專利名稱：一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的試劑盒及其檢測(cè)方法
一種檢測(cè)黃曲霉毒素B1的試劑盒及其檢測(cè)方法，用于對(duì)糧食、飼料及食品中黃曲霉毒素B1(AFB1)含量的檢測(cè)。
由于黃曲霉毒素具有毒性大，致癌力強(qiáng)，含量低(通常0-200μg/Kg，即0-200PPb)和結(jié)構(gòu)相似等特點(diǎn)，這就要求檢測(cè)方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，集分離與檢測(cè)為一體，目前黃曲霉毒素的測(cè)定方法有多種，概括起來有化學(xué)分析法，儀器分析法，生物鑒定法及免疫分析法等。上述這些分析方法也是緊密相聯(lián)的，它們之間沒有絕然的分界線。免疫分析法中的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是70年代出現(xiàn)的新的免疫測(cè)定技術(shù)。正如1994年《糧食與飼料工業(yè)》雜志中已報(bào)道，酶聯(lián)免疫吸附法其原理是抗原(或抗體)吸附于載體上的免疫吸附劑和用酶標(biāo)記的抗體(或抗原)與標(biāo)本中的待測(cè)物(抗原或抗體)起特異的免疫學(xué)反應(yīng)，最后用測(cè)定酶活力的方法來增加測(cè)定的敏感度。這一技術(shù)應(yīng)用于黃曲霉毒素的測(cè)定大體為二類一是用雙抗體夾心法檢測(cè)樣本中的黃曲霉毒素，如Sashidha將黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白涂覆于酶標(biāo)板孔穴中，經(jīng)初步培養(yǎng)后，加兔的AFB1抗體和游離AFB1，用磷酸4-硝基苯酯作基質(zhì)，以堿性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白檢測(cè)第一抗體的結(jié)合二是用競(jìng)爭法檢測(cè)樣本中的黃曲霉毒素，如在涂抗體的孔穴中，用乙烷萃取黃曲霉毒素B1，并與結(jié)合辣根過氧化物酶的黃曲霉素B1交聯(lián)物混合，37℃下培養(yǎng)10分鐘后，用水洗除去未結(jié)合的黃曲霉毒素B1交聯(lián)物，再加底物，在波長405nm進(jìn)行檢測(cè)。為得到特異性更強(qiáng)的ELISA法，發(fā)展了AFB1單克隆抗體的酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定法，Kawamura用間接和直接競(jìng)爭ELISA法分析AFB1檢出限小于1ng。上述所講的黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(酶標(biāo)抗原)的中間體是用Adsorbosil-柱層析法來提純，部分材料需進(jìn)口，操作要求較嚴(yán)格，費(fèi)用也較高。如采用薄層層析制備來提純，其中的硅膠吸附能力較強(qiáng)，在層析分離產(chǎn)物AFB1-Oxime和原料AFB1時(shí)，洗脫比較困難，其產(chǎn)率低，而且洗脫時(shí)間較長。
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，廉價(jià)，攜帶方便的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的試劑盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是克服上述不足之處，從而提供一種樣品前處理簡單，提取后就可直接測(cè)定，不需要凈化過程；一次可測(cè)定大量樣本，而且簡便，快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法。
本發(fā)明試劑盒主要由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)，A試劑瓶(稀釋液)(3)，B試劑瓶(標(biāo)準(zhǔn)AFB1試劑)(4)，C試劑瓶(酶標(biāo)抗原試劑)(5)，D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液)(6)，E試劑瓶(含吐溫20的PBS緩沖液)(7)，F(xiàn)試劑瓶(四甲基聯(lián)苯胺試劑)(8)、G試劑瓶(H2O2溶液)(9)，H試劑瓶(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)(10)，I試劑瓶(硫酸溶液)(11)、海棉托架(12)所組成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，上述A、B、C、D、E、F、G、H、I試劑瓶安裝在海棉托架(12)的孔和凹槽內(nèi)，海棉托架(12)酶標(biāo)板(2)安裝在盒體(1)內(nèi)。
