專利名稱：：由人體體表角質(zhì)生長物測定體內(nèi)甾體激素及其衍生物含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種由人體體表的毛發(fā)、指甲或趾甲等角質(zhì)生長物測定體內(nèi)甾體激素及其衍生物含量的檢測方法。甾體激素是人體內(nèi)分泌激素中的主要組成部分之一，不僅對正常的新陳代謝和生理功能有重要和巨大的影響，而且體內(nèi)不同種類的甾體激素含量水平的變化也?？深A(yù)示和反映身體的不同生理狀況，因而對其在體內(nèi)含量水平的檢測常用于醫(yī)學(xué)診斷和其它有關(guān)領(lǐng)域的分析判斷。例如，對雌二醇、孕酮等生殖激素的檢測，在女性的生理變化或疾病診斷中是一個(gè)重要的檢測項(xiàng)目和判斷依據(jù)；在體育比賽的興奮劑檢測中，對運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)的雄性激素等甾體激素或其衍生物含量的檢測也是用于判斷的重要依據(jù)。此外，對體內(nèi)多種腎上腺皮質(zhì)類的甾體激素或其衍生物含量的檢測在醫(yī)學(xué)診斷和治療上也常具有十分重要的意義和價(jià)值。目前臨床上檢測人體內(nèi)甾體激素含量的方法都是通過對人體的血液、唾液、尿液、精液或組織等采樣后才能進(jìn)行檢測，其中大多數(shù)又都是依賴抽取血樣進(jìn)行的。這些方法，特別是抽取血樣的方法，許多缺點(diǎn)是十分明顯的。首先，被采樣者必須到醫(yī)院或有相應(yīng)條件的地點(diǎn)才能取血，血液的抽取量不能太大，并還容易因此傳播或被傳染上疾病，因而許多人不易接受。其次，血液樣品的處理過程麻煩，易被污染，且必須在冰箱中保存，又不宜長途運(yùn)輸。而在對以雄性激素或其衍生物為主的興奮劑檢測時(shí)，長期以來一直使用對采集的尿液樣品進(jìn)行檢測的方法。而尿液的采集也有許多困難，且尿液的處理也十分麻煩，檢測儀器又非常昂貴，但最大的問題還是興奮劑的服用者可以采取一些方法避開對其真實(shí)尿液的興奮劑檢測。因此，在興奮劑的檢測上目前也已有越來越多的呼吁以血液檢測代替尿液檢測，但隨血液檢測而來所不可避免的上述諸多缺點(diǎn)，必然又會(huì)成為無法回避和要解決的問題。本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供一種新的人體內(nèi)甾體激素及其衍生物含量水平的檢測方法，它是通過對人體的體表角質(zhì)生長物為采樣樣品進(jìn)行檢測，從而克服和進(jìn)免了目前以體液，特別是以血液為樣品進(jìn)行檢測的諸多缺點(diǎn)和問題。本發(fā)明的體內(nèi)甾體激素及其衍生物含量的檢測方法，是以人體的頭發(fā)、胡須、指甲或趾甲等體表的角質(zhì)生長物為采樣的樣品，其中特別以人的頭發(fā)為采樣樣品最方便和有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。測定方法按下述步驟操作1)取人體體表的角質(zhì)生長物粉碎，例如，可剪切成細(xì)碎小段或碎末后，用可溶解被檢測的甾體激素或其衍生物成分的有機(jī)溶劑浸泡，充分萃取至少一次，一般可為兩次，然后將全部萃取液揮盡溶劑，得到萃取提取物；2)將上步得到的萃取提取物置于pH7.2-7.4的磷酸緩沖液中，于相當(dāng)于人體體溫的溫度，即35-39℃放置25-35分鐘后，再于室溫至少混旋1分鐘；3)用常規(guī)的放射免疫方法或酶免疫方法測定上步混旋液中被測的甾體激素或其衍生物的含量。上述方法中所說萃取用的有機(jī)溶劑最好為沸點(diǎn)低于100℃的低沸點(diǎn)類溶劑，以便萃取后揮除或回收萃取溶劑的操作。例如可以使用常規(guī)的甲醇、乙醇、乙醚、丙酮等低沸點(diǎn)的含氧溶劑，也可以使用沸程為30-60℃的石油醚等非極性溶劑。其中尤以使用乙醚作為萃取溶劑為佳，萃取效果好，沸點(diǎn)低，易于揮除和回收，后處理方便，且價(jià)廉易得。本專利申請的發(fā)明以采集人頭發(fā)樣品為例，按下述方法進(jìn)行處理，提取不同的甾體激素，進(jìn)行了檢測和有關(guān)的分析研究。