專利名稱：：生物吸附載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物吸附載體，特別涉及一種以亳微結(jié)構(gòu)(nanostructured)的表面形態(tài)為基礎(chǔ)的生物吸附載體。
背景技術(shù)：
：常用生物吸附載體包括聚合物，共聚物或有化學(xué)官能團的沒有明顯物理顯微結(jié)構(gòu)的聚合物表面(即，其表面積由載體的平均幾何形狀來確定)。從微觀角度來說，聚合物表面提供了親水和疏水位點是不均一的，從而使生物分子有不同水平的對吸附劑底物親和能力。在一個平的表面上，生物分子經(jīng)擴散而脫離和吸附到底物上的可能性是相同的。通常吸附速度可通過搖動或振蕩溶液來提高。發(fā)明概要簡單的說，本發(fā)明一方面提供一種生物吸附載體，其含有一個惰性的底物來支持一個亳微結(jié)構(gòu)表面，表面包含涂布金屬的，定向排列的，不連續(xù)的亞微米大小的單元，單元有很高的高徑比，例如大于3且表面數(shù)密度(arealnumberdensiy)在1-200/μm2范圍內(nèi)。有利的是，亳微結(jié)構(gòu)表面的物理形態(tài)(在這里描述為亳微結(jié)構(gòu)是因為表面的體積以納米表征)為溶液內(nèi)與表面接觸的生物分子在短的擴散路程長度內(nèi)提供了高的比表面積。其上吸附生物分子的亳微結(jié)構(gòu)須晶上的涂布材料可以不同，但最好用簡單金屬如貴金屬。有亳微結(jié)構(gòu)表面的底物通常是柔性的，惰性的，并易被切開或成形的。生物分子可快速吸附到載體上，并形成高水平(85-90％)的牢固結(jié)合和高的絕對結(jié)合數(shù)量(～10μg/cm2)，且不需要搖動或振蕩。而且，牢固結(jié)合的生物分子表現(xiàn)出仍保持生物活性。鑒于生物活性物質(zhì)的高度不均一性，即三聚物(通常只含有三個不同的單體)與生物活性物質(zhì)(通常有11個或更多的不同的單體)相比是簡單的，因此其結(jié)合緊密度和生物活性的保留是特別驚人的。本發(fā)明亳微結(jié)構(gòu)有高的高徑比，其表面數(shù)密度在40-50/μm2，與其它該領(lǐng)域已知的吸附載體相比可為吸附生物分子提供10-15倍的平面表面積。亳微結(jié)構(gòu)須晶上的純金屬涂層如Pt可形成一個均一的吸附表面。而且，定向排列單元的很高的高徑比和它們的高填充密度(即表面數(shù)密度)可使生物分子在擴散入亳微結(jié)構(gòu)層時被暫時截留，從而不需搖動或振蕩即可獲得更多的生物分子/吸附表面的碰撞機會。本發(fā)明另一方面是生物吸附載體可有利地用作分離裝置如過濾器，傳感器及其他。例如，含有生物活性物質(zhì)的流體可在生物吸附載體上方流過或通過生物吸附載體，以使流體內(nèi)的一個或多個生物活性物質(zhì)從流體被抽提出或被分離。抽提出的或分離出的生物活性物質(zhì)單層粘附在亳微結(jié)構(gòu)單元上。生物活性物質(zhì)可以某種方式在任意的終點時被取出，這些方式如直至吸附了預(yù)定水平的物質(zhì)，吸附了預(yù)定的時間，或直至載體被生物活性物質(zhì)所飽和。本發(fā)明還有一個方面是生物吸附載體可用于穩(wěn)態(tài)的從一種物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)變過程，如作為一種催化劑。這些特征為本發(fā)明提供了幾個方面，這些是該領(lǐng)域技術(shù)人員所不能預(yù)見的。與吸附載體
技術(shù)領(lǐng)域：
的已知技術(shù)相比，生物分子結(jié)合到這種物質(zhì)表面的速度比生物分子結(jié)合到常規(guī)平面表面上的速度更快。令人驚奇的是，生物分子的結(jié)合不僅快速而且有高的表面覆蓋率。本發(fā)明另一個有利的特征是生物分子的結(jié)合緊密度，其可用十二烷基硫酸鈉(SDS)處理時耐受解吸的能力來描述。如此高的殘留結(jié)合通常只有當(dāng)這種生物分子以共價鍵結(jié)合到表面上時才會有。同樣令人驚奇的是在如此牢固結(jié)合的同時，生物分子還可保留其生物活性。利用亳微結(jié)構(gòu)單元特別的優(yōu)點可制成一種組合體，其含有(a)一個生物吸附載體，其含有一個支持一個亳微結(jié)構(gòu)表面的惰性底物載體，表面包含涂布金屬的，定向排列的，不連續(xù)的亞微米大小的單元，單元有高的高徑比且表面數(shù)密度在1-200/μm2范圍內(nèi)和(b)吸附在涂布金屬的單元上的單層生物活性物質(zhì)，其中被吸附的一層具有生物活性。有利的是，組合體也可用作一個分離裝置，其中吸附在涂布金屬的單元上的生物活性物質(zhì)對特定的生物活性物質(zhì)具有特異性。或者，本發(fā)明還有一個方面是提供一個組合體，其包含(a)一個生物吸附載體，其含有一個支持亳微結(jié)構(gòu)表面的惰性底物，表面包含敷形涂布生物吸附劑的，定向排列的，不連續(xù)的亞微米大小的單元，單元有高的高徑比且表面數(shù)密度在1-200/μm2范圍內(nèi)(b)一個吸附在敷形涂布生物吸附劑的單元上的第一生物活性物質(zhì)單層，其中被吸附層具有生物活性，和(c)吸附在第一生物活性物質(zhì)單層上的第二生物活性物質(zhì)單層。例如，第一個組合體可用第一生物活性物質(zhì)單層涂布，該單層可暫時或永久地與藥物(第二生物活性物質(zhì)單層)結(jié)合，從而使藥物以飽和或預(yù)定劑量涂布在組合體上。