專利名稱：用于體外再現(xiàn)由丙型肝炎病毒(hcv)編碼的rna依賴的rna聚合酶和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒(HCV)的分子生物學(xué)和病毒學(xué)。更確切地說，本發(fā)明的主題是HCV產(chǎn)生的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TNTase)活性、表達(dá)HCV RdRp和TNTase的方法和為了治療目的鑒定抑制這些酶活性從而可以干擾HCV病毒復(fù)制的化合物而體外檢測由HCV編碼的RdRp和TNTase活性的方法。
已知丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非乙型肝炎(NANB)的主要原體。據(jù)估計HCV引起至少90％的輸血后NANB病毒性肝炎和50％的散發(fā)NANB肝炎。雖然在選擇血液供者和用于輸血血液的免疫學(xué)鑒定方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但在那些接受輸血的患者中仍有許多發(fā)生HCV感染(全世界每年一百萬或更多的感染者)。大約50％的HCV感染者在可以是5到40年的時間內(nèi)發(fā)展為肝硬化。另外，近來臨床研究表明在慢性HCV感染和肝細(xì)胞肉瘤的發(fā)展之間存在一定的相關(guān)性。
HCV是一種含有一條大約9.4kb正鏈RNA基因組的包膜病毒。該病毒是黃病毒家族的一個成員，這個家族的其它成員是黃病毒和瘟病毒。最近已繪出HCV的RNA基因組的圖譜。對在世界各處分離的HCV基因組序列的比較表明這些序列可以是非常同源的。HCV基因組的大部分被一個在大約9030到9099個核苷酸之間變化的開放讀框(ORF)所占據(jù)。這個ORF編碼一個單一的病毒多聚蛋白，其長度可以從3010到3033個氨基酸之間變化。在病毒感染的周期中，通過蛋白裂解將多聚蛋白加工成病毒復(fù)制所必需的單個基因產(chǎn)物。編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白的基因定位于ORF的5＇-末端，而編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域占據(jù)ORF的其余部分。
結(jié)構(gòu)蛋白由C(核心，21kDa)、E1(包膜，gp37)和E2(NS1，gp61)組成。C是一種21kDa可能形成病毒核衣殼的非糖基化蛋白質(zhì)。蛋白E1是一種大約37kDa的糖蛋白，它被認(rèn)為是外層病毒包膜的結(jié)構(gòu)蛋白。另一種61kDa的膜糖蛋白E2可能是病毒外層包膜中的另一結(jié)構(gòu)蛋白。
非結(jié)構(gòu)區(qū)從NS2(p24)，一種功能未知的24kDa疏水蛋白開始。據(jù)推測NS3，一種在多聚蛋白中位于NS2后的68kDa蛋白，具有兩個功能域在前200個氨基末端氨基酸中的絲氨酸蛋白酶功能域，和在羧基末端的一個RNA依賴ATP酶結(jié)構(gòu)域。與NS4相應(yīng)的基因區(qū)編碼兩種分別為6kDa和26kDa的疏水蛋白質(zhì)NS4A(p6)和NS4B(p26)，它們的功能還不清楚。與NS5相應(yīng)的基因也編碼兩種分別為56和65kDa的蛋白NS5A(p56)，NS5B(p65)。
各種分子生物學(xué)研究表明信號肽酶(一種與宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白酶)負(fù)責(zé)在非結(jié)構(gòu)區(qū)也就是說在C/E1、E1/E2和E2/NS2位點(diǎn)的蛋白裂解加工。一種HCV的病毒編碼蛋白酶似乎負(fù)責(zé)在NS2和NS3之間的切割。在一個包括部分NS2和含有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的NS3部分的區(qū)域中含有這種蛋白酶活性，但卻并不利用相同的催化機(jī)制。在NS3中含有的絲氨酸蛋白酶負(fù)責(zé)在NS3和NS4A之間、NS4A和NS4B之間、NS4B和NS5A之間以及NS5A和NS5B之間連接的切點(diǎn)。
與其它(+)鏈RNA病毒相似，HCV的復(fù)制被認(rèn)為是通過一個互補(bǔ)的(-)RNA鏈的啟始合成開始的，它轉(zhuǎn)過來又用作產(chǎn)生子代(+)鏈RNA分子的模板。推測在這些步驟中都有一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)參與。在所有RNA依賴的RNA聚合酶中都存在的一種氨基酸序列在NS5區(qū)中可以被識別。這表明NS5區(qū)含有病毒復(fù)制機(jī)器的成分。傳統(tǒng)上認(rèn)為病毒編碼的聚合酶是抗病毒化合物抑制作用的重要靶子，然而，在HCV的特定情況下，對于這種物質(zhì)的研究一直由于缺少一種病毒感染的合適的模型系統(tǒng)(例如在培養(yǎng)中或一種易得到的動物模型中對細(xì)胞的感染)以及一種功能性RdRp酶活性檢測方法而受到嚴(yán)重的阻礙。
已意外地發(fā)現(xiàn)可以通過采用根據(jù)本發(fā)明的方法來克服這個主要的限制，本發(fā)明還提供了將由下面的描述而清楚的其它優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是一種利用在HCV NS5B蛋白中所含序列體外再現(xiàn)HCV的RNA依賴性RNA聚合酶活性的方法。利用這種方法也可再現(xiàn)NS5B蛋白的另一個特性末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性。這種方法利用了含有NS5B序列的蛋白質(zhì)可在真核或原核異源性系統(tǒng)中表達(dá)這個事實純化至表觀均一性的或在超表達(dá)的生物體的提取物中存在的含有NS5B序列的重組蛋白質(zhì)可以以一種模板依賴(RdRp)或模板非依賴(TNTase)的方式催化核苷酸加到外源RNA分子的3＇末端。
本發(fā)明還擴(kuò)展至一種新的組合物，其特征在于它含有在序列號1中所描述的或其中所含的或者由其衍生來的序列的蛋白質(zhì)。已知這個序列在不同的HCV分離株中可以不同，因為所有的RNA病毒都表現(xiàn)出高度的變異性。這種新的組合物具有HCV為了復(fù)制其基因組而必需的RdRp活性。
本發(fā)明的另一目的是利用該組合物為治療目的制備一種能夠鑒別抑制與NS5B相關(guān)的酶活性的化合物包括RdRp的和TNTase的抑制劑。
至此已經(jīng)給出了本發(fā)明的一個大體的描述。為了更清楚地理解其要點(diǎn)、特征、優(yōu)點(diǎn)和操作方法，在下述實施例的幫助下，現(xiàn)在要給出其特定實施方案的一個更詳細(xì)的描述。


圖1表示用來將HCV cDNA轉(zhuǎn)入一個桿狀病毒表達(dá)載體的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