將人的頭發(fā)剪切成細(xì)碎次段后，用乙醚(或沸程為30-60℃的石油醚)作萃取溶劑，按每25-50毫克頭發(fā)樣品用溶劑約2毫升的比例混旋至少1分鐘后，放置1小時(shí)以上，分離出萃取液后，再按上述一半的比例加入同種溶劑重復(fù)上述的萃取操作1-2次。合并各次萃取液自然揮盡或水浴加熱揮盡溶劑后，得到萃取提取物。將磷酸二氧鈉-磷酸氧二鈉組成的pH7.2-7.4的磷酸緩沖液0.2-0.3毫升加入到該萃取提取物中混旋并置于35-39℃，通常最好可在37±0.5℃的水浴中約30分鐘后取出，在室溫下再混旋約1分鐘，即成為供檢測用的備用品。采用與對人血清(或血漿)甾體激素檢測相同的放射免疫方法(RIA)或酶免疫方法(EIA)等常規(guī)檢測方法，或者世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的放射免疫方法或酶免疫方法，對上述檢測備用品中的有關(guān)甾體激素進(jìn)行檢測。以采用125碘標(biāo)記的RIA檢測方法為例，對上述人發(fā)樣品中所含的甾體類生殖激素的含量變化情況及影響因素進(jìn)行了檢測和進(jìn)一步的深入研究。將樣本數(shù)n＝17例在24小時(shí)內(nèi)未用任何洗發(fā)劑洗過的女性頭發(fā)樣品分別取樣后，分為直接檢測、分別用市售的中日合資上?；ㄍ跤邢薰旧a(chǎn)的“花王牌洗發(fā)劑”和“詩芬牌洗發(fā)劑”洗過的三種被檢測試樣樣品，并又均將其按發(fā)尖部、發(fā)中段和發(fā)根部三部分分別檢測，以考察頭發(fā)不同部位中的雌二醇(E2)和孕酮(P)兩種甾體激素的分布差異，以及洗發(fā)劑對其在頭發(fā)中含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如表1和表2所示。表1和表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清楚顯示出，在頭發(fā)的不同部位間，E2和P兩種甾體激素的含量，以及洗發(fā)劑對頭發(fā)不同部位中該兩種激素含量變化的影響，以表1所列各數(shù)據(jù)間的差異為大。對表1中“三種頭發(fā)狀況分部位的E2量平均值”的數(shù)據(jù)中的最大差異值(42.8與47.1)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)的處理，t＝0.90，0.677(t＜1.291，故0.50＞p＞0.20，表明其最大差異組間已無顯著性差異。由此可知，其它各組數(shù)據(jù)間顯然也更無顯著性差異了。這既說明了人體內(nèi)的甾體激素在人的頭發(fā)中是普遍存在的，且其在頭發(fā)中的存在和分布可不受頭發(fā)的根、中、梢等采樣部位差異的影響，也表明了其含量不會(huì)因是否用洗發(fā)劑清洗等外部處理因素的影響而改變，具有相對的穩(wěn)定性，因而使本發(fā)明的方法具有了可實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)和價(jià)值。同時(shí)，這一實(shí)驗(yàn)所表明的另一方面的重要的意義和價(jià)值還在于如果某一洗發(fā)劑或化裝品對頭發(fā)或其它使用部位的體表角質(zhì)生長物的甾體激素檢測產(chǎn)生較大或是嚴(yán)重的影響，則至少可以作為表明該洗發(fā)劑或化裝品很可能是不適合于人體使用的重要依據(jù)。分別將不同樣本數(shù)的男性和女性的頭發(fā)樣品與血液樣品中的同種激素的含量進(jìn)行檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，作其相關(guān)性研究。結(jié)果表明，此二者間存在有明顯的相關(guān)性。有關(guān)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)據(jù)參見表3。將樣本數(shù)n＝37例的女性在其正常月經(jīng)周期中的卵泡期(月經(jīng)第7-10天)、排卵期(月經(jīng)第14天)和黃體期(月經(jīng)第20-24天)三個(gè)生理階段中分別取頭發(fā)樣品進(jìn)行檢測，以考察頭發(fā)中的甾體激素含量與人體生理狀況變化間的規(guī)律關(guān)系。