然后涂布有藥物的組合體可用于使藥物在特定部位定時解吸或仍保留藥物，其通?？晌降交螂x開所給定的區(qū)域。在本申請中“生物活性物質(zhì)”也稱”生物分子“，是指分子如有生化，免疫化學(xué)，生理和/或藥物活性的分子，即能以一種影響生物過程的方式進行反應(yīng)的分子，這類物質(zhì)包括蛋白質(zhì)，抗體，抗原，酶，輔因子，卵磷脂，激素，脂質(zhì)，介質(zhì)，受體，凝集因子，組蛋白，細胞受體和細胞表面抗原，以及還包括分子量(用SDS凝膠電泳測定)至少為1000以上，最好至少為5000以上的物質(zhì)或生物分子。附圖簡述圖1A是未涂布的不連續(xù)的亞微米大小的須晶的立體圖，該須晶由底物支持。圖1B是圖1A不連續(xù)的亞微米大小須晶被敷形涂布后的立體圖。圖2是放大倍數(shù)為10,000倍的掃描電子顯微照片(SEM)，其表明用膠乳部分包埋的涂布Pt的須晶，須晶形成用于吸附蛋白質(zhì)A的亳微結(jié)構(gòu)單元。圖3是放大倍數(shù)為150,000倍的掃描電子顯微照片(SEM)，其表明未包埋的在涂布銅的聚酰亞胺底物上的涂布Pt的須晶。圖4表示最初結(jié)合和牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)A吸附量對應(yīng)于時間的曲線圖。圖5表示最初結(jié)合和牢固結(jié)合的牛血清白蛋白(BSA)吸附量對應(yīng)于時間的曲線圖。圖6表示最初結(jié)合和牢固結(jié)合的人免疫球蛋白G(IgG)吸附量對應(yīng)于時間的曲線圖。圖7是放大倍數(shù)為150,000倍的掃描電子顯微照片(SEM)，其表明在吸附蛋白質(zhì)A后的涂布Pt的須晶。較佳實施例描述本發(fā)明提供一種生物吸附載體，其含有一個惰性的底物來支持一個亳微結(jié)構(gòu)表面，表面包含金屬涂布的，定向排列的，有不連續(xù)亞微米大小的須晶。或者，敷形涂布金屬的須晶可部分包埋或用第二種材料敷形涂布。亳微結(jié)構(gòu)表面不需搖動或振蕩即可快速且高度牢固地結(jié)合吸附生物分子。有利的是，結(jié)合的生物分子仍保持其生物活性。本申請所用的“亳微結(jié)構(gòu)”指在至少一個方向上空間大小大約為幾十納米數(shù)量級的組成不均勻的表面區(qū)域。這種在兩個方向上有空間不均勻性的亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域的例子是，底物表面上均勻地排列有伸展的涂布金屬的單元(納結(jié)構(gòu)單元)，單元間互不接觸，每單位面積內(nèi)有足夠的數(shù)目以獲得所需的性質(zhì)，如快速牢固結(jié)合。兩個方向上空間不均勻的亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域可以是一種沿任何兩個或三個正交方向至少有兩種不同的物質(zhì)如亳微結(jié)構(gòu)單元和空隙的區(qū)域。這種亳微結(jié)構(gòu)材料在如美國專利No.4,812,352中有所描述，它被引證包括在這里。簡單的說，將一種有機材料在接近室溫時真空氣相沉積在一個柔性的底物如聚酰亞胺織物上，形成約0.15微米數(shù)量級的厚度，這種有機材料基本上有平面形狀的分子和非定域的π-電子密度，如顏料N，N’-二(3，5-二甲苯基)苝-3，49，10二(二羧酰亞胺)，以下稱為PR149。此后，底物和PR149涂層在足夠的真空中退火以使最初均勻的顏料膜變?yōu)榫吒叨荣裎⒔Y(jié)構(gòu)的須晶。參照圖1(a)和1(b)，亳微結(jié)構(gòu)表面(10)包括不連續(xù)的均勻排列的結(jié)晶須晶(12)，其高為1至2微米，有高的高徑比(長度對寬度)和高的表面數(shù)密度(1-200/μm2)，直徑約為0.05微米。由底物(11)支持的須晶間的距離約為0.05微米或更小。因此得到的結(jié)晶須晶(12)的幾何表面積可比平面表面積(10)增加10到15倍。然后附著在最初底物(11)上的結(jié)晶須晶(12)可用金屬，半金屬，半導(dǎo)體，電介質(zhì)或有機物質(zhì)敷形涂布。在本申請中，噴鍍或氣相沉積金屬涂層，特別是鉑層，是直接吸附生物分子所需的表面。金屬涂層(13)也有助于加固涂布過的須晶(14)和維持須晶粘結(jié)在底物(11)上以防止其進入溶液。或者，上述的涂布過的亳微結(jié)構(gòu)單元還可任用一種有機物質(zhì)進一步敷形涂布以圍繞每個亳微結(jié)構(gòu)單元施加一層有生物官能團的薄的敷形涂層。這種涂層的涂敷方法包括，例如自組裝單層。而且，上述的亳微結(jié)構(gòu)表面可通過用可流動的物質(zhì)，如預(yù)聚合物，覆蓋須晶(14)結(jié)構(gòu)來部分包埋，預(yù)聚合物只部分填充須晶間的空隙，當(dāng)其固化成固態(tài)時，其可從原來的底物上剝落。在剝落時，固化聚合物的部分包埋劑將須晶拉出原來的底物，由于使須晶末端突出而形成起紋理的表面。該表面現(xiàn)在可作為生物分子吸附表面。許多聚合物可作為包埋劑，并可被選用來進一步增加生物分子的結(jié)合性。較佳的底物材料包括有機或無機材料，如聚合物，金屬，陶瓷，玻璃和半導(dǎo)體。較佳的有機材料是涂布金屬的聚酰亞胺薄層(工業(yè)上可從DuPontCorp.