專利名稱：：金屬螯合物標(biāo)記的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及金屬螯合物標(biāo)記的肽的制備方法、用此法制得的金屬螯合物標(biāo)記的肽，以及這些肽用于免疫檢查方法的用途。人體液、特別是人血清中免疫球蛋白的鑒別可用于診斷微生物感染，尤其是病毒如HIV，肝炎病毒等感染。鑒別在檢樣中特異免疫球蛋白的存在，常規(guī)的方法是與一種或多種抗原反應(yīng)，該抗原與特異的免疫球蛋白反應(yīng)。在檢液中特異的免疫球蛋白的測(cè)定方法應(yīng)靈敏、可靠、簡(jiǎn)便和快速。近年來，基于非放射性標(biāo)記基團(tuán)的鑒別系統(tǒng)的研制日益增多，該標(biāo)記基團(tuán)存在于檢樣如特異的抗體中，可經(jīng)光學(xué)(例如發(fā)光或熒光)、NMR或金屬沉淀等檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定之。EP-A-0307149公開了抗體的免疫試驗(yàn)，是用兩個(gè)重組的多肽作為抗原，其中一個(gè)肽鍵固定在固相上，另一肽鍵帶有標(biāo)記基團(tuán)，兩個(gè)重組的抗原于不同的有機(jī)體上實(shí)驗(yàn)，以提高鑒別的特異性。EP-A-0366673公布了鑒別檢樣中抗體的方法。是抗體與純化的、標(biāo)記的抗原反應(yīng)和在固相上結(jié)合的同樣純化的抗原反應(yīng)來鑒定的?？乖缡侨说腎gG。EP-A-0386713敘述了鑒別HIV抗體的方法，是用兩個(gè)固體載體，各種HIV抗原被免疫在兩個(gè)固體載體上，每個(gè)檢樣的等分液與標(biāo)記的HIV抗體接觸，若存在抗體，則因在至少一個(gè)檢樣上的陽性反應(yīng)而可檢出。該專利公布了用重組法制備的多肽作為HIV-抗原。EP-A-0507586敘述了對(duì)特異免疫球蛋白的免疫學(xué)檢查方法。此時(shí)檢樣與具有能與免疫球蛋白結(jié)合的兩個(gè)抗原相接觸，第一個(gè)抗原帶有結(jié)合于固體載體上的適宜的基團(tuán)，另一抗原帶有標(biāo)記基團(tuán)。標(biāo)記基團(tuán)可以是直接標(biāo)記基團(tuán)，例如酶，生色團(tuán)，金屬粒子，或是間接的標(biāo)記基團(tuán)，即在抗原上連接的標(biāo)記基團(tuán)可與該標(biāo)記基團(tuán)的受體反應(yīng)，而該標(biāo)記基團(tuán)又帶有產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán)。這類間接的標(biāo)記基團(tuán)的實(shí)例可提及螢光衍生物，其受體是一抗體，該抗體又與一酶偶聯(lián)。作為抗原公布的是多肽，如乙肝表面抗原。該抗原經(jīng)使SH基衍生化，與螢光素相偶聯(lián)。EP-A-0507587公布了鑒別IgM抗體的適宜的方法，檢樣與標(biāo)記抗原進(jìn)行溫育，該抗原指向要檢出的抗體，第二個(gè)抗體也指向要鑒別的抗體，它固定在固相上。EP-A-0199804和EP-A-0580979公布了免疫鑒別方法，所用的抗原是用螢光性的金屬螯合基團(tuán)，尤其是用釕和鋨螯合基進(jìn)行標(biāo)記。作為抗原用的是免疫球蛋白，它通過與活化的金屬配合物反應(yīng)而被標(biāo)記。EP-A-0178450公布了金屬螯合劑，特別是釕配合物，它可偶聯(lián)在免疫活性物質(zhì)如抗體上。該偶聯(lián)反應(yīng)是通過免疫活性物質(zhì)與金屬螯合劑的反應(yīng)而進(jìn)行的。EP-A-0255534公布了發(fā)光免疫測(cè)定法，它是用金屬螯合物偶聯(lián)的抗原或抗體。該偶聯(lián)反應(yīng)例如用金屬螯合物-活化酯衍生物與抗體反應(yīng)而成。WO90/05301公布了定量測(cè)定和鑒別的方法，是用電化學(xué)發(fā)光法，使用發(fā)光的金屬螯合物，后者可偶聯(lián)于(i)加入的檢樣上；(ii)檢樣的結(jié)合對(duì)應(yīng)物上或(iii)活性成分上，該活性成分與(i)或(ii)相連接。該發(fā)光測(cè)定是根據(jù)金屬螯合物結(jié)合在活化的和任選的磁性微粒上進(jìn)行的。本領(lǐng)域已知的免疫鑒別方法檢查抗體時(shí)，常規(guī)用多肽-抗原，大多由重組DNA方法產(chǎn)生。在加入這類多肽-抗原時(shí)，又可遇到問題。重組多肽通常只是以融合多肽形式而產(chǎn)生，該融合部分在檢測(cè)時(shí)可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而且重組表達(dá)生成的多肽在檢樣液中穩(wěn)定性很差，易于聚集。另一缺點(diǎn)是，這樣的多肽上的標(biāo)記基團(tuán)的引入常常無選擇性和再現(xiàn)性。此外，制備重組的多肽抗原價(jià)格很高，而且各種批號(hào)的重組多肽的免疫反應(yīng)性能有很大的波動(dòng)性?；谶@些問題，本發(fā)明提供了一種方法，是用一種簡(jiǎn)便的有效的方法制備用于免疫測(cè)定的抗原，此時(shí)，本領(lǐng)域已知的抗原的缺點(diǎn)至少部分地被克服了。此外，本方法也可以將標(biāo)記基團(tuán)選擇性地和再現(xiàn)性地引入到抗原上。該問題的解決是制題備出金屬螯合物標(biāo)記的肽，其特征是，在固相上合成所需的氨基酸序列，其中，(a)合成后，將活化的發(fā)光的金屬螯合物偶聯(lián)在肽的N-端伯氨基上，或/和(b)在合成當(dāng)中，在肽的至少一個(gè)位置上引入這樣的氨基酸衍生物，它與一發(fā)光的金屬螯合物-標(biāo)主基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵偶聯(lián)。本發(fā)明制備的肽優(yōu)選為最長(zhǎng)有50個(gè)氨基酸，尤其優(yōu)選為最多30個(gè)氨基酸，特別適宜于免疫鑒別，尤其是測(cè)定特異的免疫球蛋白。