地高辛，地高辛配基，毒毛旋花子甙，蟾二烯羥酸內(nèi)酯等)，類甾醇皂甙配基，甾類生物堿，肽激素，股酐酸，甲狀腺激素(例如T3，T4)，神經(jīng)遞質(zhì)(例如5-羥色胺，膽鹼，γ一氨基丁酸)，維他命和介質(zhì)如前列腺素，白三烯(Lenkotrienen)，白內(nèi)二炔(Leuko-En-diinen)和凝血噁烷類。另一方面半抗原可以由免疫學(xué)反應(yīng)的肽抗原決定簇選出，它優(yōu)選有直至30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。這種肽抗原決定簇可以來(lái)自例如致病的生物，如細(xì)菌，病毒和原蟲(chóng)或者自體免疫抗原。例如這種免疫學(xué)反應(yīng)肽抗原決定簇可以來(lái)自病毒的抗原，如HIVI，HIVII或肝炎C-病毒(HCV)的氨基酸序列。除此之外半抗原也可以由具有一個(gè)長(zhǎng)度優(yōu)選至50個(gè)核甙酸的核酸中選出，這些核甙酸補(bǔ)充到核酸序列，這個(gè)核酸序列在試樣中應(yīng)該被檢證。半抗原也可以由具有一個(gè)長(zhǎng)度直至50個(gè)單體單元的肽核酸選出。此外本發(fā)明的結(jié)合物含有1-10個(gè)，優(yōu)選2-8個(gè)標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)。對(duì)于標(biāo)志基團(tuán)優(yōu)選的例子是發(fā)光的金屬螯合物和熒光標(biāo)志。對(duì)于固體相結(jié)合基團(tuán)優(yōu)選的例子是生物素和生物素類似物，如脫硫生物素和非米諾(Immino)生物素，它們可以與抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白完成一個(gè)特異反應(yīng)。半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)優(yōu)選通過(guò)反應(yīng)的氨側(cè)基或/和硫羥側(cè)基，特別優(yōu)選的是通過(guò)反應(yīng)的伯氨基側(cè)基結(jié)合在載體側(cè)鏈上。這種側(cè)基可以通過(guò)向載體鏈導(dǎo)入相應(yīng)的單體，例如氨基酸如細(xì)胞溶素，烏氨酸，羥(基)賴氨酸或半胱胺酸來(lái)制造。在本發(fā)明確定的實(shí)施形式中優(yōu)選的可以是，將一個(gè)間隔基導(dǎo)入到半抗原或標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)和載體鏈之間。間隔基優(yōu)選是易彎曲的和最好是有一個(gè)3-30個(gè)原子的鏈長(zhǎng)度，特別優(yōu)選的是間隔基含有親水的基團(tuán)，例如氧化烯-或/和羥基-側(cè)基。優(yōu)選的標(biāo)志基團(tuán)是發(fā)光的金屬螯合物，亦即能夠產(chǎn)生一個(gè)可以檢證的發(fā)光反應(yīng)的金屬螯合物。這個(gè)發(fā)光反應(yīng)的檢證可以通過(guò)例如熒光-或通過(guò)電化學(xué)發(fā)光測(cè)量來(lái)完成。這種金屬螯合物的金屬是例如一個(gè)過(guò)渡金屬或者是一個(gè)稀土金屬。這種金屬優(yōu)選的是釕，鋨，錸，銥，銠，鉑，銦，鈀，鉬，锝，銅，鉻或鎢。特別優(yōu)選的是釕，銥，錸，鉻和鋨。最優(yōu)選的是釕。與金屬一起構(gòu)成金屬螯合物的配位體通常是多配位基-配位體。亦即配位體具有多個(gè)配合位。多配位基配位體包括例如芳香族的和脂肪族的配位體。適合的芳香族的多配位基-配位體包含有芳香族雜環(huán)的配位體。優(yōu)選的芳香族雜環(huán)配位體是含N的多雜環(huán)例如聯(lián)吡啶，聯(lián)吡唑(Bipyrazy)，三聯(lián)吡啶和菲酚基。這種配位體可以包括例如取代基如烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，羧酸根，羧基醛，羧酰胺，氰基，氨基，羥基，亞氨基，羥基羰基，氨基羰基，脒，胍鹽，酰脲，含硫的基，含磷的基和N-羥基琥珀酰亞胺的羧酸酯。優(yōu)選的配位體含有C2-C3-亞烷基氧基，C2-C3-亞烷基硫基和C2-C3-亞烷基氨基，特別是亞乙基氧基。螯合物也可以含有一個(gè)或多個(gè)單配位基-配位體。單配位基配位體的例子包括一氧化碳，氰化物，異氰化物，鹵化物，和脂肪族的，芳香族的和雜環(huán)的膦，胺，芪和胂。特別優(yōu)選的發(fā)光金屬螯合物是由具有聯(lián)吡啶或菲酚基的配位體的金屬螯合物選出。適合的金屬螯合物的例子和它的制備是在EP-A-017450，EP-A-0255534，EP-A-0580979和WO90/05301有所說(shuō)明。在此引入這些公開(kāi)。最優(yōu)選的金屬螯合物是釕-(聯(lián)吡啶)3-螯合物。這種螯合物可以活性酯衍生物的形式在商業(yè)市場(chǎng)上得到，例如從IgenInc.(Rockville，MD，USA)。在應(yīng)用一個(gè)可通過(guò)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢證的發(fā)光的金屬配合體作為標(biāo)志基團(tuán)時(shí)，至少將一個(gè)陽(yáng)性或/和陰性電荷載體，例如氨基或羧酸根基團(tuán)，引入到載體鏈或/和引入到金屬配合體和載體鏈之間的間隔基表明是合適的。特別優(yōu)選的是載體鏈含有一個(gè)或多個(gè)陰性電荷，它可能是例如通過(guò)在合成過(guò)程中引入谷氨酸或天冬氨酸產(chǎn)生的。