專利名稱：與體積無關(guān)的診斷試驗載體和用它來測定被分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷試驗載體，該載體含有支承層、置于其上的一個或幾個含有測定液體樣品中的被分析物所需試劑的檢測層以及比檢測層大并且粘附于支承層、覆蓋檢測層的網(wǎng)狀物。另外，本發(fā)明涉及將該診斷試驗載體用于測定液體中被分析物的用途以及借助于本發(fā)明診斷試驗載體測定液體樣品中被分析物的方法。
所謂的結(jié)合載體試驗通常用于體液成分、特別是血液成分的定性或定量分析測定。在這些試驗中，試劑存在于與樣品接觸的固體試驗載體的適當(dāng)層上或?qū)又?。液體樣品與試劑的反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號，特別是可以用肉眼或借助于儀器(通常用反射光度計)分析的顏色變化。
試驗載體通常為試驗條的形式，它基本上由塑料材料制成的細(xì)長的支承層和置于其上、作為試驗區(qū)的檢測層組成。然而，也已知試驗載體的形狀為四邊形或矩形的小板。
由德國專利文件21 18 455已知涉及上述類型的試驗載體。該文件描述了用于檢測液體中被分析物的診斷載體，該載體由支承層和至少一個含有檢測試劑的檢測層組成，檢測層未置于支承層的表面有一個覆蓋層。覆蓋層可以由織物、編織物或羊毛形式的細(xì)目網(wǎng)狀物構(gòu)成。塑料織物為推薦的網(wǎng)狀物，以便用樣品液體快速濕潤檢測層并且避免干擾層析效果。為了測定液體中的被分析物，將這樣的診斷試驗載體浸入相應(yīng)的液體、最好是尿液中。因此檢測層與試驗載體不能吸收的大量過量的流體接觸。然而，根據(jù)檢測層與待測液體的接觸時間，觀察到不同的顏色強(qiáng)度。較長的接觸時間通常導(dǎo)致較強(qiáng)的陽性結(jié)果。因此，不可能以該方式正確地定量測定被分析物。
糖尿病的監(jiān)測中(即定期控制糖尿病患者血液中葡萄糖含量)錯誤測量值的一個常見原因一方面是樣品體積不合適。需要最小可能體積的試驗載體是當(dāng)前發(fā)展的其中一個目標(biāo)。然而，這類試驗載體必須不僅能用很小的樣品體積(大約3μl)獲得正確的測量值，而且用相對大的樣品體積(大約15-20μl)也必須能可靠地進(jìn)行測定，還必須能保留樣品液體。如果液體從試驗載體漏出，那么可能引起衛(wèi)生問題，例如如果測定潛在傳染性的外源血液，或如果要用儀器測定試驗載體，那么就有污染儀器的危險。就本專利申請人所知，至今尚未以簡單并且令人滿意的方式達(dá)到該目標(biāo)。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于液體中被分析物定量測定的診斷試驗載體，在該載體上可以應(yīng)用不定量的樣品液體。大約3μl的樣品體積應(yīng)該是合適的。然而，過量的樣品液體不導(dǎo)致依賴于時間的假陽性結(jié)果。此外，過量的樣品液體不應(yīng)引起衛(wèi)生問題，試驗載體也應(yīng)該能盡可能簡單地生產(chǎn)。
本發(fā)明達(dá)到了該目的，本發(fā)明的特征在權(quán)利要求中進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
本發(fā)明的要點是具有支承層和檢測層(置于支承層上、含有測定液體樣品中被分析物所需的試劑)的診斷試驗載體。檢測層用網(wǎng)狀物覆蓋，網(wǎng)狀物比檢測層大，并且固定到檢測層外的支承層上。本發(fā)明診斷試驗載體的網(wǎng)狀物是親水的，但單獨使用時沒有毛細(xì)活性。由不能滲透樣品液體的材料制成的惰性覆蓋層置于網(wǎng)狀物延伸到檢測層以外的區(qū)域上，使得位于檢測層上的網(wǎng)狀物區(qū)域中用于加樣區(qū)域保持游離。
此外，本發(fā)明涉及使用這一診斷試驗載體測定液體中的被分析物。因此，借助于這一診斷試驗載體測定液體樣品中被分析物的方法也是本發(fā)明的要點，在該方法中將樣品液體加到點樣點。網(wǎng)狀物將過量的液體由檢測層導(dǎo)入網(wǎng)狀物延伸到檢測層以外的區(qū)域，然后可以觀察檢測層信號的產(chǎn)生。該信號的產(chǎn)生是測定待測樣品中被分析物的存在或被分析物的量。
本發(fā)明診斷試驗載體的網(wǎng)狀物本身應(yīng)該不具有毛細(xì)活性或吸收性，因此樣品液體可以盡可能地完全被檢測層利用。那些當(dāng)垂直浸入水中時，水在網(wǎng)狀物中上升不足2mm的網(wǎng)狀物被證明是合適的。最好將親水性粗目單絲織物用作網(wǎng)狀物。為此，織物材料本身可以是親水的，或用例如濕潤劑處理制成親水的。特別優(yōu)選將聚酯用作網(wǎng)狀材料，在這種情況下，然后在濕潤劑處理后使用該材料制成的網(wǎng)狀物。
網(wǎng)狀物的厚度必須使得置于其上的覆蓋物與在網(wǎng)狀物之下的薄層相互之間的距離能使得液體從浸透的檢測層吸收保留液體，然后在覆蓋物之下區(qū)域中通過毛細(xì)力進(jìn)入填充網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)狀物中，將液體由點樣點導(dǎo)出。為此，通常網(wǎng)狀物的厚度最好為50-400μm。