令人意外的發(fā)現(xiàn)是，本發(fā)明制備的肽類盡管存在有龐大的金屬螯合物-標(biāo)記基團(tuán)，但對(duì)于鑒別免疫球蛋白仍有很高的親和性和特異性。本發(fā)明方法可以選擇性地引入金屬螯合物-標(biāo)記基團(tuán)，無論在定位上，或是在數(shù)目上均有選擇性。本發(fā)明合成的肽有可能通過選擇性地建造金屬螯合物-標(biāo)記的氨基酸衍生物，而有目的地選擇在肽中的位置，在該位置上進(jìn)行標(biāo)記。用這種方法，免疫試驗(yàn)有較好的再現(xiàn)性和靈敏度。本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過使用肽-抗原，可以知道所有的抗體如IgG，IgM，IgE和IgA。用確定的小的、穩(wěn)定的、不易聚集的抗原進(jìn)行測(cè)定，出錯(cuò)率也是很小的。用本發(fā)明方法偶聯(lián)于肽上的金屬螯合物是發(fā)光的金屬螯合物，即產(chǎn)生可以檢查到的發(fā)光反應(yīng)的金屬螯合物。檢查這樣的發(fā)光反應(yīng)，例如可通過熒光測(cè)定或電化學(xué)發(fā)光測(cè)定而進(jìn)行。這類金屬螯合物的金屬例如是過渡金屬或稀土金屬，優(yōu)選的金屬是釕、鋨、錸、銥、銠、鉑、銦、鈀、鉬、锝、銅、鉻、鎢。尤其優(yōu)選的是釕、銥、錸和鋨，最優(yōu)選的是釕。與金屬結(jié)合成金屬螯合物的配體常規(guī)是多齒配體，即具有多個(gè)配基的配體。多齒配體包括例如芳香性和脂肪性配體。適宜的芳香族多齒配體有芳香族雜環(huán)配體。優(yōu)選的芳香族雜環(huán)配體是含氮的多雜環(huán)，如二吡啶、二吡唑、三聯(lián)吡啶和菲咯啉。這些配體可以包含有代表性的取代基，例如烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、羧根、羧基醛基、羧酰胺基、氰基、氨基、羥基、亞胺基、羥羰基、胺基羰基、脒基、胍基、脲基、含硫基團(tuán)，含磷基團(tuán)(以及N-羥基丁二酰亞胺的羧酸酯。該螯合物也可含有一個(gè)或多個(gè)單齒配體，例如單齒配體包括一氧化碳，氰化物，異氰化物，鹵化物，脂肪族、芳香族和雜環(huán)的膦、胺、和胂化物。特別優(yōu)選的發(fā)光金屬螯合物是選自聯(lián)吡啶和菲咯啉配體的金屬螯合物，例如適宜的金屬螯合物及其制法敘述于EP-A-0178450，EP-A-0255534，EP-A-0580979和WO90/05301。在此聲明，有關(guān)內(nèi)容并入本發(fā)明。最為優(yōu)選的金屬螯合物是釕-(聯(lián)吡啶)3-螯合物。該螯合物以活性酯衍生物形式可以買到，例如在Igen公司(美國(guó)Rockville，MD)。按照本發(fā)明方法(a)，在合成了所需的氨基酸序列后，經(jīng)肽的N-端伯氨基上與一種活化的金屬螯合物如金屬螯合物-活化酯衍生物的選擇性反應(yīng)，將金屬螯合物標(biāo)記基團(tuán)引入到肽上。該活化的金屬螯合劑的偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選發(fā)生在肽從固相上脫離之前和在肽合成中所用氨基酸活潑側(cè)鍵上的保護(hù)基去掉之前。本發(fā)明的(b)法是，在固相合成時(shí)引入已用共價(jià)鍵偶聯(lián)上發(fā)光的金屬螯合物-標(biāo)記基團(tuán)的氨基酸衍生物。金屬螯合物-標(biāo)記的基團(tuán)優(yōu)選偶聯(lián)在氨基上，尤其是氨基酸衍生物的伯氨基上。在合成中，若標(biāo)記基團(tuán)要引入到肽序列的氨基末端時(shí)，則金屬螯合物可偶聯(lián)在N-末端氨基酸的游離氨基上。若標(biāo)記基團(tuán)要引入到序列的中間，則金屬螯合物最好偶聯(lián)在某個(gè)氨基酸如賴氨酸或鳥氨酸的伯氨側(cè)基上。制備氨基酸-金屬合物-衍生物例如可將活化的金屬螯合物如金屬螯合物活潑酯衍生物偶聯(lián)在必要時(shí)部分被保護(hù)的氨基酸衍生物的游離伯氨基上。圖1是優(yōu)選的金屬螯合物偶聯(lián)的賴氨酸衍生物。本發(fā)明的“活潑酯”一詞包括活化酯基，它在這樣反應(yīng)條件下可以與肽的游離氨基反應(yīng)，而不致于與肽的其它有反應(yīng)活性的基團(tuán)發(fā)生干擾的副反應(yīng)。作為活潑酯衍生物優(yōu)選的實(shí)例是N-羥基丁二酰亞胺酯。除此之外，也可用對(duì)硝基苯基-、五氟苯基-、咪唑基-或N-羥基苯并三唑-酯。本發(fā)明方法具有所希望有的、氨基酸序列的肽是用固相、最好在市售的肽合成儀(例如A431或A433儀，AppliedBiosystems公司)上制備。該合成是按照已知方法進(jìn)行，優(yōu)選用氨基酸衍生物始自肽的羧基端。最好加入這樣的氨基酸衍生物，其在偶聯(lián)時(shí)所需的末端氨基被芴甲氧羰基-(Fmac)-基衍生化。加入的氨基酸的有反應(yīng)活性的側(cè)鍵有保護(hù)基，該保護(hù)基在肽合成完畢后不必再行裂解。優(yōu)選的保護(hù)基有如三苯甲基(Trt)，叔丁醚(tBu)，叔丁酯(OtBu)，叔丁氧羰基(Boc)或2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)。賴氨酸殘基的氨基酸側(cè)鏈或其它氨基酸衍生物的伯氨基側(cè)鏈-它出現(xiàn)在肽鏈上，且在其上應(yīng)引入一個(gè)標(biāo)記基團(tuán)-可按照方法(b)經(jīng)共價(jià)鍵將金屬螯合物偶聯(lián)。除20個(gè)天然氨基酸外，肽也可含有非天然氨基酸，如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸，正亮氨酸、或鳥氨酸。非天然氨基酸在合成中用類似于天然氨基酸方法，以被保護(hù)的形式使用。按本發(fā)明方法(a)，在合成完畢后，金屬螯合物標(biāo)記基的引入這樣進(jìn)行，將優(yōu)選固相結(jié)合的肽與所希望的活化金屬螯合物進(jìn)行反應(yīng)。該螯合物與肽的N-末端氨基酸的游離伯氨基反應(yīng)?；顫婖サ募尤肓渴敲慨?dāng)量游離伯氨基用1.5-4當(dāng)量。