并且在其它的標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)，例如熒光基團(tuán)或生物素中，向載體鏈或/和向間隔基引入電荷載體是優(yōu)選的。對(duì)于優(yōu)選的標(biāo)志基團(tuán)的另一個(gè)例子是熒光標(biāo)志，如熒光素，香豆素，若丹明，試鹵靈，花香和它們的衍生物。在應(yīng)用發(fā)熒光的標(biāo)志基團(tuán)時(shí)載體主鏈為一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)證明是有利的，它固定熒光標(biāo)志基團(tuán)有關(guān)空間定位和距離以防止通過(guò)能量傳遞所致的熒光熄滅。對(duì)于產(chǎn)生一個(gè)適合的螺旋結(jié)構(gòu)的單體的例子是脯氨酸或者是帶有一個(gè)脯氨酸側(cè)基的肽核酸衍生物。本發(fā)明的結(jié)合物的制備是通過(guò)以下方法，即由單體單元在固相合成一個(gè)聚合載體，優(yōu)選肽載體，其中(a)在合成過(guò)程中將單體衍生物引入到載體的預(yù)定部位，單體衍生物與半抗原分子或/和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)共價(jià)結(jié)合；或/和(b)在合成后將活性的半抗原分子或/和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)結(jié)合在載體的反應(yīng)側(cè)基上。由本發(fā)明方法演變的改進(jìn)方法(a)是在固相合成時(shí)引入單體衍生物，它最好是通過(guò)堿性氨基酸如細(xì)胞溶素或?yàn)醢彼岬牟被鶄?cè)基或者是通過(guò)氨基酸如半胱氨酸的硫羥側(cè)基與半抗原分子或/和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。相應(yīng)的單體衍生物的制備例如可以通過(guò)將一個(gè)活性的半抗原分子或者一個(gè)活性的標(biāo)志基團(tuán)或者是固體相結(jié)合基團(tuán)，例如一個(gè)活性酯衍生物結(jié)合在一個(gè)自由的伯氨基上或者是將一個(gè)馬來(lái)酰亞胺衍生物結(jié)合在一個(gè)必要時(shí)是部分被保護(hù)的單體衍生物，例如氨基酸衍生物的一個(gè)自由硫羥基上來(lái)完成。在圖1中所示是一個(gè)優(yōu)選的結(jié)合了金屬螯合物的細(xì)胞溶素衍生物。在圖2所示是一個(gè)生物素化的細(xì)胞溶素衍生物?！盎钚怎ァ钡母拍畎幢景l(fā)明的意思包括活性酯基團(tuán)，它能與肽的自由氨基在這樣的條件下反應(yīng)，即沒(méi)有可能與肽的其它反應(yīng)基團(tuán)出現(xiàn)干擾的副反應(yīng)。優(yōu)選的是應(yīng)用N-羥基琥珀酰亞胺作為活性酯衍生物。除了N-羥基琥珀酰亞胺也可以應(yīng)用類似的p-硝基苯基-，五氟苯基-，咪唑基-或N-羥基苯并三唑基酯。適合引入低(聚)核苷酸載體中的半抗原-，標(biāo)志基團(tuán)-和固體相結(jié)合基團(tuán)衍生物的制備，在Theisen等發(fā)表的文章(TetrahedronLetter33(1992)，5033-5036)中舉例熒光染料5-羧基熒光素時(shí)有所說(shuō)明，該熒光染料被轉(zhuǎn)化成磷酰胺衍生物。這個(gè)磷酰胺衍生物可以引入到低(聚)核苷酸衍生物的5’-尾端或/和3’-尾端或者是引入到低(聚)核苷酸序列之內(nèi)。由本發(fā)明方法演變的改進(jìn)方法(b)是在用于固相合成的單體衍生物的保護(hù)基離解之后，最好是將引入基團(tuán)結(jié)合在載體的氨基-或/和硫羥-側(cè)基上，特別優(yōu)選的是結(jié)合在伯氨基側(cè)基上。優(yōu)選的是按改進(jìn)方法(a)引入半抗原和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)，亦即在固體相合成時(shí)應(yīng)用結(jié)合了待引入基團(tuán)的單體衍生物。例如發(fā)光的金屬螯合物，生物素或肽半抗原可以按照這種改進(jìn)方法順利地導(dǎo)入。然而在敏感的熒光染料或-標(biāo)志基團(tuán)或其它半抗原，如類固酮中，前面的方法有較小的優(yōu)越性，因?yàn)檫@些物質(zhì)通過(guò)在固相合成時(shí)控制的條件可以遭到破壞。在這種情況結(jié)合物的制備優(yōu)選是按照改進(jìn)方法(b)，即通過(guò)在完成了的載體分子上的補(bǔ)充結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。自然改進(jìn)方法(a)和(b)相結(jié)合是可能的。也可以按照改進(jìn)方法(b)即合成結(jié)束之后將兩個(gè)不同的基團(tuán)引入，例如一個(gè)半抗原和一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)或一個(gè)半抗原和一個(gè)固體相結(jié)合基團(tuán)。對(duì)此可以按改進(jìn)方法(b)例如這樣進(jìn)行，即第一個(gè)待引入的基團(tuán)結(jié)合在載體分子的氨基側(cè)基和第二個(gè)待引入的基團(tuán)結(jié)合在載體分子的硫羥側(cè)基。