專利名稱：測(cè)定因子IXa催化活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定Ⅸa因子催化活性的方法。根據(jù)本發(fā)明所述的方法適于搜索因子Ⅸa抑制劑(篩選)、調(diào)節(jié)血凝結(jié)(治療應(yīng)用)和在體液中測(cè)定因子Ⅸ和因子Ⅸa(診斷應(yīng)用)。
血漿蛋白酶在由血纖維蛋白形成引起的血凝結(jié)和傷口愈合以及血纖維蛋白溶解作用即血塊溶解中起作用。受傷后，通過(guò)無(wú)活性酶原的順序激活(特異的蛋白水解)形成有活性的酶擴(kuò)增“受傷信號(hào)”，這些活性酶啟動(dòng)血凝結(jié)并確保傷口快速愈合。血凝結(jié)可以由兩條途徑啟動(dòng)，內(nèi)途徑，其中所有蛋白成分存在血中；和外途徑，其中膜蛋白，所謂的組織因子起關(guān)鍵作用。
血穩(wěn)態(tài)(血凝結(jié)、血纖維蛋白溶解作用和此平衡的調(diào)節(jié))的分子機(jī)制及參與的成分在幾篇綜述文章中得到全面描述[Furie,B.和Furie,B.C.，細(xì)胞，53(1988)505-518；Davie,E.W.等，生物化學(xué)，30(1991)10363-10379；Bergmeyer,H.U.(編輯)酶分析方法，第五卷，第3章，第三版，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1983)]。
血凝結(jié)級(jí)聯(lián)的因子是十分復(fù)雜的蛋白。按常規(guī)，它們只能用復(fù)雜的方法以有限數(shù)量，不同的質(zhì)量、同質(zhì)性和純度從天然原材料血漿中分離[Van Dam-Mieras,M.C.E.等，于Bergmeyer,H.U.(編輯)，酶分析方法，第五卷，第三版，365-394頁(yè)，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1983)]。它們?cè)谘€(wěn)態(tài)即血凝結(jié)、血塊形成和溶解之間的平衡的調(diào)節(jié)中起重要作用。良好調(diào)節(jié)的系統(tǒng)可能由于遺傳缺損如A型血友病(缺損因子Ⅷ)和B型血友病(缺損因子Ⅸ)變得不平衡。急性紊亂會(huì)導(dǎo)致心肌梗塞、栓塞和中風(fēng)。
因此，根據(jù)醫(yī)學(xué)需求，需要能影響血凝結(jié)和血纖維蛋白溶解作用系統(tǒng)的物質(zhì)。例如使用從血液中分離的或重組合成的因子Ⅷ或因子Ⅸ治療A型和B型血友病。tPA(組織型纖溶酶原激活物)和鏈球菌激酶(細(xì)菌纖溶酶原激活物)用于例如心肌梗塞后的血塊溶解。除了復(fù)雜的蛋白，諸如蛭素(由65個(gè)氨基酸組成，凝血酶抑制劑)、肝素(雜聚糖，內(nèi)源抑制劑的輔因子)和維生素K拮抗物(GlA區(qū)域Glu殘基γ-羧基化的抑制劑)的物質(zhì)可用于抑制血凝結(jié)。然而，可得到的物質(zhì)經(jīng)常十分昂貴(蛋白因子)并且對(duì)于它們的醫(yī)學(xué)應(yīng)用不理想(副作用)，因此需要能用于特異調(diào)節(jié)血凝結(jié)和血塊溶解的藥物。
可以例如通過(guò)篩選物質(zhì)庫(kù)，隨后通過(guò)藥物模型改進(jìn)已鑒定的前導(dǎo)結(jié)構(gòu)(1ead structure)進(jìn)行血凝結(jié)、血纖維蛋白溶解作用以及穩(wěn)態(tài)的新調(diào)節(jié)劑(活化劑、抑制劑)的研究。對(duì)于此研究需要(ⅰ)適合的檢測(cè)和(ⅱ)可以足夠數(shù)量和質(zhì)量得到的關(guān)鍵蛋白(靶蛋白)以用于篩選和晶體結(jié)構(gòu)研究(例如根據(jù)蛋白組成和前導(dǎo)結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)通過(guò)改變的特定預(yù)測(cè)改進(jìn)前導(dǎo)結(jié)構(gòu))。
為了找到調(diào)節(jié)血凝結(jié)的抑制劑，因子Ⅸa(FⅨa)對(duì)于抑制劑的篩選是令人感興趣的靶蛋白。B型血友病(因子Ⅸa缺損)的已知臨床情況證實(shí)了設(shè)想，即在相當(dāng)大的多效副作用方面，特異的因子Ⅸa抑制劑優(yōu)于已知的凝血酶抑制劑。
以前由于適用性和因子Ⅸa的極低的催化活性，對(duì)FⅨa抑制劑活性的篩選都遭到失敗。
未活化的絲氨酸蛋白酶FⅨ(酶原)從血漿中的分離和隨后通過(guò)蛋白水解的活化是困難、耗時(shí)和昂貴的，經(jīng)常不能產(chǎn)生所需的數(shù)量和質(zhì)量。未活化蛋白酶原FⅨ的血漿濃度只有0.5mg/l(Furie,B.和FurieB.C.，細(xì)胞，53(1988)505-518)。而且從血漿中分離并體外活化的蛋白酶制劑常常是異質(zhì)的和不穩(wěn)定的。
未活化的FⅨ酶原可以用純化的FⅨa活化/轉(zhuǎn)化[Van Dam-Mieras,M.C.E.；Muller,A.D.；van Dieijen,G.；Hemker,H.C.血凝結(jié)因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ用合成底物測(cè)定。于Bergmeyer,H.U.(編輯)酶分析方法，第5卷，酶3多肽酶、蛋白酶和它們的抑制劑，365-394頁(yè)，第三版，Academic Press,NewYork(1983)]。
