專利名稱：：肺結(jié)核快速檢驗試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肺結(jié)核快速檢驗試劑，更確切地說，本發(fā)明涉及一種包含已精確確定最低及最高陽性臨界值的顯示載體的肺結(jié)核快速檢驗試劑。傳統(tǒng)的肺結(jié)核檢驗方法包括細(xì)菌培養(yǎng)法和痰抹片檢查法，前者將痰樣品置于LowensteinJensenSlants試管中培養(yǎng)，歷時八周才能獲得最后結(jié)果，檢驗極為費時；而后者檢驗靈敏度低。目前最新的肺結(jié)核檢驗方法是血清檢驗法，例如，R.Maes(ClinWochenschr.1991；69696-709)使用抗原-60，并利用免疫連結(jié)酶法來測定血清中抗原-60的抗體并進(jìn)行定量；BenjaminRG等(Am.Rev.Respir.Dis.1982；1261013-6)使用抗原-5，并利用免疫連結(jié)酶法來測定血清中抗原-5的抗體；英國Omega公司利用38KD抗原制成免疫連結(jié)酶試劑盒；Kreatech公司利用KP-90抗原制成免疫連結(jié)酶試劑盒。雖然免疫連結(jié)酶法靈敏度高，但實驗耗時至少三小時以上，而且需用儀器判讀，不僅成本高，而且具有局限性。為克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，本發(fā)明提供一種肺結(jié)核快速檢驗試劑，該試劑包含一種已精確確定最低及最高陽性臨界值的顯示載體，用該試劑檢驗肺結(jié)核靈敏度高，且快速省時。本發(fā)明的一種肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于該試劑包含(I)一種已精確確定最低及最高陽性臨界值的顯示載體，該顯示載體是平均粒徑為0.1μm～0.9μm選自塑膠、碳黑、金屬、纖維質(zhì)有顏色的顆粒，在該顆粒表面上固定一種受體或多種受體復(fù)合體，該顆粒的空白處固定或占滿一種阻斷蛋白質(zhì)，采用連續(xù)稀釋的已知抗體濃度的液體樣品經(jīng)檢測精確確定半定量值；(II)一種已精確確定相對配體濃度的溶液。本發(fā)明中所用的顯示載體為平均粒徑0.376μm和0.5μm的聚乙烯苯顆粒。本發(fā)明中所述的受體是一種抗原或半抗原，在顯示載體表面上固定一種抗原或多種抗原復(fù)合體，例如，抗原-5、抗原-60、38KD抗原等。在顯示載體的空白處固定或占滿一種阻斷蛋白質(zhì)，例如gelatin、glycerol、TritonX-100、Tween-20或一種血清蛋白質(zhì)(牛血清蛋白質(zhì)、兔血清蛋白質(zhì)等)，優(yōu)選為牛血清蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，精確確定出顯示載體的最低及最高陽性臨界值，其意義在于檢測出一種精確的半定量值。例如，將已知抗體濃度的液體樣品(血清樣品)連續(xù)稀釋成1X，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶8，再將顯示載體與每一樣品單獨反應(yīng)，3～5分鐘后出現(xiàn)肉眼可見的測定指標(biāo)，從而可確定是否為陽性反應(yīng)，并確定最高陽性稀釋段，例如1∶4陽性。由于顯示載體已經(jīng)精確定出最高及最低陽性臨界值，因此，可很容易推算出最高陽性稀釋段的半定量值。當(dāng)然，若想獲得更精確的半定量值，可在最高陽性稀釋段作進(jìn)一步稀釋后，再與顯示載體反應(yīng)，即可獲得最精確的半定量值。本發(fā)明中所述的相對配體是一種抗結(jié)核桿菌抗體。此相對配體可與顯示載體上的多種肺結(jié)核桿菌抗原復(fù)合體形成結(jié)合反應(yīng)。而上述的液體樣品中的被測物也會與顯示載體上的一種抗原或多種抗原復(fù)合體形成結(jié)合反應(yīng)。因此當(dāng)相對配體、液體樣品和顯示載體依順序同時反應(yīng)時，此相對配體將與液體樣品中的被測物一起競爭去與顯示載體上的一種抗原或多種抗原復(fù)合體結(jié)合，使之成為肉眼可見的測定指標(biāo)。