另一方面也可以將這二個(gè)待引入基團(tuán)分別選擇性地結(jié)合在載體的預(yù)定的伯氨基側(cè)基上，在此在載體的應(yīng)該與半抗原發(fā)生結(jié)合的部位，應(yīng)用一個(gè)帶有用于氨基側(cè)基的第一個(gè)保護(hù)基的單體衍生物，而在載體的應(yīng)該與標(biāo)志-或固體相結(jié)合基團(tuán)發(fā)生結(jié)合的部位，應(yīng)用一個(gè)帶有用于氫基側(cè)基的第二個(gè)保護(hù)基的單體衍生物，并且第一個(gè)和第二個(gè)保護(hù)基是這樣選擇的，即一個(gè)選擇性保護(hù)基的解離及其之后一個(gè)選擇性的結(jié)合能夠分在兩個(gè)反應(yīng)步驟完成。對(duì)此第一個(gè)和第二個(gè)保護(hù)基可以由酸不穩(wěn)定的氨基保護(hù)基，如BOC或酸穩(wěn)定的保護(hù)基，如苯乙?；x出。在按本發(fā)明的方法中具有所希望的單體序列的載體分子是在一個(gè)固體相制備。肽載體的制備優(yōu)選是用商業(yè)上的肽-合成設(shè)備(例如Applied生物系統(tǒng)設(shè)備A431或A433)。合成根據(jù)已知方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選是在應(yīng)用氨基酸衍生物的條件下由肽的羧基末端開(kāi)始。優(yōu)選使用氨基酸衍生物，它們用于結(jié)合所需要的氨基-端基是與芴基甲基羥基羰基(Fmoc)-殘基衍化了的。加入的氨基酸的反應(yīng)側(cè)基含有保護(hù)基，它們?cè)陔暮铣山Y(jié)束后可以順利的解離。對(duì)此優(yōu)選的例子是保護(hù)基，如三苯甲基(Trt.)，叔丁醚(TBu)，叔丁酯(OtBu)，叔丁氧基(BOC)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酸基(Pmc)或苯乙?；?。賴氨酸的殘基的或其它具有伯氨基側(cè)基的氨基酸衍生物的氨基側(cè)鏈，按改進(jìn)方法(a)與待引入的基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。所提及的伯氨基側(cè)基位于肽的部位，在這個(gè)部位應(yīng)該引入一個(gè)半抗原或一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)。除了20種天然的氨基酸之外肽還可以包含人工的氨基酸，如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸，正亮氨酸或?yàn)醢彼?。這些人工的氨基酸是與天然氨基酸類似以被保護(hù)的形式用于合成。按本發(fā)明方法的改進(jìn)方法(b)在合成結(jié)束后半抗原或標(biāo)志的引入是通過(guò)肽的保護(hù)基解離之后與所期望的活性基團(tuán)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，這個(gè)活性基團(tuán)與肽的自由的伯氨基反應(yīng)。每一個(gè)自由伯氨基優(yōu)選是加入1.5至4當(dāng)量的活性酯。然后將反應(yīng)產(chǎn)物提純，優(yōu)選是通過(guò)高壓液體色譜法(HPLC)。兩個(gè)不同活性基團(tuán)的引入是按照改進(jìn)方法(b)通過(guò)應(yīng)用兩個(gè)如上述的選擇性解離的保護(hù)基完成的。結(jié)合物的肽主鏈上占有一個(gè)非免疫反應(yīng)的氨基酸序列，亦即一個(gè)氨基酸序列，在結(jié)合物作為抗原用于預(yù)定的免疫學(xué)檢證方法時(shí)不影響試驗(yàn)的進(jìn)行。另一方面載體分子的主鏈也可以由核苷酸或肽的核酸組成。一個(gè)低(聚)核苷酸載體分子的合成可以在一個(gè)商業(yè)的DNA-合成設(shè)備內(nèi)完成。半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)優(yōu)選是作為磷酰胺衍生物導(dǎo)入(Theisen等，Supra；應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystem)，應(yīng)用者公報(bào)(UserBulletin)67，F(xiàn)AMAmidite，1992年5月)或/和追加地結(jié)合在自由反應(yīng)的側(cè)基上。肽核酸基礎(chǔ)上的載體分子的合成是類似于固相肽合成，例如按照在WO92/20703中所說(shuō)明的方法。半抗原分子或標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)的導(dǎo)入可以用有關(guān)的對(duì)于肽-和低(聚)核苷酸載體所說(shuō)明的方法進(jìn)行。本發(fā)明的目的并且也是應(yīng)用結(jié)合物作為在免疫學(xué)方法中的抗原(當(dāng)半抗原分子是一個(gè)免疫反應(yīng)分子時(shí))或者用于DNA-診斷(當(dāng)半抗原是一個(gè)核酸時(shí))。含有多于1個(gè)半抗原分子的結(jié)合物可以在免疫學(xué)檢證方法中作為多半抗原來(lái)使用。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施形式是結(jié)合物在免疫學(xué)方法的應(yīng)用，此方法是用于確定在一個(gè)試液中的抗體。優(yōu)選是確定這些抗體，它們可以指明由微生物，如細(xì)菌，病毒或原蟲(chóng)，所致的感染。特別優(yōu)選的是確定針對(duì)病毒的抗體，例如針對(duì)愛(ài)滋病病毒(HIV)或肝炎病毒的抗體。試液最好是血清，特別優(yōu)選的是人血清。此外優(yōu)選的是本發(fā)明的結(jié)合物在免疫學(xué)方法中以橋試驗(yàn)形式使用。