血漿蛋白酶是復(fù)雜的糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族。它們?cè)诟沃凶鳛槲椿罨冈铣?，分泌到血液中，?dāng)需要時(shí)通過(guò)特異的蛋白水解即一個(gè)或兩個(gè)多肽鍵的切割來(lái)活化。它們?cè)诘鞍捉Y(jié)構(gòu)域的排列和組成方面結(jié)構(gòu)上十分相似[Furie,B.和Furie,B.C.，細(xì)胞，53(1988)505-518]。
根據(jù)Furie B.和Furie,B.C.，因子Ⅸ家族(因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和蛋白C)的蛋白酶包括--前肽，--GLA結(jié)構(gòu)域，--芳香氨基酸聚集結(jié)構(gòu)域，--兩個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域(EGF1和EGF2)--酶原活化結(jié)構(gòu)域(活化肽，AP)和--蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域(CD)。
而且血漿蛋白酶在分泌期間經(jīng)過(guò)翻譯后修飾--11-12二硫鍵--N-和/或O-糖基化作用(GLA結(jié)構(gòu)域和活化肽)-Bharadwaj,D等，生物化學(xué)雜志，270(1995)6537-6542,-Medved,L.V.等，生物化學(xué)雜志，270(1995)13652-13659，--前肽的切割--Glu殘基的γ-羧基化(GLA結(jié)構(gòu)域)--Asp殘基的β-羥基化(EGF結(jié)構(gòu)域)--酶原區(qū)域的切割(部分)通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)多肽鍵的特異切割(活化多肽的切割)活化(蛋白的酶原形式)之后，具有酶活性的蛋白酶包括兩條鏈，根據(jù)它們的分子量稱為重鏈和輕鏈。在因子Ⅸ蛋白酶家族中兩條鏈通過(guò)EGF2結(jié)構(gòu)域和蛋白酶結(jié)構(gòu)域之間的分子間二硫鍵連在一起。酶原-酶轉(zhuǎn)化(活化)引起蛋白酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的構(gòu)象改變。這使得在蛋白酶結(jié)構(gòu)域的N-端氨基酸和蛋白酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Asp殘基之間形成蛋白酶活性所需的必要鹽橋。N-端區(qū)域?qū)Υ私z氨酸蛋白酶亞類十分關(guān)鍵，不能被修飾。然后才有可能形成具有包括Ser、Asp和His催化三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶典型活性位點(diǎn)[Blow,D.M.:Acc.Chem.Res.,9(1976)145-152；Polgar,L.于蛋白酶作用機(jī)制，Boca Raton,Florida,CRC Press,第3章(1989)]。
血漿蛋白酶可以用傳統(tǒng)方法通過(guò)從血液中分離未活化的酶原并隨后活化它們得到，或者通過(guò)在合適的哺乳細(xì)胞系或酵母中表達(dá)相應(yīng)的cDNA來(lái)重組合成。
利用真核宿主/載體系統(tǒng)通過(guò)酶原或活性蛋白酶的表達(dá)/分泌來(lái)合成凝結(jié)因子在FⅦ:Hagen,F.S.等，EP0200421；Pedersen,A.H.等，生物化學(xué)28(1989)9391-9336；FⅨ:Lin,S.-W.等，生物化學(xué)雜志，265(1 990)144-150；FⅩ:Wolf,D.L.等，生物化學(xué)雜志，266(1991)13726-13730；蛋白C:Bang,N.U.等，EP0191606中得到描述。
按常規(guī)，使用在分泌過(guò)程中能象天然酶一樣翻譯后修飾凝結(jié)因子的宿主細(xì)胞。然后例如以凝血酶原或因子Ⅹ為例，通過(guò)使用來(lái)自蛇毒液的活化物在隨后的下游加工過(guò)程中進(jìn)行酶原-酶轉(zhuǎn)化(Sheehan，J.P.等，生物化學(xué)雜志，268(1993)3639-3645；Fujikawa,K.等，生物化學(xué)，11(1972)4892-4898)。
為了體內(nèi)酶原-酶活化(已在分泌過(guò)程中)的目的，可以用能被天然存在于宿主細(xì)胞如Kex2(酵母)或PACE(哺乳細(xì)胞系)的分泌途徑中的特異切割蛋白酶切割的蛋白酶切割位點(diǎn)(幾個(gè)相鄰堿性氨基酸)替換天然酶原切割位點(diǎn)或整個(gè)活化肽。(FⅩ:Wolf,D.L.等，生物化學(xué)雜志，266(1991)13726-13730；凝血酶原Holly,R.D.和Foster,D.C.,WO93/13208).