本發(fā)明中，一種已精確確定相對配體濃度的溶液可與液體樣品中的被測物一起競爭去與顯示載體上的一種抗原或多種抗原復(fù)合體結(jié)合而形成所謂的競爭法反應(yīng)，并呈現(xiàn)肉眼可見的直接判讀的測定指標(biāo)。因此，當(dāng)將欲測樣品置于檢測元件上，再加入一種已固定有一種抗原或多種抗原復(fù)合體，并已確定最高及最低陽性臨界值的顯示載體，使其混合反應(yīng)，然后馬上加入一種已精確確定相對配體(即抗結(jié)核桿菌抗體)濃度的溶液，從而形成所謂的競爭法反應(yīng)，此時，若欲測樣品不存在被測物，如入抗結(jié)核桿菌抗體，或被測物低于所確定的最低陽性臨界值，則將形成肉眼可見的陰性凝集反應(yīng)結(jié)果；反之，若欲測樣品中的被測物高于最低陽性臨界值，則形成不凝集的陽性反應(yīng)結(jié)果。由此可見，本發(fā)明是利用免疫分析法，利用抗原、抗體間的專一性反應(yīng)，將抗原或抗體固定在有顏色的顯示載體上，通過欲測樣品抗體、檢測試劑抗體與抗原的競爭性反應(yīng)進(jìn)行顯示以檢測抗結(jié)核桿菌抗體，在3～5分鐘內(nèi)即可得到精確的檢測結(jié)果。本發(fā)明的另一種實施方案，即是利用一種或多種配體直接測定肺結(jié)核桿菌菌體。將一種或多種配體各固定于第三顯示載體及第四顯示載體上。因此，本發(fā)明的一種肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征還在于該試劑包含(I)一種第三顯示載體，在其表面上固定一種或多種配體；(II)一種第四顯示載體，在其表面上固定一種或多種配體；該第三顯示載體及第四顯示載體是平均粒徑為0.1μm～0.9μm選自塑膠、碳黑、金屬、纖維質(zhì)有顏色的顆粒，該顆粒空白處固定或占滿一種阻斷蛋白質(zhì)，例如gelatin、glycerol、Tri-tonX-100、Tween-20或一種牛血清蛋白質(zhì)等。上述固定在第三顯示載體上的配體為單克隆抗體或多克隆抗體，例如，兔抗結(jié)核桿菌抗體。上述固定在第四顯示載體上的配體為單克隆抗體，例如一種抗肺結(jié)核桿菌單克隆抗體或不同亞型的抗結(jié)核桿菌單克隆抗體。當(dāng)欲測的液體樣品經(jīng)適當(dāng)處理(例如加入適量Trypsin，使結(jié)核桿菌破裂，然后中和)，再置于檢測元件上，加入第三和第四顯示載體后充分混合，此時若存在有結(jié)核桿菌，則第三和第四顯示載體將同時與結(jié)核桿菌結(jié)合形成肉眼可見的陽性凝集反應(yīng)；反之，若欲測液體樣品中不存在結(jié)核桿菌菌體，則形成不凝集反應(yīng)的陰性結(jié)果。在本發(fā)明中，也可單獨使用上述(I)的第三顯示載體或上述(II)的第四顯示載體與欲檢測樣品反應(yīng)，這足以達(dá)到預(yù)期的測定結(jié)果。但同時使用第三顯示載體與第四顯示載體進(jìn)行檢測，將會提高其靈敏度。附圖1為本發(fā)明的經(jīng)連續(xù)稀釋的血清樣品與顯示載體反應(yīng)結(jié)果示意圖；附圖2為本發(fā)明的陽、陰性血清與顯示載體和相對配體反應(yīng)結(jié)果示意圖。下面的實施例僅為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是對其加以限制。實施例(一)A.顯示載體的制備(A-1)顯示載體的前處理將已經(jīng)用磷覆蓋的0.376μm和0.5μm的聚乙烯苯顆粒(Magsphere、PolymerLabs)，分別置于不同漏斗內(nèi)，每個漏斗連接一真空馬達(dá)，漏斗底部內(nèi)有一個膜孔徑為0.2μm的過濾膜用來過濾微粒，加入500mL2N鹽酸溶液于漏斗內(nèi)，攪拌2小時以洗掉磷覆蓋物，接著用真空馬達(dá)抽掉2N的鹽酸溶液，再加入500mL去離子水于漏斗內(nèi)攪拌20分鐘，再用真空馬達(dá)抽掉漏斗內(nèi)的去離子水，重復(fù)此步驟直到加入的去離子水的PH值與被真空馬達(dá)抽掉的去離子水的PH值達(dá)到平衡為止。