然后根據(jù)需要，將反應(yīng)產(chǎn)物自固相上裂解并將保護(hù)基裂解掉，再純化，優(yōu)選用HPLC法。若肽中仍含已用第二個(gè)保護(hù)基如苯乙酰基衍生化了的氨基，則在最后-步除去該保護(hù)基。苯乙?；Ｗo(hù)基的除去方法例如可用酶法、用固定化的或溶解性的青霉素G酰氨酶在室溫下，于帶有機(jī)溶劑含量的水溶液中進(jìn)行。本發(fā)明制備的肽若含有分子內(nèi)二硫橋鍵，則在合成完畢后、但在N-末端氨基酸殘基的Fmoc-保護(hù)基裂解之前，肽序列可用例如碘、于六氟異丙醇/二氯甲烷中、在固相上氧化(Kamber和HisKey于E.Gross和J.Meienhofer編，肽，學(xué)術(shù)出版社(TheDeptide，AcademiePress)，N.Y.1981，p.145～147)，然后再將N-端Fmoc-保護(hù)基裂解掉。所合成的肽優(yōu)選含有免疫學(xué)反應(yīng)活性的抗原決定基部分，即與抗體結(jié)合的肽序列，以及間隔基部分。在這種情況下，優(yōu)選至少一個(gè)金屬螯合物-標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)在間隔基部分上。在在其間隔基部位連結(jié)有標(biāo)記基團(tuán)的肽通常具有較好的免疫試驗(yàn)靈敏性。優(yōu)選具有1-10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的間隔基，其作用是起穩(wěn)定化和賦予溶解性的作用，因?yàn)樗须姾珊?或可形成氫鍵。此外，間隔基還可使多個(gè)例如高分子受體鍵合于金屬螯合物-標(biāo)記的肽的位阻上的過程從立體上變得容易。間隔基的氨基酸最好選自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、賴氨酸以及結(jié)構(gòu)式為NH2-[(CH2)nO]X-CH2-CH2COOH的化合物，式中n為2或3，X為1-10。此外，間隔基中至少部分地含有非天然性氨基酸是優(yōu)選的。間隔基優(yōu)選處于肽的氨基端和/或羧基端。優(yōu)選用本發(fā)明方法合成這樣的肽，它們含有的抗原決定部分來自病原有機(jī)體中，如細(xì)菌，病毒，原蟲或自家免疫抗原。免疫活性抗原決定部分最好來自病毒抗原，如HIV-I、HIV-II、HIV-O亞型或丙肝病毒(HCV)。HIV-I、HIV-II或HIV-O亞型抗原決定基最好選自gp32、gp41和gp120區(qū)域。HCV抗原決定基最好選自NS3，NS4或NS5的核/Env-區(qū)域或非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域。HIV-I、HIV-II或HIV-O亞型的氨基酰序裂尤其優(yōu)選自如下序列NNTRKSISIGPGRAFYT(I)NTTRSISIGPGRAFYT(II)IDIQEERRMRIGPGMAWYS(III)QARILAVERYLKDQQLLGIWGASG(IV)LGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS(V)KDQQLLGIWGSSGKL(VI)ALETLLQNQQLLSLW(VII)LSLWGCKGKLVCYTS(VIII)WGIRQLRARLLALETLLQN(IX)QAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWPNDSLT(X)或者它們的部分序列，但至少有6個(gè)、并最好至少有8個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。氨基酸序列I-III來自HIV-I的gp120一區(qū)，序列IV-IX來自HIV-I的gp-41區(qū)，序列X來自HIV-II的gp-32區(qū)。氨基酸序列I-X還可是序列原型SEQIDNo.1-SEQIDNo.10。序列V、VIII和X各含2個(gè)半脫氨酸，優(yōu)選以二硫化物橋鍵形式存在。該序列最好含于N-或/和C-末端的間隔基，如上面所定義的那樣，該間隔基攜帶有金屬螯合物-標(biāo)記基。在抗原決定基區(qū)內(nèi)部還可任選地有以標(biāo)記3的形式存在的賴氨酸殘基。HCV氨基酸序列的抗原決定基區(qū)優(yōu)選選自如下序列SRRFAQALPVWARPD(XI)PQDVKFPGGGQIVGGV(XII)EEASQHLPYIEQ(XIII)QKALGLLQT(XIV)SRGNHVSPTHYVPESDAA(XV)PQRKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGW(XVI)AWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPV(XVII)或它們的部分序列，長(zhǎng)度是至少6個(gè)、優(yōu)選至少8個(gè)氨基酸。序列XI來自HIV的NS5-區(qū)，序列XII和XVI來自核區(qū)，序列XIII、XIV和XV來自NS4區(qū)，序列XVII來自NS3區(qū)。氨基酸序列XI-XVII是序列原型SEQIDNo11到SEQIDNo.17。具有上述抗原決定基的肽優(yōu)選還含有攜帶金屬螯合物標(biāo)記基的間隔基部分。本發(fā)明的另一內(nèi)容是金屬螯合物標(biāo)記的肽，其長(zhǎng)度最大為50個(gè)氨基酸，優(yōu)選最大為30個(gè)，在氨基末端或/和氨基側(cè)鍵基上至少有1個(gè)發(fā)光的金屬螯合物，優(yōu)選是金屬螯合物-活潑酯衍生物，發(fā)光的金屬螯合物優(yōu)選為釕螯合物。本發(fā)明肽最好包含有免疫活性的抗原決定基區(qū)，它可與抗體如人血清反應(yīng)；還含有免疫非活性的間隔基區(qū)，其上至少帶有一個(gè)金屬螯合物標(biāo)記基。該間隔基最好連在末端氨基上，長(zhǎng)度為1-10個(gè)氨基酸?？乖瓫Q定區(qū)域最好來自HIV-I或HIV-II并包括其變異體的氨基酸序列，例如其亞型HIV0亞型的序列，并是氨基酸序列I-XVII或其部分序列中的一個(gè)。本發(fā)明還涉及金屬螯合物標(biāo)記的肽的用途，用作用于免疫法測(cè)定檢液中特異抗體的抗原。