本發(fā)明主要采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)競(jìng)爭法來檢測(cè)AFB1。采用ELISA競(jìng)爭法的技術(shù)主要有兩個(gè)方面。特異性抗體(多克隆或單克隆)的制備，利用抗原免疫家免，獲得含有抗體的血清，經(jīng)過生化提純分離免疫球蛋白；第二，抗原-酶交聯(lián)物(即酶標(biāo)抗原)的制備。由于AFB1(黃曲霉毒素B1)不脂直接與酶結(jié)合，必須先將AFB1修飾，引入一個(gè)-COOH修飾基團(tuán)，然后和酶的氨基反應(yīng)，使其具有酶的活性，即能催化底物的顯色反應(yīng)。
首先將多克隆(或單克隆)抗體包被在酶標(biāo)板(2)上，酶標(biāo)板(2)放在4℃左右冰箱過夜。再進(jìn)行試劑及酶底物混合液的配制，在B試劑(標(biāo)準(zhǔn)AFB1中)加20-30mlA試劑混勻，在C試劑(酶標(biāo)抗原)中加入10-20mlD試劑(無酶標(biāo)抗原稀釋液)，溶解、混勻，在2-8℃下保存，E試劑(含吐溫20的PBS固體)中加入蒸餾水配制成洗滌液，用E洗滌液洗酶標(biāo)板2-4次，洗液不得溢出，每次間隔0.5-1.5分鐘，放在吸水紙上拍干，在酶標(biāo)板小孔中加入配制好的試劑及樣品稀釋液進(jìn)行競(jìng)爭免疫反應(yīng)，在37-38℃放置28-35分鐘，再用洗滌液洗板4-6次，每次間隔1-2分鐘，拍干，再加入酶底物混合液，混勻，在37-38℃放置13-18分鐘，顯色，最后加入I終止液(硫酸溶液)中止反應(yīng)，測(cè)定。
黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備1、黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(B1-Oxime)的制備(中間體)(1)合成取20-30mg黃曲霉毒素B1，30-40mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽于圓底瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反應(yīng)溶劑，回流2-4小時(shí)，再室溫?cái)嚢?5-20小時(shí)，減壓揮干溶劑，得固體。
(2)、提純
在上述固體中加入5-10ml蒸餾水，采用0.1-0.5N碳酸氫鈉調(diào)pH至堿性，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，靜置分層，得水相層，再用0.1-0.5N鹽酸調(diào)水相層至酸性，用4-8ml氯仿萃取，得氯仿層，用0.5-2ml蒸餾水洗氯仿層，棄去水層，減壓蒸餾，揮干溶劑，得淡桔黃色固體。
2、黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備(1)、合成取0.5-1.0mg黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黃色固體溶于10-20ml的乙醇液中，混勻，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽及5-10mg的辣根過氧化物酶，慢速攪拌15-30分鐘，再加150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽，在2-8℃攪拌15-18小時(shí)，并在5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-10分鐘，取上清液。
(2)、提純將上述上清液通過pH7.0-8.0磷酸鹽緩沖液平衡的Sephadex層析柱，并用該緩沖液洗脫，部分收集器收集，洗脫液分別在波長350-370nm和390-420nm處測(cè)定吸光度值，繪制洗脫曲線，收集雙峰并存的洗脫液，在pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液透析3-5天，得含黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分裝冷凍干燥，得粉狀固體。
實(shí)施例1本發(fā)明主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)黃曲霉毒素B1的含量。具體操作步驟如下一、多克隆抗黃曲霉毒素B1抗體的制備1、免疫用抗原首次免疫用5ml黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白與5ml完全福氏佐劑混合后作為免疫抗原，加強(qiáng)免疫時(shí)取5ml黃曲霉毒素B1-牛血清白蛋白與5ml不完全福氏佐劑混合作為免疫抗原。