(A-2)洗滌緩沖液的配制取分析純NaH2PO4·H2O1.56克分析純Na3PO49.00克加入800mL去離子水，使其完全溶解，用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為7.8，加入去離子水直至1000mL。(A-3)抗體或抗原緩沖液的配制(a)取分析純Na2HPO4·12H2O27.6g，置于1000mL的去離子水中，使其完全溶解；(b)取分析純NaH2PO4·2H2O28.4g，置于1000mL的去離子水中，使其完全溶解；其中，取(a)液30mL與(b)液70mL互相混合，并調(diào)節(jié)PH值為5.5，可利用0.5N的鹽酸或0.5N的氫氧化鈉來調(diào)節(jié)PH值，最后補(bǔ)加去離子水使其為1000mL止。(A-4)抗原溶液的配制將一種或多種肺結(jié)核桿菌抗原復(fù)合體直接加入(A-3)抗原緩沖液內(nèi)，使其濃度為0.2mg抗原/ml。(A-5)檢驗試劑的配制方法1.取10ml(A-4)抗原溶液(0.2mg/ml)放入50ml離心管內(nèi)；2.加入0.1g(A-1)已經(jīng)處理洗滌的0.5μm的聚乙烯苯微粒；3.攪拌3小時以使抗原完全被固定于微粒上；4.加入9g牛血清蛋白，并使其充分混合；5.攪拌1小時，以使牛血清蛋白完全占滿微粒空白處；6.加入5％甘油，攪拌或振蕩30分鐘；甘油亦可用較強(qiáng)之Tri-tonX-100或Tween-20代替，使微粒呈完全分散狀；7.在4℃以15000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘；8.倒掉上清液，保留聚乙烯苯微粒沉淀物；9.加入10mlPH值為5.5的磷酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杌蛲ㄟ^振蕩使聚乙烯苯微粒沉淀物成為微粒懸浮液，并靜置10分鐘；10.重復(fù)第7、第8步驟；11.加入10mlPH值為7.8的磷酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杌蛲ㄟ^振蕩使微粒沉淀，再使微粒呈懸浮狀；12.重復(fù)第7、第8步驟；13.加入5ml含5％甘油或TritonX-100或Tween-20的磷酸緩沖液，其PH值為5.5，并加入0.01％防腐劑(疊氮化鈉)；14.攪拌或振蕩30分鐘，使微粒沉淀物再形成完全分散的懸浮液；15.保存于4℃。臨界值的確定取已知濃度抗原-60抗體的標(biāo)準(zhǔn)血清如下100unit/ml200unit/ml210unit/ml230unit/ml240unit/ml250unit/ml300unit/ml400unit/ml500unit/ml550unit/ml580unit/ml590unit/ml600unit/ml610unit/ml620unit/ml630unit/ml640unit/ml650unit/ml700unit/ml800unit/ml各取50μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清置于檢測元件上，再分別加入20μl(A-5)的顯示載體懸浮液，并分別涂開來，于3～5分鐘判讀結(jié)果</tables>注(-)為陰性，(±)為弱陽性，(+)為陽性，(++)為中度陽性，(+++)為強(qiáng)度陽性。取一已知抗體濃度(300unit/ml)的血清樣品，作1X，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8的連續(xù)稀釋，取每一稀釋樣品50μl分別置于檢測元件的單獨反應(yīng)圈1、2、3、4、5上，再加入20μl的顯示載體(A-5)進(jìn)入每一反應(yīng)圈并充分混合，于3～5分鐘呈現(xiàn)如下結(jié)果上表中檢測元件的第1反應(yīng)圈為1X稀釋段，呈凝集的陽性反應(yīng)，第2反應(yīng)圈為1∶1稀釋段，呈不凝集的陰性反應(yīng)，第3反應(yīng)圈為1∶2稀釋段，呈不凝集陰性反應(yīng)，第4反應(yīng)圈為1∶4稀釋段，呈不凝集的陰性反應(yīng)，第5反應(yīng)圈為1∶8稀釋段，呈不凝集的陰性反應(yīng)(如附圖1所示)。結(jié)果表明此血清樣品為陽性反應(yīng)，且在1X稀釋段呈陽性凝集反應(yīng)。