圖2表示分別用來體外合成HCV RNA依賴的RNA聚合酶的D-RNA底物的質(zhì)粒(pT7-7(DCoH))和用來在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)HCV RNA依賴的RNA聚合酶的質(zhì)粒(pT7-7(NS5B))。
圖3表示D-RNA的(+)和(-)鏈的一個模式圖。轉(zhuǎn)錄物包括DCoH mRNA的編碼區(qū)。將DNA-寡核苷酸a、b和c設(shè)計成與新合成的反義RNA退火并將DNA/RNA雜交體用RNA酶H切割。圖式的下部分描繪通過RNA酶消化分別與寡核苷酸a、b和c雜交的RNA(-)所產(chǎn)生的預(yù)期RNA片段大小。
利用分別含有序列號1、序列號2、序列號1 2轉(zhuǎn)錄的cDNA和序列號1轉(zhuǎn)錄的cDNA的質(zhì)粒pBac5B、pBac25、pT7.7 DCoH和pT7.7NS5B轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH1細(xì)菌于1995年5月9日以登記號分別為NCIMB 40727、40728、40729和40730在英國國家工業(yè)和海洋細(xì)菌收集中心(The NationalCollections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，Aberden，Scotland，UK)寄存。
實施例1在草地夜蛾克隆9(Sf9)培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)HCV RdRp/TNTase的方法在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中用于外源基因表達(dá)的系統(tǒng)如用桿狀病毒載體感染的草地夜蛾克隆9(Sf9)細(xì)胞在本領(lǐng)域中是已知的(V.A.Luckow，用于表達(dá)人基因產(chǎn)物的桿狀病毒系統(tǒng)，(1993)《生物技術(shù)中的最新觀點(diǎn)》(Current Opinion in Biotechnology)，564-572頁)。通常將外源基因置于家蠶核多角體病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的多角體蛋白強(qiáng)啟動子的控制下。用于通過同源重組在桿狀病毒載體的預(yù)期位點(diǎn)上引入外源DNA的方法在本領(lǐng)域中也是已知的(D.R.O＇Reilly，L.K.Miller，V.A.Luckow，(1992)，《桿狀病毒表達(dá)載體實驗室手冊》(BaculivirusExpression Vectors-A Laboratory Manual)，W.H.Freeman and Company，紐約)。
質(zhì)粒載體pBac5B和pBac25是pBlueBacIII(Invitrogen)的一個衍生物衍生來的，構(gòu)建它們用來將編碼NS4B和其它非結(jié)構(gòu)HCV蛋白的基因轉(zhuǎn)入桿狀病毒表達(dá)載體。在圖1中以模式圖說明這些質(zhì)粒，并且在實施例8中詳細(xì)地描述了它們的構(gòu)建。將所選的與HCV-BK分離株的基因組相應(yīng)的cDNA片段(HCV-BK；Takamizawa，A.，Mori，C.，F(xiàn)uke，I.，Manabe，S.，Murakami，S.，F(xiàn)ujita，J.，Onishi，E.，Andoh，T.，Yoshida，I.和Okayama，H.，(1991)從人攜帶者中分離的丙型肝炎病毒基因組的結(jié)構(gòu)和組織，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)65，1105-1113)克隆在核型多角病毒的多角蛋白的強(qiáng)啟動子下并以允許在一個桿狀病毒載體中同源重組的序列作為側(cè)翼。
為了構(gòu)建pBac5B，將一個含有編碼HCV多聚蛋白的2420到3010位氨基酸的并與NS5B蛋白(序列號1)相應(yīng)的cDNA區(qū)的PCR產(chǎn)物克隆在pBlueBacIII的BamHI和HindIII位點(diǎn)之間。PCR有義寡核苷酸含有一個翻譯啟始信號，而原有的HCV終止密碼子用作翻譯的終止。
pBac25是pBlue BacIII(Invitrogen)的一個衍生物，其中編碼HCV-BK多聚蛋白的810到3010位氨基酸(序列號2)的cDNA區(qū)被克隆在NcoI和HindIII限制性位點(diǎn)之間。
草地夜蛾克隆9(Sf9)細(xì)胞和桿狀病毒重組試劑盒購自Invitrogen。將細(xì)胞于27℃在含有10％胎牛血清(Gibco)的完全Grace昆蟲培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)于平皿上或懸浮培養(yǎng)。按照制造商推薦的方法進(jìn)行桿狀病毒構(gòu)建物的轉(zhuǎn)染、重組和篩選。分離到兩個含有所需HCV cDNA的重組桿狀病毒克隆，Bac25和Bac5B。
對于蛋白質(zhì)的表達(dá)，用重組桿狀病毒Bac25或Bac5B在每ml2×106細(xì)胞的密度下以大約每個細(xì)胞5個病毒顆粒的比例轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48-72小時將Sf9細(xì)胞沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次并小心重懸于(每ml 7.5×107個細(xì)胞)含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF，Sigma)和4mg/ml亮抑蛋白酶肽的緩沖液A(10mMtris/Cl pH8，1.5mM MgCl2，10mM NaCl)中。下面的所有步驟都在冰上進(jìn)行溶脹30分鐘后，利用一個緊密相配的研杵在一個Dounce勻漿器中通過擊打20次破碎細(xì)胞。加入甘油和去污劑Nonidet P-40(NP40)和3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨基]-1-丙磺酸(CHAPS)至終濃度分別為10％(v/v)、1％(v/v)和0.5％(v/v)，并將細(xì)胞提取物在冰上繼續(xù)孵育1小時，不時地攪拌。通過在1000×g離心10分鐘沉淀細(xì)胞核，并收集上清。通過在一個Dounce勻漿器中擊打20次將沉淀重懸于含有上述濃度的甘油和去污劑的緩沖液A中(每7.5×107核0.5ml)。然后在冰上孵育1小時。重新沉淀細(xì)胞核后，將兩種上清混合，于8000×g離心10分鐘，棄去沉淀。所獲的粗制胞漿提取物或者直接用來檢測RdRp的活性或者以一個蔗糖梯度進(jìn)行進(jìn)一步純化(見實施例5)。
用重組的桿狀病毒Bac25或Bac5B感染Sf9細(xì)胞導(dǎo)致預(yù)期的HCV蛋白的表達(dá)。實際上，在用Bac25感染Sf9細(xì)胞后，在細(xì)胞裂解液中通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫染色可檢測到HCV的NS2(24kDa)、NS3(68kDa)、NS4B(26kDa)、NS4A(6kDa)、NS5A(56kDa)和NS5B(65kDa)蛋白。在用Bac5B感染Sf9細(xì)胞后，通過SDS-PAGE后免疫染色或考馬斯藍(lán)染色只可檢測到一種HCV編碼的蛋白，其大小與真正的NS5B(65kDa)相應(yīng)。
