專利名稱：點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)試蘋(píng)果潛隱病毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)試蘋(píng)果潛隱病毒方法技術(shù)領(lǐng)域。
用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)試蘋(píng)果潛隱病毒是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)，由于該技術(shù)檢測(cè)過(guò)程需時(shí)較長(zhǎng)，靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性還不夠高，數(shù)據(jù)重復(fù)性差、抗原、抗體和試劑藥品用量大，耗資高，檢測(cè)標(biāo)本不能保存。
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)試蘋(píng)果潛隱病毒方法，使檢測(cè)時(shí)間縮短、靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，檢測(cè)成本低，標(biāo)本可保存。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的把待檢蘋(píng)果葉片放入0.02M磷酸鹽溶液中研磨，然后加入等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋(píng)果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋(píng)果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液，抗體緩沖液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白制成；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時(shí)用抗體緩沖液稀釋制成酶標(biāo)A蛋白液；將硝酸纖維素膜用打孔器打圓孔狀印跡，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然后浸入封閉緩沖液中30分鐘，封閉緩沖液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白制成；然后取出硝酸纖維素膜吸干，用0.02M磷酸鹽加0.05吐溫20液洗滌，吸干，然后加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μ1,28℃保濕孵育1小時(shí)，然后再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20液洗滌，吸干；然后浸入抗體緩沖液封閉15分鐘，洗滌、吸干；再加入酶標(biāo)A蛋白液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時(shí)，洗滌、吸干；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保濕避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點(diǎn)顯色；底物溶液由二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽加咪唑制成，用時(shí)加過(guò)氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水沖洗，再用蒸餾水洗滌，吸干，如圓孔狀印跡上的斑點(diǎn)與硝酸纖維素膜顏色相同為無(wú)蘋(píng)果潛隱病毒，如斑點(diǎn)顏色為黃褐色或褐色為有蘋(píng)果潛隱病毒。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程需時(shí)較短，靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高，重復(fù)性好、抗原、抗體和試劑藥品用量小，成本低，檢測(cè)樣本可保存。
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明采蘋(píng)果葉片時(shí)間以春秋二季為宜，每個(gè)待檢樣品采1-2片葉，裝入樣品袋，再裝入塑料袋，保濕存放待檢；取待檢蘋(píng)果葉片0.5克加2倍體積的0.02M磷酸鹽緩沖液研磨，加等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋(píng)果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋(píng)果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液，抗體緩沖液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白制成；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時(shí)用抗體緩沖液稀釋制成酶標(biāo)A蛋白液；每種病毒抗血清應(yīng)單獨(dú)用1張硝酸纖維素膜，每個(gè)重復(fù)也可單用1張，硝酸纖維素膜的大小根據(jù)等檢樣品數(shù)確定，按每個(gè)斑點(diǎn)占1cm2剪裁，用直徑0.5cm2的打孔器在該膜上打圓孔狀印跡，按設(shè)計(jì)要求繪制排列圖，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然后浸入封閉緩沖液中30分鐘，封閉緩沖液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白制成；然后取出硝酸纖維素膜吸干，用0.02M磷酸鹽加0.05％吐溫20液洗滌3次，每次5分鐘，吸干；然后加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時(shí)，然后再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20洗滌3次，每次5分鐘，吸干；然后浸入抗體緩沖液封閉15分鐘，洗滌3次，每次5分鐘，吸干；再加入酶標(biāo)A蛋白液,每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時(shí)，洗滌3次，每次5分鐘，吸干；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保濕避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點(diǎn)顯色，底物溶液由二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽加咪唑制成，用時(shí)加0.1％過(guò)氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水沖洗，再用蒸餾水洗滌，吸干，反應(yīng)中止，根據(jù)樣品斑點(diǎn)顯色程度判斷如下陰性- 樣品斑點(diǎn)與白色硝酸纖維素膜顏色相同+ 樣品斑點(diǎn)隱約可見(jiàn)淡黃褐色印跡陽(yáng)性 + 樣品斑點(diǎn)為淡黃褐色印跡或僅周邊顯黃褐色圓環(huán)、半圓環(huán)、中間不顯色++樣品斑點(diǎn)黃褐色+++樣品斑點(diǎn)深黃褐色或褐色將檢測(cè)結(jié)果記入排列圖，寫(xiě)出檢測(cè)報(bào)告，連以硝酸纖維素膜一并歸檔保存。
權(quán)利要求
1.點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)試蘋(píng)果潛隱病毒方法，其特征是把待檢蘋(píng)果葉片放入0.02M磷酸鹽溶液中研磨，然后加入等量氯仿離心10分鐘取上清液為抗原液；取兔抗蘋(píng)果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋(píng)果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液，抗體緩沖液由0.02M磷酸鹽溶液，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％牛血清白蛋白制成；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解，使用時(shí)用抗體緩沖液稀釋制成酶標(biāo)A蛋白液；將硝酸纖維素膜用打孔器打圓孔狀印跡，在圓孔狀印跡上滴入2μl抗原液，然后浸入封閉緩沖液中30分鐘，封閉緩沖液由0.02M磷酸鹽，0.05％吐溫20,2％聚乙烯吡咯烷酮和2％牛血清白蛋白制成；然后取出硝酸纖維素膜吸干，用0.02M磷酸鹽加0.05％吐溫20液洗滌，吸干；然后加抗血清液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時(shí)，然后再用0.02M磷酸鹽溶液加0.05％吐溫20液洗滌，吸干；然后浸入抗體緩沖液封閉15分鐘，洗滌、吸干；再加入酶標(biāo)A蛋白液，每圓孔狀印跡上加25μl,28℃保濕孵育1小時(shí)，洗滌、吸干；每圓孔狀印跡上加25μl底物溶液，保濕避光孵育10-30分鐘，帶病毒樣點(diǎn)顯色；底物溶液由二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽加咪唑制成，用時(shí)加過(guò)氧化氫；將顯色的硝酸纖維素膜用水沖洗，再用蒸餾水洗滌，吸干，如圓孔狀印跡上的斑點(diǎn)與硝酸纖維素膜顏色相同為無(wú)蘋(píng)果潛隱病毒，如斑點(diǎn)顏色為黃褐色或褐色為有蘋(píng)果潛隱病毒。
全文摘要
點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)試蘋(píng)果潛隱病毒方法,把蘋(píng)果葉片放入0.02M磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行研磨,然后加入等量氯仿離心提取抗原液,取兔抗蘋(píng)果褪綠葉斑病毒血清和兔抗蘋(píng)果莖溝病毒血清用抗體緩沖液稀釋制成抗血清液,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)A蛋白用0.02M磷酸鹽溶解,使用時(shí)用抗體緩沖液稀釋,將硝酸纖維素膜打上圓孔狀印跡,在其上滴入2μl抗原液,然后再加上抗血清酶標(biāo)A蛋白液和底物溶液,根據(jù)其斑點(diǎn)顯色情況判斷被檢蘋(píng)果是否帶有潛隱病毒。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1210266SQ9710607
公開(kāi)日1999年3月10日 申請(qǐng)日期1997年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月3日
發(fā)明者石蔭萍, 王強(qiáng)生, 楊建明, 孫清榮, 隋從義 申請(qǐng)人:山東省果樹(shù)研究所