因此本發(fā)明的目的是一個(gè)免疫確定試液中特異抗體的方法，其特征在于，(a)試液與至少一個(gè)本發(fā)明的結(jié)合物一起孵育，該結(jié)合物是針對(duì)欲確定抗體的，(b)此抗體通過(guò)與肽結(jié)合可以證實(shí)。本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法實(shí)質(zhì)上可以根據(jù)任何已知的試驗(yàn)方式進(jìn)行，例如在一個(gè)均勻的有一個(gè)單一反應(yīng)相的免疫測(cè)定法或在一個(gè)不均勻的有多于一個(gè)反應(yīng)相的免疫測(cè)定法。優(yōu)選應(yīng)用一個(gè)不均勻的試驗(yàn)形式，在這種方法中固體相的出現(xiàn)可以證實(shí)抗體的存在。這種試驗(yàn)形式的一個(gè)實(shí)施形式是所謂的雙抗原-橋-試驗(yàn)方案。在這里試樣液與兩個(gè)針對(duì)欲檢測(cè)的抗體的抗原在反應(yīng)固相存在的情況下孵育，其中第一個(gè)抗原攜帶一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)和第二個(gè)抗原結(jié)合在固體相上或者以一個(gè)可以結(jié)合在固體相的形式存在。第一個(gè)或/和第二個(gè)抗原是一個(gè)本發(fā)明的結(jié)合物。在試液中欲檢測(cè)的抗體必要時(shí)在固相由孵育液分出后通過(guò)測(cè)定在固相中或/和在液相中的標(biāo)志來(lái)證實(shí)。優(yōu)選第一個(gè)抗原是一個(gè)用一種發(fā)光的金屬螯合物或一個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)志的結(jié)合物。第二個(gè)抗原最好是用生物素標(biāo)志的并且是可以結(jié)合在固體相上的，這個(gè)固體相是用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白涂層的。試驗(yàn)的進(jìn)行優(yōu)選是包括試液與第一個(gè)標(biāo)志的抗原和固相側(cè)的第二個(gè)抗原混合，以得到一個(gè)由第一個(gè)抗原，抗體和固相結(jié)合的第二個(gè)抗原構(gòu)成的標(biāo)志的、固定的配合體。橋試驗(yàn)形式與其它抗體檢證試驗(yàn)形式相比較不僅提高了敏感性，即它可以辨認(rèn)所有免疫球蛋白的類別，如IgG，IgM，IgA和IgE，而且也提高了特異性，即它減少了非特異性反應(yīng)。本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施形式涉及將結(jié)合物應(yīng)用在一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法。競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定一般是用于檢證低分子量的分析物，并且原則上可以以兩個(gè)試驗(yàn)形式進(jìn)行，即“標(biāo)記抗體”形式和“標(biāo)記類似物”形式。在“標(biāo)志抗體”形式中含有欲檢測(cè)的分析物的試液是試液用一個(gè)可以結(jié)合在固體相上的半抗原(它與分析物免疫學(xué)競(jìng)爭(zhēng))和一個(gè)標(biāo)志的、針對(duì)半抗原和分析物的受體(例如抗體)進(jìn)行標(biāo)志。在這種試驗(yàn)形式結(jié)合在固體相的標(biāo)志與分析物濃度成反比。在“標(biāo)志類似物”的形式中是將含有欲檢測(cè)分析物的試液用一個(gè)標(biāo)志的、與分析物免疫競(jìng)爭(zhēng)的半抗原和一個(gè)針對(duì)分析物和半抗原的受體(此受體可以結(jié)合在一個(gè)固體相上)一起孵育。結(jié)合在固體相上的標(biāo)志的半抗原的量是與自由的、待檢分析物的濃度成反比。因此本發(fā)明的目的是根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法的原則以“標(biāo)志類似物”的形式檢證在一個(gè)試液中分析物的方法，其特征在于，(a)試液在反應(yīng)固體相存在下與一個(gè)本發(fā)明的結(jié)合物(它含有一個(gè)標(biāo)志基團(tuán))和一個(gè)受體(它是結(jié)合在固體相上或者是可以結(jié)合在固體相上的并且它可以與分析物和結(jié)合物的半抗原成分發(fā)生一個(gè)特異的免疫學(xué)反應(yīng))一起孵育，(b)必要時(shí)固體相從孵育液分開(kāi)和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量通過(guò)測(cè)量在固體相或/和在孵育液中結(jié)合物的標(biāo)志部分來(lái)確定。優(yōu)選應(yīng)用一個(gè)含生物素的抗體或一個(gè)含生物素的抗體片段作為可以固定的受體和應(yīng)用一個(gè)用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白涂層的固體相作為反應(yīng)固體相。本發(fā)明另外一個(gè)目的是根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法的原則以“標(biāo)記抗體”的形式檢證試液中分析物的方法，其特征在于，(a)試液在反應(yīng)固體相存在下與一個(gè)本發(fā)明的結(jié)合物(它含有一個(gè)固體相結(jié)合基團(tuán))和一個(gè)受體(它攜帶一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)并且可以與分析物和結(jié)合物的半抗原部分發(fā)生一個(gè)特異的免疫學(xué)反應(yīng))一起孵育，(b)必要時(shí)固體相從孵育液分開(kāi)和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量是通過(guò)測(cè)量在固體相或/和在孵育液中受體的標(biāo)志部分來(lái)確定。