實施例2在一個合成的RNA模板/底物上檢測重組HCV RdRp的方法RdRp檢測是基于對摻入新生RNA產(chǎn)物中的被標(biāo)記的核苷酸的檢測。在一個含有1-5ul Sf9粗制胞漿提取物或純化后蛋白組分的40ul總體積中進(jìn)行體外檢測來確定RdRp的活性。被Bac25或Bac5B感染的Sf9細(xì)胞的未純化或純化后的胞漿提取物可用作HCV RdRp的來源。獲自用表達(dá)一種與HCV無關(guān)蛋白的重組桿狀病毒結(jié)構(gòu)感染的Sf9細(xì)胞的提取物用作陰性對照。將下面的添加物加入反應(yīng)混合物(終濃度)20mM Tris/Cl pH7.5、5mMMgCl2、1mM DTT、25mM KCl、1mM EDTA、5-10μCi的一種[32P]NTP(除非另有說明，所用的為GTP，3000Ci/mmol，Amersham)、0.5mM每種NTP(即CTP、UTP、ATP，除非另有說明)、20U RNasin(Promega)、0.5ugRNA-底物(約4pmol，終濃度100nM)、2μg放線菌素D(Sigma)。室溫下孵育反應(yīng)兩小時，通過加入等體積2×蛋白酶K(PK，BoehringerMannheim)緩沖液(300mM NaCl，100mM Tris/Cl pH7.5，1％w/v SDS)隨后在37℃用50ug PK處理半小時來終止反應(yīng)。將RNA產(chǎn)物用PCA抽提，乙醇沉淀并通過在含有7M尿素的5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳來分析。
我們通常用于檢測的RNA底物(D-RNA)具有在序列號12中報道的序列，并典型地通過如下所述的用T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄線性化的質(zhì)粒pT7-7(DCoH)來獲得。
用在DCoH編碼序列的末端所含的單一的Bg1II限制性位點(diǎn)將質(zhì)粒pT7-7(DCoH)(圖2)線性化并用T7聚合酶(Stratagene)利用制造商所描述的程序體外轉(zhuǎn)錄。通過加入5U/10μl的DNA酶I(Promega)終止轉(zhuǎn)錄。將混合物繼續(xù)孵育15分鐘并用酚/氯仿/異戊醇(PCA)抽提。通過一個1-mlSephadex G50離心柱凝膠過濾去除未摻入的核苷酸。PCA抽提和乙醇沉淀后，將RNA吹干，溶于水中并通過在260nm處的光密度確定其濃度。
除了D-RNA外任何其它RNA分子可被用于本發(fā)明的RdRp檢測，這從下面所描述的實驗中將會清楚。
上述的HCV RdRp檢測產(chǎn)生一種放射性標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物的特征性圖譜一種被標(biāo)記的產(chǎn)物，在所有反應(yīng)包括陰性對照中都觀察到它與底物RNA共遷移。通過銀染色也能使這種RNA可見，因而被認(rèn)為與加入的底物RNA相關(guān)，并極可能被在桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的胞漿提取物中存在的末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性標(biāo)記。在用Bac25或Bac5B感染的Sf9細(xì)胞的胞漿提取物而不是用表達(dá)一種與HCV無關(guān)的蛋白的重組桿狀病毒感染的細(xì)胞的胞漿提取物進(jìn)行的反應(yīng)中，觀察到一條比底物RNA遷移快的額外的帶。發(fā)現(xiàn)這一后者反應(yīng)產(chǎn)物被標(biāo)記為一種高的特異性活性，因為它在不加RNA的對照反應(yīng)中并不出現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)這一產(chǎn)物是從外加的RNA模板衍生而來的，因為在不加RNA的對照反應(yīng)中不存在這一產(chǎn)物。有趣的是，用多種模板RNA分子無論含有HCV 3′-非翻譯區(qū)與否都可以觀察到形成比底物RNA遷移快的被標(biāo)記的樣品。肝特異性轉(zhuǎn)錄輔助因子DCoH的399個核苷酸的mRNA(D-RNA)在我們的RdRp檢測中被證明是一種被有效接受的底物。
為了確定在反應(yīng)中由Bac25或Bac5B感染細(xì)胞的提取物產(chǎn)生的新生樣品的性質(zhì)，我們進(jìn)行了下述系列的實驗(i)用RNA酶A或核酸酶P1處理產(chǎn)物混合物。由于這導(dǎo)致了放射性條帶的完全消失，我們推斷這兩種被標(biāo)記的產(chǎn)物都是RNA分子。(ii)在反應(yīng)混合物中省略四種核苷酸三磷酸的任何一種導(dǎo)致只有輸入RNA的標(biāo)記，這表明快速遷移樣品是聚合反應(yīng)的產(chǎn)物。(iii)在檢測中省略Mg2+離子導(dǎo)致反應(yīng)的完全阻斷既沒有觀察到新生RNA的合成也沒有觀察到輸入RNA的標(biāo)記。(iv)當(dāng)用一種放射性標(biāo)記的輸入RNA和未標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行檢測時，被標(biāo)記的產(chǎn)物與那些在標(biāo)準(zhǔn)條件下獲得的產(chǎn)物是無法區(qū)別的。從這個結(jié)果我們推斷新生RNA產(chǎn)物是從最初加入的RNA分子產(chǎn)生的。
總之，我們的資料表明Bac25或Bac5B感染的Sf9細(xì)胞的提取物含有一種催化RNA合成的新型鎂離子依賴性酶活性。這種活性被表明是依賴輸入RNA的存在但不依賴加入的引物或輸入RNA分子的來源。另外，由于用Bac25或Bac5B感染的Sf9細(xì)胞的提取物所產(chǎn)生的產(chǎn)物看起來似乎是相同的，所以剛才所描述的實驗表明所觀察到的RdRp活性是由HCV NS5B蛋白編碼的。
實施例3用于鑒定HCV RdRp RNA產(chǎn)物的方法。
為了闡明新合成RNA產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征，利用了下面的方法。在我們的標(biāo)準(zhǔn)電泳條件(5％聚丙烯酰胺，7M尿素)，新生RNA產(chǎn)物的大小似乎是大約200個核苷酸。這可能是由于RNA轉(zhuǎn)錄的內(nèi)部啟始或提前終止。然而，這些可能性似乎很不可能，因為發(fā)現(xiàn)利用不同RNA底物進(jìn)行的RdRp檢測所獲的產(chǎn)物都明顯比它們各自的底物遷移快。增加電泳過程中溫度和分析凝膠中的丙烯酰胺的濃度導(dǎo)致顯著不同的RdRp產(chǎn)物的遷移行為。例如，利用一個如含有10％丙烯酰胺、7M尿素的凝膠系統(tǒng)，以較高的溫度進(jìn)行分離，RdRp產(chǎn)物比加入的底物RNA遷移慢，其在與至少兩倍于輸入RNA的長度相應(yīng)的位置上。當(dāng)在電泳前于低百分比/低溫度凝膠上向RdRp產(chǎn)物中加入RNA變性劑如羥甲基汞(CH3HgOH，10mM)時，可觀察到相似的效應(yīng)。這些觀察表明RdRp產(chǎn)物具有廣泛的二級結(jié)構(gòu)。