檢測得其中雌二醇的平均含量分別為22.8、21.8和25.6(pg/g)。此含量變化規(guī)律與L.特雷格在其所著的《類固醇激素》(科學(xué)出版社，1980)中記載的女性雌二醇激素的血漿水平與性周期關(guān)系研究結(jié)果中所表述的變化規(guī)律是完全吻合的。除以上述的頭發(fā)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)外，以人的指甲為檢測樣品，同樣進(jìn)行了甾體激素含量的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。將取自女性的指甲樣品粉碎后，用上述相同的處理方法得到待測的混旋液后，檢測到其中雌二醇的含量為102pg/g，孕酮的含量為5.9ng/g。表明除頭發(fā)外，人體體表的其它角質(zhì)生長物同樣也含有可以利用并具有檢測意義和價(jià)值的甾體激素。除上述激素外，對人體內(nèi)的其它甾體激素的檢測也同樣是可行的。例如，分別對n＝7例的男性和n＝7例女性的進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，其每50毫克毛發(fā)中皮質(zhì)醇激素的平均含量均為9ng。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果已充分表明，無論男性還是女性，甾體激素不僅在頭發(fā)中均穩(wěn)定存在，而且其含量及變化與其在血液中的存在狀況具有顯著的相關(guān)性。即，對其在頭發(fā)中含量的檢測與對其在血液中含量的檢測是具有同等的意義和價(jià)值的。以放射免疫方法對上述有關(guān)甾體激素的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其結(jié)論，采用“磁性微粒分離的免疫酶聯(lián)測定法(IEMA)”檢測同樣是可行的。顯然，上述的檢測原理及操作方法對于有關(guān)的甾體激素衍生物的檢測無疑同樣也是適用和可行的。由于迄今為止，人們并未認(rèn)識到在人發(fā)中，當(dāng)然更不可能認(rèn)識到在人的胡須、指(趾)甲等人體體表的這些角質(zhì)生長物中含有甾體激素，并有著與人體生理、病理狀況的變化相適應(yīng)的自身變化規(guī)律及其重要的應(yīng)用價(jià)值，因此本發(fā)明的方法在科學(xué)上的重要意義是顯而易見的。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果所表明的實(shí)際應(yīng)用意義和價(jià)值同樣也是顯而易見的，它可以徹底改變對人體甾體激素及其衍生物的檢測必須到醫(yī)院或有相應(yīng)條件的地點(diǎn)抽取血樣的傳統(tǒng)方式，以人體體表的角質(zhì)生長物，特別是以量大易得而目前通常被視為廢棄物的人發(fā)為檢測樣品，可以具有同等的意義和作用，簡便易行，沒有任何痛苦，不會(huì)感染和傳播疾病，因而易于為人們廣泛接受，而且避免了隨對血液的采樣和檢測而帶來的諸多弊端和不便，又大大降低了檢測的費(fèi)用成本，不僅在疾病的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和診斷上有重大的使用意義和價(jià)值，在科學(xué)研究上也有重要意義，它可成為內(nèi)分泌研究的重要手段。在簡化和方便如對運(yùn)動(dòng)員的興奮劑檢測等其它有關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用也具有重要和巨大的現(xiàn)實(shí)意義和價(jià)值。