專利名稱：活動性結核標志物氫譜多肽的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別是涉及一種活動性結核標志物(ActiveTuberculosis Mark-ATM)′H(氫譜)多肽的檢測方法。
國內(nèi)外有關結核病實驗診斷技術種類較多，早期建立現(xiàn)在仍廣泛使用的常規(guī)檢測方法有痰涂片、菌型鑒定、分離培養(yǎng)、藥敏試驗及OT皮試等。近十年來發(fā)展較快的方法有，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、酶聯(lián)免疫電泳技術(ELIEP)、聚合酶鏈反應(PCR)及核酸探針(DNA Pribe)等。以上各種方法進行結核病診斷時，均是以抗體、抗原及免疫復合物作檢測指標。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用活動性結核標志物′H多肽對活動性結核病患者的體液進行檢測的活動性結核標志物的檢測方法。
本發(fā)明活動性結核標志物′H多肽檢測方法中的活動性結核標志物′H多肽經(jīng)氫譜象位分析，確定不屬于抗體范疇，而是一種僅存在于活動性結核病患者體內(nèi)的一種蛋白質成分，并從對11個國家和地區(qū)的標準菌株中，經(jīng)反復技術分析和實驗篩選，確立了CD-1331顆粒性抗原，其特點是與′H多肽結合穩(wěn)定，特異，且無毒無污染，在特定的試驗條件下，通過反應，CD1331可與′H多肽形成疏松的吸附環(huán)。經(jīng)染色后，通過觀察吸附環(huán)的顏色對活動性結核病進行診斷。
本發(fā)明活動性結核標志物′H多肽的檢測方法是這樣進行的，在反應原CD1331中加入活化劑，如多肽、內(nèi)纖酶等常用活化劑，充分混合，活化反應原后備用；在瓊脂糖介質中加入緩沖液，如巴比妥緩沖液、薩姆緩沖液等常用緩沖液，加熱熔化，控制PH＝8.5～8.6，離子強度u＝0.03，介質含水量大于99％，并于40～46℃溫度下，向瓊脂糖介質緩沖液中加入反應原CD1331，其加入比例為，瓊脂糖介質緩沖液∶反應原＝10∶1，制備反應原凝膠板。采用常規(guī)的U型制板框制備，控制反應原凝膠板的厚度為2mm，其長度和寬度可根據(jù)條件設定；然后利用孔位模板對反應原凝膠板打孔，控制孔徑為3mm，孔間距為12～15mm，打孔時注意挑出孔中凝膠塊，每孔中加入待測樣品，待測樣品為體液，如血清、血漿、胸腹水、腦脊液、尿液及膿汁等。樣品高體放置時間不超過10小時，放置時間過長會影響檢測結果；再將加樣后的凝膠板于37～42℃的溫度下擴散30分鐘～16小時，即反應30分鐘～16小時，擴散時間的長短與樣品離體放置時間的長短有關，放置時間越長，擴散時間亦越長，此時，′H多肽與反應原形成疏松的吸附環(huán)。樣品加入量以10μl為宜。恒溫擴散可在水箱或培養(yǎng)箱等恒溫箱中進行；最后將擴散后的凝膠板置于生理鹽水中浸泡8～24小時，其間更換生理鹽水2～3次，徹底洗凈各種未結合的雜蛋白，干燥后，用染色液染色，脫色，吸附環(huán)即成一中心深染，隨面積擴大色澤逐漸變淡，直至消失的著色環(huán)，晾干后觀察著色環(huán)顏色，判定檢測結果。所用染色液可以是麗春紅、氨基黑等常用染色液。觀察時如著色環(huán)為無色，則為陰性，而根據(jù)不同染色液呈現(xiàn)不同顏色時，則為陽性。
本發(fā)明活動性結核標志物的檢測方法與OT皮試、酶聯(lián)免疫ELISA、DNA探針、PCR基因擴增技術及典型病例組患者進行X線計算機斷層攝影(CT)、磁共振成像(MRI)等進行多組對比試驗，試驗及臨床研究證明，′H多肽檢測的總敏感度為86.87％，特異度96.15％，準確度95.20％，診斷效率為83.53％，批內(nèi)CV1.2％，批間CV2.0％，P＜0.005，X2檢驗＝443.19，相關系數(shù)＝0.93。
本發(fā)明活動性結核標志物的檢測方法的優(yōu)點在于其準確性高和實用性廣，1)由于檢測對象不是抗原，故解決了肺外結核，如骨結核、肝結核、子宮內(nèi)膜結核等深部病變部位取材的困難，使肺部結核不排菌時，痰培養(yǎng)及抗酸染色出現(xiàn)的假陰性結果得以糾正。2)由于檢測對象不是抗體，故不受曾否預防接種和曾否罹患結核病的影響，使結果具確診的價值。3)檢測程序合理，設計科學，干擾因素少，在體外檢查機體感染結核菌情況，完全避免了皮膚實驗造成的醫(yī)源性損傷。4)與疾病的輕重呈正相關，與療效的好差成負相關，因半衰期很短，有助于臨床調(diào)整藥物、觀察療效、及時判斷采取相應措施。5)方法簡捷，費用低廉，既可用于臨床，又可用于大批量人群普查和流行病學調(diào)查。
下面結合附圖