優(yōu)選地是應(yīng)用一個(gè)含生物素的結(jié)合物和一個(gè)用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白涂層的固體相，優(yōu)選是應(yīng)用一個(gè)抗體或一個(gè)抗體片段作為標(biāo)志受體。發(fā)光的金屬螯合物基團(tuán)的檢證優(yōu)選是通過(guò)電化學(xué)發(fā)光來(lái)實(shí)現(xiàn)，在此發(fā)光的物體在一個(gè)電極表面以電化學(xué)方式產(chǎn)生。熒光的檢證可以定性或/和定量進(jìn)行。關(guān)于發(fā)光分析法進(jìn)行的實(shí)例在EP-A-0580979，WO90/05301，WO90/11511中和在WO92/14138中可以找到。在那里面公開(kāi)的用于發(fā)光分析法的方法和設(shè)備在此引入。在電化學(xué)發(fā)光分析法中的固體相優(yōu)選是由微粒組成，特別優(yōu)選的是磁性的微粒，它具有一個(gè)復(fù)蓋層，它與固體相側(cè)的第二個(gè)抗原相互作用。微粒優(yōu)選用抗生蛋白鏈菌素涂層。電化學(xué)發(fā)光-測(cè)量?jī)?yōu)選是在有金屬配合體的還原劑存在的情況下進(jìn)行，例如胺。優(yōu)選的是脂肪族胺，特別是伯，仲，叔的烷基胺，它們的烷基分別具有一至三個(gè)碳原子。特別優(yōu)選的是三丙胺。然而胺也可以是一個(gè)芳香胺，如苯胺或雜環(huán)胺。另外必要時(shí)可以存在一個(gè)非離子的表面活性劑作為活化劑，例如乙氧基化的酚。這種物質(zhì)例如在商業(yè)上以標(biāo)志為Triton×100或TritonN-401可以買到。另外發(fā)光的金屬螯合物的檢證也可以通過(guò)熒光實(shí)現(xiàn)，在此金屬螯合物通過(guò)合適的波長(zhǎng)的光的照射來(lái)激發(fā)并測(cè)量由此產(chǎn)生的熒光射線。有關(guān)熒光-分析法實(shí)施的例子在EP-A-0178450和EP-A-0255534中可以找到。這些公開(kāi)文章在此引入供參考。熒光基團(tuán)也如發(fā)光金屬螯合物一樣屬于本發(fā)明結(jié)合物的優(yōu)選的標(biāo)志基團(tuán)，其檢證可以如前所述用己知的方法通過(guò)激發(fā)和測(cè)量熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種免疫學(xué)試劑，它至少含有一個(gè)本發(fā)明的標(biāo)志的或可以結(jié)合固體相的結(jié)合物。用于按照雙抗原-橋試驗(yàn)原則進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定特異抗體的試劑含有(a)一個(gè)標(biāo)志的按本發(fā)明的結(jié)合物或/和(b)另外一個(gè)本發(fā)明的結(jié)合物，后者結(jié)合在固體相或者是以一個(gè)可以結(jié)合在固體相的形式存在。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法的原則用于確定一個(gè)分析物，更可取的是測(cè)定一個(gè)低分子量的分析物的試劑含有一個(gè)標(biāo)志的結(jié)合物(“標(biāo)記類似物”形式)或含有一個(gè)可以結(jié)合固體相的結(jié)合物(“標(biāo)記抗體”形式)，這個(gè)結(jié)合物與欲確定的分析物免疫學(xué)地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一個(gè)受體。優(yōu)選地，用于競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法的試劑空間上從本發(fā)明的結(jié)合物分開(kāi)，它含有或者一個(gè)標(biāo)志受體(“標(biāo)記抗體”形式)或者一個(gè)可以結(jié)合固體相的受體(“標(biāo)記類似物”形式)，該受體可以與欲確定的分析物和與本發(fā)明的結(jié)合物發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。通過(guò)以下實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作了進(jìn)一步說(shuō)明，圖1表示一種金屬螯合物-賴氨酸-衍生物，圖2表示一種生物素-賴氨酸衍生物，圖3表示按本發(fā)明的結(jié)合物，圖4表示對(duì)比結(jié)合物。實(shí)施例1金屬螯合物-賴氨酸-衍生物的制備6mmol按照EP-A-0580979的釕配合物釕(二吡啶)2(二吡啶-CO-N-羥基琥珀酰亞胺酯)加在50ml二甲基甲酰胺中使之溶解并且向其中滴加α-Fmoc-賴氨酸溶液。蒸去溶劑后將殘留物溶于少量丙酮中，與300ml氯仿混合和加熱至煮沸短時(shí)間。將溶劑分開(kāi)后得到如圖1所示的作為固體的化合物。