2、免疫程序先將購買的新西蘭大白免飼養(yǎng)數(shù)周后，在背部脊柱兩側(cè)脫毛區(qū)取5-10個(gè)接種點(diǎn)，每點(diǎn)內(nèi)接種完全佐劑抗原0.2-0.3ml，然后每隔4周四肢肌肉加強(qiáng)接種不完全佐劑抗原1ml，共加強(qiáng)免疫2次。
3、采血首先免疫前可取耳緣靜脈采血，以后每次加強(qiáng)免疫前各采血1次，第二次加強(qiáng)免疫后第四周再采血一次，測(cè)定血清抗體效價(jià)后頸動(dòng)脈放血。
4、分離血清分別以30％和60％的硫酸銨分級(jí)沉淀血清中雜蛋白與抗體免疫球蛋白，離心后得含有抗黃曲霉毒素B1多克隆抗體的溶液。
二、單克隆抗黃曲霉毒素B1的制備1、抗原制備通過黃曲霉毒素B1的肟化反應(yīng)和交聯(lián)反應(yīng)制備免疫用人工抗原黃曲霉毒素B1-羧甲基肟-牛血清白蛋白人工抗原(AFB1-Oxime-BSA)。
2、免疫動(dòng)物采用BALB/C小白鼠作為免疫動(dòng)物，免疫抗原劑量為10-100ng，經(jīng)腹腔注射，在4-6周后靜脈加強(qiáng)免疫2-4次，取脾細(xì)胞。
3、細(xì)胞融合取對(duì)數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與脾細(xì)胞在聚乙二醇(4000)的溶劑中進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)液中作選擇培養(yǎng)。
4、雜交瘤細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直至得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。
6、單克隆抗體的保存在液氮-20℃下保存，37℃水浴快速解凍，使細(xì)胞存活率保持80％以上。
7、單克隆抗體大量生長及提純?cè)谛∈蟾骨粌?nèi)注射一定量的雜交瘤細(xì)胞，采集腹水，經(jīng)HPLC提純后小瓶分裝待用。
三、黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備(試劑盒中C試劑瓶)。
1、黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制備(1)合成稱取20mg黃曲霉毒素B1(AFB1)和30mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)放在30-50ml圓底蒸餾瓶中，再加入10ml吡啶∶甲醇(1∶3-1∶6)的反應(yīng)溶劑，回流2小時(shí)，再室溫?cái)嚢?5小時(shí)。當(dāng)黃曲霉毒素B1(AFB1)已大部分轉(zhuǎn)化為其衍生物羧甲基黃曲霉毒素肟時(shí)，停止反應(yīng)，減壓揮干反應(yīng)溶劑，得黃色固體。
(2)、提純?cè)诤鲜鳇S色固體的圓底蒸餾瓶中，加入5ml蒸餾水，用0.1N碳酸氫納(NaHCO3)調(diào)PH至堿性，使固體全部溶解，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用2ml氯份(CHCl3)萃取，靜置分層，棄氯仿(CHCl3)層，得水相層，再用0.1N鹽酸(HCl)調(diào)水相層至酸性，出現(xiàn)沉淀，用4ml氯仿(CHCl3)萃取，沉淀溶解在氯仿(CHCl3)層中，得氯仿(CHCl3)層，用0.5ml蒸餾水洗氯仿層，棄去水層，減壓蒸餾揮干溶劑得淡桔黃色固體。
2、黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)(酶標(biāo)抗原)的制備。
(1)、合成
稱取上述0.5mg黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)固體溶于10ml的乙醇溶液中，混勻，依次加入150mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和5.0mg的辣根過氧化物酶(HRP)混勻，慢速攪拌15分鐘，再加入150ml乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，在2℃溫度下攪拌15小時(shí)，在轉(zhuǎn)速為5000-10000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，取上清液。
(2)、提純將上清液通過pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Sephadex層析柱，再用該緩沖液洗脫，采用BS-100A自動(dòng)部分收集器收集。洗脫液分別在波長350-370nm和390-420nm處測(cè)定吸光度值，繪制洗脫曲線，見圖3所示。收集雙峰并存的洗脫液，在pH7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)透折3天，得含AFB1-HRP的溶液，小瓶分裝冷凍干燥得粉狀固體，為黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)。