以商品名KAPTONTM獲得)。本發(fā)明適用的其它底物材料的例子在美國專利No.4,812,352中有描述，并且引證包括在這里。在美國專利No.5,238,729中描述了一種用于證實本發(fā)明的特別有用的制造方法來制備生物吸附載體的亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域，且該描述被引證包括在這里。在美國專利No.5,039,561和4,812,352中描述了含有亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域的亳微結(jié)構(gòu)單元，該描述被引證包括在這里。其它產(chǎn)生亳微結(jié)構(gòu)表面的方法包括(1)有機顏料真空沉積在加熱的底物上，(2)用物理蒸氣遷移生長而不用真空蒸氣沉積，(3)無機材料以高入射角真空沉積，(4)有不同噴涂速率的聚合物，半導(dǎo)體或合金的離子噴涂浸蝕或RF噴涂浸蝕，(5)采用微島(microisland)掩蔽的聚合物噴涂浸蝕，(6)光刻法(UV和X-射線)，和電子束石印術(shù)，(7)鋁水解而形成一水軟鋁石，(8)金屬的電化學(xué)腐蝕和粗糙金屬的電鍍，(9)光聚合物表面的光刻法，(10)低共熔混合物直接固化和浸蝕法，和(11)氣液固(VLS)晶體生長。這些方法的任一個都可用于形成亳微結(jié)構(gòu)表面。一些技術(shù)或方法有利于制備如須晶狀結(jié)構(gòu)。在J.Vac.Sci.Tech.(1983，1(3)，1398-1402)和美國專利No.4,812,352，5,039,561和5,238,729中描述了無機物，金屬或半導(dǎo)體為基礎(chǔ)的微結(jié)構(gòu)層或微結(jié)構(gòu)的制備方法?？捎糜谥苽漤毦У脑牧习ㄓ袡C和無機化合物。須晶對于后續(xù)的薄層金屬涂布，以及任選的和敷形涂布和任選的包埋必須是無反應(yīng)性的或不活潑的骨架。較佳的有機材料可大致分為多環(huán)芳香烴和雜環(huán)芳香烴化合物。特別有用的多環(huán)芳香烴包括，例如萘，菲，苝，蒽，暈苯和芘這些類別。較佳的多環(huán)芳香烴是N，N’-二(3，5-二甲苯基)苝-3，49，10二(二羧酰亞胺)(工業(yè)上可從Hoechst-CelaneseCorp.以商品名“C.I.PigmentRed149”獲得，也稱為“PR149”)。用于制備須晶的有機材料可用該領(lǐng)域已知涂布技術(shù)來將有機材料層涂布在底物上，其包括(但不局限于)真空蒸發(fā)，噴鍍，化學(xué)蒸氣沉積，噴涂，溶液吸附，LangmuirBlodgett，或刮涂。有機層的涂布最好用物理真空蒸氣沉積(即，有機材料在所施加的真空下升華)。在沉積時底物較佳的溫度取決于所選擇的有機材料。對于PR149，底物的溫度近室溫(即，約25℃)是理想的。在制備有機須晶的較佳方法中，沉積的有機層的厚度將決定在退火過程中形成的微結(jié)構(gòu)的主要方向。這一較佳的方法包括在或接近室溫時使形成須晶的材料沉積，然后升高底物的溫度，在低于約130帕斯卡的真空下，最好低于10-2帕斯卡的真空下對形成須晶的材料退火。須晶在底物上生長，其特征和方法在美國專利No.5,039,561中有所描述，它被引證并包括在這里。這種獲得須晶的方法在下面的實施例1中也有描述。另一種形成須晶的方法包括將形成須晶的材料沉積在底物上，其中對形成須晶的材料和底物升溫。材料被在低于約130帕斯卡的真空下沉積，直至獲得有高的高徑比的隨機取向的須晶。這種可供選擇的方法在美國專利No.5,352,651中有所描述，被引證并包括在這里。在兩種情況下，PR149都是較佳的有機材料。PR149層在退火前的厚度通常為約0.05至0.3μm，更佳在0.05至0.15μm，最佳在0.1至0.15μm。當(dāng)有機材料退火時，如在1.0×10-2帕斯卡和約250℃退火30分鐘，就形成了須晶。最好，須晶是單晶的或多晶的而不是無定形的。由于晶體的特征和微結(jié)構(gòu)的一致取向，須晶層的物理和化學(xué)性質(zhì)是各向異性的。通常須晶的取向是一致的，是垂直于底物表面的。每個須晶的較佳長度在0.1至3μm，更佳為0.5至2.5μm。每個須晶的橫截面寬度最好小于0.1μm。須晶最好有高的高徑比(即須晶的長度和須晶的直徑之比約在3∶1至100∶1之間)。敷形涂布的亳微結(jié)構(gòu)單元的表面數(shù)密度較佳是在1-200/μm2，最好在5-50/μm2范圍內(nèi)。而且，無論亳微結(jié)構(gòu)單元是同軸取向還是隨機取向，最好每個亳微結(jié)構(gòu)單元的至少一端與所有亳微結(jié)構(gòu)單元共有的二維平面接觸。參照圖1B，亞微米寬度和幾微米長度的亳微結(jié)構(gòu)單元(14)，是一個包含有機須晶核心(12)和至少一個敷形涂層(13)的復(fù)合物。敷形涂層材料從生物材料，有機材料如自組裝單層、有機顏料如酞菁或雜環(huán)芳香族化合物，或無機材料中選出。通常敷形涂層材料被選擇用于優(yōu)化生物分子的吸附和結(jié)合。無機涂層材料最好從導(dǎo)電金屬，半金屬，電介質(zhì)和半導(dǎo)體中選出。較佳的金屬敷形涂層材料包括Pt，Pd，Ag，Cu，Au，和合金，如CrCo，NiCr和PtIr。圍繞須晶的敷形涂層材料其壁厚在約0.5nm至約50nm范圍內(nèi)。敷形涂層可用常規(guī)技術(shù)沉積在須晶上，其包括，例如在美國專利No.5,039,561中描述的方法。