已知用真核宿主/載體系統(tǒng)合成凝結(jié)因子的變異體(variant)(FⅩ:Rezaie,A.R等，生物化學(xué)雜志，268(1993)8176-8180；FⅨ:zhang,D.G.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9111994)3574-3578)、突變體(mutant)(FⅩ:Rezaie,A.R.等，生物化學(xué)雜志269(1994)21495-21499；凝血酶Yee,J.等，生物化學(xué)雜志，269(1994)17965-17970)；FⅦ:Nicolaisen,E.M.等，WO88/10295)和包括FⅨ和FⅩ的嵌合體(Lin,S.-W.等，生物化學(xué)雜志，265(1990)144-150；Hertzberg,M.S.等，生物化學(xué)雜志，267(1992)14759-14766)。
然而，真核哺乳細(xì)胞系中的表達(dá)是費(fèi)時(shí)、昂貴的并且表達(dá)產(chǎn)量有限。此外會(huì)發(fā)生不需要的翻譯后修飾。
Thogersen,H.C.等(WO94/18227)描述了通過(guò)原核細(xì)胞中表達(dá)和隨后表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性來(lái)合成血漿蛋白酶。根據(jù)這些，F(xiàn)Ⅹ變異體用循環(huán)復(fù)性方法復(fù)性，其中未活化的FⅩ蛋白用金屬螯合復(fù)合物(多聚組氨酸-親和柄)固定在層析柱上。在此使用的融合蛋白包括截短的FⅩ變異體(EGFl、EGF2和蛋白酶結(jié)構(gòu)域)、其它FⅩa蛋白酶識(shí)別序列和位于催化結(jié)構(gòu)域C端包含6個(gè)組氨酸殘基的助結(jié)合劑。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)醇類能促進(jìn)因子Ⅸa對(duì)底物的催化活性，因此能以簡(jiǎn)單的方式建立十分敏感的因子Ⅸa測(cè)試。
因此本發(fā)明涉及在樣品溶液中測(cè)定因子Ⅸa的方法，其特征在于將可測(cè)定的因子Ⅸa的底物和可與水均勻混溶并形成一相的醇類加到樣品溶液中，測(cè)定因子Ⅸa的底物的切割作為對(duì)因子Ⅸa活性的測(cè)量。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)醇類可以將催化因子Ⅸa的活性提高超過(guò)20倍。因而有可能直接測(cè)定樣品溶液中因子Ⅸa的活性。在用Russels蝰蛇毒或從蛇毒液分離的蛋白酶(RVV-X蛋白酶)將因子Ⅸ活化為因子Ⅸa之后，樣品溶液優(yōu)選地體液如血漿中的因子Ⅸ可以得到測(cè)定。
本發(fā)明的另一主題是使用根據(jù)本發(fā)明所述的測(cè)定因子Ⅸa的方法篩選調(diào)節(jié)(抑制或活化)因子Ⅸa活性的物質(zhì)。因此本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)因子Ⅸa活性的物質(zhì)的方法，其特征在于a)在醇類存在時(shí)，用規(guī)定濃度的具有因子Ⅸa活性的多肽切割因子Ⅸa的底物，并且測(cè)定所述底物的切割速率作為因子Ⅸa活性的量度標(biāo)準(zhǔn)，b)在待測(cè)物質(zhì)存在時(shí)測(cè)定所述活性，
c)比較存在和不存在待測(cè)物質(zhì)時(shí)的活性，d)活性的差異用作待測(cè)物質(zhì)調(diào)節(jié)活性的量度標(biāo)準(zhǔn)。
優(yōu)選地檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)對(duì)因子Ⅸa的抑制。
EP-B0034122中所述的因子Ⅸa底物是合適的因子Ⅸa底物。R-Xxx-Gly-Arg-pNA型底物是尤其適合的，其中Xxx代表疏水D-氨基酸，pNA代表可確定的離去基團(tuán)。R限定為與EP-B0034122相似。優(yōu)選來(lái)自EP-B0034122的具基本分子結(jié)構(gòu)式Ⅰ的底物，其中R3=R4=H。
優(yōu)選的底物是N-末端含有疏水D-氨基酸的三肽，并優(yōu)選使用環(huán)已基取代的疏水D-氨基酸。尤其優(yōu)選環(huán)已基甘氨酸和環(huán)已基丙氨酸。
進(jìn)一步優(yōu)選的底物是也可以被因子Ⅹa如Chromozym X(Boehringer Mannheim GmbH,Moc-D-Nle-Gly-Arg-pNA)或Pefachrom tPA(Pentapharm Ltd.,Basel,MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA)切割的底物。優(yōu)選使用能光學(xué)測(cè)定的商業(yè)(優(yōu)選生色的或發(fā)熒光的)底物。后者是具有很容易通過(guò)光學(xué)方法測(cè)定的可切割殘基(優(yōu)選對(duì)硝基苯胺殘基)的生色肽/底物，根據(jù)本發(fā)明所述的方法優(yōu)選在緩沖溶液中進(jìn)行。所有在pH范圍7-10(優(yōu)選在pH7.5-9.0之間)有效的緩沖液都可以作為緩沖物質(zhì)。優(yōu)選Tris緩沖液、三乙醇胺和Tris-咪唑緩沖液。
FⅨa活性的測(cè)定和篩選實(shí)驗(yàn)優(yōu)選在20～40℃，特別優(yōu)選在室溫下進(jìn)行，并對(duì)切割的可光學(xué)測(cè)定的基團(tuán)的量進(jìn)行光度或熒光測(cè)定。優(yōu)選地測(cè)定405nm的吸光度。根據(jù)Michaelis-Menten方程式從線性初始斜率確定酶活性和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
在因子Ⅸ活化為因子Ⅸa之后，也可以類似地測(cè)定因子Ⅸ或因子Ⅸ與因子Ⅸa的比率。為了測(cè)定血漿中因子Ⅸ，首先用Russels蝰蛇毒(優(yōu)選0.2mg/ml)或RVV-X蛋白酶(優(yōu)選0.1mg/ml)在CaCl2(10mmol/l)的存在下于20-40℃(優(yōu)選37℃)將因子Ⅸ活化為因子Ⅸa?；罨瓿珊?優(yōu)選15分鐘)，分別加入20-40％和0.2-1mmol/l濃度的1,2-乙二醇和可切割的底物。
已證明對(duì)于具有umol/l范圍待測(cè)物質(zhì)濃度的篩選實(shí)驗(yàn)，加入0.02-0.5umol/l，優(yōu)選0.05umol/l濃度的因子Ⅸa和0.2-1mmol/l濃度的可切割的底物是有利的。醇類優(yōu)選使用1,2-乙二醇、乙醇和甲醇。醇類的濃度優(yōu)選在20-40％的范圍內(nèi)。天然人因子Ⅸa或豬或牛因子Ⅸa或重組合成的人因子Ⅸa可以用作因子Ⅸa。尤其優(yōu)選使用EP96109288.9中所述的截短的人重組因子Ⅸa。
如果包含N-末端與EGF結(jié)構(gòu)域(EGF1和/或EGF2)連接的FⅨa絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(催化區(qū)域)和酶原活化結(jié)構(gòu)域，那么具有酶活性的重組因子Ⅸa可以通過(guò)原核生物中相應(yīng)cDNA的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性和酶切割合成。