圖4為酶標(biāo)抗原合成原理反應(yīng)式可以看出，其反應(yīng)分兩步進(jìn)行，即AFB1-Oxime的肟化反應(yīng)和AFB1-O-HRP交聯(lián)反應(yīng)。
具體檢測(cè)步驟如下將多克隆(或單克降)抗黃曲霉毒素B1抗體包裝在酶標(biāo)板上，然后進(jìn)行樣品的處理。
1、先將樣品粉碎至20目，稱取5g樣品于磨口的50ml試管中，加入提取液25ml(甲醇∶水為7∶3)，加塞振蕩5-10min，過濾。濾液按下表用A試劑適當(dāng)稀釋。
樣品 濾液量(ml) A試劑量(ml)稀釋倍數(shù)豆類發(fā)酵食品，其它糧食0.1 0 0大米食用油、肉雞、生長0.1 0.11∶1雞飼料玉米(食品用)、混合、0.05 0.15 1∶3配合飼料玉米(飼料用)、花生餅、粕0.02 0.18 1∶92、試劑的配制(1)標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素B1(AFB1)B試劑中加入稀釋液A試劑20ml混勻；(2)酶標(biāo)抗原(AFB1-HRP)C試劑中加入10ml酶標(biāo)抗原稀釋液D試劑，溶解，混勻，在2-8℃下保存；(3)在含0.05％吐溫-20(Tween-20)的磷酸鹽(PBS)的E試劑中加入200ml蒸餾水配制洗滌液；(4)底物混合液配制根據(jù)每次測(cè)定所需底物混合液用量，用醋酸鈉-檸檬酸緩沖液H試劑四甲基聯(lián)苯胺F試劑按H∶F＝7-9.5∶3-0.5的比例稀釋F試劑，再按每毫升此稀釋液需加入14μl的雙氧水G試劑配成底物混合液(臨用前半小時(shí)內(nèi)配制)。
3、將試劑盒平衡至室溫4、用E洗滌液洗酶板2次，洗液不得溢出，每次間隙0.5分鐘，放在吸水紙上拍干。
5、反應(yīng)物組成按下表所列，依次加入配制好的試劑及待測(cè)樣品稀釋液。1-3號(hào)孔為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔。4-12號(hào)孔為樣品孔。
>6、反應(yīng)按上表所列加入各試劑在38℃放置28分鐘。
7、洗滌顯色用E洗滌液洗酶標(biāo)板4次，加入50μl底物混合液，混勻，在38℃放置13分鐘。
8、中止加底物液I試劑50μl中止反應(yīng)。
9、測(cè)定先比較1-3號(hào)孔顏色，若1號(hào)最深，2號(hào)孔次之，3號(hào)孔按近無色，說明標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確。
(1)、目視法比較樣品孔與2號(hào)孔顏色，若淺者，則為陽性，反之為陰性，若顏色接近，則用儀器法或國標(biāo)法驗(yàn)證。
(2)、儀器法用酶標(biāo)儀(通用)測(cè)定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中黃曲霉毒素B1的含量(定量)。
10、結(jié)果判讀若樣品經(jīng)目視法為陽性則AFB1含量如下表稀釋倍數(shù)AFB1含量(PPb)0 ＞51∶1＞101∶3＞201∶9＞50本發(fā)明試劑盒體(1)內(nèi)裝有海棉托架(12)，酶標(biāo)板(2)，有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，孔及凹槽內(nèi)放有A試劑瓶(稀釋液)(3)，B試劑瓶(標(biāo)準(zhǔn)AFB，試劑)(4)，C試劑瓶(酶標(biāo)抗原試劑)(5)，D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液試劑)(6)，E試劑瓶(含吐溫20的PBS固體)(7)，F(xiàn)試劑瓶(四甲基聯(lián)苯胺)(8)，G試劑瓶(H2O2溶液)(9)，H試劑瓶(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)(10)，I試劑瓶(硫酸溶液)(11)。試劑盒放在2-8℃貯存，忌0℃下凍存，有效期12個(gè)月。詳見

圖1、圖2實(shí)施例21、多克隆(或單克隆)抗黃曲霉毒素B1抗體的制備與實(shí)施例1相同，略。
二、黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備(試劑盒中C試劑瓶)。
1、黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制備(1)、合成稱取25mg黃曲霉毒素B1(AFB1)，35mg羧甲基羥胺半鹽酸醇鹽(CMO)回流3小時(shí)，室溫?cái)嚢?8小時(shí)，其它工藝條件操作步驟同實(shí)施例1。
(2)、提純蒸餾水取7.5ml，0.3N碳酸氫鈉(NaHCO3)，3ml氯仿(CHCl3)萃取，0.3N鹽酸(HCl)再取6ml氯仿(CHCL3)萃取，用1.2ml蒸餾水洗氯仿層，其它工藝流程條件操作步驟相同于實(shí)施例1。