敷形涂層沉積的方法應(yīng)避免機械的或類似機械的力擾亂亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域。更佳的是無機敷形涂層采用真空沉積的方法沉積，例如真空升華，噴涂，蒸氣遷移和化學(xué)蒸氣沉積的方法。此外，可在亳微結(jié)構(gòu)單元外涂敷第二，第三或更多層敷形涂層。一種特別有用的涂敷附加的敷形涂層的方法是從溶液中吸附有機材料，例如末端硫代的低聚物。盡管最好用多組分的亳微結(jié)構(gòu)單元(如上所述)，但是本發(fā)明也考慮了含有一個組分的亳微結(jié)構(gòu)單元。單一組分的單元有和多組分單元類似的尺寸，然而，單一組分的單元只含有一種材料，如金屬，參照如上所述的金屬敷形涂層?；蛘?，盡管不是最佳的，但可任意在亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域的暴露表面涂敷一種有機或無機的包埋劑，其中包埋劑全部或部分地包埋亳微結(jié)構(gòu)單元。包埋劑可用適于特定包埋劑的方法以液態(tài)，氣態(tài)或固態(tài)涂敷到亳微結(jié)構(gòu)表面區(qū)域上。涂敷的包埋劑可用適于所用特定材料的方法固化，縮合或聚合。在亳微結(jié)構(gòu)單元被包埋后，得到的復(fù)合體即被包埋的本發(fā)明的生物吸附載體，用機械的方法，如將包埋的生物吸附載體從底物中拉出，將底物從包埋的生物吸附載體中拉出或兩者共同作用的方法，使載體從底物-亳微結(jié)構(gòu)層界面剝落。在一些例子中，包埋的生物吸附載體在包埋劑固化時會自動脫落。另一種較佳的方法是制造包埋的生物吸附載體的無溶劑方法，該方法可用于任何有亳微結(jié)構(gòu)表面的組分，即，一個包含各種材料組分，形狀，取向和堆積密度的亳微結(jié)構(gòu)單元的組合。如美國專利No.5,352,651中所述，亳微結(jié)構(gòu)單元可用熱輥壓延入聚合物織物的任何預(yù)定的深度。生物吸附載體通常在25-50μm厚的底物上形成大面積的片材，適于切割或沖出許多小的樣品片。例如，可沖出小直徑的片(～6mm)并將其置于微量滴定孔的底部以使亳微結(jié)構(gòu)表面面對孔的內(nèi)部。有利的是，亳微結(jié)構(gòu)表面的高表面積和小的體積不會受到由于化學(xué)和生物官能團包括在須晶的敷形涂層中的影響，因此增加了亳微結(jié)構(gòu)表面的用途和對生物活性的特異性。我們相信本發(fā)明的生物吸附載體上結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)量的增加是由于實施例中所示的亳微結(jié)構(gòu)表面的表面積增加了10至15倍。用對SDS的耐受性測定的牢固結(jié)合的生物分子的比率始終是高的，特別是對Pt，并且它代表了比常規(guī)載體性能的提高。不想受理論約束，但與常規(guī)的生物吸附載體相比，在天然氧化的純金屬底物上可以預(yù)期小的親水和疏水區(qū)域的均一性更好，這部分地解釋了更高的對SDS的耐受性和更高水平的結(jié)合數(shù)量。不想受理論約束，但據(jù)認(rèn)為與絕緣(聚合物)材料相比，金屬底物(吸附劑)上的電荷容易重新分配，這也使溶解的生物分子易接近吸附劑-水界面而發(fā)生結(jié)合(在此處會產(chǎn)生色散力和靜電鏡像力)。當(dāng)生物分子擴散進入或離開吸附劑時，與在均勻的平的吸附劑表面上發(fā)生的碰撞機會相比，在相對高的柱狀須晶間生物分子的有效截留將引起每單位隨機移動距離內(nèi)有更多的生物分子/吸附劑間的碰撞機會。即，如果當(dāng)生物分子接近須晶表面但不吸附而是擴散離開時，它將主要向另一個只有幾步“費克擴散”距離的須晶表面擴散，因為大多數(shù)須晶的表面是須晶的側(cè)面。在一個無此類結(jié)構(gòu)的平的底物上，生物分子的一半時間是靜態(tài)擴散離開。碰撞率的增加可解釋吸附過程的動力學(xué)的改善。本發(fā)明的生物吸附載體可用于任何需要生物分子結(jié)合的場合。載體特別適于需要更牢固結(jié)合的生物分子，或更高密度或更高吸附速率的情況；例如，結(jié)合的生物分子數(shù)量限制了反應(yīng)速度的場合。這類情況通常發(fā)生在酶反應(yīng)器中，在這里通常反應(yīng)速率與酶濃度是表現(xiàn)出一級動力學(xué)。另一個例子是純化系統(tǒng)，其中系統(tǒng)的性能通常與某些官能團的數(shù)量成比例，如親和純化系統(tǒng)中的結(jié)合生物分子。另一個例子是分析測試，其中測試的靈敏度與檢測器分子(配體)的敏感性量成比例，且通常受檢測器分子的數(shù)量限制。如果結(jié)合的檢測器分子(通常是生物分子)的密度增加，結(jié)合的被分析物數(shù)量就增加，信號就增加。還有一個例子是結(jié)合的生物分子用作生物傳感器，其中檢測靈敏度隨結(jié)合的生物分子的數(shù)量而變。本發(fā)明的目的和優(yōu)點還在下列實施例中進一步描述，但這些實施例中列舉的特定的材料和數(shù)量以及條件和細節(jié)不應(yīng)被理解為本發(fā)明的限制范圍。所有的材料是工業(yè)上可獲得的或是該領(lǐng)域已知的，但加以描述或顯而易見的其他情況除外。