實(shí)施例2金屬螯合物-標(biāo)志的和含生物素的肽的制備金屬螯合物-標(biāo)志肽或含生物類的肽是借助于芴基甲基氧基碳基-(Fmoc)-固相肽合成在一個(gè)批料肽合成器中制備的，例如應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)A431或A433中所敘。對(duì)此應(yīng)用表1中所示的氨基酸衍生物時(shí)每一種分別取4.0當(dāng)量。</tables>金屬螯合物基團(tuán)和生物素基團(tuán)向肽序列的導(dǎo)入是通過(guò)金屬螯合物基團(tuán)或生物素結(jié)合的氨基酸衍生物的直接引入來(lái)完成，例如在序列內(nèi)通過(guò)用金屬螯合物-活性酯ε-衍生物的賴氨酸殘基(圖1)或通過(guò)用生物素衍生的賴氨酸殘基(圖2)或N-末端通過(guò)應(yīng)用相應(yīng)的α-衍生的氨基酸殘基。氨基酸或氨基酸衍生物溶解在N-甲基-吡咯烷酮中。肽是在400-500mg4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-樹(shù)脂(四面體簡(jiǎn)訊(TetrahedronLetters)28(1987)，2107)用0.4-0.7mmol/g的負(fù)荷合成的(JACS95(1937)，1328)。結(jié)合反應(yīng)是涉及Fmoc-氨基酸衍生物與4當(dāng)量二環(huán)己基碳二亞胺和4當(dāng)量N-羥基苯并三唑在二甲基甲酰胺反應(yīng)介質(zhì)中在20分鐘時(shí)間進(jìn)行。在每一個(gè)合成步驟之后Fmoc-基團(tuán)用20％的哌啶在二甲基甲酰胺中在20分鐘被解離。肽由載體的釋放和酸不穩(wěn)定的保護(hù)基的解離是用20ml三氟醋酸，0.5ml乙二硫醇，1ml硫苯胺，1.5g酚和1ml水在室溫下40分鐘發(fā)生。反應(yīng)溶液隨即與300ml冷卻的二異丙醚混合和在0℃保持40分鐘以使肽完全沉淀、將沉淀物過(guò)濾，用二異丙醚再洗滌，用少量50％的醋酸溶解和冰凍干燥。得到的粗產(chǎn)物借助于制劑高壓液體色譜法(HPLC)在Delta-PAKRPC18-材料上(柱50×300mm，100，15μ)通過(guò)一個(gè)相應(yīng)的梯度(洗脫液A水，0.1％三氟醋酸，洗脫液B乙腈，0.1％三氟醋酸)在約120分鐘的時(shí)間內(nèi)提純，洗提物的同一性用離子流-質(zhì)譜分析測(cè)試。酸穩(wěn)定的苯乙酰保護(hù)基的移去是用固定的或可溶的青霉素G-酰胺酶在具有有機(jī)溶劑成分的水溶液中在室溫下酶促發(fā)生的。實(shí)施例3與半抗原結(jié)合金屬螯合物標(biāo)志的或含生物素的肽在二甲基甲酰胺中溶解和對(duì)于肽的能夠結(jié)合的部位(例如賴氨酸的氨側(cè)基)總是稍稍過(guò)量(約30％)地加入激活了的半抗原(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)。在室溫下攪拌1小時(shí)，在高度真空中將溶劑除去并將肽通過(guò)制劑高壓液體色譜法提純。在應(yīng)用圖I所示的金屬螯合物-賴氨酸-衍生物作為標(biāo)志基團(tuán)和雌(甾)二醇作為半抗原時(shí)結(jié)合物是以下面的結(jié)構(gòu)制備的IAcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)UEUK(E2)-NH2IIAcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)U-NH2結(jié)合物1在圖3示出，肽鏈的氨基末端是被乙?；?AC)保護(hù)。羧基末端是作為酰胺基存在。金屬螯合物-和半抗原分子分別通過(guò)賴氨酸的ε-氨基側(cè)基結(jié)合在肽鏈。以類似的方法應(yīng)用睪(甾)酮作為半抗原分子合成了具有結(jié)合物I的序列的結(jié)合物。制出的結(jié)合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)1H-NMR(500MHz)檢查和證實(shí)。實(shí)施例4血清中雌(甾)二醇的測(cè)定為了檢測(cè)人血清中雌(甾)二醇根據(jù)“標(biāo)記類似物”形式進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)的二步-測(cè)定法。為此90μl溶液1(0.69nmol/l本發(fā)明的結(jié)合物I(圖3)或1.68nmol/l對(duì)比結(jié)合物(圖4)，分別在50nmol/l4-嗎啉乙磺酸(MES)，pH6.8，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Thesit，0.01甲基異噻唑，0.1％Oxypyrion，30ng/ml分離試劑二氫睪酮中)與50μl試樣(血清試樣或雌(甾)二醇標(biāo)準(zhǔn))在一個(gè)聚苯乙烯容器中在37℃孵育10分鐘。隨后陸續(xù)加入90μl溶液2(0.7μg/ml或1.4μg生物素和多克隆的抗-雌(甾)二醇-免-抗原結(jié)合分段(Fab’)的結(jié)合物在50mmol/lMES-緩沖液pH6.0中)和50μl顆粒懸浮液(720μg/ml抗生蛋白鏈菌素涂層的磁性激粒，F(xiàn)a.Dynal)。在37℃繼續(xù)孵育10分鐘后將150μl的混合物移到一個(gè)測(cè)量小室中。在那里在電極表面發(fā)生顆粒微粒和在它上面附著的釕標(biāo)志物的磁性濃縮和在28℃檢查到一個(gè)電化學(xué)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在表2顯示的試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的結(jié)合物與對(duì)比結(jié)合物相比較在敏感性和檢證下限方面明顯改善了試驗(yàn)效果。