詳細說明本發(fā)明實施例實施例1一、試劑1、反應原CD-1331(顆粒性反原)2、活化劑多肽3、緩沖液巴比妥緩沖液(PH＝8.6，u＝0.03)4、介質瓊脂糖(日本進口)5、染色液麗春紅二、操作取反應原CD1331(安瓶、10U)1支，加入多肽4.0ml，充分混勻備用。取瓊脂糖0.9g于三角燒瓶中，加入巴比妥緩沖液100ml，置于沸水浴加熱溶化，準確吸取瓊脂糖介質緩沖液10ml于燒杯中，待41℃溫度時加反應原液1,0ml，充分混勻，乘熱倒入制板框中，靜置冷卻后移去文具夾、蓋片及U型框，制成2mm×70mm×130mm的反應原凝膠板。將孔位模板襯在抗原凝膠板下，用打孔器對準孔位打孔(孔徑3mm，孔間距15mm)，并挑出孔中凝膠塊，每孔加入待測樣品血清10μl(離體放置1小時)，避免氣泡外溢。將加樣后的凝膠板水平放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃下擴散30分鐘。取出凝膠板，放入生理鹽水中浸泡8小時，其間更換2次生理鹽水，于燥后用麗春紅染色液染色，脫色，晾干后觀察吸附環(huán)里紅色，檢測結果為陽性。
實施例2一、試劑1、反應原CD-1331(顆粒性反應原)2、活化劑內(nèi)纖酶3、緩沖液薩姆緩沖液(PH＝8.5，υ＝0.03)4、介質瓊脂糖(國產(chǎn))5、染色液氨基黑二、操作取反應原CD1331(安瓶、10U)1支，加入內(nèi)纖酶1.0ml，充分混勻備用。取瓊脂糖0.9g于三角燒瓶中，加入薩姆緩沖液100ml，置于沸水浴加熱溶化，準確吸取瓊脂糖介質緩沖液10ml于燒杯中，待溫度45℃時加反應原液1.0ml，充分混勻，乘熱倒入制板框中，靜置冷卻后移去文具夾、蓋片及U型框，制成2mm×70mm×130mm的反應原凝膠板。將孔位模板襯在抗原凝膠板下，用打孔器對準孔位打孔(孔徑3mm，孔間距12mm)，并挑出孔中凝膠塊，每孔加入待測樣品血槳10μl(離體放置8小時)，避免氣泡外溢。將加樣后的凝膠板水平放置于水浴箱內(nèi)，在37℃下擴散15小時。取出凝膠板，放入生理鹽水中浸泡24小時，其間更換3次生理鹽水，干燥后用氨基黑染色液染色，脫色，晾于后觀察吸附環(huán)呈蘭色，檢測結果為陽性。
權利要求
1.一種活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于1)在反應原CD1331中加入活化劑，充分混合備用；2)在瓊脂糖介質中加入緩沖液，加熱熔化，并控制PH＝8.5～8.6，離子強度u＝0.03，于40～46℃溫度下加入反應原CD1331，制備反應原凝膠板；3)利用孔位模板對反應原凝膠板進行打孔，然后向孔內(nèi)加入待測樣品；4)將加樣后的反應原凝膠板于37～42℃的溫度下擴散30分鐘～16小時；5)將擴散后的反應原凝膠板置于生理鹽水中浸泡8～24小時，其間更換生理鹽水2～3次，干燥后用染色液染色，脫色，晾干后觀察吸環(huán)顏色。
2.如權利要求1所述的活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于瓊脂糖介質緩沖液的含水量大于99％。
3.如權利要求1所述的活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于瓊脂糖介質緩沖液與反應原的混合比例為10∶1。
4.如權利要求1所述的活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于反應原凝膠板的厚度為2mm。
5.如權利要求1所述的活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于凝膠板打孔用孔位模板的孔徑為3mm，孔間距為12～15mm。
6.如權利要求1所述的活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于待測樣品是離體放置時間不超過10小時的體液。
7.如權利要求1所述的活動性結核標志物′H多肽的檢測方法，其特征在于反應原CD1331是顆粒性反應原。
全文摘要
本發(fā)明提供一種活動性結核標志物′H多肽的檢測方法,首先在反應原CD1331中加入活化劑備用;在瓊脂糖介質中加入緩沖液,加熱熔化,并控制pH=8.5～8.6,離子強度u=0.03,于40～46℃溫度下加入反應原CD1331,制備反應原凝膠板;對反應原凝膠板打孔,然后向孔內(nèi)加入待測樣品;于37～42℃擴散30分鐘～16小時,用生理鹽水浸泡,干燥,染色,脫色,觀察吸附環(huán)顏色。本法適合于活動期結核病患者體液檢查,敏感度86.87%,特異度96.15%,準確度95.20%。
文檔編號G01N33/53GK1186242SQ9611784
公開日1998年7月1日 申請日期1996年12月23日 優(yōu)先權日1996年12月23日
發(fā)明者胡娟 申請人:成都軍區(qū)生物醫(yī)學研究所