我們研究了產(chǎn)物分子對多種不同特異性的核糖核酸酶的敏感性。用RNA酶A處理時產(chǎn)物完全降解。另一方面，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)它對單鏈特異性核酸酶RNA酶T1是有抗性的。與60U RNA酶T1于22℃孵育10分鐘后輸入RNA完全降解，同一凝膠的銀染證實不但模板而且在Sf9細(xì)胞胞漿提取物中＇常規(guī)可檢測到的其他RNA也在與RNA酶T1孵育過程中被完全水解。而RdRp產(chǎn)物保持不變，它只在與RNA酶T1的長時間孵育后才受影響。例如，用RNA酶T1處理2小時后在凝膠中其原始位置不再能檢測到標(biāo)記的產(chǎn)物分子。而出現(xiàn)了電泳遷移與輸入的模板RNA相似的新帶。用RNA酶T1但在不同溫度下消化1小時觀察到相似的效果在22℃時，RdRp產(chǎn)物仍大部分未受影響，而在37℃它轉(zhuǎn)變?yōu)榕c原始底物共遷移的新產(chǎn)物。
對這些觀察的解釋是輸入的RNA用作HCV RdRp的模板，其中3＇-OH用作通過一個回轉(zhuǎn)或“回復(fù)復(fù)制”機(jī)制引起互補(bǔ)鏈的合成以產(chǎn)生將反義鏈共價連于其上的有義(模板)鏈組成的雙鏈RNA“發(fā)夾”分子。這樣一種結(jié)構(gòu)可以解釋RdRp產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠中的異常電泳遷移率和它對單鏈特異性核酸酶的高度抗性?；剞D(zhuǎn)環(huán)可能不是堿基配對的因而對于核酸酶應(yīng)該是可接近的。于是用RNA酶T1處理導(dǎo)致在有義和反義鏈之間共價鍵的水解以產(chǎn)生一種成雙鏈的RNA分子。在變性凝膠電泳過程中，這兩條鏈分離并只有在長度上與原始的RNA模板相似的新合成的反義鏈仍可被檢測到。這種機(jī)制似乎更可能，尤其考慮到這種產(chǎn)物是在體外由幾種其它RNA聚合酶產(chǎn)生的這一事實。
為了證明在聚合酶反應(yīng)過程中標(biāo)記的并通過RNA酶T1處理而明顯釋放的RNA產(chǎn)物表現(xiàn)與加入的模板反義的方向，設(shè)計了下述的實驗。為了這一目的，我們合成了與輸入模板RNA分子的三個獨(dú)立的序列相應(yīng)的寡聚脫氧核苷酸(圖2)與D-RNA的170-195位核苷酸相應(yīng)的寡核苷酸a(序列號3)；與286-309位核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸b(序列號4)；與331-354位核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸c(序列號5)。這些被用于與聚合酶反應(yīng)的產(chǎn)物形成DNA/RNA雜交體，以便將它們用RNA酶H進(jìn)行消化。起初，將所有的RdRp產(chǎn)物用于雜交。然而，因為這個結(jié)構(gòu)是非常熱穩(wěn)定的，所以未形成特異性的雜交，因而用RNA酶T1預(yù)處理發(fā)夾型RNA，通過煮沸5分鐘變性。然后在寡核苷酸分別存在的條件下降至室溫。象預(yù)期的那樣，雜交體暴露于RNA酶H產(chǎn)生特異性的切割產(chǎn)物。寡核苷酸a指導(dǎo)的切割導(dǎo)致長度大約170和200個核苷酸的產(chǎn)物，寡核苷酸b產(chǎn)生大約290和110個核苷酸的產(chǎn)物而寡核苷酸c產(chǎn)生大約330和65個核苷酸的片段。由于這些片段具有預(yù)期的大小(見圖3)，結(jié)果提示HCV NS5B介導(dǎo)的RNA合成通過產(chǎn)生發(fā)夾樣RNA雙螺旋的回復(fù)復(fù)制機(jī)制進(jìn)行。
實施例4在一合成的RNA底物上的重組HCV TNTase的檢測方法TNTase檢測是基于對非模板依賴摻入到RNA底物的3＇羥基基團(tuán)的標(biāo)記核苷酸的檢測。用于檢測的RNA底物(D-RNA)典型地是如在實施例2中所描述的通過用T7聚合酶對線性化質(zhì)粒pT7-7DCoH的體外轉(zhuǎn)錄獲得的。然而，除D-RNA外的任何其它RNA分子用于本發(fā)明的TNTase檢測。
在含有1-5μl Sf9粗制胞漿提取物或純化的蛋白組分的40μl總體積中進(jìn)行體外檢測來確定TNTase的活性。被Bac25或Bac5B感染的Sf9細(xì)胞的未分離或純化的胞漿提取物可用作HCV TNTase的來源。從被表達(dá)一種與HCV無關(guān)蛋白的重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞獲得的Sf9細(xì)胞提取物可用作一種陰性對照。將下述的添加物加入反應(yīng)混合物(終濃度)20mM Tris/ClpH7.5、5mM MgCl2、1mM DTT、25mM KCl、1mM EDTA、5-10μCi的一種[32P]NTP(除非另有說明，所用的為UTP，3000Ci/mmol，Amersham)、20U RNasin(Promega)、0.5μgRNA-底物(約4pmol，終濃度100nM)、2μg放線菌素D(Sigma)。室溫下孵育反應(yīng)兩小時，通過加入等體積2×蛋白酶K(PK，Boehringer Mannheim)緩沖液(300mM NaCl，100mMTris/Cl pH7.5，1％w/v SDS)隨后在37℃用50μgPK處理半小時來終止反應(yīng)。將RNA產(chǎn)物用PCA抽提，乙醇沉淀并通過在含有7M尿素的5％聚丙烯酰胺凝膠上電泳來分析。
實施例5通過蔗糖梯度沉降純化HCV RdRp/TNTase的方法在含有去污劑的緩沖液A(見實施例1)中制備一個線性0.3-1.5M蔗糖梯度。將多達(dá)2ml的被Bac5B或Bac25感染的Sf9細(xì)胞的提取物(相當(dāng)于大約8×107個細(xì)胞)加樣至一個12ml梯度上。利用一Beckman SW40轉(zhuǎn)頭以39000×g進(jìn)行離心20小時。收集0.5ml組分并檢測活性。發(fā)現(xiàn)通過蛋白質(zhì)印跡法鑒定的NS5B蛋白在密度梯度中以出乎預(yù)料高的沉降系數(shù)遷移。病毒蛋白和核蛋白體被發(fā)現(xiàn)在相同的梯度組分中共沉降。這種獨(dú)特的行為使我們能夠?qū)⒉《镜鞍讖娜员Ａ粼谔荻壬喜康陌麧{蛋白的主要部分中分離出來。RdRp活性檢測揭示RdRp活性與NS5B蛋白共沉降。一種末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性(TNTase)也存在于這些組分中。