網(wǎng)的篩目必須具有足夠大的寬度，使得液體可以通過網(wǎng)進(jìn)入檢測層上。網(wǎng)狀物的性質(zhì)可使得液體不在網(wǎng)表面上的網(wǎng)上水平展開，而通過網(wǎng)垂直流到檢測層上。
在本發(fā)明診斷試驗載體中，特別要考慮的承托層材料是那些不吸收待測液體的材料。這些材料是所謂的非吸收性材料、由例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚碳酸酯或特別優(yōu)選聚酰胺制成的塑料薄片。然而，也可以將吸收性材料(諸如木材、紙或卡紙板等)浸漬防水劑或涂布防水膜，在這種情況下可以將硅或硬脂用作疏水劑，而例如硝酸纖維素或醋酸纖維素可以用作成膜劑。另外，金屬箔和玻璃也適用作承載材料。
相反，檢測層需要使用能夠與其中含有的組分一起吸收待測液體的材料。這些材料是所謂的吸收性材料(諸如羊毛、織物、編織物、膜或其它多孔塑料材料等)或溶脹材料(諸如明膠或可以用作膜材料的分散膜等)。當(dāng)然，考慮用于檢測層的材料必須也能夠攜帶檢測待測被分析物所需的試劑。在最簡單的情況下，被分析物試驗所需的所有試劑在一層上或一層中。然而，也可以想象最好在幾個一個疊一個放置的收性材料層或溶脹材料層中分配試劑。下文使用的“檢測層”包括那些試劑或者只位于一個層上或?qū)又?、或者位于兩個或甚至多個如上述放置的薄層中的情況。
此外，檢測層也可以含有一個能夠從全血分離血漿或血清的薄層，諸如由例如EP-B-0 045 476已知的玻璃纖維的羊毛狀物等。一個或幾個這樣的分離層可以位于一個或幾個攜帶檢測試劑的薄層上。這一結(jié)構(gòu)也包括在“檢測層”中。
優(yōu)選用于檢測層的材料是紙或諸如膜之類的多孔塑料材料。其中特別優(yōu)選非對稱多孔膜，最好安放多孔膜使得待測樣品液體加到膜的大孔邊，而從膜的細(xì)孔邊檢測被分析物。最優(yōu)選聚酰胺、聚偏二氟乙烯、聚醚砜或聚砜膜作為多孔膜材料。聚酰胺66膜和親水化非對稱聚砜膜特別適合。用于檢測待測被分析物的試劑通常通過浸入上述材料中或通過涂布用于膜的一面來導(dǎo)入。涂布非對稱膜時，最好涂布細(xì)孔邊。
然而，檢測層也可以考慮如例如EP-B-0 016 387中描述的所謂開孔膜(open film)。為此，可以加入不溶性有機(jī)或無機(jī)細(xì)顆粒的成膜有機(jī)塑性固體的含水分散體，另外加入檢測反應(yīng)所需的試劑。適宜的成膜劑優(yōu)選有機(jī)塑料(諸如聚乙烯酯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯等)、混合聚合物(諸如丁二烯和苯乙烯的混合聚合物或馬來酸酯和乙酸乙烯酯的混合聚合物等)或其它天然或合成的成膜有機(jī)聚合物及其含水分散體形式的混合物。分散體可以涂到基板上，形成均一的薄層，該層干燥后生成防水膜。干膜厚度為10-500μm，最好為30-200μm。該薄膜可以與基板一起用作載體或可以置于另一檢測反應(yīng)載體上。盡管通常將檢測反應(yīng)所需的試劑加入用來產(chǎn)生開孔膜的分散體中，但形成的薄膜在生產(chǎn)后浸漬試劑也可能是有利的。也可以用試劑預(yù)浸漬填料?？梢杂脕頇z測被分析物的試劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知。這一點在這里就不需要更詳細(xì)地闡述了。
另一推薦的本發(fā)明檢測層的實例是WO-A-92 15 879中描述的薄膜層。該層是由在均勻分散體中還含有顏料、溶脹劑和檢測試劑的聚合成膜劑的乳液或分散體生產(chǎn)的。聚乙烯酯、聚乙烯醋酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚乙烯酰胺、聚酰胺和聚苯乙烯特別適合用作聚合成膜劑。除同聚物外，諸如丁二烯、苯乙烯或馬來酸酯之類的混合聚合物也適用。二氧化鈦是特別合適的膜顏料。所用的溶脹劑應(yīng)該具有特別好的溶脹性質(zhì)，特別推薦甲基·乙烯基醚馬來酐共聚物。適用哪種試劑來檢測特殊被分析物的問題留給本領(lǐng)域技術(shù)人員。
在本發(fā)明診斷試驗載體中，特別推薦使用由兩層組成的試驗區(qū)作為檢測層。該試驗區(qū)包含透明薄片和置于其上的第一薄膜層以及第一薄膜層之上的第二薄膜層。重要的是位于透明薄片上的第一層在濕潤狀態(tài)下散射的光大大低于位于其上的第二層。透明薄片的未涂布面稱為檢測面，而第二層置于第一層的面相對的面稱為點樣面。
薄膜層由聚合成膜劑的乳液或分散體產(chǎn)生。分散體成膜劑含有顯微鏡下可見的聚合物顆粒，這些顆粒不溶于載體液體(通常是水)，很好地分散在載體液體中。如果在成膜期間通過蒸發(fā)除去液體，那么顆粒相互接近并很好地相互接觸。在該過程中產(chǎn)生并在伴隨成膜產(chǎn)生的表面能中獲得的大力使得顆粒實際上生成緊密的薄膜層?；蛘撸部梢允褂萌苡谌軇┲械某赡┤橐?。溶解的聚合物在載體液體中乳化，不能與溶劑混合。
聚乙烯酯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚乙烯酰胺、聚酰胺和聚苯乙烯特別適合用作這類成膜劑的聚合物。除同聚物外，諸如丁二烯、苯乙烯或馬來酸酯之類的混合聚合物也適用。