所有的樣品除另有描述，均制備和分析三份，其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差歸納列在下列表中。實施例對SDS的耐受性下面報告中的對SDS的耐受性百分比按下列公式計算[(牢固結(jié)合的蛋白質(zhì))÷(最初結(jié)合的蛋白質(zhì))]×100＝％對SDS的耐受性。它是耐受SDS增溶處理的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。實施例1-2一片3cm×10cm的玻璃微載物片，用銅進行RF噴鍍至厚度約為100nm。將有機顏料N，N’-二(3，5-二甲苯基)苝-3，49，10二(二羧酰亞胺)(PR149)以20nm/min的平均沉積速度真空(基礎(chǔ)壓力為約2.0×10-4帕斯卡)蒸氣相沉積在涂布銅的載物片上，至厚度為146nm。如美國專利No.4,812,352所述的那樣，將涂有有機顏料層的載物片在真空下退火至最高溫度為200℃，以使有機顏料層變成有不連續(xù)的垂直取向的結(jié)晶須晶的亳微結(jié)構(gòu)層。然后大約一半的須晶狀有機顏料層用銅進行RF噴鍍，以在須晶上形成相當(dāng)平面厚度約100nm的敷形涂層。由于須晶表面積比平面表面積大得多，因此銅涂層的有效厚度應(yīng)遠遠小于100nm。大約三分之一的須晶用鉑噴鍍以形成相當(dāng)于平面厚度為約100nm的敷形涂層。載物片剩下的約六分之一的面積不涂布，其上只有加上制備的裸PR149須晶。一個常用的空氣加壓涂料噴霧器可用于在敷形涂布的亳微結(jié)構(gòu)層上噴涂一層包埋的膠乳前體(工業(yè)上可從3MCo.以商品名“STRIPPABLEMASKANTYR-43”獲得)，其形成的濕厚度為約0.157至0.165mm。然后包埋層在常規(guī)的空氣烘箱中在約66℃干燥約20分鐘。從涂布的組合體的三個區(qū)域上分別切下一組(每組含有三個)邊長為5mm的正方形樣品，并用鑷子從載玻片上剝下。原先涂布在載玻片上的銅涂層仍在玻片上。第一組樣品含有以銅敷形涂布并包埋在可剝落的保護層中的須晶(實施例1)。三組樣品中的第二組樣品含有鉑敷形涂布并包埋在可剝落的保護層中的須晶(實施例2)。第一對照組是含有裸須晶(沒有敷形涂布)且包埋在可剝落的保護層中的5mm正方形的一組樣品。第二對照組是從干燥的可剝落保護層上切下的一組三個5mm的正方形樣品，該保護層噴涂在鋼板上形成了一個無包埋的亳微結(jié)構(gòu)的表面。由于有涂布金屬的須晶的樣品片其亳微結(jié)構(gòu)表面有高度的光吸收效應(yīng)，因此其看上去非常黑。部分包埋在可剝落保護層中的以鉑敷形涂布的須晶其表面比以銅敷形涂布的須晶表面更有紋理，圖2的SEM照片表示了以鉑敷形涂布的須晶表面。為測定蛋白質(zhì)結(jié)合，每個正方形樣品在250μg/ml，125I放射標(biāo)記的蛋白質(zhì)A(GenzymeCorp.，Boston，MA)的磷酸鹽緩沖液中(0.15MNaCl在25mM磷酸鈉中)(這里稱為PBS，pH7.5)振蕩恒溫反應(yīng)18小時。色層分析雜志，第512卷，345-363頁(1990)(J.Chromatog，vol.512，p.345-363(1990))。然后表面用3.0M，pH9.0的乙醇胺處理1小時，再用PBS沖洗四次。用Packard自動γ輻射計數(shù)儀(5230型，CanberraIndustriesInc./PackardInstrumentCo.，Meriden，CT)測定殘余的放射性來得出蛋白質(zhì)的最初結(jié)合水平。每一組樣品，即涂布鉑，涂布銅和未涂布的樣品均一式三份地進行制備和分析。膠乳對照品也一式三份地制備和分析。三個未涂布的，以鉑敷形涂布的和以銅敷形涂布的須晶樣品，以及膠乳對照品每單位面積吸附的蛋白質(zhì)量的平均值和平均偏差歸納在表1中。然后樣品進一步在1％的SDS水溶液中于37℃下恒溫反應(yīng)4小時，然后用SDS淋洗三次，以除去結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。再通過測定剩下的放射性以測定殘余的牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。三個樣品對SDS的耐受性和牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)密度的平均值和平均偏差歸納在表1中。值得注意的是，鉑敷形涂布的須晶樣品與其它樣品相比有顯著的較高的結(jié)合性和對SDS的耐受性。盡管，在SDS處理后，膠乳對照樣品和涂布銅的須晶樣品被損壞，未涂布樣品發(fā)生斷裂，但是樣品還可進行分析處理，結(jié)果列在表1。敷形涂布鉑的須晶仍保持完整。表1</tables>實施例3-4這些實施例采用相同類型的如實施例1和2制備的部分包埋的亳微結(jié)構(gòu)樣品，但是恒溫反應(yīng)的時間更短，所用的緩沖液也不同。將邊長為5mm樣品方片從如實施例1和2所述制備的的膠乳包埋的有須晶的樣品上切下，并將其與涂布銅的載玻片分離。從涂布銅和涂布鉑的區(qū)域和平面膠乳對照區(qū)上各切下6個方片。從裸須晶對照區(qū)域只切下三個方片。采用與實施例1和2所述相同的蛋白質(zhì)A結(jié)合過程和測定方法，只是最初蛋白質(zhì)恒溫反應(yīng)時間為2小時而不是18小時，并用兩個不同的緩沖液。每種類型的三個方片用pH7.5的含蛋白質(zhì)A的PBS涂布，其它三個方片用pH7.5，含蛋白質(zhì)A的1.5M硫酸鈉的磷酸鈉緩沖液(下面稱為“硫酸鹽緩沖液”)涂布。