實施例6從Sf9細(xì)胞中純化HCV TNTase/RdRp的方法從1g被Bac5B重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞制備全細(xì)胞提取物。在冰上將凍存的細(xì)胞融化在補(bǔ)充有1mM PMSF的10ml含有20mM Tris/Hcl pH7.5、1mM EDTA、10mM DTT、50％甘油(N緩沖液)的緩沖液中。為了促進(jìn)細(xì)胞破碎，然后加入Triton X-100和NaCl至終濃度分別為2％和500mM。在加入MgCl2(10mM)和DNA酶I(15ug/ml)后，在室溫下攪拌混合物30分鐘。然后通過在一Beckman離心機(jī)中利用一90Ti轉(zhuǎn)頭于4℃以40,000rpm超速離心30分鐘澄清提取物。為了調(diào)節(jié)NaCl濃度至300mM，用含有20mMTris/HCl pH7.5、1mMEDTA、10mMDTT、20％甘油、0.5％TritonX-100(LG緩沖液)的緩沖液稀釋澄清的提取物并與在含有300mM NaCl的LG緩沖液中平衡過的5ml DEAE-Sepharose Fast Flow成批孵育。然后將基質(zhì)倒入一個柱子并用兩倍體積的同樣緩沖液洗滌。將流出物和DEAE-Sepharose Fast Flow柱的第一次洗滌液用LG緩沖液以1∶3稀釋并加入一用含有100mM NaCl的LG緩沖液平衡過的肝素-Sepharose CL6B柱(10ml)中。徹底洗滌肝素-Sepharose C16B并用一在LG緩沖液中100mM到1M NaCl的線性100ml梯度洗脫所結(jié)合的蛋白質(zhì)。根據(jù)通過SDS-PAGE的銀染色和免疫染色的鑒定，混合含有NS5B的級分并用LG緩沖液稀釋以調(diào)節(jié)NaCl濃度至50mM。隨后將稀釋過的級分上樣于一個用含有50mM NaCl的LG緩沖液平衡過的Mono Q-FPLC柱(1ml)。用一在LG緩沖液中從50mM至1M NaCl的線性梯度(20ml)洗脫蛋白質(zhì)。根據(jù)通過SDS-PAGE的銀染色和免疫染色的鑒定，混合含有NS5B的級分并用含有100mM NaCl的LG緩沖液透析。在廣泛的透析后，將混合的級分上樣于一用含有100mM NaCl的LG緩沖液平衡過的PoyU-Sepharose CL6B(10ml)上。徹底沖洗PoyU-Sepharose CL6B并用一在LG緩沖液中從100mM到1M NaCl的線性100ml梯度洗脫所結(jié)合的蛋白質(zhì)。根據(jù)通過SDS-PAGE的銀染色和免疫染色的鑒定，混合含有NS5B的級分，用含有100mM NaCl的LG緩沖液透析并在活性檢測前貯存在液氮中。
對含有純化的NS5B蛋白的級分測試兩種活性的存在。在相同的級分中發(fā)現(xiàn)了RdRp和TNTase活性。這些結(jié)果提示RNA依賴的RNA聚合酶和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶這兩種活性都是HCV NS5B蛋白質(zhì)的功能。
我們利用4種核苷酸三磷酸的每一種在非飽和底物濃度下測試經(jīng)純化的NS5B的末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果清楚地表明無論輸入RNA的來源，UTP是優(yōu)選的TNTase底物，隨后是ATP、CTP和GTP。
實施例7在一同型多聚RNA模板上重組HCV RdRp的檢測方法到此為止我們已經(jīng)描述了HCV NS5B具有一種RNA依賴的RNA聚合酶活性以及互補(bǔ)RNA鏈的合成是一種模板引發(fā)的反應(yīng)。有趣的是，利用Bac5B或Bac25感染的Sf9細(xì)胞的未分離的胞漿提取物作為RdRp的來源，我們不能觀察到利用一種外源加入的寡核苷酸作為引物的互補(bǔ)鏈RNA的合成。我們解釋這可能是由于在我們的未分離提取物中肯定存在的大量的ATP依賴的RNA雙螺旋酶。因而我們想利用純化的NS5B回答這個問題。
首先，我們想確定是否純化的NSSB聚合酶能夠以一種引物依賴的方式在一同型聚RNA模板上合成RNA，這種模板不能夠形成分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因而我們希望互補(bǔ)鏈RNA合成是嚴(yán)格引物依賴的。因而我們測定了依賴poly(A)模板的UMP滲入。并評價了oligo(rU)12和oligo(dT)12-18作為聚合酶反應(yīng)的引物。按照下面的方法測定放射性UMP的滲入。在一含20mM Tris/HClpH7.5、5mM MgCl2、1mM DTT、25mM KCl、1mM EDTA、20U RNasin(Promega)、1μCi[32P]UTP(400Ci/mmol，Amersham)或1μCi[3H]UTP(55Ci/mmol，Amersham)、10μMUTP和10ug/ml poly(A)或poly(A)/oligo(dT)12-18的緩沖液中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)(10-100μl)。加入oligo(U)12(1μg/ml)作為一個引物。PolyA和PolyA/oligo(dT)12-18購自Pharmacia。oligo(U)12獲自Genset。最終NS5B酶濃度是10-100nM。在這些條件下反應(yīng)直線進(jìn)行達(dá)3小時。在22℃孵育2小時后，通過將樣品加至DE81濾膜(Whatman)終止反應(yīng)，用1M Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.0徹底沖洗濾膜，用水漂洗，吹干，在閃爍β計數(shù)儀上測定濾膜結(jié)合的放射性。另外，在0.2M焦磷酸鈉中通過10％三氯乙酸和100ug載體tRNA沉淀體外合成的放射性產(chǎn)物，將其收集于0.45um Whatman GF/C濾膜上，真空抽干并在閃爍液體中計數(shù)。
雖然在缺少一種引物時一些[32P]UMP或[3H]UMP摻入是可檢測到的并且可能是由于與我們純化的NS5B相關(guān)的末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，但只有當(dāng)在反應(yīng)混合物中加入oligo(rU)12作為引物時觀察到了高達(dá)20％的產(chǎn)物滲入。出乎意料地，oligo(dT)12-18雖然效率較低但也能發(fā)揮一種poly(A)依賴的poly(U)合成的引物功能。
其它適于測定NS5B的RdRp活性的模板/引物包括在放射性GTP存在時的poly(C)/oligo(G)或poly(C)/oligo(dG)，在放射性CTP存在時的poly(G)/oligo(C)或poly(G)/oligo(dC)，在放射性ATP存在時的poly(U)/oligo(A)或poly(U)/oligo(dA)，在放射性CTP存在時的poly(I)/oligo(C)或poly(I)/oligo(dC)。
實施例8在大腸桿菌中表達(dá)HCV RdRp/TNTase的方法為了允許在大腸桿菌中表達(dá)具有在序列號1中所報道的序列的HCV蛋白片段，構(gòu)建了在圖2和實施例8中所描述的質(zhì)粒pT7-7(NS5B)。這種蛋白片段含有如上面所討論的NS5B的RdRp和TNTase。于是利用分子生物學(xué)實踐中已知的并在實施例8中詳細(xì)描述的方法將編碼NS5B蛋白的HCV eDNA片段克隆在噬菌體T7φ10啟動子的下游并與噬菌體T7基因10蛋白的第1個ATG密碼子在同一讀框中。pT7-7(NS5B)質(zhì)粒還含有可用作轉(zhuǎn)有質(zhì)粒pT7-7(NS5B)的大腸桿菌細(xì)胞的一個篩選標(biāo)志。