兩個所謂的薄膜層位于試驗區(qū)中的透明薄片上。對此，可以考慮使用那些能夠浸漬液體的塑料薄片。聚碳酸酯薄片被證明是特別適合的。
涂布含有相同聚合成膜劑的化合物或者涂布含有不同聚合成膜劑的化合物，可以生產(chǎn)兩個薄膜層。第一薄膜層含有溶脹劑以及可選的弱散射光的填料，而第二薄膜層則需要溶脹劑以及在任何情況下都需要的至少一種強(qiáng)散射光的顏料。此外，第二薄膜層也含有非多孔性填料以及少量的諸如硅藻土之類的多孔填料，而對紅細(xì)胞沒有滲透性。
通過加入溶脹性好的溶脹劑(即吸收水時體積增大的物質(zhì))，盡管該溶脹劑有這種開孔作用，但我們的確不僅獲得可以相當(dāng)快地滲透樣品液體的薄膜層，而且這些薄膜層具有很好的紅細(xì)胞以及血的顏料分離性質(zhì)。溶脹劑的溶脹性質(zhì)應(yīng)該很好，使得試驗的顏色生產(chǎn)速率(諸如葡萄糖試驗反應(yīng)等)主要取決于樣品液體的通過薄膜層的滲透，在至多1分鐘后，可選地測定可檢測的反應(yīng)。特別適合的溶脹劑被證明是甲基·乙烯基醚馬來酐共聚物、合成生物聚合膠和甲基·乙烯基醚馬來酐共聚物。
硅藻土(Kieselghur)也表示為硅藻土(diatomaceous earth)。這些硅藻土是由在不同地方開采的矽藻型硅酸骨干形成的沉積物。最好使用的硅藻土的平均顆粒直徑為5-15μm，這些數(shù)值是用德國PabischCompany，Munich出售的715型激光粒度分析儀測定的。
第二層中強(qiáng)散射光顏料的量至少為試驗區(qū)現(xiàn)成的干燥雙層重量的25％。由于弱散射光填料和強(qiáng)散射光顏料是薄膜層光學(xué)性質(zhì)所必需的，因此第一和第二薄膜層含有不同的填料和顏料。
第二薄膜層應(yīng)該或者不含填料、或者含有那些折光率接近水折光率的填料。對此，二氧化硅、硅酸鹽和硅酸鋁被證明特別適用。特別推薦商品名為Traspafill的硅酸鋁鈉。
按照本發(fā)明，第二層應(yīng)該非常強(qiáng)地散射光。第二薄膜層中顏料的折光率理想的應(yīng)該為至少2.5。因此，優(yōu)選使用二氧化硅。平均直徑為0.2-0.8μm的顆粒被證明是特別有利的。尤其優(yōu)選在銳鈦礦修飾中易加工類型的二氧化鈦。
通過顏色生成檢測特殊被分析物的試劑體系對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的?？赡芩性噭w系的組分都位于一個薄膜層中。然而，也可能試劑體系的組分在兩個薄膜層中進(jìn)行分配。產(chǎn)生顏色的試劑體系最好至少部分位于第一薄膜層上。
本發(fā)明范圍內(nèi)的顏色生成不僅應(yīng)理解為由白色變?yōu)椴噬?，而且?yīng)理解為顏色的任何變化，當(dāng)然特別優(yōu)選與最大光吸收波長(λmax)的變化有關(guān)的這類顏色變化。
為了優(yōu)化本發(fā)明診斷試驗載體的試驗區(qū)，相應(yīng)的薄膜層分別用所述組分的均勻分散體連續(xù)生產(chǎn)。為此，將透明薄片用作基板，生成第一薄膜層的涂布化合物。當(dāng)應(yīng)用的第一薄膜層涂布化合物具有特殊的薄層厚度后，干燥薄膜層。然后，將第二薄膜層涂布化合物涂布到該層上，使其也具有薄層厚度，然后進(jìn)行干燥。干燥后，第一薄膜層和第二薄膜層的總厚度應(yīng)該不超過0.2mm，優(yōu)選不超過0.12mm，特別優(yōu)選不超過0.08mm。干燥的第二薄膜層最好比第一薄膜層厚2-5倍。
本發(fā)明的試驗載體可以具有一個檢測層。然而，也可以含有幾個一個接一個放置的檢測層。在幾個檢測層的情況下，這些檢測層可以相同或不同，因此可以在幾個檢測層中平行檢測一個相同的被分析物，或分別在另一檢測層中檢測不同的被分析物。然而，也可能幾個空間上分離的反應(yīng)區(qū)一個接一個地位于檢測層上，因此，在這種情況下，可以在相同檢測層中平行檢測幾次相同的被分析物，或者檢測不同的被分析物。在后一種情況下，薄膜層的材料是不含被分析物檢測試劑的相同材料。不同的試劑位于不同的反應(yīng)區(qū)。不同的反應(yīng)區(qū)可以并排出現(xiàn)并相互接觸，或用同被分析物不產(chǎn)生信號的插入?yún)^(qū)分離。
在本發(fā)明的診斷試驗載體中，覆蓋檢測層的網(wǎng)狀物比在它之下的檢測層大。網(wǎng)狀物延伸到檢測層之外的部分(即不與檢測層接觸的網(wǎng)狀物部分)直接固定或通過墊片間接固定到檢測層之外的支承層上?？梢杂迷囼炤d體技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行固定。例如可以用熱固性粘合劑或通過硬化冷固化粘合劑進(jìn)行固定。由于毛細(xì)活性的液體轉(zhuǎn)移在這種情況下進(jìn)行得特別好，因此在這種情況下最好使用點粘合或圖案粘合。雙面膠粘帶也被證明是有利的。然而，在所有情況下，重要的是將網(wǎng)狀物粘附于支承層上，使得可能從檢測層通過毛細(xì)活性將液體轉(zhuǎn)移到粘附于支承層的網(wǎng)狀物部分。當(dāng)檢測層浸透液體時，這種毛細(xì)活性的液體轉(zhuǎn)移特別可能發(fā)生。由天然或合成橡膠制成的膠粘帶被證明特別適于該加工。用來將網(wǎng)狀物粘附于支承層的粘合劑的厚度與檢測層相同時尤其有利。那么將它或多或少地用作墊片，以便全部在也在檢測層區(qū)域外的連續(xù)平面中固定網(wǎng)狀物。