依照顯示載體的最高及最低臨界值推算，即可精確確定半定量值。當(dāng)然在1X段作更進(jìn)一步的稀釋，并與顯示載體反應(yīng)，將獲得更精確的半定量值。實施例(二)(B).一種已精確確定相對配體(抗結(jié)核桿菌抗體)濃度的溶液的配制取已知濃度10000unit/ml的抗原-60抗體的血清，將其稀釋到1000unit/ml的濃度，并加入0.01％的防腐劑(疊氮化鈉)，保存于4℃。取已知500unit/ml的陽性血清50μl進(jìn)入檢測元件上的第6反應(yīng)圈上(如附圖2所示)及取50μl的陰性血清到第5反應(yīng)圈上，再各加入40μl的(A-5)顯示載體，充分混合后，馬上再加入50μl之(B)1000unit/ml的抗結(jié)核桿菌抗體溶液，充分混合后，于3～5分鐘后判讀結(jié)果，第5反應(yīng)圈呈現(xiàn)陰性的凝集反應(yīng)，是為陰性的競爭法反應(yīng)結(jié)果，第6反應(yīng)圈呈現(xiàn)陽性的不凝集反應(yīng)，是為陽性的競爭法反應(yīng)結(jié)果。此競爭反應(yīng)陽性臨界的高低，可通過調(diào)節(jié)抗結(jié)核桿菌抗體溶液的濃度來達(dá)到。實施例(三)(C).第三顯示載體的配制(A-6)抗體溶液的配制將抗結(jié)核桿菌多克隆抗體直接加入抗體緩沖液內(nèi)，使其濃度達(dá)到0.2mg抗體/ml。(A-7)檢驗試劑的配制方法1.取10ml(A-6)抗體溶液(0.2mg/ml)放入50ml離心管內(nèi)；2.加入0.1g(A-1)已經(jīng)處理洗滌的0.376μm的聚乙烯苯微粒；3.攪拌3小時以使抗體完全被固定于微粒上；4.加入9g的牛血清蛋白，并使其充分混合；5.攪拌1小時，以使牛血清蛋白完全占滿微?？瞻滋帲?.加入5％甘油，攪拌或振蕩30分鐘；甘油亦可用較強(qiáng)的Tri-tonX-100或Tween-20代替，使微粒呈完全分散狀；7.在4℃以15000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘；8.倒掉上清液，保留聚乙烯苯微粒沉淀物；9.加入10mlPH值為5.5的磷酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杌蛲ㄟ^振蕩使聚乙烯苯微粒沉淀物成為微粒懸浮液，并靜置10分鐘；10.重復(fù)第7、第8步驟；11.加入10mlPH值為7.8的磷酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杌蛲ㄟ^振蕩使微粒沉淀，再使其呈微粒懸浮狀；12.重復(fù)第7、第8步驟；13.加入5ml含5％甘油或TritonX-100或Tween-20的磷酸緩沖液，其PH值為5.5，并加入0.01％防腐劑(疊氮化鈉)；14.攪拌或振蕩30分鐘，使微粒沉淀物再形成完全分散的懸浮液；15.保存于4℃。(D).第四載體的配制(A-8)抗體溶液的配制將抗結(jié)核桿菌單克隆抗體直接加入抗體緩沖液內(nèi)使其濃度為0.2mg抗體/ml。(A-9)檢驗試劑的配制方法1.取10ml(A-8)抗體溶液(0.2mg/ml)放入50ml離心管內(nèi)；2.加入0.1g(A-1)已經(jīng)處理洗滌的0.5μm的聚乙烯苯微粒；3.攪拌3小時以使抗體完全被固定于微粒上；4.加入9g的牛血清蛋白，并使其充分混合；5.攪拌1小時，以使牛血清蛋白完全占滿微粒空白處；6.加入5％甘油，攪拌或振蕩30分鐘；甘油亦可用較強(qiáng)的Tri-tonX-100或Tween-20代替，使微粒呈完全分散狀；7.在4℃以15000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘；8.倒掉上清液，保留聚乙烯苯微粒沉淀物；9.加入10mlPH值為5.5的磷酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杌蛲ㄟ^振蕩使聚乙烯苯微粒沉淀物成為微粒懸浮液，并靜置10分鐘；10.重復(fù)第7、第8步驟。11.加入10mlPH值為7.8的磷酸緩沖液，充分?jǐn)嚢杌蛲ㄟ^振蕩使微粒沉淀，再使微粒呈懸浮狀；12.