優(yōu)選確定的抗體是指示微生物感染，如某種細(xì)菌、病毒或原蟲感染的抗體。尤其優(yōu)選的是針對(duì)病毒的抗體，例如HIV或肝炎病毒的抗體。檢液優(yōu)選為血清，尤其是人血清。此外優(yōu)選的是，本發(fā)明金屬螯合物標(biāo)記的肽于免疫法中用于試劑盒。此外，本發(fā)明還涉及對(duì)檢液中特異抗體的免疫測(cè)定方法，其特征是，將檢液與針對(duì)欲測(cè)定的抗體的第一個(gè)標(biāo)記的抗原和如上面定義的金屬螯合物標(biāo)記的肽混和并溫育，抗體經(jīng)與肽鍵合而鑒定出。作為第一抗原優(yōu)選用具有釕、錸、銥或鋨螯合物標(biāo)記的肽。本發(fā)明的免疫測(cè)定方法可按照已知的試劑盒進(jìn)行，例如在均相的、具有單反應(yīng)相的免疫試驗(yàn)中、或在非均相的、具有多于一個(gè)反應(yīng)相的免疫試驗(yàn)中進(jìn)行。非均相的試劑盒優(yōu)選使用于固相存在下鑒別抗體的存在。該試劑盒的實(shí)施形式是所謂雙抗原-試劑盒。此時(shí)，檢液在固相存在下與第一和第二抗原溫育，第二抗原是針對(duì)所要測(cè)定的抗體，并且(a)與固相連接或(b)以可與固相結(jié)合的形式存在。檢液中待測(cè)定的抗體是經(jīng)測(cè)定固相中或/和液相中的標(biāo)記基團(tuán)而鑒定的。第二個(gè)抗原優(yōu)選用生物素標(biāo)記，并可與固相結(jié)合，后者用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白覆蓋。第二抗原優(yōu)選用生物素標(biāo)記的肽。試驗(yàn)方法優(yōu)選是將檢液和第一抗原和固相上的第二抗原混合，以得到由第一抗原、抗體和固相連接的第二抗原構(gòu)成的、標(biāo)記的固定配合物。與其他的試劑盒不同，本發(fā)明的試劑盒用于鑒別抗體時(shí)既提高了靈敏度，即所有的球蛋白家族如IgG、IgM、IgA和IgE均可鑒別出，也改善了特異性，即減少了非特異性反應(yīng)。雙抗原試劑盒的另一優(yōu)點(diǎn)是加入了固相結(jié)合的金屬螯合物標(biāo)記的肽作為抗原，可以減少抗體具有高滴度檢樣的假陰性危險(xiǎn)，是因?yàn)殂^效應(yīng)和提高了每個(gè)肽的標(biāo)記基團(tuán)的數(shù)目，優(yōu)選是2-10個(gè)標(biāo)記基團(tuán)。增加金屬螯合物-標(biāo)記基的數(shù)目導(dǎo)致了對(duì)受體的信號(hào)的放大作用，相對(duì)于用可直接檢出標(biāo)記基團(tuán)，改善了試驗(yàn)方法的鉤-靈敏性。最好是用電化學(xué)發(fā)光法鑒別發(fā)光的金屬螯合物，經(jīng)電化學(xué)作用，在電極的表面產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)。該發(fā)光作用可用定性法或(和)定量方法檢查。例如在EP-A-0580797，WO90/05301，WO90/11511和WO92/14138中敘述了發(fā)光試驗(yàn)法。那里公開的發(fā)光分析法及裝置在此聲明并入本發(fā)明。電化學(xué)發(fā)光分析法的固相最好是由微粒、尤其是磁性微粒組成，它構(gòu)成一層覆蓋層，它與固相上的第二個(gè)抗體相互作用。優(yōu)選的微粒是用抗生蛋白鏈菌素覆蓋。電化學(xué)發(fā)光測(cè)定最好是在有對(duì)金屬配合物是還原劑的物質(zhì)例如胺存在下進(jìn)行，優(yōu)選的是脂族胺，尤其是伯、仲、叔脂族胺，其烷基可有1-3個(gè)碳原子。尤其優(yōu)選的是三丙胺。還可以是芳胺，如苯胺或是雜環(huán)胺。此外，可任選有作為增強(qiáng)劑的非離子性表面活性劑，如乙氧基化苯酚。這樣的物質(zhì)例如可買到，名稱為TritonX100或TritonN-401。另一方面，也可用熒光的方法檢出發(fā)光的金屬螯合基，此時(shí)金屬螯合物用適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射，從而測(cè)定生成的熒光。例如在EP-A-0178450和EP-A-0255534中敘述了熒光測(cè)定。有關(guān)內(nèi)容在此聲明本發(fā)明。本發(fā)明的另一內(nèi)容是用于免疫測(cè)定特異抗體的試劑，它含有至少一種用本發(fā)明的金屬螯合物標(biāo)記的、能與待測(cè)定抗體反應(yīng)的肽。若該試劑用于雙抗原試劑盒，則它最好含有(a)螯合物標(biāo)記的肽，和(b)另一種與待測(cè)定的抗體反應(yīng)的抗原，它連接于一種固相上或處于可同固相結(jié)合的形式。本發(fā)明還涉及通式(Ia)或(Ib)的氨基酸衍生物。式中，R1為氫或陽離子基團(tuán)，例如一個(gè)堿金屬離子或銨離子，R2為氫或用于固相-肽合成的氨基保護(hù)基，R3為C1-C5烷基，Y為一種任意氨基酸的側(cè)鏈，MXn為發(fā)光的金屬螯合基，其中M被n個(gè)相同或不相同的配位體X螯合。通式Ia的氨基酸衍生物中，金屬螯合基MXn偶聯(lián)在氨基酸如賴氨酸或鳥氨酸的伯氨基上。在通式(Ib)的氨基酸衍生物中，金屬螯合基偶聯(lián)在一種任意的氨基酸如天然氨基酸或非天然氨基酸的α-氨基上，這些氨基任選帶有保護(hù)基。通式Ia的氨基酸衍生物可以引入到肽序列的內(nèi)部或末端。通式Ib的氨基酸衍生物中，只要基團(tuán)Y中不含有伯氨基，則該氨基酸僅引入到肽序列的N端上。金屬螯合基MXn優(yōu)選為結(jié)構(gòu)ML1L2L3，L1、L2和L3相同或不相同，每一個(gè)為含至少兩個(gè)含N雜環(huán)的配位體如聯(lián)吡啶或菲咯啉，該配位體之一任選經(jīng)間隔基偶聯(lián)于氨基酸的一個(gè)氨基上。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例是賴氨酸-釕螯合物(Fmoc-Lys(BPRu)-OH)，列于圖1。此外，本發(fā)明用如下的實(shí)施例、序列類型和圖加以說明。