如果本發(fā)明的診斷試驗載體含有幾個一個接一個的檢測層，那么網(wǎng)狀物可以覆蓋所有檢測層，或者可以使用幾個網(wǎng)狀物。
為了檢測樣品液體中的待測被分析物，可以透過本發(fā)明的診斷試驗載體的支承層可見到檢測層以及至少可以見到反應(yīng)區(qū)(即可以觀察到的并測定信號生成的攜帶試劑的檢測層區(qū)域)。用透明的支承層可以做到這一點。然而，支承層也可以具有孔眼，孔眼用一個檢測層或幾個檢測層覆蓋。那么可以透過孔眼看見檢測層或幾個檢測層以及至少檢測層的反應(yīng)區(qū)。在本發(fā)明的診斷試驗載體的推薦實施方案中，在檢測層之下的支承層中有孔，透過孔可以觀察檢測層或反應(yīng)區(qū)。該孔的直徑稍微小于檢測層最小的線性長度，因此孔外的檢測層位于并可以粘附于支承層上。位于檢測層兩邊附近的雙面膠粘帶最好固定到位于檢測之上的網(wǎng)狀物上，并且適當(dāng)?shù)卣掣接谥С袑由?。然而，檢測層本身也最好用薄膠粘帶粘附于支承層上。
然而，透過一個孔也可能看見檢測層的幾個反應(yīng)區(qū)。
本發(fā)明的診斷試驗載體的孔眼可以由兩個或幾個用來檢測被分析物(一個或幾個被分析物)的孔組成?？梢詫⒉煌臋z測層或只有一個具有幾個反應(yīng)區(qū)的檢測層置于孔上，因此在各種情況下通過一個孔可以觀察到一個檢測層或一個反應(yīng)區(qū)。也可以通過一個孔觀察幾個反應(yīng)區(qū)。
由不能滲透樣品(通常是不透水)的非吸收性材料制成的惰性覆蓋物置于本發(fā)明診斷試驗載體的網(wǎng)狀物上，使得可覆蓋檢測層外的網(wǎng)狀物區(qū)域。理想的是覆蓋物也稍微延伸至檢測層區(qū)域外。然而，在任何情況下，覆蓋檢測層的網(wǎng)狀物的相當(dāng)一部分保持游離。網(wǎng)狀物的游離部分代表點樣點。
塑料薄片被證明特別適用作覆蓋物。如果覆蓋物和網(wǎng)狀物具有不同顏色，例如白色和黃色或白色和紅色，這樣可以非常好地標(biāo)記應(yīng)該加入待測樣品液體的位點。
如果在覆蓋物上印刷例如一個或幾個箭頭，也可以清楚地看出本發(fā)明的診斷試驗載體應(yīng)該置于或插入測量儀中的方向(即一端)。
點樣點可以用兩個帶狀塑料薄片特別簡單地得到，塑料薄片使得覆蓋檢測層的網(wǎng)狀物的帶狀區(qū)域保持游離。如果提供兩個或幾個點樣點，那么必須使用三個或更多的帶狀塑料薄片。用來覆蓋的塑料薄片粘附于網(wǎng)狀物上，也可選地粘附于支承層上。如果塑料薄片本身不是粘合劑，那么例如以點或光柵用于支承層或覆蓋物底面的熱融性粘合劑適用于這類附著物或膠粘帶。然而，在任何情況下都必須注意，由網(wǎng)狀物產(chǎn)生的毛細(xì)管空隙保持在覆蓋物之下，在這里可以從浸透液體的檢測層吸收過量的樣品液體。點樣點最好位于支承層的孔眼之上，透過孔眼可以觀察檢測層信號的產(chǎn)生。
為了實施借助于本發(fā)明的診斷試驗載體測定液體樣品中的被分析物的方法，將樣品液體加到非面對檢測層的網(wǎng)狀物面上，理想的是使得液體通過網(wǎng)狀物完全浸透檢測層。特別要考慮諸如血液、血漿、血清、尿液、唾液等體液作為樣品液體。血或由血液產(chǎn)生的液體(諸如血漿或血清等)以及尿液是特別優(yōu)選的樣品液體。過量的液體通過網(wǎng)狀物從檢測層導(dǎo)出，進(jìn)入延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物區(qū)域。然后當(dāng)存在待測被分析物時，可以在檢測層中檢測信號。這一信號最好是顏色的變化，可理解為顏色的產(chǎn)生、顏色的喪失以及顏色的變化。顏色變化的強(qiáng)度可測定待測液體樣品中被分析物的量?？梢阅繙y評價或借助于儀器(通常用反射光度計)進(jìn)行定量測定。
如果到達(dá)檢測層的液體太少，即少于浸透檢測層所必需的液體，那么由于液體只能垂直通過網(wǎng)狀物到達(dá)檢測層，而不在網(wǎng)狀物表面上水平展開，所以可以從上面或從下面見到檢測層區(qū)域保持干燥。既然如果存在被分析物，只在檢測層完全潮濕的區(qū)域產(chǎn)生信號，那么可以通過網(wǎng)狀物以及通過支承層看見或用儀器檢測不均勻信號的產(chǎn)生。這對檢測人員清楚地表明，使用的樣品液體太少，因此檢測結(jié)果可能是錯誤的。即使樣品中不存在被分析物，檢測層的幾個部分區(qū)域的目測或反射光度計測定也可以例如證實，只有一部分檢測層潮濕，因此使用的樣品液體太少。
除標(biāo)記點樣點外，這一覆蓋物也可保持毛細(xì)力，將過量的液體導(dǎo)出檢測層。此外，覆蓋物也防止導(dǎo)出檢測層的過量液體與外部接觸，并防止這種液體輕易地從試驗載體滴出。