權(quán)利要求1.結(jié)合物，含有一個(gè)具有最多至100個(gè)單體單元的聚合載體，此載體含有結(jié)合在反應(yīng)側(cè)基上的1-10個(gè)半抗原分子和1-10個(gè)標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)，其中單體單元是由氨基酸，核苷酸，核苷酸類似物和肽的核酸選出。2.按權(quán)利要求1的結(jié)合物，其特征在于，聚合載體具有3-80個(gè)單體單元的長(zhǎng)度。3.按權(quán)利要求1或2的結(jié)合物，其特征在于，聚合載體具有5-60個(gè)單體單元的長(zhǎng)度。4.按前述權(quán)利要求中之一的結(jié)合物，其特征在于，它含有1-6個(gè)半抗原分子。5.按前述權(quán)利要求中之一的結(jié)合物，其特征在于，它含有2-8個(gè)標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)。6.按前述權(quán)利要求中之一的結(jié)合物，其特征在于，聚合載體含有一個(gè)由氨基酸構(gòu)成的肽鏈。7.按權(quán)利要求1-5中之一的結(jié)合物，其特征在于，聚合載體含有一個(gè)由核苷酸或/和核苷酸類似物構(gòu)成的鏈。8.按權(quán)利要求1-5中之一的結(jié)合物，其特征在于，聚合載體含有一個(gè)由肽核酸構(gòu)成的鏈。9.按權(quán)利要求7或8的結(jié)合物，其特征在于，聚合載體是作為雙股存在。10.按權(quán)利要求9的結(jié)合物，其特征在于，雙股至少有一個(gè)鏈含有肽核酸。11.按前述權(quán)利要求中之一的結(jié)合物，其特征在于，半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)是通過(guò)反應(yīng)的氨基側(cè)基或/和硫羥側(cè)基結(jié)合在聚合載體上。12.按前述權(quán)利要求中之一的結(jié)合物，其特征在于，它含有的標(biāo)志基團(tuán)是由發(fā)光的金屬螯合物或熒光基團(tuán)選出的。13.按權(quán)利要求1至11中之一的結(jié)合物，其特征在于，它含有的固體相結(jié)合基團(tuán)是由生物素和生物素類似物選出的。14.按權(quán)利要求12的結(jié)合物，其特征在于，標(biāo)志基團(tuán)是發(fā)光的金屬螯合物并且聚合載體至少含有一個(gè)陽(yáng)性的或/和陰性的電荷載體。15.按權(quán)利要求12的結(jié)合物，其特征在于，標(biāo)志基團(tuán)是熒光基團(tuán)，聚合載體顯示一個(gè)基本上螺旋形的結(jié)構(gòu)。16.按前述權(quán)利要求中之一的結(jié)合物，其特征在于，半抗原是一個(gè)免疫學(xué)反應(yīng)分子，其分子量≤2000Da。17.按權(quán)利要求16的結(jié)合物，其特征在于，半抗原是由藥理學(xué)生物活性物質(zhì)，激素，代謝產(chǎn)物，維他命，介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)選出。18.按權(quán)利要求1至15中之一的結(jié)合物，其特征在于，半抗原是由免疫學(xué)反應(yīng)的肽抗原決定簇選出，它具有直至30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。19.按權(quán)利要求1至15中之一的結(jié)合物，其特征在于，半抗原是由具有長(zhǎng)度直至50個(gè)核苷酸的核酸選出。20.按權(quán)利要求1至15中之一的結(jié)合物，其特征在于，半抗原是由具有長(zhǎng)度至50個(gè)單體單元的肽核酸選出。21.按權(quán)利要求1至20中之一的結(jié)合物的制備方法，其特征在于，聚合載體是由單體單元在固體相上合成，其中(a)當(dāng)合成時(shí)單體衍生物引入載體的預(yù)定的部位，單體衍生物是與半抗原分子或/和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，或/和(b)合成后激活了的半抗原分子或/和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)結(jié)合在載體的反應(yīng)側(cè)基上。22.按權(quán)利要求21的方法，其特征在于，肽載體是由氨基酸衍生物合成。23.按權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于，在其改進(jìn)方法(a)中半抗原分子或/和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)總是結(jié)合在單體衍生物的伯氨基或硫羥基上。24.按權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于，在其改進(jìn)方法(b)中在載體的氨基側(cè)基或/和硫羥側(cè)基的結(jié)合是在用于固體相合成的單體衍生物的保護(hù)基解離之后發(fā)生。25.按權(quán)利要求21，22或24的方法，其特征在于，在改進(jìn)方法(b)中的合成之后半抗原分子和標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)結(jié)合在載體的伯氨基側(cè)基上，其中在載體的應(yīng)該與半抗原分子發(fā)生結(jié)合的部位，是應(yīng)用了一個(gè)具有用于氨基側(cè)基的第一個(gè)保護(hù)基的單體衍生物，和在載體的應(yīng)該與標(biāo)志基團(tuán)或固體相結(jié)合基團(tuán)發(fā)生結(jié)合的部位是應(yīng)用了一個(gè)具有用于氨基側(cè)基的第二個(gè)保護(hù)基的單體衍生物并且第一個(gè)和第二個(gè)保護(hù)基是這樣選出的，即選擇性的保護(hù)基解離是可能的。