優(yōu)選使用包含下列結(jié)構(gòu)域的非糖基化、具酶活性的因子Ⅸaa)FⅨa蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，其N-末端連接b)酶原活化結(jié)構(gòu)域，其N-末端連接c)EGF1和/或EGF2結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選EGF2或EGF1和EGF2)。
優(yōu)選地將長(zhǎng)達(dá)50個(gè)氨基酸的間隔區(qū)插在酶原活化結(jié)構(gòu)域和EGF結(jié)構(gòu)域之間。當(dāng)在酶原活化結(jié)構(gòu)域切割根據(jù)本發(fā)明所述的單一鏈形式的酶原時(shí)，得到兩條鏈形式的活性蛋白。兩條鏈都由兩鏈形式中的分子內(nèi)二硫鍵連接。根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白優(yōu)選包含EGF2結(jié)構(gòu)域、因子Ⅸ的活化肽和催化結(jié)構(gòu)域。在歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?6110959.2中描述了這樣的因子Ⅸ突變蛋白。
在根據(jù)本發(fā)明所述的測(cè)定方法中可以使用任何血漿，優(yōu)選檸檬酸鹽血漿。
此方法在中性或微堿性pH值，優(yōu)選在7.5和9.0之間的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在此范圍有效的生理學(xué)上可接受緩沖液都可以用作緩沖液。另外也可以加入凝結(jié)測(cè)試常用的穩(wěn)定劑和防腐劑如牛血清白蛋白、乙汞硫代水楊酸鈉等。
另外，根據(jù)本發(fā)明所述的方法和根據(jù)本發(fā)明所述的試劑也可以包含表面活性劑，優(yōu)選非離子表面活性劑如Tween80＠。在此情況下濃度優(yōu)選0.01-1％的量。
本發(fā)明另一主題是測(cè)定因子Ⅸa的試劑，它含有能被因子Ⅸa切割的、可光學(xué)測(cè)定的底物、醇類和pH7至10范圍之間的緩沖液。
下列實(shí)施例、公開(kāi)文獻(xiàn)、序列表和附圖進(jìn)一步闡明了本發(fā)明和在專利權(quán)利要求書(shū)中的保護(hù)范圍。所述方法應(yīng)理解為實(shí)施例，它們即使在修改后也仍描述本發(fā)明的主題。圖.1表示乙醇和1,2-乙二醇對(duì)重組γFⅨa(0.48umol/l)和天然FⅨa(0.14umol/l)活性的影響。pH7.4；底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(1.02mmol/l)-對(duì)應(yīng)于表2的圖。圖.2a表示1,2-乙二醇對(duì)rFⅨa活性的影響。
S1=MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA；S2=MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA；S3=MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA；S4=MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA；S5=MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC；rFⅨa=0.48umol/l；pH=7.4-對(duì)應(yīng)于表3的圖。圖.2b表示乙醇對(duì)γFⅨa活性的影響。
S1=MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA；S2=MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA；S3=MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA；S4=MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA；S5=MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC；rFⅨa=0.48umol/l；pH=7.4-對(duì)應(yīng)于表3的圖。圖.3a表示乙醇對(duì)P(血漿)-激肽釋放酶、FⅫa、FⅪa、FⅨa、FⅩa和凝血酶活性的影響(pH7.4；1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA)-對(duì)應(yīng)于表5的圖。圖.3b表示1,2-乙二醇對(duì)P-激肽釋放酶、FⅫa、FⅪa、FⅨa、FⅩa
和凝血酶活性的影響(pH7.4；1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA)-對(duì)應(yīng)于表6的圖。方法重組DNA技術(shù)如Sambrook,J.等(1989)于分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約中所述的使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用分子生物學(xué)試劑。蛋白測(cè)定使用根據(jù)氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，通過(guò)測(cè)定280nm處的光密度(OD)來(lái)測(cè)定FⅨ變異體的蛋白濃度。表達(dá)載體用于FⅨ變異體表達(dá)的載體是基于用于核心-抗生素蛋白鏈霉素的表達(dá)載體pSAM-CORE。在WO93/09144中描述了質(zhì)粒pSAM-CORE的制備。
用目的變異體的基因替換pSAM-CORE載體中的核心-抗生素蛋白鏈霉素基因。實(shí)施例1克隆FⅨ基因的催化結(jié)構(gòu)域(質(zhì)粒pFⅨ-CD)用PCR引物N1(SEQ ID NO:1)和N2(SEQ ID NO:2)和來(lái)自Stratagene公司(La Jolla,CA,U.S.A)的市售人肝cDNA基因庫(kù)(載體λZAP_Ⅱ)作為模板DNA擴(kuò)增編碼FⅨ蛋白酶結(jié)構(gòu)域181至415位氨基酸的FⅨ cDNA的690至1403位堿基對(duì)[cDNA的序列和氨基酸序列數(shù)按照McGraw,R.A.等的公開(kāi)文獻(xiàn)(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82,1985,2847-2851)]。PCR引物在編碼區(qū)5′末端引入單一NcoⅠ切點(diǎn)和ATG起始密碼子并在編碼區(qū)3′末端引入單一HindⅢ切點(diǎn)。