其中SEQIDNO.1自HIV-I的gp-120部分的抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.2自HIV-I的gp-120部分的另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.3自HIV-I，O亞類的gp-120部分的另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.4自HIV-I的gp-41部分的抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.5自HIV-I的gp-41部分的另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.6自HIV-I的gp-41部分的再另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.7自HIV-I、O亞類的gp-41部分的抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.8自HIV-I，O亞類的gp-41部分的另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.9自HIV-I，O亞類的gp-41部分的再另外一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.10自HIV-II的gp-32部分的一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.11自HCV的NS5-部分的一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.12自HCV的核心部分的一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.13自HCV的NS4-部分的一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.14自HCV的NS4-部分的另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.15自HCV的NS4-部分的再另外一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，SEQIDNO.16自HCV的核心部分的另一個(gè)抗原決定簇的氨基酸序列，和SEQIDNO.17自HCV的NS3-部分的抗原決定簇的氨基酸序列。圖1釕-(聯(lián)吡啶)3-偶聯(lián)的、并在α-氨基上保護(hù)的賴氨酸衍生物實(shí)施例1金屬螯合物標(biāo)記肽的制備金屬螯合物標(biāo)記肽是在例如AppliedBiosytemsA431或A433批處理式肽合成儀上借助芴甲氧羰基-(Fmoc)-固相肽合成而制備的。每4.0當(dāng)量在表1中所示的氨基酸衍生物使用于制備表1</tables>在方法(a)-在固相合成完畢后引入標(biāo)記基-中，在肽的N-端偶聯(lián)活化的BPRu-COOH。用賴氨酸衍生物K1為間隔部分，賴氨酸衍生物K2為抗原決定部分。按方法(b)，通過直接建造金屬螯合物偶聯(lián)的氨基酸衍生物，將金屬螯合物基團(tuán)引入到肽序列中。例如在序列內(nèi)部經(jīng)用金屬螯合物-活性酯ε-衍生化的賴氨酸殘基如賴氨酸衍生物K3(圖1)，或在N-末端用α-衍生化的氨基酸殘基來偶聯(lián)。氨基酸或氨基酸衍生物溶解于N-甲基吡咯烷酮中，在400-500mg4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧樹脂(TetrahedronLetters，28，(1987)2107)上構(gòu)建肽，載量為0.4-0.7mmol/g(JACS，95(1973)，1328)。偶聯(lián)反應(yīng)是用二甲基甲酰胺為反應(yīng)介質(zhì)、20分鐘內(nèi)，以Fmoc-氨基酸衍生物與4當(dāng)量二環(huán)己基碳二亞胺和4當(dāng)量N-羥基苯并三唑進(jìn)行的。每個(gè)合成步驟之后，F(xiàn)moc-基團(tuán)用含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液于20分鐘內(nèi)進(jìn)行裂解。肽序列中若存在半胱氨酸殘基時(shí)，合成完畢后，用碘在六氟異丙醇/二氯甲烷中直接在固相上進(jìn)行氧化。自載體上將肽游離下來、并裂解下酸敏感的保護(hù)基，是在室溫下40分鐘內(nèi)于20ml三氟乙酸、0.5ml乙二硫醇、1ml硫代茴香醚、1.5g苯酚和1ml水中進(jìn)行。然后將反應(yīng)液與300ml冷二異丙基醚混合，保持于0℃40分鐘，使肽完全沉出。濾集沉淀，用二異丙醚洗滌，溶解于50％醋酸后，凍干。得到的粗品用制備型HPLC于Delta-PAKRPC18-填充料(柱50×300mm，100，15μ)，梯度洗脫，洗脫液A水、0.1％三氟乙酸；洗脫液B乙腈，0.1％三氟乙酸，純化時(shí)間大約120分鐘。洗脫物質(zhì)的鑒別采用離子噴射質(zhì)譜法。按照方法(a)引入金屬螯合物標(biāo)記基時(shí)，是將相應(yīng)的活性酯衍生物偶聯(lián)在與載體連結(jié)的肽的N-末端氨基上。為此，將每1當(dāng)量伯氨基4當(dāng)量的BPRu-COOH用N-羥基苯并三唑/二環(huán)己基碳二亞胺活化，并于少量DMSO中溶解，于室溫下攪拌。反應(yīng)用分析型HPLC跟蹤。裂解掉載體后，產(chǎn)物用制備型HPLC純化。洗脫的產(chǎn)物用離子噴射質(zhì)譜鑒定。也可用方法(a)和(b)的組合法制備肽，即將金屬螯合物偶聯(lián)的氨基酸衍生物構(gòu)建到肽序列之中，裂解掉N-末端Fmoc-基，使游離的N-末端氨基與金屬螯合物-活性酯衍生物反應(yīng)。按照方法(b)，在固相合成期間，唯一地直接建造金屬螯合物偶聯(lián)的氨基酸衍生物，就不再必要再加入金屬螯合物-活化酯了。表2列出了由HIV-1或HIV-II的gp120，gp41和gp32區(qū)域制備的肽化合物。表2釕化的線型肽</tables>表3列出了由HCV的NS5、NS4和核心部分制備出的肽。