重復(fù)第7、第8步驟；13.加入5ml含5％甘油或TritonX-100或Tween-20的磷酸緩沖液，其PH值為5.5，并加入0.01％防腐劑(疊氮化鈉)；14.攪拌或振蕩30分鐘，使微粒沉淀物再形成完全分散的懸浮液；15.保存于4℃。將胸水樣品或經(jīng)液化的痰樣品經(jīng)簡單Trypsin消化及中和后，各取50μl以上樣品置于檢測元件上，再分別加20μl的第三及第四顯示載體于每一樣品中充分混合，經(jīng)3～5分鐘后，若呈現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)，則為陽性的結(jié)核桿菌抗原反應(yīng)。若呈現(xiàn)不凝集反應(yīng)，則為陰性的結(jié)核桿菌抗原反應(yīng)。在本發(fā)明中只單獨使用一種第三顯示載體或單獨使用一種第四顯示載體，已足以達(dá)到測定要求，但為提高靈敏度可同時使用第三顯示載體和第四顯示載體進(jìn)行檢測。權(quán)利要求1.一種肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于該試劑包含(I)一種已精確確定最低及最高陽性臨界值的顯示載體，該顯示載體是平均粒徑為0.1μm～0.9μm選自塑膠、碳黑、金屬、纖維質(zhì)有顏色的顆粒，在該顆粒表面上固定一種受體或多種受體復(fù)合體，該顆粒的空白處固定或占滿一種阻斷蛋白質(zhì)，采用連續(xù)稀釋的已知抗體濃度的液體樣品經(jīng)檢測精確確定半定量值；(II)一種已精確確定相對配體濃度的溶液。2.權(quán)利要求1所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于顯示載體是平均粒徑為0.376μm和0.5μm的聚乙烯苯顆粒。3.權(quán)利要求1所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于受體為抗原或半抗原。4.權(quán)利要求1所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于阻斷蛋白質(zhì)為牛血清蛋白。5.權(quán)利要求1所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于相對配體為一種抗結(jié)核桿菌抗體。6.一種肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于該試劑包含(I)一種第三顯示載體，在其表面上固定一種或多種配體；(II)一種第四顯示載體，在其表面上固定一種或多種配體；該第三顯示載體及第四顯示載體是平均粒徑為0.1μm～0.9μm選自塑膠、碳黑、金屬、纖維質(zhì)有顏色的顆粒，該顆?？瞻滋幑潭ɑ蛘紳M一種阻斷蛋白質(zhì)。7.權(quán)利要求6所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于固定在第三顯示載體上的配體為單克隆抗體或多克隆抗體。8.權(quán)利要求6所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于固定在第四顯示載體上的配體為單克隆抗體。9.權(quán)利要求6所述的肺結(jié)核快速檢驗試劑，其特征在于該試劑只包含(I)第三顯示載體或(II)第四顯示載體。全文摘要本發(fā)明涉及一種肺結(jié)核快速檢驗試劑,其特征在于該試劑包含:(Ⅰ)一種已精確確定最低及最高陽性臨界值的顯示載體,該顯示載體是平均粒徑為0.1μm～0.9μm選自塑膠、碳黑、金屬、纖維質(zhì)有顏色的顆粒,在該顆粒表面上固定一種受體或多種受體復(fù)合體,用連續(xù)稀釋的已知抗體濃度的液體樣品經(jīng)檢測精確確定半定量值;(Ⅱ)一種已精確確定相對配體濃度的溶液。用該試劑檢測抗結(jié)核桿菌抗體以檢驗肺結(jié)核靈敏度高,且快速省時。文檔編號G01N33/53GK1169536SQ9610670公開日1998年1月7日申請日期1996年6月25日優(yōu)先權(quán)日1996年6月25日發(fā)明者劉永詳,陳詠儀申請人:劉永詳,陳詠儀