NcoⅠN1:5′-AAAAAACCATGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACC-3′MetValValGlyGlyGluAspAlaLysHindⅢN2:5′-AAAAAAAAGCTTCATTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATC-3′約730bp長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化后將約720bp長(zhǎng)的NcoⅠ/HindⅢ-FⅨ片段連入約2.55kbp長(zhǎng)的NcoⅠ/HindⅢ-pSAM-CORE載體片段中(見(jiàn)WO93/09144)。用限制性圖譜鑒定目的質(zhì)粒pFⅨ-CD，并用DNA測(cè)序檢測(cè)通過(guò)PCR分離的FⅨcDNA序列。實(shí)施例2含有EGF2結(jié)構(gòu)域、活化肽和催化結(jié)構(gòu)域的FⅨ蛋白酶基因(質(zhì)粒pFⅨ-EGF2-AP-CD)的構(gòu)建用PCR引物N3(SEQ ID NO:3)和N4(SEQ ID NO:4)和來(lái)自Strataqene公司(La Jolla,CA,U.S.A.)的市售人肝cDNA基因庫(kù)(載體λZAp_Ⅱ)作為模板DNA擴(kuò)增編碼EGF2結(jié)構(gòu)域、FⅨa蛋白酶結(jié)構(gòu)域的N-末端區(qū)域和活化肽的85-278位氨基酸的FⅨ cDNA的402至986位堿基對(duì)(McGraw等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82,1985,2847-2851)。PCR引物N3在編碼區(qū)5′末端引入ATG起始密碼子和單一NcoⅠ切點(diǎn)。
NcoⅠN3:5′-AAAAAACCATGGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCA-3′MetAspValThrCysAsnIleLysAsnGlyN4:5′-GGGTTCGTCCAGTTCCAGAAGGGC-3′約590bp長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BsmⅠ消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化后將約360bp長(zhǎng)的NcoⅠ/BsmⅠ-FⅨ-EGF2-AP片段連入的3.2kbp長(zhǎng)的NcoⅠ/BsmⅠ-pFⅨ-CD載體片段(實(shí)施例1)。用限制性圖譜鑒定目的質(zhì)粒pFⅨ-EGF2-AP-CD，并通過(guò)DNA測(cè)序檢測(cè)通過(guò)PCR分離的FⅨ cDNA序列。實(shí)施例3a)FⅨa蛋白酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了表達(dá)包含活化肽的FⅨ基因，用實(shí)施例2中所述的表達(dá)質(zhì)粒pFⅨ-EGF2-AP-CD(氨芐青霉素抗性)和lacIq阻遏質(zhì)粒pUBS520(卡那霉素抗性，制備和描述見(jiàn)Brinkmann,U.等，基因，85,1989,109-114)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株UT5600(Grodberg,J.和Dunn,J.J.，細(xì)菌學(xué)雜志，170,1988,1245-1253)。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和可得到的其它大腸桿菌菌株如HB101和大腸桿菌B來(lái)代替UT5600菌株。
用表達(dá)質(zhì)粒pFⅨ-EGF2-AP-CD轉(zhuǎn)化的UT5600/pUBS520細(xì)胞于37℃在含有50-100mg/l氨芐青霉素和50mg/l卡那霉素的DYT培養(yǎng)基[1％(重量/體積)酵母抽提液、1％(重量/體積)Bacto胰蛋白胨、Difco和0.5％氯化鈉)中振蕩培養(yǎng)至550nm光密度(OD550)0.6-0.9，隨后用IPTG(終濃度1-5mmol/l)誘導(dǎo)。經(jīng)37℃4-8小時(shí)(h)誘導(dǎo)期后，通過(guò)離心(Sorvall RC-5B離心機(jī)，GS3轉(zhuǎn)頭，6000rpm,15分鐘)收獲細(xì)胞，用50mmol/l Tris-HCl緩沖液(pH7.2)洗滌，并保存于-20℃直至進(jìn)一步操作。來(lái)自1升振蕩培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量是4-5g(溫重)。
b)表達(dá)分析對(duì)用質(zhì)粒pFⅨ-EGF2-AP-CD轉(zhuǎn)化的UT5600/pUBS520細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行分析。為此目的，將各來(lái)自1ml離心培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重新懸浮于0.25ml 10mmol/l Tris-HCl(ph7.2)中，并用來(lái)自Branson公司(Heusenstamm，德國(guó))的Sonifier_細(xì)胞破裂儀B15通過(guò)超聲處理(在50％強(qiáng)度下30秒，2個(gè)脈沖)裂解細(xì)胞。沉淀(Eppendorf5415離心機(jī)，14000rpm,5分鐘)不溶的細(xì)胞成分，向上清液加入1/5體積(Vol)5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl(pH6.8)、1％SDS、1％巰基乙醇、10％甘油、0.001％溴酚蘭)。將不溶的細(xì)胞碎片組分(沉淀)重新懸浮于含6-8M尿素的0.3ml 1×SDS樣品緩沖液中，將樣品在95℃溫育5分鐘并再次離心。之后通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝胺電泳(PAGE)[Laemmli,U.K.，自然，227(1970)680-685]和用考馬斯亮藍(lán)R染色染色分離蛋白。
大腸桿菌中合成的FⅨ變異體是均一的并專一存在于不溶細(xì)胞碎片組分(內(nèi)含體，IBs)中。相對(duì)于大腸桿菌總蛋白的表達(dá)產(chǎn)量是10-50％。實(shí)施例4細(xì)胞裂解、溶解和復(fù)性a)細(xì)胞裂解和內(nèi)含體(IBs)的制備將來(lái)自3升振蕩培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀(約15g濕重)重新懸浮于75ml50mmol/l Tris-HCl(pH7.2)中。使懸浮液與0.25mg/ml溶菌酶混合并在0℃溫育30分鐘。加入2mmol/l MgCl2和10μg/ml DNaseⅠ(Boehringer Mannhein GmbH，目錄號(hào)104159)后，在來(lái)自SLM Amico公司(Urbana,IL,USA)的弗氏壓榨器(French_Press)中利用高壓分散機(jī)械破碎細(xì)胞。隨后DNA室溫(RT)下消化30分鐘。向制劑中加入37.5ml 50mmol/l Tris-HCl(pH7.2)、60mmol/l EDTA、1.5mol/lNaCl、6％Triton X-100，室溫進(jìn)一步溫育30分鐘并在Sorvall RC-5B離心機(jī)中離心(GSA轉(zhuǎn)頭，12000rpm,15分鐘)。除去上清，將100ml50mmol/l Tris-HCl(pH7.2)、20mmol/l EDTA加到沉淀中，在4℃邊攪拌邊溫育30分鐘，并再次沉淀。重復(fù)上次洗滌步驟。純化的ⅨB(1.5-2.0g濕重，25-30％干物質(zhì)，100-150mg蛋白酶)保存在-20℃直至進(jìn)一步處理。