三個從包埋的裸須晶樣品區(qū)域獲得的5mm的方片只用含蛋白質(zhì)A的PBS緩沖液涂布。所有的樣品在乙醇胺鈍化后均用PBS淋洗三次。表2歸納了對于每種樣品類型和緩沖液條件的三份樣品的最初結(jié)合，對SDS的耐受性和牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)密度及標(biāo)準(zhǔn)偏差。表2證實了實施例1和2的結(jié)果，即涂布鉑的樣品比涂布銅或裸須晶能更好地吸附蛋白質(zhì)，并繼續(xù)有很高的對SDS的耐受性的趨勢。對于鉑，硫酸鹽緩沖液可吸附更多的蛋白質(zhì)。表2a(PBS)</tables>表2b(硫酸鈉)</tables>實施例5-8實施例5-8證明無包埋的須晶的亳微結(jié)構(gòu)表面可在更短的暴露時間內(nèi)吸附更多的蛋白質(zhì)，并揭示不同金屬的相應(yīng)效果，其與表面形態(tài)無關(guān)。這些實施例特別比較了四種金屬，它們均涂布在同一樣品的不同象限內(nèi)，因此保證了每個須晶微結(jié)構(gòu)是相同的，盡管在實施例9-12中有特別，但圖3顯示了以鉑敷形涂布的須晶，特別是用于本實施例的須晶的SEM顯微照片。在兩個不銹鋼鋼圈之間拉伸安裝0.050mm(2mil)厚的聚酰亞胺薄層(ICIFilms)以形成一個直徑為8.3cm的片。在該聚酰亞胺底物片上rf噴鍍銅，形成的厚度約180nm。PR149紅顏料如實施例1-2所述用真空蒸氣沉積在涂布銅的聚酰亞胺上，形成大約150nm厚的涂層，然后在真空(基礎(chǔ)壓力為2.5×10-5帕斯卡)中于280℃退火40分鐘。涂布有紅色顏料的聚酰亞胺轉(zhuǎn)變成1-2μm高的取向的結(jié)晶須晶。在一個單獨的常規(guī)(13.47MHz)rf噴鍍真空器中，須晶連續(xù)地用Cu(實施例5)，CoCr(86∶14)(實施例6)和Fe(實施例7)沉積噴鍍分別敷形涂布在三個象限上，通過一個金屬網(wǎng)罩每次只暴露底物片的一個象限。20cm的靶在樣品上方10cm，底物用水冷卻，并使其在3.2帕斯卡Ar下用500瓦正向功率和1200-1600伏電壓靶偏壓噴鍍10分鐘。Cu，CoCr和Fe的等質(zhì)量厚度分別為約350nm，250nm和250nm。在單獨的類似噴鍍?nèi)萜髦?，鉑被噴鍍在底物片的第四象限，其等質(zhì)量厚度為120nm(實施例8)。將第二個涂布銅的聚酰亞胺片用PR149蒸汽涂布，但不退火(即沒有須晶)來作為對照。Fe，Cu，CoCr和Pt涂層如實施例5-8所述同樣方式噴鍍沉積在未轉(zhuǎn)化的顏料層上。從亳微結(jié)構(gòu)樣品片和對照樣品片的每個象限中切下邊長為5mm的六個方片(共有48片)。方片一式三份在含250μg/ml，125I標(biāo)記的蛋白質(zhì)A的PBS或硫酸鹽緩沖液中保溫兩個小時而不搖動或振蕩。所有的樣品均用適當(dāng)?shù)木彌_液淋洗。剩余的未結(jié)合的表面用無放射性標(biāo)記的BSA(牛血清白蛋白)溶液(2.5mg/ml，在PBS緩沖液中)在不搖動或振蕩下保溫或反應(yīng)1小時來鈍化。如實施例1和2所述，在用PBS緩沖液沖洗三次后，通過測定剩余的放射性來測定總的蛋白質(zhì)A的結(jié)合量，如實施例1所述。然后用SDS處理，在不振蕩下除去未牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)。再測定放射性以測定牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)的密度。表3歸納了對于每種緩沖液，四種涂布金屬的須晶樣品類型的最初結(jié)合，對SDS的耐受性和牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)量。由于所有涂布金屬的PR149對照樣品沒有須晶結(jié)構(gòu)，其在沖洗或用SDS處理后發(fā)生崩解，即覆蓋金屬層的苝涂層從聚酰亞胺底物上剝落，所以對照樣品沒有數(shù)據(jù)。所有的涂布金屬的須晶樣品在整個實驗中保持完整。表3a(PBS)表3b(硫酸鹽緩沖液)</tables>表3a和表3b的結(jié)果顯示，在僅僅兩個小時內(nèi)，在所有步驟均不搖動或振蕩樣品的情況下，在未包埋的涂布金屬的須晶上牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)A的質(zhì)量密度出乎意料地高。這些數(shù)量在數(shù)量級上大于實施例3-4的從被包埋的須晶獲得的數(shù)量。實施例9-14這些實施例研究了非包埋的，敷形涂布鉑的須晶的吸附動力學(xué)過程，其表明短達7.5分鐘的保溫時間足以實現(xiàn)顯著的結(jié)合，且也包括了另外兩個蛋白質(zhì)，BSA和人IgG抗體。如實施例3-8所述，將片狀的直徑為8.3cm的涂布銅的聚酰亞胺用PR149蒸氣涂布，然后退火。如實施例5-8所述，將得到的亳微結(jié)構(gòu)須晶用rf噴鍍壓力為1.3帕斯卡的Ar和200瓦正向功率進行Pt的敷形涂布以形成120nm的等質(zhì)量厚度。圖3顯示了涂布鉑的須晶的放大倍數(shù)為150,000倍的高分辨率SEM顯微照片。在須晶的鉑涂層上明顯有高度精細的結(jié)狀結(jié)構(gòu)。