然后將質(zhì)粒pT7-7(NS5B)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE53)株，通常為了克隆入含有T7啟動子的表達(dá)載體中的基因高水平表達(dá)而使用該菌株。在大腸桿菌的這個菌株中，在噬菌體1 DE53上載有T7基因聚合酶，它被整合在BL21細(xì)胞的染色體中(Studier和Moffatt，用噬菌體T7RNA聚合酶指導(dǎo)克隆基因的選擇性高水平表達(dá)，(1986)，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)189，113-130頁)。按照前面已經(jīng)描述的方法(Studier和Maffatt)通過在生長培養(yǎng)基中加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。于是含有RdRp的重組NS5B蛋白片段被產(chǎn)生于宿主細(xì)胞的包涵體中?？梢詮拇竽c桿菌BL21(DE53)提取物的顆粒級分中純化重組NS5B蛋白并按照本領(lǐng)域已知的方法重新折疊(D.R.Thatcher和A.Hichcok，在生物技術(shù)中的蛋白質(zhì)折疊(1994)《蛋白質(zhì)折疊機(jī)制》(Mechanism of protein folding)中R.H.Pain編，TRL PRESS，229-255頁)。另外通過將細(xì)菌生長培養(yǎng)基的溫度降低在20℃以下也可以將重組NS5B蛋白產(chǎn)生為可溶性蛋白。于是可以基本按照如實施例5中的描述從大腸桿菌裂解液中純化可溶性蛋白。
實施例9附圖中質(zhì)粒的詳細(xì)構(gòu)建將所選的與HCV-BK分離株(HCVBK)基因組相應(yīng)的cDNA片段克隆在核多角型病毒的核多角蛋白強(qiáng)啟動子下，并以允許在一桿狀病毒中同源重組的序列作為側(cè)翼。
pBac5B含有包括在7590到9366位核苷酸之間的HCV-BK序列，并編碼在序列號1中所報道的NS5B蛋白。為了獲得該質(zhì)粒，利用分別具有序列5＇-AAGGATCCATGTCAATGTCCTACACATGGAC-3＇(序列號6)和5＇-AATATTCGAATTCATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATG-3＇(序列號7)的合成寡核苷酸通過PCR產(chǎn)生cDNA片段。然后用Klenow DNA聚合酶處理PCR產(chǎn)物，用BamHI在5＇末端消化，隨后克隆在Bluescript SK(+)載體的BamHI和SmaI位點(diǎn)之間。隨后，將目的cDNA片段用限制性酶BamHI和HindIII完全消化并在pBlueBacIII載體(Invitrogen)的相同位點(diǎn)上重新連接。
pBac25含有2759到9416位核苷酸之間所包含的HCV-BK cDNA區(qū)，并編碼HCV-BK多聚蛋白的810到3010位氨基酸(序列號2)。按照下面的方法獲得該質(zhì)粒。首先，通過NcoI消化從pCD(38-9.4)(Tomei，L.，F(xiàn)ailla，C.，Santolini，E.，De Francesco，R.和La Monica，N.(1993)NS3是一種丙型肝炎病毒多聚蛋白加工所需的絲氨酸蛋白酶，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)，67，4017-4026)獲得含有2759-3578位核苷酸之間所包括的HCV-BK序列的820bp cDNA片段，并克隆在pBlueBacIII載體(Invitrogen)的NcoI位點(diǎn)上產(chǎn)生一質(zhì)粒稱為pBacNCO。通過NotI和XbaI消化從pCD(38-9.4)(Tomei等，1993)獲得含有1959到9461位核苷酸之間所包括的HCV-BK序列的cDNA片段并克隆在Bluescript SK(+)載體的相同位點(diǎn)中產(chǎn)生一質(zhì)粒稱為pBlsNX。通過SacII和HindIII消化從pBlsNX獲得含有3304到9461位核苷酸之間所包括的HCV-BK序列的cDNA片段并克隆在pBlsNX質(zhì)粒的相同位點(diǎn)上產(chǎn)生pBac25質(zhì)粒。
pT7-7(DCoH)含有大鼠肝細(xì)胞核因子1a_的二聚化輔因子的完整編碼區(qū)(316個核苷酸)(DCoH；Mendel，D.B.，Khavari，P.A.，Conley，P.B.，Graves，M.K.，Hansen，L.P.，Admon，A.和Crabtree，G.R.(1991)調(diào)節(jié)哺乳動物同源區(qū)蛋白二聚化的一種輔助因子的鑒別，《科學(xué)》(Science)254，1762-1767；基因庫登記號M83740)。利用分別具有序列TGGCTGGCAAGGCACACAGGCT(序列號8)和AGGCAGGGTAGATCTATGTC(序列號9)的合成核苷酸Dprl和Dpr2通過PCR擴(kuò)增與大鼠DCoH的編碼序列相應(yīng)的cDNA片段。將由此獲得的cDNA片段克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pT7-7的SmaI限制性位點(diǎn)中。pT7-7表達(dá)載體是除了β-內(nèi)酰胺酶基因和Col E1復(fù)制起點(diǎn)外還含有T7聚合酶啟動子φ10和T7基因10蛋白的翻譯啟始位點(diǎn)的pBR322的衍生物(Tabor S.和Richerdson C.C.(1985)一種用于受控的特定基因唯一表達(dá)的T7噬菌體RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)，《美國國家科學(xué)院學(xué)報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)82，1074-1078)。
pT7-7(NS5B)含有從7590到9366位核苷酸的HCV序列，并編碼在序列號1中所報道的NS5B蛋白。
為了獲得該質(zhì)粒，利用分別具有序列5＇-TCAATGTCCTACACATGGAC-3＇(序列號10)和5＇-GATCTCTAGATCATCGGTTGGGGGAGGAGGTAGATGCC-3′(序列號11)的合成寡核苷酸通過PCR產(chǎn)生一cDNA片段。然后將PCR產(chǎn)物用Klenow DNA聚合酶處理。隨后將其連接至經(jīng)過用EcoRI線性化并用Klenow DNA聚合酶補(bǔ)平末端后的大腸桿菌表達(dá)載體pT7-7。另外，利用分別含有序列5＇-TGTCAATGTCCTACACATGG-3＇(序列號13)和5＇-AATATTCGAATTCATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATG-3＇(序列號14)的合成寡核苷酸通過PCR產(chǎn)生cDNA片段。然后將PCR產(chǎn)物用Klenow DNA聚合酶處理，隨后連接在經(jīng)過NdeI線性化并用Klenow DNA聚合酶補(bǔ)平末端后的大腸桿菌表達(dá)載體pT7-7中。
序列表一般信息(i)申請人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.