b)IB的溶解和衍生化作用純化的IB于室溫在6mol/l鹽酸胍、100mmol/l Tris-HCl、20mmol/lEDTA、150mmol/l GSSG和15mmol/l GSH,pH8.0中以相當(dāng)于5-10mg/ml蛋白的100mg IB沉淀(濕重)/ml的濃度邊攪拌邊懸浮1至3小時(shí)。之后，將pH調(diào)至pH5.0并通過(guò)離心(Sorvall RC-5B離心機(jī)，SS34轉(zhuǎn)頭，16000rpm,10分鐘)分離不溶組分。上清逆著100體積的4-6mol/l鹽酸胍(pH5.0)于4℃透析24小時(shí)。
c)復(fù)性在每一種情形下通過(guò)將0.5ml IB溶解物/衍生物以24小時(shí)的間隔重復(fù)(如3次)加到50ml 50mmol/l Tris-HCl、0.5mol/l精氨酸、20mmol/l CaCl2、1mmol/l EDTA和0.5mmol/l半胱氨酸(pH8.5)中并接下來(lái)在4℃溫育48小時(shí)，在4℃進(jìn)行溶于6mol/l鹽酸胍并用GSSG/GSH衍生化的蛋白的復(fù)性。復(fù)性反應(yīng)完成后，用配有深床濾器K250的過(guò)濾設(shè)備通過(guò)過(guò)濾分離不溶組分，其中深床濾器K250來(lái)自Seitz公司(Bad Kreuznach，德國(guó))，過(guò)濾設(shè)備來(lái)自Satorius公司(G_ttingen，德國(guó))。
d)復(fù)性制劑的濃縮和透析含有蛋白酶的澄清上清在來(lái)自Filtron公司(Karlstein，德國(guó))的Minisette(膜型Omega 10K)中通過(guò)交叉過(guò)濾濃縮10-15倍，并于4℃逆著100體積20mmol/l Tris-HCl和50mmol/l NaCl、pH7.2透析24小時(shí)以去除鹽酸胍和精氨酸。離心(Sorvall RC-5B離心機(jī)，SS34轉(zhuǎn)頭，16000rpm,20分鐘)去除沉淀的蛋白，澄清上清用來(lái)自Nalge公司(Rochester,NY,USA)的Nalgene_一次性濾器(孔徑0.2um)過(guò)濾。實(shí)施例5復(fù)性FⅨ變異體的純化來(lái)自復(fù)性制劑的FⅨ變異體如果需要可以用層析方法進(jìn)一步純化，層析方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。
a)在Q-Sepharose ff上通過(guò)離子交換層析純化FⅨ變異體將逆著20mmol/l Tris-HCl和50mmol/l NaCl、pH8.0透析的濃縮的復(fù)性制劑加到用相同緩沖液平衡的Q-Sepharose ff柱(1.5×11cm,V=20ml；負(fù)載容量10mg蛋白/ml膠)上，此柱來(lái)自PharmaciaBiotech公司(Freiburg，德國(guó))(2柱體積/小時(shí)，2CV/h)，并用平衡液洗滌直至洗脫液在280nm的吸收值達(dá)到緩沖液的空白值。結(jié)合的物質(zhì)用在20mmol/l Tris-HCl pH8.0中的50-500mmol/l NaCl梯度洗脫(2CV/h)。含有FⅨ的組分通過(guò)非還原和還原的SDS PAGE測(cè)定，并收集洗脫峰。
b)在肝素-Sepharose CL-6B上通過(guò)離子交換層析最終純化FⅨ變異體在Q-Sepharose ff上層析后，將含有FⅨ的合并組分直接加到(2CV/h)已用20mmol/l Tris-HCl和200mmol/l NaCl pH8.0平衡過(guò)的肝素-Sepharose CL-6B柱(1.5×11cm,V=20ml，負(fù)載容量1mg蛋白/ml膠)上，此柱來(lái)自Pharmacia Biotech公司(Freiburg，德國(guó))。之后用平衡緩沖液洗滌直至洗脫液280nm吸收值達(dá)到緩沖液的空白值。連接的物質(zhì)用在20mmol/l Tris-HCl pH8.0中的0.2-1.0mol/lNaCl梯度洗脫(2CV/h)。FⅨ變異體在500-600mmol/l的NaCl濃度下洗脫。含有FⅨ的組分通過(guò)非還原和還原的SDS PAGE測(cè)定，合并洗脫峰，并逆著20mmol/l Tris-HCl、50-200mmol/l NaCl、5mmol/lCaCl2、pH7.8中透析。實(shí)施例6FⅨ變異體的活化和純化復(fù)性的純化的FⅨ變異體用純化的Russel蝰蛇毒(RVV-X)蛋白酶活化。如Esmon,C.T.的文章中所述的(凝血酶原的活化，博士論文，華盛頓大學(xué)，st.Louis,MO(1973)),RVV-X蛋白酶通過(guò)凝膠過(guò)濾，接著通過(guò)在Q-Sepharose ff上的離子交換層析從商業(yè)可獲得的蛇毒凍干制劑中純化得到，蛇毒凍干制劑來(lái)自Sigma Aldrich Chemie GmbHCo.(Deisenhofen，德國(guó))。
a)復(fù)性FⅨ變異體的活化和純化于25℃在20mmol/l Tris-HCl、50mmol/l NaCl、10mmol/lCaCl2、pH7.8中以0.5至2.0mg/ml的濃度和1∶10至1∶20的蛋白酶/底物比率消化FⅨ變異體。用生色底物(見(jiàn)實(shí)施例13a)通過(guò)測(cè)定活性來(lái)監(jiān)控酶促FⅨ活化的時(shí)間過(guò)程直至消化完成(曲線平穩(wěn)期，最大活化)。為此目的以3-4h的間隔在24小時(shí)的時(shí)段內(nèi)從反應(yīng)混合物中取出樣品(10至100ul)并測(cè)定產(chǎn)生的FⅨa活性。達(dá)到活化平穩(wěn)期后，在Q-Sepharose ff上通過(guò)負(fù)層析純化活化的制品。
在給定的條件下RVV-X和未活化的FⅨ變異體結(jié)合到Q-Sepharose ff，但活化的FⅨa變異體不結(jié)合。
將活化制品加到(2CV/h)已用20mmol/l Tris-HCl、50mmol/lNaCl、pH7.8平衡的Q-Sepharose ff柱(1.0×10cm,V=8ml)上，此柱來(lái)自Pharmacia Biotech公司(Freiburg，德國(guó))，分級(jí)分離時(shí)繼續(xù)加入平衡緩沖液至柱中。含有蛋白酶的組分通過(guò)非還原和還原SDSPAGE和活性測(cè)定來(lái)鑒定。實(shí)施例7純化的蛋白酶變異體的鑒定a)活性檢測(cè)使用生色底物ChromozymX(Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim，德國(guó)，目錄號(hào)789763)測(cè)定FⅨa變異體的活性。10-100ul樣品與190-100μl 50mmol/l Tris-HCl、150mmol/l NaCl、5mmol/lCaCl2、1％PEG8000、pH8.0混合成200ul，與20ul Chromozym×(0.5-40mmol)混和并在ELISA閱讀儀上于405nm波長(zhǎng)和室溫下對(duì)照試劑空白值來(lái)測(cè)量。根據(jù)Michaelis Menten方程從線性初始斜率確定活性和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