本發(fā)明診斷試驗載體的主要優(yōu)點在于，不需要將預(yù)定體積的樣品液體加到試驗載體上。過量的液體如上述通過延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物導(dǎo)出檢測層。由于過量的液體導(dǎo)出檢測層，所以也考慮到衛(wèi)生方面的問題?？煽康乇苊饬藦脑囼炤d體滴出液體或用于儀器檢測時避免液體例如與放置試驗載體的儀器零件接觸。這在血液或由血液產(chǎn)生的樣品(諸如血漿或血清等)的檢測中是非常重要的。
延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物區(qū)域(延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物部分)的大小取決于實際上預(yù)期的最大樣品體積，使得真正過量的液體也可以導(dǎo)出檢測層。這樣，存在被分析物時產(chǎn)生的信號強(qiáng)度與樣品液體與檢測層接觸的量以及接觸時間無關(guān)。因此檢測反應(yīng)完成后(通常在幾秒至幾分鐘內(nèi))產(chǎn)生的顏色進(jìn)行測定時保持不變。它僅僅由顏色生成體系的穩(wěn)定性所決定，而不由例如過量液體擴(kuò)散回檢測層的被分析物所決定。也可以避免假陽性結(jié)果，被分析物的定量測定成為可能。
覆蓋網(wǎng)狀物部分并因此標(biāo)記點樣點確保了液體只能置于檢測層上最佳位點。這與只吸收少量液體、然而確保生成增強(qiáng)信號的檢測層一起，確保甚至用非常少的樣品體積也可能進(jìn)行被分析物的可靠的檢測。由于本發(fā)明試驗載體只由可以簡單并快速組裝的幾個元件組成，因此它可以非常便宜地生產(chǎn)。
本發(fā)明診斷試驗載體的推薦實施方案示于

圖1-23中。
圖1顯示具有點樣點的本發(fā)明診斷試驗載體的透視圖。
圖2顯示在檢測層下具有圓形孔眼的本發(fā)明圖1試驗載體底面的俯視圖。
圖3顯示圖1的本發(fā)明診斷試驗載體沿A-A截面的剖視圖。
圖4顯示圖3剖視圖一部分的放大圖。
圖5顯示具有點樣點的本發(fā)明診斷試驗載體的透視圖。
圖6顯示在兩個分離的檢測層下具有孔眼(包含圓形孔和矩形孔)的本發(fā)明圖5的診斷試驗載體底面的俯視圖。
圖7顯示本發(fā)明圖5的診斷試驗載體沿A-A截面的剖視圖。
圖8顯示具有非常大的點樣點的本發(fā)明診斷試驗載體的透視圖。
圖9顯示在非常大的檢測層下具有孔眼(包含圓形孔和矩形孔)的本發(fā)明圖8的診斷試驗載體底面的俯視圖。
圖10顯示本發(fā)明圖8的診斷試驗載體沿A-A截面的剖視圖。
圖11顯示在兩個檢測層中的一個檢測層上具有點樣點的本發(fā)明診斷試驗載體的透視圖。
圖12顯示在兩個分離的檢測層下具有孔眼(包含圓形孔和矩形孔)的本發(fā)明圖11的診斷試驗載體底面的俯視圖。
圖13顯示本發(fā)明圖11的診斷試驗載體沿A-A截面的剖視圖。
圖14顯示具有非常大的點樣點的本發(fā)明診斷試驗載體的透視圖。
圖15顯示在具有兩個鄰近的反應(yīng)區(qū)的檢測層下具有孔眼(包含一個非常大的矩形孔)的本發(fā)明圖14的診斷試驗載體底面的俯視圖。
圖16顯示本發(fā)明圖14的診斷試驗載體沿A-A截面的剖視圖。
圖17顯示在兩個反應(yīng)區(qū)中的一個反應(yīng)區(qū)上具有點樣點的本發(fā)明診斷試驗載體的透視圖。
圖18顯示在具有兩個鄰近的反應(yīng)區(qū)的檢測層下具有孔眼(包含一個非常大的矩形孔)的本發(fā)明圖17的診斷試驗載體底面的俯視圖。
圖19顯示本發(fā)明圖17的診斷試驗載體沿A-A截面的剖視圖。
圖20-23顯示按實施例2描述的方法產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線1-4。
用于圖中的參考數(shù)字具有以下含義。
1診斷試驗載體2支承層3檢測層4網(wǎng)狀物5覆蓋物6延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物區(qū)域7點樣點8孔眼9反應(yīng)區(qū)10墊片11毛細(xì)活性間隙12樣品液體13定位孔14用于檢測層的膠粘帶附著物示于圖1透視圖和圖3剖視圖的本發(fā)明診斷試驗載體(1)為試驗條的形式。在支承層(2)上放置一個由較大的網(wǎng)狀物(4)覆蓋的檢測層。網(wǎng)狀物(4)在檢測層(2)附近借助于墊片(10)附于支承層上。這些墊片可以是熱融性粘合劑區(qū)或雙面膠粘帶，將網(wǎng)狀物(4)固定到支承層(2)上。理想的是墊片的厚度與檢測層(3)厚度相同。用作覆蓋物的薄層附于支承層(2)和網(wǎng)狀物(4)上。放置網(wǎng)狀物使得它們覆蓋延伸到檢測層(3)以外的網(wǎng)狀物(4)區(qū)域。覆蓋物(5)也稍微延伸到檢測層(3)以外。然而，它們使得覆蓋檢測層(3)的網(wǎng)狀物(4)的大多數(shù)部分保持游離。該區(qū)域代表點樣點(7)。將待測樣品液體(12)加到該區(qū)域。在用諸如反射光度計之類的儀器測定時，定位孔(13)使得試驗條在用儀器(諸如反射光度計等)測定時，能夠在儀器上保持準(zhǔn)確的預(yù)定位置。可以用插入定位孔(13)的針做到這一點，因此將試驗載體(1)保持在預(yù)定位置。左邊的覆蓋物(5)含有印刷的箭頭，向用戶表明試驗載體(1)的哪一端應(yīng)該放入或插入測量儀中。