從片上一式三份切下足夠數(shù)量的5mm樣品方片以對三個蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)A，人IgG抗體和BSA)，在PBS和硫酸鈉緩沖液系統(tǒng)中，采用五個保溫時間即7.5，15，30，60和120分鐘進行結(jié)合研究。125I標(biāo)記的蛋白質(zhì)A溶液與實施例1-8中的相同。三個蛋白質(zhì)的濃度均為250μg/ml(BSA和人IgG在工業(yè)上均可從SigmaChemicalCo.獲得其無放射性的形式)。三個蛋白質(zhì)溶液的氯化物濃度均為0.15M，pH為7.5。蛋白質(zhì)A和BSA的硫酸鹽濃度為1.5M，pH為7.5，人IgG中硫酸鹽濃度為0.75M，pH為7.5。所有未反應(yīng)的結(jié)合位點用無放射性標(biāo)記的BSA溶液(2.5mg/ml)鈍化一小時，然后用PBS沖洗三次，一次30分鐘，另兩次洗10分鐘。實施例1所述的SDS處理過程用于使蛋白質(zhì)變性，并除去未牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后，用平面的未敷形涂布的聚酰亞胺膜的同樣的一組對照樣品進行操作。表4和6歸納了兩種緩沖液中不同的蛋白質(zhì)類型和反應(yīng)時間的最初結(jié)合質(zhì)量密度，對SDS的耐受性和牢固結(jié)合的質(zhì)量密度的三個測定值的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差。表5和7歸納了從未涂布的聚酰亞胺對照膜上取下的樣品對于三種蛋白質(zhì)和兩種緩沖液在不同時間的最初結(jié)合質(zhì)量密度，對SDS的耐受性和牢固結(jié)合的質(zhì)量密度。圖4-6(曲線A-D)各自表示兩種緩沖液中最初結(jié)合和牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)對應(yīng)于吸附時間的曲線。APBSBPBS(在SDS處理之后)C硫酸鹽緩沖液D硫酸鹽緩沖液(在SDS處理之后)E硫酸鹽緩沖液中的對照樣品FPBS中的對照樣品GPBS中的對照樣品(在SDS處理之后)H硫酸鹽緩沖液中的對照樣品(在SDS處理之后)首先，與實施例5-8一致，結(jié)合水平很高，且與人IgG和BSA的結(jié)合水平比與蛋白質(zhì)A的結(jié)合水平更高。其次，結(jié)合水平在15分鐘后變?yōu)槠椒€(wěn)，且在小于最小觀測時間7.5分鐘時就有顯著高的結(jié)合水平。第三，與實施例5-8不同，對于人IgG(hIgG)和蛋白質(zhì)A來說，在PBS中的結(jié)合水平比在硫酸鹽緩沖液中要高。第四，對SDS的耐受性很高，且非常平均。表4下面歸納了在PBS中，涂布鉑的須晶對于三種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。表5下面歸納了聚酰亞胺膜對照樣品，在PBS中對于三種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。平面的未經(jīng)涂布的聚酰亞胺對照樣品的結(jié)果進一步證明了平面的聚合物表面蛋白質(zhì)吸附值相當(dāng)?shù)?。在圖4-6中也繪出了對照樣品牢固結(jié)合的蛋白質(zhì)量的平均值(曲線E-H)，其表明有亳微結(jié)構(gòu)的膜在兩小時內(nèi)比未涂布的聚酰亞胺可多吸附70倍的蛋白質(zhì)。表6下面歸納了在硫酸鹽緩沖液中，涂布鉑的須晶對于三種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。<>表7下面歸納了聚酰亞胺膜對照樣品，在硫酸鹽緩沖液中對于三種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)合和對SDS的耐受性在不同暴露時間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差實施例15與圖3在吸附任何蛋白質(zhì)之前的照片相比，圖7是放大倍數(shù)為150,000倍的高分辨率掃描電子顯微照片，其表明了在不加振搖地吸附PBS中的蛋白質(zhì)A(250μg/ml)一小時后再用水洗三次(每次10分鐘)后的同一涂布鉑的須晶樣品。在敷形涂布伯的須晶上可看見與圖3相同的超細紋理，只是紋理看上去并不明顯、清楚，好象分辨率下降。在圖7中從蛋白質(zhì)包覆的鉑須晶發(fā)出的次級電子發(fā)射并不象未暴露的須晶那樣高，即通常它們并不象未暴露的須晶那樣亮。這些觀察結(jié)果與在鉑上的第二層不導(dǎo)電的包覆層如蛋白質(zhì)分子相符合，蛋白質(zhì)分子位于噴鍍鉑的表面明顯高低不平的紋理的角落和縫隙內(nèi)。未暴露的和暴露于蛋白質(zhì)的須晶上的鉑涂層的粗糙度之間的區(qū)別可從所有的須晶上看出，即圖3和圖7的顯微照片是不同的。實施例16該實施例證明了結(jié)合到亳微結(jié)構(gòu)膜上的蛋白質(zhì)仍保持其生物活性，及亳微結(jié)構(gòu)膜可用作蛋白質(zhì)吸附載體。將銅涂布厚度為0.050mm直徑為8.3cm的聚酰亞胺片用PR149蒸氣涂布，并如實施例9-14一樣退火。得到的亳微結(jié)構(gòu)須晶再如實施例9-14所述的用rf噴鍍(壓力為1.3帕斯卡的Ar)和200瓦正向功率進行鉑的敷形涂布至等質(zhì)量厚度為120nm。