b)SDS PAGE通過(guò)非還原(無(wú)巰基乙醇)和還原(加巰基乙醇)SDS PAGE(Laemmli,UK，自然227(1970)680-685)檢測(cè)復(fù)性活化和純化的FⅨa蛋白酶變異體通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵形成寡聚體和聚合體以及均一性和純度。實(shí)施例8因子Ⅸa檢測(cè)用重組合成的天然人FⅨa作為樣品和在Tris-HCl緩沖液中的肽底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tpA,Pentapharm Ltd.，Basel,Switzerland)或R-D-Xxx-Gly-Arg-pNA型其它生色/發(fā)熒光底物(EP-B-0034122)及要檢測(cè)的物質(zhì)(醇、溶劑和抑制劑)進(jìn)行FⅨa檢測(cè)。加入FⅨa起始反應(yīng)。檢測(cè)原理檢測(cè)信號(hào)pNAFⅨa的底物 MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(Chromozym X)MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tPA)MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNAMeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNAMeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC縮寫(xiě)pNA，對(duì)硝基苯胺AMC,7-氨基-4-甲基-香豆酰MOC，甲氧羰基HHT，六氫酪氨酸CHG，環(huán)己基甘氨酸CHA，環(huán)己基丙氨酸基本檢測(cè)混合物200ul緩沖液-50-100mmol/l Tris-HCl,pH7-9.5-100-200mmol/l NaCl-5mmol/l CaCl2-有添加劑(醇類、溶劑和抑制劑)+25μl多肽底物(1-20mmol/l)+20μl FⅨa(0.02-0.5μmol/l)室溫(25℃)下在微量滴定板上溫育反應(yīng)混合物，并用ELISA閱讀儀測(cè)量405nm吸收值的改變(ΔA/min)。根據(jù)Michaelis-Menten方程從線性初始斜率確定活性和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。實(shí)施例9醇類和有機(jī)溶劑對(duì)rFⅨa活性的影響測(cè)試能與水完全混合形成單一相的各種醇類(甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、叔丁醇、乙二醇和甘油)和有機(jī)溶劑[乙腈、DMSO(二甲基亞砜)及DMF(二甲基甲酰胺)及易溶多價(jià)醇[m-赤蘚糖醇、PEG(聚乙二醇)]對(duì)rFⅨa活性的影響以及醇或無(wú)機(jī)溶劑濃度(0-50％)之間關(guān)系。測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-41mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/CaCl2-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.48μmol/l rFⅨa(人)-0-50％(醇類或有機(jī)溶劑)結(jié)果顯示于表1中。計(jì)算比率V/V0以說(shuō)明對(duì)rFⅨa催化活性的促進(jìn)。
V0，無(wú)添加劑時(shí)的反應(yīng)速率V，有添加劑時(shí)的反應(yīng)速率表1
>*)g/100ml結(jié)果某些醇類(乙二醇＞乙醇＞甲醇)在15-40％的濃度范圍內(nèi)將rFⅨa的活性提高約5-15倍。甘油直至要更高濃度(25-50％)才有促進(jìn)作用而m-赤蘚糖醇只有輕微的效果。相反聚乙二醇(PEG)抑制rFⅨa的活性。在不含羥基的溶劑中只有二甲基亞砜直至30％也不抑制rFⅨa，而二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈則使酶失活。實(shí)施例10乙醇和乙二醇對(duì)重組人FⅨa和天然FⅨa活性的影響測(cè)試是否用天然FⅨa(人)通過(guò)乙醇和乙二醇也發(fā)生所觀察到的rFⅨa的提高(活化rFⅨa變異體包括EGFⅡ結(jié)構(gòu)域、已加工的活化多肽和催化結(jié)構(gòu)域)。測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-41mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
-0.48μmol/l人rFⅨa或-0.14μmol/l天然的FⅨa(人)-0-50％乙醇或1,2.乙二醇結(jié)果總結(jié)在表2中并在

圖1中表示。
表2
關(guān)于由乙醇和乙二醇所產(chǎn)生的活化，對(duì)于重組人rFⅨa和天然人FⅨa未發(fā)現(xiàn)差異。實(shí)施例11乙醇和乙二醇對(duì)rFⅨa對(duì)生色和發(fā)熒光肽的活性的影響使用多肽底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tPA,Pentapharm Ltd.,Basel,Switzerland),MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(Chromozym X,Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany,目錄號(hào)789763),MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(Pentapharm Ltd.,Basel,Switzerland),MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-pNA(PentapharmLtd.,Basel,Switzerland)和MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC(Pentapharm Ltd.,Basel,Switzerland)測(cè)試由乙醇和乙二醇對(duì)人rFⅨa的促進(jìn)。生色的測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-0-50％1,2-乙二醇-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA,-0.48μmol/l rFⅨa(人)或