26.按權(quán)利要求25的方法，其特征在于，第一個(gè)和第二個(gè)保護(hù)基是由酸不穩(wěn)定的或酸穩(wěn)定的保護(hù)基選出。27.按權(quán)利要求1至20中之一的結(jié)合物用于在免疫學(xué)方法中作為抗原或用于核酸診斷。28.按權(quán)利要求27的應(yīng)用，其特征在于，將含有多于1個(gè)半抗原分子的結(jié)合物作為多半抗原用于免疫檢證方法。29.在競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法中按權(quán)利要求27或28的應(yīng)用。30.在檢證特異抗體的免疫測(cè)定法中按權(quán)利要求27或28的應(yīng)用。31.根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法原則以“標(biāo)記類似物”形式檢證試液中分析物的方法，其特征在于，(a)試液在反應(yīng)固體相存在下與一個(gè)按權(quán)利要求1至20中一項(xiàng)的結(jié)合物(它含有一個(gè)標(biāo)志基團(tuán))和一個(gè)受體(它是結(jié)合在固體相上或者是可以結(jié)合在固體相上并且它可以與分析物或者是結(jié)合物的半抗原成分發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng))一起孵育。(b)必要時(shí)固體相從孵育液分開(kāi)和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量通過(guò)測(cè)量在固體相或/和在孵育液中結(jié)合物的標(biāo)志部分來(lái)確定。32.按權(quán)利要求31的方法，其特征在于，是利用一個(gè)含生物素的抗體或一個(gè)含生物素的抗體片段作為受體，并且利用以抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白涂層的固體相。33.根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法原則以“標(biāo)記抗體”的形式檢證試液中分析物的方法，其特征在于，(a)試液在反應(yīng)固體相存在下與一個(gè)按權(quán)利要求1至20中的一項(xiàng)的結(jié)合物(它含有一個(gè)固體相結(jié)合基團(tuán))和一個(gè)受體(它攜帶一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)并且可以與分析物和結(jié)合物的半抗原成分發(fā)生一個(gè)特異的免疫學(xué)反應(yīng))一起孵育。(b)必要時(shí)固體相從孵育液分開(kāi)和(c)在試液中分析物的存在或/和它的量通過(guò)測(cè)量在固體相或/和在孵育液中受體的標(biāo)志部分來(lái)確定。34.按權(quán)利要求33的方法，其特征在于，應(yīng)用一個(gè)含生物素的結(jié)合物和一個(gè)用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白涂層的固體相。35.檢證試液中特異抗體的方法，其特征在于，(a)試液至少與一個(gè)按權(quán)利要求1至20中之一的結(jié)合物(這個(gè)結(jié)合物是針對(duì)欲確定的抗體的)一起孵育和(b)抗體通過(guò)與結(jié)合物結(jié)合而被證實(shí)。36.按權(quán)利要求35的方法，其特征在于，(a)試液在反應(yīng)固體相存在下和兩個(gè)針對(duì)欲確定的抗體的抗原一起孵育，其中第一個(gè)抗原攜帶一個(gè)標(biāo)志基團(tuán)和第二個(gè)抗原結(jié)合在固體相上或者以可以結(jié)合在固體相上的形式存在，(b)必要時(shí)固體相從孵育液分開(kāi)和(c)抗體的存在或/和它的量通過(guò)測(cè)定在固體相或/和在液體相中的標(biāo)志來(lái)證實(shí)，其中是用權(quán)利要求1至20中一項(xiàng)的結(jié)合物作為第一或/和第二個(gè)抗原。37.按權(quán)利要求36的方法，其特征在于，應(yīng)用一個(gè)用發(fā)光的金屬螯合物或者熒光基團(tuán)標(biāo)志的結(jié)合物作為第一種抗原。38.按權(quán)利要求36或37的方法，其特征在于，應(yīng)用一個(gè)含生物素的結(jié)合物和一個(gè)用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白涂層的固體相作為第二個(gè)抗原。全文摘要本發(fā)明涉及新的結(jié)合物，其制備方法以及該結(jié)合物作為抗原在免疫學(xué)的檢證法中或DNA-診斷中的應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/92GK1153555SQ95194279公開(kāi)日1997年7月2日申請(qǐng)日期1995年7月24日優(yōu)先權(quán)日1994年7月25日發(fā)明者H·P·約瑟爾,A·芬克,R·赫爾曼,E·霍斯,A·馬莎爾,C·塞德?tīng)柹暾?qǐng)人:伯倫格·曼海姆有限公司