2，黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備。
(1)、合成取0.75mg上述固體，乙醇溶液15ml175mg乙二醇3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)7.5mg辣根過氧化物酶(HRP)，攪拌25分鐘再加入175mg(EDC·HCL)乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸胺，4℃攪拌16.5小時(shí)，離心7.5分鐘，其它工藝條件操作步驟同實(shí)施例1。
(2)、提純pH7.5透析4天，其它工藝條件、操作步驟同實(shí)施例1。
檢測(cè)步驟樣品處理同實(shí)施例1。
試劑配制B試劑中加入A試劑25mlC試劑中加入15mlD試劑，洗滌液洗酶板3次，每次間隔1分鐘，在37.5℃下放置30分鐘，第二次洗酶板5次，每次間隔1.5分鐘，在37.5℃下放置15分鐘，其它工藝條件操作步驟同于實(shí)施例1。
實(shí)施例3一、多克隆(或單支隆)抗黃曲霉毒素B抗體的制備同實(shí)施例1，略。
二、黃曲霉毒素B1-辣根過氧化酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備(試劑盒中C試劑瓶)1、黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制備(1)、合成稱取30mg黃曲霉毒素B1(AFB1)，40mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)，回流4小時(shí)，室溫?cái)嚢?0小時(shí)，其它工藝條件操作步驟相同實(shí)施例1(2)、提純蒸餾水取10ml，0.5N碳酸氫鈉(NaHCO3)，5ml氯仿(CHCl3)萃取，0.5N鹽酸(HCl)，再取6ml氯仿(CHCl3)萃取，用2ml蒸餾水洗氯仿層，其它工藝條件制作步驟相同于實(shí)施例1。
2、黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備1、合成取1.0mg上述固體，乙醇溶液20ml，200mg乙二醇3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC· HCl)、10mg辣根過氧化物酶(HRP)，攪拌30分鐘，再加入200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，8℃攪拌18小時(shí)，離心10分鐘，其它操作步驟同于實(shí)施例1。
(2)、提純pH8.0透析5天，其它工藝條件制作步驟相同于實(shí)施例1檢測(cè)步驟樣品處理同于實(shí)施例1試劑配制B試劑中加入A試劑30ml，C試劑中加入20mlD試劑，洗滌液洗板4次，每次間隔1.5分鐘，在37℃下放置35分鐘，第二次洗酶板6次，每次間隔2分鐘，在37℃下放置18分鐘，其它操作步驟同于實(shí)施例1。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具以下優(yōu)點(diǎn)1、試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，攜帶使用配制方便，2、靈敏度高，特異性好，操作簡單、方便，3、檢測(cè)結(jié)果易判讀，4、試劑來源方便，價(jià)格低廉，尤其適用于糧食、食品、飼料中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)黃曲霉毒素B1的試劑盒由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)、A試劑瓶(稀釋液)(3)，B試劑瓶(標(biāo)準(zhǔn)AFB1試劑)(4)，C試劑瓶(酶標(biāo)抗原試劑)(5)，D試劑瓶(酶標(biāo)抗原稀釋液試劑)(6)，E試劑瓶(含吐溫-20的PBS固體)(7)，F(xiàn)試劑瓶(四甲基聯(lián)苯胺試劑(8)，G試劑瓶(H2O2溶液)(9)、H試劑瓶(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)(10)，I試劑瓶(硫酸溶液)(11)，海棉托架(12)所組成，海棉托架(12)內(nèi)裝有上述A、B、C、D、E、F、G、H、I試劑瓶，海棉托架(12)及酶標(biāo)板(2)均安裝在盒體(1)內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的試劑盒，其特征在于所述的海棉托架(12)上制有孔和凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成。