圖3表示涂布Pt的須晶的高分辨SEM顯微照片。從亳微結(jié)構(gòu)樣品片和未涂布的聚酰亞胺的對照層上各自切下兩組相同的每組為三個的5mm的方形片。第一組(組I)與300μL含濃度為250μg/ml的125I標(biāo)記的蛋白質(zhì)A的PBS(pH7.5)在室溫反應(yīng)60分鐘。同時第二組(組II)同樣但與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)A溶液在相同條件下反應(yīng)。然后兩組均用500μL的含2.5mg/ml的BSA的PBS(pH7.5)在室溫下處理19小時。必須處理長時間以保證表面被完全封閉。如前述實施例一樣不進行搖動或振蕩，只是用輕微地回蕩直至樣品被浸沒。這兩組均用500μL的純化水(從Millipore以商品名Milli-Q水獲得)洗4次，每次洗15分鐘。測定組I的放射性，而將組II在室溫真空干燥箱內(nèi)干燥5小時。組II在室溫下與300μL含250μg/mld125I標(biāo)記的人IgG的PBS(pH7.5)溶液保溫反應(yīng)18小時。然后在測定放射性前將該組用500μLPBS清洗四次，每次洗15分鐘。表8歸納了結(jié)合到表面上的蛋白質(zhì)A的量，結(jié)合的抗體和結(jié)合的蛋白質(zhì)A之比，以及每單位表面積的抗體結(jié)合的量。表8下面歸納了蛋白質(zhì)A上結(jié)合的人IgG抗體，蛋白質(zhì)A固定在涂布鉑的有亳微結(jié)構(gòu)的須晶上。表8顯示，樣品每單位面積上蛋白質(zhì)S結(jié)合到亳微結(jié)構(gòu)表面的量比聚酰亞胺對照膜50倍。結(jié)合的人IgG的量增加33倍，表明其生物活性大部分被保留。結(jié)果證明亳微結(jié)構(gòu)的表面可用于從溶液中純化IgG并在固體載體上將其濃縮。對于該領(lǐng)域技術(shù)人員來說，不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提的許多改進和變化是顯而易見的，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不能不適當(dāng)?shù)叵抻谏厦嫠龅拿枋鲂詫嵤├?。?quán)利要求1.一種用生物吸附載體作為分離手段的方法，其中生物吸附載體包含一個支持亳微結(jié)構(gòu)表面的惰性底物，亳微結(jié)構(gòu)表面包含涂布金屬的，不連續(xù)的亳微結(jié)構(gòu)單元，該單元的表面數(shù)密度在1-200/μm2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每個亳微結(jié)構(gòu)單元是含有兩個組分的單元，其中第一組分是定向排列的須晶，第二組分是生物分子吸附劑敷形涂層，敷形涂層涂布在第一組分上。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中有生物活性的物質(zhì)被吸附在生物吸附載體上。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中亳微結(jié)構(gòu)單元的高徑比大于3。5.一種組合體，包含(a)一種生物吸附載體，其包含一個支持亳微結(jié)構(gòu)表面的惰性底物，亳微結(jié)構(gòu)表面包含敷形涂布生物分子吸附劑的，定向排列的，不連續(xù)的亞微米大小的單元，該單元的表面數(shù)密度在1-200/μm2和(b)一個吸附在敷形涂布生物分子吸附劑的單元上的生物活性物質(zhì)的單層，其中被吸附層有生物活性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合體，其中生物分子吸附劑敷形涂層是貴金屬。7.一種用權(quán)利要求5所述的組合體作為分離手段，用作免疫測定的傳感器，抽提手段或過濾器中的至少一種的方法。8.一種組合體包含(a)一種生物吸附載體，其包含一個支持亳微結(jié)構(gòu)表面的惰性底物，亳微結(jié)構(gòu)表面包含敷形涂布生物分子吸附劑的，定向排列的，不連續(xù)的亞微米大小的單元，該單元的表面數(shù)密度在1-200/μm2和(b)一個吸附在敷形涂布生物分子吸附劑的單元上的第一生物活性物質(zhì)單層，其中被吸附層有生物活性，和(c)一個吸附在第一生物活性物質(zhì)單層上的第二生物活性物質(zhì)單層。9.一種用權(quán)利要求8所述的組合體作為分離手段，用作免疫測定的傳感器，抽提手段或過濾器中的至少一種的方法。10.一種用權(quán)利要求8所述的組合體作為催化反應(yīng)器的方法。全文摘要本發(fā)明提供生物測定方法和生物吸附載體,生物吸附載體包含一個支持有亳微結(jié)構(gòu)表面的惰性底物,該表面包含涂布金屬的,定向排列的,不連續(xù)的亞微米大小的須晶。或者,敷形涂布金屬的須晶可被部分包埋或被第二種材料敷形涂布。毫微結(jié)構(gòu)表面不需攪拌或振蕩即可快速且高度牢固地吸附結(jié)合生物分子。有利的是,結(jié)合的生物分子仍保留其生物活性。文檔編號G01N33/53GK1183735SQ96193700公開日1998年6月3日申請日期1996年4月1日優(yōu)先權(quán)日1995年5月4日發(fā)明者P·L·科爾曼,M·K·迪布,J·B·斯托爾申請人:美國3M公司