表1頭發(fā)中雌二醇(E2)的含量測定結(jié)果(n＝17，E2含量單位為pg/g)</tables>注含量單位中的pg為10-12克表2頭發(fā)中孕酮(P)的含量測定結(jié)果(n＝17，P含量單位為ng/g)</tables>注含量單位中的ng為10-9克表3人發(fā)與血液中同種甾體激素間的相關(guān)性\性別及樣本數(shù)激素種類頭發(fā)中含量血清中含量發(fā)中含量/血中含量相關(guān)值(r)相關(guān)性女n＝35雌二醇25.6pg/g59.8pg/ml42.8％0.3960.05＞p＞0.025顯著性相關(guān)女n＝35孕酮8.25ng/g13.1ng/ml63.5％0.4400.025＞p＞0.01顯著性相關(guān)男n＝5睪酮1.30ng/g4.86ng/ml26.7％0.9200.025＞p＞0.01顯著性相關(guān)</table></tables>權(quán)利要求1.一種由人體體表角質(zhì)生長物測定體內(nèi)甾體激素及其衍生物含量的檢測方法，其特征在于按下述步驟操作1)取人體體表的角質(zhì)生長物粉碎后，用可溶解被檢測的甾體激素或其衍生物成分的有機(jī)溶劑浸泡，充分萃取至少一次后，將全部萃取液揮盡溶劑，得到萃取提取物；2)將上步得到的萃取提取物置于pH7.2-7.4的磷酸緩沖液中，于35-39℃放置25-35分鐘后，再于室溫至少混旋1分鐘；3)用常規(guī)的放射免疫法或酶免疫法測定上步混旋液中被測甾體激素或其衍生物的含量。2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所說的有機(jī)溶劑為沸點(diǎn)低于100℃的低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑。3.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所說的有機(jī)溶劑為含氧的低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑。4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所說的有機(jī)溶劑為乙醚。5.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所說的有機(jī)溶劑為沸點(diǎn)范圍為30-60℃的石油醚。6.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所說的用溶劑萃取時(shí)有機(jī)溶劑的用量為25-50毫克的被萃取角質(zhì)物用溶劑2毫升的比例，萃取次數(shù)至少為兩次。7.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于所說的用溶劑萃取時(shí)有機(jī)溶劑的用量為25-50毫克的被萃取角質(zhì)物用溶劑2毫升的比例，萃取次數(shù)至少為兩次，每次萃取和放置時(shí)間至少為60分鐘，合并各次萃取液自然揮盡或水浴揮盡萃取溶劑后得到萃取提取物。8.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于將所說的萃取提取物置于由磷酸二氫鈉—磷酸氫二鈉組成的緩沖液中，于37±0.5℃水浴下放置約30分鐘后取出，再于室溫下混旋1分鐘后，用常規(guī)的免疫測定方法測定其中的甾體激素或其衍生物含量。9.如權(quán)利要求1至8之一所述的檢測方法，其特征在于所說的人體體表角質(zhì)生長物為人體的毛發(fā)。10.如權(quán)利要求1至8之一所述的檢測方法，其特征在于所說的人體體表角質(zhì)生長物為人體的指甲或趾甲。全文摘要本發(fā)明涉及的是一種由人體體表角質(zhì)生長物測定體內(nèi)甾體激素及其衍生物含量的檢測方法,按下述步驟操作:1)取人體體表的角質(zhì)生長物粉碎后,用可溶解被檢測的甾體激素或其衍生物成分的有機(jī)溶劑浸泡,充分萃取至少一次后,將全部萃取液揮盡,得萃取提取物;2)將所得到的萃取提取物置于pH7.2—7.4的磷酸緩沖液中,于35—39℃放置25—35分鐘后,再于室溫至少混旋1分鐘;3)用常規(guī)的放射免疫法或酶免疫法測定上步的混旋液中甾體激素或其衍生物的含量。文檔編號G01N33/53GK1173641SQ97107498公開日1998年2月18日申請日期1997年5月19日優(yōu)先權(quán)日1997年5月19日發(fā)明者楊惠鐘申請人:四川省計(jì)劃生育科學(xué)研究所