圖4顯示通過示于圖1和圖3的本發(fā)明診斷試驗載體的放大剖視圖。該圖是為了闡述檢測液體樣品中被分析物的方法是如何進(jìn)行的。對這一檢測而言，將樣品液體加到網(wǎng)狀物(4)的點樣點(7)上。液體垂直通過網(wǎng)狀物(4)滲透到檢測層(3)中，檢測層用雙面膠粘帶(14)粘附于支承層(2)上。膠粘帶附著物(14)含有一個孔，該孔對應(yīng)于支承層(2)的孔眼(8)，并且也準(zhǔn)確地位于孔眼(8)之上。如果加入足夠的樣品液體，那么該液體分散在檢測層(3)中的整個反應(yīng)區(qū)(9)上。如果液體體積非常小，由于網(wǎng)狀物(4)本身沒有毛細(xì)活性，那么檢測層甚至可能吸干上面的網(wǎng)狀物(4)。在大液體體積介質(zhì)的情況下，液體首先充滿檢測層(3)上網(wǎng)狀物(4)的空的空間，隨后充滿覆蓋物(5)下的毛細(xì)管空隙。為了使這些毛細(xì)管空隙適當(dāng)?shù)仄鹱饔茫采w物(5)必需至少稍微重疊覆蓋物(5)下的檢測層(3)區(qū)域?？梢酝ㄟ^孔眼(8)觀察檢測層(3)的反應(yīng)區(qū)(9)。對于這方面，圖2顯示圖1和圖3診斷試驗載體底面的俯視圖。如果加入的樣品液體中存在被分析物，那么反應(yīng)區(qū)(9)將會變化。信號產(chǎn)生，例如顏色改變，顏色強(qiáng)度用來測定樣品液體中被分析物的量。
示于圖5-7中的本發(fā)明診斷試驗載體具有兩個檢測層(3)，允許樣品液體(12)通過位于檢測層上的兩個點樣點(7)進(jìn)入。通過三個條狀覆蓋物(5)(覆蓋延伸到檢測層(3)以外的網(wǎng)狀物區(qū)域)形成點樣點(7)。在所示實例中，使用連續(xù)的網(wǎng)狀物(4)。然而，也可以使用兩個分離的網(wǎng)狀物(4)，在它們之間插入液體屏障(諸如例如膠粘帶或熱融性粘合劑條等)。位于試驗載體(1)的支承層(2)上的孔眼(8)包含兩個孔，每個孔使得可以觀察兩個檢測層(3)中的一個檢測層的反應(yīng)區(qū)(9)。這一試驗載體(1)例如適用于同時檢測兩個不同被分析物。在這種情況下，如果試劑或反應(yīng)產(chǎn)物可以相互干擾，那么最好使用空間上分離的檢測層(3)。
本發(fā)明圖8-10的診斷試驗載體(1)在檢測層(3)上具有非常大的點樣點(7)，可以通過包含兩個孔的孔眼(8)觀察到檢測層。含有用于不同被分析物的試劑的不同反應(yīng)區(qū)(9)可以例如置于兩個孔上。因此，可以檢測一個樣品的兩個被分析物。然而，兩個反應(yīng)區(qū)也可以用來檢測相同樣品的不同靈敏度。
示于圖11-13中的本發(fā)明診斷試驗載體(1)的兩個檢測層(3)位于包含兩個孔的孔眼(8)上?？籽?8)的每個孔上放置一個檢測層(3)。在這種情況下，點樣點(7)只位于兩個檢測層(3)中的一個檢測層上。因此，樣品液體(12)首先進(jìn)入位于點樣點(7)下的檢測層(3)中，然后過量的液體通過右邊覆蓋物(5)下的網(wǎng)狀物(4)區(qū)域中的毛細(xì)力進(jìn)入右邊的檢測層(3)，這可以通過支承薄片(2)中的矩形孔觀察。這一試驗載體例如適用于用兩個不同靈敏度的檢測層檢測被分析物。靈敏度較低的通用區(qū)最好之直接位于點樣點下，另一高靈敏度區(qū)位于通用區(qū)附近。該試驗載體使得能夠在樣品體積小的情況下用通用區(qū)進(jìn)行測定，而在樣品體積大的情況下用兩個區(qū)進(jìn)行改進(jìn)的測定。
圖14-16的試驗載體(1)在攜帶兩個相鄰反應(yīng)區(qū)(9)的檢測層(3)上具有一個非常大的點樣點(7)。從支承層(2)底面通過孔眼(8)(在這種情況下只由一旦單獨的矩形孔組成)可以見到這兩個反應(yīng)區(qū)。加到點樣點(7)中央的樣品液體(12)通過網(wǎng)狀物(4)滲透到檢測層(3)中，并同時到達(dá)兩個反應(yīng)區(qū)(9)。這一試驗載體可以例如用來檢測一個樣品的兩個不同的被分析物。
圖17-19所示的試驗載體(1)基本上相當(dāng)于圖14-16的試驗載體。然而，點樣點(7)只位于兩個反應(yīng)區(qū)(9)中的一個反應(yīng)區(qū)上。用右邊的覆蓋物(5)防止樣品液體(12)直接加入右邊的反應(yīng)區(qū)(9)。樣品液體(12)只能在位于右邊覆蓋物下的網(wǎng)狀物(4)區(qū)域內(nèi)，通過毛細(xì)力達(dá)到該反應(yīng)區(qū)。
通過以下實施例更詳細(xì)地闡述本發(fā)明。
實施例1
檢測葡萄糖的本發(fā)明診斷試驗載體的生產(chǎn)通過以下生產(chǎn)步驟生產(chǎn)圖1的試驗載體將一個5mm寬的雙面膠粘帶(聚酯支承和合成橡膠粘合劑)置于含有二氧化鈦的聚酯支承層上。該復(fù)合材料以6mm的孔間距離鉆孔以產(chǎn)生測定孔。然后除去雙面膠粘帶的保護(hù)紙。