4.一種檢測(cè)黃曲霉毒素B1的試劑盒及用該試劑盒檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法，先進(jìn)行樣品處理，將樣品粉碎至20目，取樣品。放在50ml試管中，加入提取液(甲醇∶水為7∶3)。加塞振蕩5-10分鐘，過濾，濾液采用A試劑液適當(dāng)稀釋，其特征為首先采用多克隆(或單克隆)抗體包被在酶標(biāo)板(2)上，酶標(biāo)板(2)放在4℃冰箱過夜，然后進(jìn)行試劑及酶底物混合液的配制在B試劑(標(biāo)準(zhǔn)AFB1)中加20-30mlA試劑混勻，在C試劑(酶標(biāo)抗原)中加入10-20mlD試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液)，溶解混勻，在2-8℃下保存，E試劑(含吐溫-20的PBS固體)中加入蒸餾水配制成洗滌液，用E洗滌液洗酶板2-4次，洗液不得溢出，每次間隔0.5-1.5分鐘，放在吸水紙上拍干，在酶板小孔中加入配制好的試劑及樣品稀釋液進(jìn)行競(jìng)爭免疫反應(yīng)，在37-38℃放置28-35分鐘，再用洗滌液洗板4-6次，每次間隔1-2分鐘，拍干，再加入酶底物混合液，混勻，在37-38℃放置13-18分鐘顯色，最后加入I終止液(硫酸溶液)中止反應(yīng)，測(cè)定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法，其特征是C試劑為黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原，(酶標(biāo)抗原)分二步進(jìn)行制備①黃曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)(中間體)的制備(1)、合成取20-30mg黃曲霉毒素B1、30-40mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽于圓底蒸餾瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反應(yīng)溶劑，回流2-4小時(shí)，再室溫?cái)嚢?5-20小時(shí)，減壓揮干溶劑，得固體。(2)，提純?cè)谏鲜龉腆w中加入5-10ml蒸餾水，采用0.1-0.5N碳酸氫鈉調(diào)pH至堿性，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，靜置分層，得水相層，再用0.1-0.5N鹽酸調(diào)水相層至酸性，再用4-8ml氯仿萃取，得氯仿層，用0.5-2ml蒸餾水洗氯仿層，棄去水層，減壓蒸餾，揮干溶劑得淡桔黃色固體②黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)酶標(biāo)抗原的制備。(1)、合成取0.5-1.0mg黃曲霉毒素B-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黃色固體溶于10-20ml的乙醇液中，混勻，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽及5-10mg的辣根過氧化物酶，混勻，慢速攪拌15-30分鐘，再加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亞胺鹽酸鹽，在2-8℃攪拌15-18小時(shí)，并在5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-10分鐘，取上清液。(2)、提純將上述上清液通過pH7.0-8.0磷酸鹽緩沖液平衡的Sephadex層析柱，再用該緩沖液洗脫，部分收集器收集，洗脫液分別在波長350-370nm和390-420nm處測(cè)定吸光度值，繪制洗脫曲線，收集雙峰并存的洗脫液，在pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液透析3-5天，將含黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分裝冷凍干燥得粉狀固體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法，其特征在于所述的底物混合液，采用H試劑(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)和F試劑(四甲基聯(lián)苯胺)按H∶F＝7-9.5∶3-0.5和每毫升此稀釋液加14μlG試劑(H2O2)混合配制而成。(臨用前半小時(shí)內(nèi)配制)。
全文摘要
一種檢測(cè)黃曲霉毒素B
文檔編號(hào)G01N33/53GK1153908SQ9611680
公開日1997年7月9日 申請(qǐng)日期1996年1月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月4日
發(fā)明者成恒嵩, 潘中華, 宓曉黎, 趙曉聯(lián), 袁建興, 楊焱, 殷旭仁, 余傳信, 徐燕芳, 葛其德 申請(qǐng)人:江蘇省微生物研究所