表3釕化的線型肽生物素標(biāo)記的肽的制備或是在樹脂上N-末端的衍生物(生物素-活化酯)，或經(jīng)過生物素活潑酯-ε-衍生化的賴氨酸殘基(Fmoc-Lys(生物素)-OH)引入到序列中。實(shí)施例2用雙抗原測(cè)定時(shí)，將本發(fā)明的肽抗原與重組的多肽抗原作比較。本發(fā)明實(shí)施例中，釕化的肽抗原gp41/2(表2)與同樣序列的生物素化的肽抗原加以組合進(jìn)行測(cè)定。于比較實(shí)施例中，釕化的多肽-抗原重組gp41(Chang等，Science228(1985)，93-96)與同樣序列的生物素化的多肽抗原組合進(jìn)行測(cè)定。這些測(cè)定表明，重組的多肽抗原對(duì)陰性和陽性檢樣之間實(shí)際上沒有區(qū)別，而肽抗原有非常良好的區(qū)別。序列記錄(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱波林格曼海姆有限公司(B)街道散德菏非街116(C)城市曼海姆(D)國(guó)家德國(guó)(E)郵編68305(ii)登錄標(biāo)題金屬螯合物標(biāo)記的肽(iii)序列數(shù)17(iv)計(jì)算機(jī)讀取形式(A)數(shù)據(jù)載體軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.25(EPA)(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人免疫缺陷病毒I型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gpl20(xi)序列表示SEQIDNO1AsnAsnThrArgLysSerIleSerIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThr151015(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人免疫缺陷病毒I型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp120(xi)序列表示SEQIDNO2AsnThrThrArgSerIleSerIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThr151015(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人免疫缺陷病毒I型(B)來源亞型O(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp120(xi)序列表示SEQIDNO3IleAspIleGlnGluGluArgArgMetArgIleGlyProGlyMetAlaTrp151015TyrSer(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人免疫缺陷病毒I型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp41(xi)序列表示SEQIDNO4GlnAlaArgIleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeu151015GlyIleTrpGlyAlaSerGly20(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(C)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人體免疫缺陷病毒I型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp41(xi)序列表示SEQIDNO5LeuGlyIleTrpGlyCysSerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrp151015AsnAlaSerTrpSer20(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人體免疫缺陷病毒I型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp41(xi)序列表示SEQIDNO6LysAspGlnGlnLeuLeuGlyIleTrpGlySerSerGlyLysLeu151015(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(C)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人體免疫缺陷病毒I(B)來源O亞型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp41(xi)序列表示SEQIDNO7AlaLeuGluThrLeuLeuGlnAsnGlnGlnLeuLeuSerLeuTrp151015(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人體免疫缺陷病毒I型(B)來源亞型O(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp41(xi)序列表示SEQIDNO8LeuSerLeuTrpGlyCysLysGlyLysLeuValCysTyrThrSer151015(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人免疫缺陷病毒I型(B)來源亞型O(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp4l(xi)序列表示SEQIDNO9TrpGlyIleArgGlnLeuArgAlaArgLeuLeuAlaLeuGluThrLeuLeu151015GlnAsn(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(C)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物人體免疫缺陷病毒II型(viii)基因組位置(A)染色體/片段gp32(xi)序列表示SEQIDNO10GlnAlaGlnLeuAsnSerTrpGlyCysAlaPheArgGlnValCysHisThr151015ThrValProTrpProAsnAspSerLeuThr2025(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段NS5(xi)序列表示SEQIDNO11SerArgArgPheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArgProAsp151015(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段核心(xi)序列表示SEQIDNO12ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyGlyVal151015(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段NS4(xi)序列表示SEQIDNO13GluGluAlaSerGlnHisLeuProTyrIleGluGln1510(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(D)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段NS4(xi)序列表示SEQIDNO14GlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThr15(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(C)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段NS4(xi)序列表示SEQIDNO15SerArgGlyAsnHisValSerProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAla151015(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(C)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段核心(xi)序列表示SEQIDNO16ProGlnArgLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArgProGlnAspValLys151015PheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyValVal2025(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)性質(zhì)氨基酸(C)拓?fù)湫螤罹€型(ii)分子性質(zhì)肽(iii)前提無(vi)原始來源(A)有機(jī)物肝炎C病毒(viii)基因組位置(A)染色體/片段NS3(xi)序列表示SEQIDNO17AlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyr151015MetAsnThrProGlyLeuProVal202權(quán)利要求1.金屬螯合物標(biāo)記的肽的制備方法，其特征是，在固相上合成具有所希望有的氨基酸序列的肽，其中(a)在合成后，將活化了的發(fā)光的金屬螯合物偶聯(lián)在肽的N端伯氨基上，或/和(b)在合成中，在肽鏈的至少一個(gè)位置上引入共價(jià)偶聯(lián)了金屬螯合物標(biāo)記基團(tuán)的氨基酸衍生物。2.權(quán)利要求1的方法，其特征是，發(fā)光的金屬螯合物選自釕、錸、銥和鋨的螯合物。3.權(quán)利要求2的方法，其特征是，發(fā)光的金屬螯合物選自釕螯合物。4.權(quán)利要求1-3中一項(xiàng)的方法，其特征是，金屬螯合物的配位體選自芳香性雜環(huán)多齒配位體。5.權(quán)利要求4的方法，其特征是，配位體選自聯(lián)吡啶、聯(lián)吡唑、三吡啶和菲咯啉配位體。6.權(quán)利要求5的方法，其特征是，發(fā)光的金屬螯合物是選自釕(吡啶)3-螯合物。7.權(quán)利要求1的方法，其特征是，在方法(a)中，在肽自固相上裂解和保護(hù)基自活性的側(cè)鏈上去保護(hù)之前，將活性的金屬螯合物進(jìn)行偶聯(lián)。8.權(quán)利要求1的方法，其特征是，在方法(b)中，將金屬螯合物標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)在氨基酸衍生物的伯氨基上。9.權(quán)利要求1-8中一項(xiàng)的方法，其特征是，合成包含有免疫活性的抗原決定部分和間隔基部分的肽，在間隔基部分上至少偶聯(lián)了一個(gè)金屬螯合物標(biāo)記物。10.權(quán)利要求9的方法，其特征是，間隔基部分的長(zhǎng)度為1-10個(gè)氨基酸。11.權(quán)利要求9或10的方法，其特征是，間隔基部分在肽的氨基和/或羧基末端。12.權(quán)利要求9到11中一項(xiàng)的方法，其特征是，間隔基部分含有的氨基酸上有電荷或/和可形成氫鍵。13.權(quán)利要求9到12中一項(xiàng)的方法，其特征是，間隔基部分的氨基酸選自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、賴氨酸和如下結(jié)構(gòu)的化合物H2N-[(CH2)n-O]x-CH2-CH2-COOH式中，n為2或3，x為1到10。14.權(quán)利要求1到13中一項(xiàng)的方法，其特征是，合成這樣的肽，它含有免疫學(xué)活性的病毒抗原決定部分。15.權(quán)利要求14的方法，其特征是，合成這樣的肽，它的抗原決定部分選自HIV-I和HIV-II或HCV的氨基酸序列。16.