(ii)發(fā)明題目用于體外再現(xiàn)由丙型肝炎病毒(HCV)編碼的RNA依賴的RNA聚合酶和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法(iii)序列數(shù)14(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Societa Italiana Brevetti(B)街:Piazza di Pietra(C)城市羅馬(D)國家意大利(E)郵政編碼1-00186(V)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型3.5″1.44M字節(jié)的軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS Rev.6.22(D)軟件Microsoft Word 6.0(viii)律師/代理人信息(A)姓名DI CERBO，Mario(Dr.)(C)參考號RM/X88530/PCT-DC(ix)通訊信息(A)電話06/6785941(B)傳真06/6794692(C)電傳612287 ROPAT(1)序列號1的資料(i)序列特征(A)長度591個氨基酸(B)類型氨基酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(v)片段類型C-末端片段(vi)最初來源(A)生物體丙型肝炎病毒(B)分離株BK(vii)直接來源由Tomei等1993年描述的cDNA克隆pCD(38-9.4)(ix)特點(diǎn)(A)名稱NS5B非結(jié)構(gòu)多聚蛋白(C)鑒別方法實驗性(xi)序列描述序列號1Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala1 5 10 15Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Sar Leu Leu Arg20 25 30His His Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Gly Leu Arg35 40 45Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr50 55 60Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala65 70 75 80Lys Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser85 90 95Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser100 105 110Ser Lys Ala Val Asn His Ile His Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu115 120 125Asp Thr Val Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val130 135 140Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile145 150 155 160Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr165 170 175Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln Val Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly180 185 190Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Thr Trp195 200 205Lys Ser Lys Lys Asn Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe210 215 220Asp Ser Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr225 230 235 240Gln Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Lys Ser Leu245 250 255Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln260 265 270Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser275 280 285Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg290 295 300Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu305 310 315 320Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu325 330 335Arg Val Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp340 345 350Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser355 360 365Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu370 375 380Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala385 390 395 400Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala405 410 415Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile420 425 430Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr435 440 445Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu450 455 460Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly465 470 475 480Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro485 490 495Leu Arg Val Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu500 505 510Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp515 520 525Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Arg530 535 540Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile545 550 555 560Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Leu Cys Leu565 570 575Leu Leu Leu Ser Val Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg580 585 590(2)序列號2的資料(i)序列特征(A)長度2201個氨基酸(B)類型氨基酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(v)片段類型C-末端片段(vii)直接來源由Tomei等1993年描述的cDNA克隆pCD(38-9.4)(ix)特點(diǎn)(A)名稱NS2-NS5B非結(jié)構(gòu)蛋白前體(C)鑒別方法實驗性(xi)序列描述序列號2Met Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe Val Gly1 5 10 15Leu Val Leu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Val Phe Leu Ala Arg20 25 30Leu Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Thr Thr Arg Ala Glu Ala Asp Leu35 40 45His Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn Ala Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile50 55 60Ile Leu Leu Met Cys Ala Val His Pro Glu Leu Ile Phe Asp Ile Thr65 70 75 80Lys Leu Leu Ile Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly85 90 95Ile Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile His Ala100 105 110Cys Met Leu Val Arg Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala115 120 125Phe Met Lys Leu Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Tyr Asn His Leu130 135 140Thr Pro Leu Arg Asp Trp Pro Arg Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val145 150 155 160Ala Val Glu Pro Val Val Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Ile Ile Thr165 170 175Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Leu Pro180 185 190Val Ser Ala Arg Arg Gly Lys Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser195 200 205Leu Glu Gly Arg Gly Leu Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser210215 220Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly225 230 235 240Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Sar Thr Ala245 250 255Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val260 265 270Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Ala Pro Lys Gly Pro Ile275 280 285Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Lys290 295 300Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp305 310 315 320Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg325 330 335Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu340 345 350Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Phe Gly His Ala Val355 360 365Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val370 375 380Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val385 390 395 400Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln Val405 410 415Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro420 425 430Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser435 440 445Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly450 455 460Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala465 470 475 480Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys485 490 495Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Set Thr50θ505 510Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu515 520 525Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly530 535 540Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn545 550 555 560Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile565 570 575Arg Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp580 585 590Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr595 600 605Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ile Gly Asp Val Val610 615 620Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp625 630 635 640Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser645 650 655Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala660 665 670Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Arg Gly675 680 685Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp690 695 700Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu705 710 715 720Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr725 730 735Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val740 745 750Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys755 760 765Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val770 775 780Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys785 790 795 800Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu805 810 815Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile820 825 830Thr Lys Tyr Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr835 840 845Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr850 855 860Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser865 870 875 880Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Leu Leu Tyr Gln Glu Phe885 890 895Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly900 905 910Met Gln Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln915 920 925Thr Ala Thr Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Glu Ser Lys930 935 940Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile945 950 955 960Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro965 970 975Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu980 985 990Thr Thr Gln Ser Thr Leu Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala99510001005Ala Gln Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe Val Gly Ala Gly101010151020Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu Val1025 103010351040Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala104510501055Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn106010651070Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val107510801085Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val109010951100Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val1105 111011151120Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Sar Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr112511301135Gln Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile Thr Gln Leu Leu Lys Arg Leu His114011451150Gln Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu115511601165Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Thr Asp Phe Lys Thr117011751180Trp Leu Gln Ser Lys Leu Leu Pro Gln Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe1185 119011951200Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met120512101215Gln