按以下步驟生產(chǎn)由2個薄膜層組成的檢測層A.按以下組成將以下純物質(zhì)或貯液形式的組分一起加入燒杯中，通過攪拌進(jìn)行混合水 820.0g檸檬酸一水合物 2.5g氯化鈣二水合物 0.5g氫氧化鈉 1.4g合成生物聚合膠 3.4g氯化四乙銨 2.0gN-辛?；?N-甲基-葡糖酰胺 2.1g聚乙烯吡咯烷酮(MW25000)3.5gTranspafill(硅酸鋁鈉) 62.1g聚乙烯基丙酸鹽分散體(在水中50％(重量)) 60.8g氯化二-(2-羥乙基)-(4-肟基亞環(huán)己-2，5-二烯基)-銨1.2g2，18-磷鉬酸六鈉鹽 16.1g吡咯并喹啉-醌 32mg得自乙酸鈣不動桿菌的葡萄糖脫氫酶， 1.7MUEC1.1.99.17(2.4g)1-己醇 1.6g1-甲氧基-2-丙醇20.4g總組合物用NaOH調(diào)至大約pH6，然后以89g/qm的面積重量用于厚度為125μm的聚碳酸酯薄片上，然后干燥。
B.按以下組成將以下純物質(zhì)或貯液形式的組分一起加入燒杯中，通過攪拌進(jìn)行混合水 579.7g氫氧化鈉3.4gGrantrez(甲基乙烯基醚馬來酸共聚物) 13.8gN-辛酰基-N-甲基-葡糖酰胺3.6g氯化四乙銨 9.7g聚乙烯吡咯烷酮(MW25000) 20.2g二氧化鈦177.1g硅藻土 55.3g聚乙烯基丙酸鹽分散體(在水中50％(重量)) 70.6g2，18-磷鉬酸六鈉鹽 44.3g六氰基高鐵(III)酸鉀 0.3g1-己醇 1.6g1-甲氧基-2-丙醇 20.4g總組合物用NaOH調(diào)至大約pH6，然后以104g/qm的面積重量通過A.中描述的方法用于聚碳酸酯薄片上，然后干燥。
將以該方式生產(chǎn)的5mm寬的檢測層條準(zhǔn)確地固定并用粘合于支承層上，其薄片面位于鉆孔的雙面膠粘帶上。
在支承層的兩邊將雙面膠粘帶作為墊片(PVC支承和天然橡膠粘合劑)粘合于支承薄片上，并直接連接檢測層。在本發(fā)明實施例中，一個墊片寬6mm，而另一個墊片寬9mm。隨后除去兩個雙面膠粘帶的保護(hù)薄片。
將浸漬濕潤劑的黃色單絲粗目聚酯織物Scrynel PE 280 HC(“Zurcher Beuteltuchfabrik，Ruschlikon，Switzerland)置于該化合物結(jié)構(gòu)上并通過按壓進(jìn)行粘合。
將兩個雙面膠粘帶(PVC支承和天然橡膠粘合劑)粘合于作為覆蓋物的黃色網(wǎng)上，使得完全覆蓋墊片，并且與反應(yīng)區(qū)至少還有一點重疊。這樣就完成了帶形材料。
將帶形材料切成6mm寬的試驗載體，使得測定孔在試驗載體中間。
實施例2本發(fā)明診斷試驗載體的體積無關(guān)性實施例1的試驗載體用反射光度計進(jìn)行測定。當(dāng)?shù)玫叫?zhǔn)曲線時，測定顏色強(qiáng)度的反射比數(shù)值可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度。如果使用“相對反射比”，那么這是指干燥試驗載體的反射比。
A.測定大量的具有不同葡萄糖濃度的靜脈血樣品，建立校準(zhǔn)曲線。用參考方法測定的這些靜脈血樣品的反射比數(shù)數(shù)值和葡萄糖濃度可以用來建立校準(zhǔn)曲線。
在校準(zhǔn)變體1中，將10μl的靜脈血加到實施例1的試驗載體上，21秒后測定反射比。校準(zhǔn)曲線1(圖20)是通過10個試驗載體的平均反射比和血液樣品的參考值進(jìn)行回歸計算確定的。
在校準(zhǔn)變體2中，將10μl的靜脈血也加到實施例1的試驗載體上，30秒后測定反射比。校準(zhǔn)曲線2(圖21)是通過10個試驗載體的平均反射比和血液樣品的參考值進(jìn)行回歸計算確定的。
在校準(zhǔn)變體3中，將10μl的靜脈血也加到實施例1的試驗載體上，每隔3秒測定反射比。只要反射比的差值連續(xù)兩次低于0.3，就終止測定，然后將反射比數(shù)數(shù)值用于評價。校準(zhǔn)曲線3(圖22)是通過10個試驗載體的平均反射比和血液樣品的參考值進(jìn)行回歸計算確定的。
在校準(zhǔn)變體4中，將10μl的靜脈血也加到實施例1的試驗載體上，每隔3秒測定反射比。只要反射比的差值連續(xù)兩次低于0.9，就終止測定，然后將反射比數(shù)數(shù)值用于評價。校準(zhǔn)曲線4(圖23)是通過10個試驗載體的平均反射比和血液樣品的參考值進(jìn)行回歸計算確定的。
B.在測定變體1中，將不同體積的靜脈血加到實施例1的試驗載體上，21秒后測定反射比。用圖20相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線將各個反射比轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度。由10個試驗載體的平均濃度和血液樣品的參考值測定準(zhǔn)確度的偏差，準(zhǔn)確度偏差示于表1中。
在測定變體2中，將不同體積的靜脈血也加到實施例1的試驗載體上，30秒后測定反射比。用圖21相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線將各個反射比轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度。由10個試驗載體的平均濃度和血液樣品的參考值測定準(zhǔn)確度的偏差，準(zhǔn)確度偏差示于表2中。