權(quán)利要求15的方法，其特征是，抗原決定部分選自HIV-I和HIV-II的氨基酸序列NNTRKSISIGPGRAFYT(I)NTTRSISIGPGRAFYT(II)IDIQEERRMRIGPGMAWYS(III)QARILAVERYLKDQQLLGIWGASG(IV)LGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS(V)KDQQLLGIWGSSGKL(VI)ALETLLQNQQLLSLW(VII)LSLWGCKGKLVCYTS(VIII)WGIRQLRARLLALETLLQN(IX)QAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWPNDSLT(X)或上述序列的部分序列，其長(zhǎng)度至少有6個(gè)氨基酸。17.權(quán)利要求15的方法，其特征是，抗原決定部分選自HCV的氨基酸序列SRRFAQALPVWARPD(XI)PQDVKFPGGGQIVGGV(XII)EEASQHLPYIEQ(XIII)QKALGLLQT(XIV)SRGNHVSPTHYVPESDAA(XV)PQRKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGVV(XVI)AWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPV(XVII)或上述序列的部分序列，其長(zhǎng)度至少有6個(gè)氨基酸。18.金屬螯合物標(biāo)記的肽，其長(zhǎng)度最多為50個(gè)氨基酸，在其末端氨基或/和側(cè)鏈氨基上至少偶聯(lián)了一個(gè)發(fā)光的金屬螯合物。19.權(quán)利要求18的方法，其特征是，發(fā)光的金屬螯合物是釕螯合物。20.權(quán)利要求18或19的方法，其特征是，肽包含免疫活性的抗原決定部分和間隔基部分，該間隔基部分至少含有1個(gè)金屬螯合標(biāo)記物。21.權(quán)利要求20的方法，其特征是，間隔基部分處于肽的氨基或/和羧基末端。22.權(quán)利要求18到21中一項(xiàng)的方法，其特征是，抗原決定部分是來自HIV-I、HIV-II或HCV的氨基酸序列。23.權(quán)利要求22的方法，其特征是，抗原決定部分選自HIV-I和HIV-II的氨基酸序列，NNTRKSISIGPGRAFYT(I)NTTRSISIGPGRAFYT(II)IDIQEERRMRIGPGMAWYS(III)QARILAVERYLKDQQLLGIWGASG(IV)LGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS(V)KDQQLLGIWGSSGKL(VI)ALETLLQNQQLLSLW(VII)LSLWGCKGKLVCYTS(VIII)WGIRQLRARLLALETLLQN(IX)QAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWPNDSLT(X)或上述序列的部分序列，其長(zhǎng)度至少有6個(gè)氨基酸。24.權(quán)利要求22的方法，其特征是，抗原決定部分選自HCV的氨基酸序列SRRFAQALPVWARPD(XI)PQDVKFPGGGQIVGGV(XII)EEASQHLPYIEQ(XIII)QKALGLLQT(XIV)SRGNHVSPTHYVPESDAA(XV)PQRKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGVV(XVI)AWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPV(XVII)或上述序列的部分序列，其長(zhǎng)度至少有6個(gè)氨基酸。25.按照權(quán)利要求1-17的方法制備的或按照權(quán)利要求18-24的金屬螯合物標(biāo)記的肽的用途，在免疫方法中作為抗原用于測(cè)定檢液中的特異抗體。26.權(quán)利要求25的用途，用作免疫方法試劑盒中。27.用免疫方法測(cè)定檢液中特異抗體的方法，其特征是，將帶有針對(duì)待測(cè)定的抗體的第一標(biāo)記的抗原的檢液以及按照權(quán)利要求1-17的方法制備的金屬螯合物標(biāo)記的肽或按照權(quán)利要求18-24的肽溫育，抗體由于與肽結(jié)合而被檢出。28.權(quán)利要求27的方法，其特征是，作為第一抗原可以是用釕-、錸-、銥-或鋨螯合物標(biāo)記的肽。29.權(quán)利要求27或28的方法，其特征是，檢液在有固相的存在下，與第一抗原和第二抗原混合溫育，該抗原是針對(duì)待測(cè)定的抗體的，并且(a)結(jié)合于固相上，或(b)處于可與固相結(jié)合的形式，通過測(cè)定固相或/和液相中的標(biāo)記物，檢出待測(cè)定的抗體。30.權(quán)利要求29的方法，其特征是，作為第二抗原使用的是用生物素標(biāo)記的抗原和用抗生物鏈菌素或抗生物素蛋白覆蓋的固相。31.權(quán)利要求30的方法，其特征是，作為第二抗原使用的是用生物素標(biāo)記的肽。32.權(quán)利要求29-31的方法，其特征是，使用由磁性顆粒組成的固相。33.特異抗體免疫法測(cè)定的試劑，其特征是，它含有用金屬螯合物標(biāo)記的、與待測(cè)定抗體有反應(yīng)性的肽，該肽是由權(quán)利要求1-17中的一個(gè)方法制備的，或是在權(quán)利要求18-24中之一定義的金屬螯合物標(biāo)記的。34.權(quán)利要求33的試劑，其特征是，它含有(a)金屬螯合物標(biāo)記的、與待測(cè)定的抗體有反應(yīng)性的肽，(b)另一種與待測(cè)定的抗體有反應(yīng)性的抗原，它已與固相結(jié)合或以能與固相結(jié)合的形式存在。35.通式Ia和Ib的氨基酸衍生物，式中，R1為氫或一個(gè)陽離子基團(tuán)，R2為氫或用于固相肽合成的氨基酸保護(hù)基，R3為C1-C5亞烷基，Y為一個(gè)任意氨基酸的側(cè)鏈，MXn為發(fā)光的金屬螯合基，其中M被n個(gè)相同或不相同的配位體X螯合。全文摘要本發(fā)明涉及金屬螯合物標(biāo)記的肽抗原的制備方法，用此法制得的肽和它用于免疫鑒別的用途。文檔編號(hào)G01N33/68GK1161745SQ95194321公開日1997年10月8日申請(qǐng)日期1995年7月24日優(yōu)先權(quán)日1994年7月25日發(fā)明者C·塞德爾,U-H·威恩豪斯,E·霍斯申請(qǐng)人:伯倫格曼海姆有限公司