Thr Thr Cys Pro Cys Gly Ala Gln Ile Thr Gly His Val Lys Asn122012251230Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp His1235 1240 1245Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser125012551260Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val Ala Ala Glu Glu1265 127012751280Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly Met128512901295Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gln Val Pro Ala Pro Glu Phe130013051310Phe Ser Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys131513201325Arg Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gln Val Gly Leu Asn Gln133013351340Tyr Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro ASp Val Ala1345 135013551360Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr136513701375Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser138013851390Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr139514001405His His Val 5er Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp141014151420Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys1425 143014351440Val Val Val Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu144514501455Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe146014651470Pro Ala Ala Met Pro Ile Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu147514801485Leu Glu Ser Trp Lys Asp Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly149014951500Cys Pro Leu Pro Pro Ile Lys Ala Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg1505 151015151520Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Ser Val Ser Ser Ala Leu Ala152515301535Glu Leu Ala Thr Lys Thr Phe Gly Ser Ser Glu Ser Ser Ala Val Asp154015451550Ser Gly Thr Ala Thr Ala Leu Pro Asp Gln Ala Ser Asp Asp Gly Asp155515601565Lys Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly157015751580Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser1585 159015951600Glu Glu Ala Ser Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp160516101615Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro162016251630Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr163516401645Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Gly Leu Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe165016551660Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr Arg Asp Val Leu Lys Glu1665 167016751680Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu168516901695Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly170017051710Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys Ala Val Asn His171517201725Ile His Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Thr Val Thr Pro Ile173017351740Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu1745 175017551760Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly176517701775Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr Leu178017851790Pro Gln Val Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly179518001805Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Thr Trp Lys Ser Lys Lys Asn Pro181018151820Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu1825 183018351840Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Ala184518501855Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile186018651870Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln Asn Cys Gly Tyr Arg Arg187518801885Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr189018951900Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gln Asp1905 191019151920Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser192519301935Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala194019451950Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr195519601965Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His197019751980Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr1985 199019952000Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr Pro Val Asn200520102015Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg202020252030Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu Leu Ala Gln Glu Gln203520402045Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile205020552060Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Ser2065 2070 2075 2080Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala208520902095Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Val Trp Arg His210021052110Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu Ser Gln Gly Gly Arg Ala211521202125Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys Thr Lys Leu213021352140Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Arg Leu Asp Leu Ser Gly Trp2145 215021552160Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Leu Ser Arg216521702175Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Val Gly218021852190Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg21952200(3)序列號3的資料(i)序列特征(A)長度26個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱oligo a(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號3GCCGAGATGC CATCTTCAAA CAGTTC 26(4)序列號4的資料(i)序列特征(A)長度24個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(ii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱oligo b(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號4GTGTACAACA AGGTCCATAT CACC 24(5)序列號5的資料(i)序列特征(A)長度24個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱oligo c(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號5GGTCTTTCTG AACGGGATAT AAAC 24(6)序列號6的資料(i)序列特征(A)長度31個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱5＇-5B
(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號6AAGGATCCAT GTCAATGTCC TACACATGGA C 31(7)序列號7的資料(i)序列特征(A)長度36個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱3＇-5B(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號7AATATTCGAA TTCATCGGTT GGGGAGCAGG TAGATG 36(8)序列號8的資料(i)序列特征(A)長度22個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀
(ix)特點(diǎn)(A)名稱Dpr1(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號8TGGCTGGCAA GGCACACAGG CT 22(9)序列號9的資料(i)序列特征(A)長度20個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義是(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱Dpr2(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號9AGGCAGGGTA GATCTATGTC20(10)序列號10的資料(i)序列特征(A)長度20個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否
(iv)反義否(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱NS5B-5＇(1)(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號10TCAATGTCCT ACACATGGAC20(11)序列號11的資料(i)序列特征(A)長度38個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義是(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱HCVA-13(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號11GATCTCTAGA TCATCGGTTG GGGGAGGAGG TAGATGCC38(12)序列號12的資料(i)序列特征(A)長度399個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型mRNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vi)最初來源(A)生物體Rattus Norvegicus(B)分離株Sprague-Dawley(vii)直接來源pT7-7(DCoH)(ix)特點(diǎn)(A)名稱D-RNA(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號12GGGAGACCAC AACGGUUUCC CUCUAGAAAU AAUUUUGUUU AACUUUAAGA AGGAGAUAUA60CAUAUGGCUA GAAUUCGCGC CCUGGCUGGC AAGGCACACA GGCUGAGUGC UGAGGAACGG 120GACCAGCUGC UGCCAAACCU GCGGGCCGUG GGGUGGAAUG AACUGGAAGG CCGAGAUGCC 180AUCUUCAAAC AGUUCCAUUU UAAAGACUUC AACAGGGCUU UUGGCUUCAU GACAAGAGUC 240GCCCUGCAGG CUGAAAAGCU GGACCACCAU CCCGAGUGGU UUAACGUGUA CAACAAGGUC 300CAUAUCACCU UGAGCACCCA CGAAUGUGCC GGUCUUUCUG AACGGGAUAU AAACCUGGCC 360AGCUUCAUCG AACAAGUUGC CGUGUCUAUG ACAUAGAUC 399(13)序列號13的資料(i)序列特征(A)長度20個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義否(vi)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)
(A)名稱NS5B-up(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號13TGTCAATGTC CTACACATGG 20(14)序列號14的資料(i)序列特征(A)長度38個核苷酸(B)類型核苷酸(C)線型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)否(iv)反義是(vii)直接來源寡核苷酸合成儀(ix)特點(diǎn)(A)名稱3＇-5B(C)鑒別方法聚丙烯酰胺凝膠(xi)序列描述序列號14AATATTCGAA TTCATCGGTT GGGGAGCAGG TAGATG 3權(quán)利要求
1.一種用于體外再現(xiàn)由丙型肝炎病毒編碼的RNA依賴RNA聚合酶活性或末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其特征在于將含有NS5B(序列號1)的序列用于反應(yīng)混合物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1體外再現(xiàn)由HCV編碼的RNA依賴RNA聚合酶活性的方法，其中將NS5B以NS2-NS5B前體摻入反應(yīng)混合物中，所說的前體利用發(fā)生在超量生產(chǎn)生物體中的多個蛋白裂解反應(yīng)而產(chǎn)生一種酶活性形式的NS5B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1體外再現(xiàn)由HCV編碼的末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法，其中將NS5B以NS2-NS5B前體摻入反應(yīng)混合物中，所說的前體利用發(fā)生在超量生產(chǎn)生物體中的多個蛋白裂解反應(yīng)而產(chǎn)生一種酶活性形式的NS5B。
4.一種組合物，其特征在于它含有根據(jù)權(quán)利要求1到3的NS5B序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其含有在序列號1中描述的及此中所含或由此衍生的序列的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的組合物用于建立一種能夠篩選抑制與NS5B蛋白相關(guān)酶活性的治療目的化合物的酶檢測法的用途。
7.根據(jù)上面的描述、實施例和權(quán)利要求用于體外再現(xiàn)NS5B的RNA依賴RNA聚合酶和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法、組合物和該組合物在建立一種能夠篩選抑制與NS5B相關(guān)的酶活性的治療目的化合物的酶測試法中的用途。
全文摘要
這是一種用于體外再現(xiàn)與丙型肝炎病毒相關(guān)RNA依賴的RNA聚合酶活性的方法。本方法的特征在于將NS5B中所含的序列用于反應(yīng)混合物中。利用這種方法也可復(fù)制NS5B蛋白的另一特征性末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性。這種方法利用純化至表觀均一性的或在超表達(dá)的生物體的提取物中存在的NS5B蛋白可以催化核苷酸加到外源性或內(nèi)源性NNA分子的3′末端這個事實。本發(fā)明還涉及一種含有在NS5B中所含序列的組合物,以及該組合物在建立一種能夠篩選抑制與NS5B相關(guān)的酶活性的治療目的化合物的酶測試法中的用途。圖中所示為在培養(yǎng)的真核和原核細(xì)胞中產(chǎn)生丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的方法中所用的質(zhì)粒。
文檔編號G01N33/573GK1189187SQ96195029
公開日1998年7月29日 申請日期1996年5月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月24日
發(fā)明者R·迪弗朗希斯克, L·托梅, S－E·比倫斯 申請人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所