在測定變體3中，將不同體積的靜脈血也加到實施例1的試驗載體上，每隔3秒測定反射比。只要反射比的差值連續(xù)兩次低于0.3，就終止測定，然后將反射比數(shù)數(shù)值用于評價。用圖22相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線將各個反射比轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度。由10個試驗載體的平均濃度和血液樣品的參考值測定準(zhǔn)確度的偏差，準(zhǔn)確度偏差示于表3中。
在測定變體4中，將不同體積的靜脈血也加到實施例1的試驗載體上，每隔3秒測定反射比。只要反射比的差值連續(xù)兩次低于0.9，就終止測定，然后將反射比數(shù)數(shù)值用于評價。用圖23相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線將各個反射比轉(zhuǎn)化為葡萄糖濃度。由10個試驗載體的平均濃度和血液樣品的參考值測定準(zhǔn)確度的偏差，準(zhǔn)確度偏差示于表4中。
表1 測定變體1中的試驗條的體積容許量
<p>表2測定變體2中的試驗條的體積容許量
表3測定變體3中的試驗條的體積容許量
表4測定變體4中的試驗條的體積容許量
C.如表中可以看出的，本發(fā)明試驗載體主要與體積無關(guān)。
權(quán)利要求
1.診斷試驗載體(1)，包括支承層(2)、位于支承層上的含有測定液體樣品中被分析物所需的試劑的檢測層(3)和覆蓋檢測層的網(wǎng)狀物(4)(比檢測層(3)大，并且粘附于支承層(2)上)，其中網(wǎng)狀物(4)為親水性的，但本身沒有毛細(xì)活性，而由不能滲透樣品的材料制成的惰性覆蓋物(5)置于延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物區(qū)域(6)上，使得覆蓋檢測層上的網(wǎng)狀物(4)區(qū)域上的點樣點(7)保持游離，網(wǎng)狀物(4)在覆蓋物(5)和檢測層(3)之間以及覆蓋物(5)和支承層(2)之間或覆蓋物(5)和在支承層(2)上的墊片(10)之間產(chǎn)生毛細(xì)活性空隙。
2.按照權(quán)利要求1的診斷試驗載體，其中幾個檢測層一個接一個地置于支承層上。
3.按照權(quán)利要求1或2的診斷試驗載體，其中支承層是穿孔的，而檢測層置于孔眼上。
4.按照權(quán)利要求3的診斷試驗載體，其中點樣點位于支承層的孔眼上。
5.按照權(quán)利要求3的診斷試驗載體，其中點樣點不位于支承層的孔眼上。
6.按照前述權(quán)利要求中一項權(quán)利要求的診斷試驗載體，其中支承層含有幾個作為孔眼的孔，在孔上放置一個或幾個檢測層。
7.按照權(quán)利要求2-5中一項權(quán)利要求的診斷試驗載體，其中支承層含有幾個作為孔眼的孔，在每個孔上放置不同的檢測層。
8.按照權(quán)利要求1的診斷試驗載體，其中支承層含有一個孔，在孔上放置含有幾個相鄰反應(yīng)區(qū)的檢測層。
9.按照權(quán)利要求7或8中一項權(quán)利要求的診斷試驗載體，其中在所有情況下，點樣點都位于幾個或所有檢測層或反應(yīng)區(qū)上。
10.按照權(quán)利要求7或8中一項權(quán)利要求的診斷試驗載體，其中點樣點只位于其中一個檢測層或一個反應(yīng)區(qū)上。
11.按照前述權(quán)利要求中的一項權(quán)利要求的診斷試驗載體，其中網(wǎng)狀物為單絲織物。
12.按照前述權(quán)利要求中的一項權(quán)利要求的診斷試驗載體，其中網(wǎng)狀物通過最好含有天然或合成橡膠的膠粘帶粘附于支承層上。
13.將權(quán)利要求1-12中的一項權(quán)利要求的診斷試驗載體用于液體中被分析物的測定。
14.借助于權(quán)利要求1-12中的一項權(quán)利要求的試驗載體測定液體樣品中被分析物的方法，其中將樣品液體加到點樣點上，不被檢測層和位于其上的網(wǎng)狀物(4)區(qū)域吸收的過量液體被導(dǎo)入延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物區(qū)域，觀察在檢測層產(chǎn)生的信號，產(chǎn)生的信號用來測定待測液體樣品中被分析物的存在或測定被分析物的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷試驗載體(1),該載體含有支承層(2)、檢測層(3)(置于支承層上、含有測定液體樣品中被分析物所需的試劑)和覆蓋檢測層的網(wǎng)狀物(4)(比檢測層(3)大,并且粘附于支承層(2)上),其特征在于,網(wǎng)狀物(4)為親水性的,但其本身沒有毛細(xì)活性,而由不能滲透樣品的材料制成的惰性覆蓋物(5)置于延伸到檢測層以外的網(wǎng)狀物區(qū)域(6)上,使得覆蓋檢測層上的網(wǎng)狀物(4)區(qū)域上的點樣點(7)保持游離;本發(fā)明也涉及將這一試驗載體用來測定液體中被分析物。此外,本發(fā)明涉及借助于本發(fā)明的診斷試驗載體測定液體中被分析物的方法。
文檔編號G01N33/52GK1176390SQ9711536
公開日1998年3月18日 申請日期1997年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月23日
發(fā)明者D·蒂姆, H·萊寧格爾 申請人:曼海姆泊靈格股份公司