-0.82mmol/l MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA-0.48μmol/l rFⅨa(人)或-1.02mmol/l MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA-0.28μmol/l rFⅨa(人)或-1.02mmol/l MeSO2-D-CFA-Gly-Arg-pNA-0.48μmol/l rFⅨa(人)發(fā)熒光的測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-0-50％1,2-乙二醇-0.51mmol/l MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC-0.08μmol/l rFⅨa(人)結(jié)果總結(jié)在表3中，加有乙二醇的結(jié)果顯示在圖2a，加有乙醇的結(jié)果顯示在圖2b中。
表3
結(jié)果當(dāng)使用肽底物MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA而不是MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA時(shí)可以進(jìn)一步促進(jìn)由乙醇和乙二醇對(duì)γFⅨa的促進(jìn)，表示為系數(shù)V/V0。在超過(guò)25％的乙二醇濃度下，系數(shù)V/V0比用底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA時(shí)提高1.5-2倍。
醇類以類似的方式提高熒光底物MeSO2-D-CHA-G1y-Arg-AMC的切割。乙二醇(33％)分別將具有序列MeSO2-D-CHA-Gly-Arg和C-末端AMC或pNA的三肽的切割提高9和11倍。由于高的敏感性，必須使用少得多的(1/10)rFⅨa去切割熒光底物MeSO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC。實(shí)施例12乙二醇對(duì)重組人FⅨa和天然FⅨa切割生色肽底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA、MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA的動(dòng)力學(xué)的影響測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-0-50％1,2-乙二醇-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)-0.48μmol/l rFⅨa(人)或-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02 mmol/l)-0.29μmol/l native FⅨa(人)或-MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)-0.48μmol/l rFⅨa(人)或-MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(0.102-1.02mmol/l)-0.28μmol/l rFⅨa(人)根據(jù)Lineweaver Burk圖確定動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Kcat/Km)(因?yàn)橹本€通過(guò)原點(diǎn)不能分別確定Km和Kcat)。
表4a底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA
<p>表4b不同底物， rFⅨa
>n.l.=non-linear結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了重組或天然人FⅨa催化的生色多肽底物切割的促進(jìn)，因?yàn)橹敝?3％的乙二醇濃度動(dòng)力學(xué)常數(shù)Kcat/Km都增加。當(dāng)?shù)孜锸荕eSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA時(shí)在33％乙二醇時(shí)發(fā)現(xiàn)最高催化活性即最高Kcat/Km值。在未受影響的反應(yīng)中，圖不是線性的，沒(méi)有測(cè)定到常數(shù)。實(shí)施例13與血漿激肽釋放酶、FⅫa、FⅪa、FⅩa和凝血酶比較，乙醇和乙二醇對(duì)FⅨa活性的影響FⅨa測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH 7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.14μmol/l天然的FⅨa(人)-0-50％乙醇或1,2-乙二醇血漿激肽釋放酶測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.0176U/ml血漿激肽釋放酶(人)-0-50％乙醇或1,2-乙二醇FⅫa測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl.pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1 mmol/l CaCl2-1.02 mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.0045U/ml FⅫa(人)-0-50％醇或1,2-乙二醇FⅨa測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1 mmol/l CaCl2-1.02 mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.0012μmol/l FⅪa(人)-0-50％醇或1,2-乙二醇FⅩa測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1 mmol/l CaCl2-1.02 mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.088μmol/l FⅩa(牛)-0-50％醇或l,2-乙二醇凝血酶測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH7.4-82mmol/l NaCl-4.1 mmol/l CaCl2-1.02 mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA-0.045μmol/l凝血酶(牛)-0-50％乙醇或1,2-乙二醇結(jié)果總結(jié)在表5和6中，乙醇的效果顯示于圖3a，乙二醇的效果顯示于圖3b。
表5
表6<
結(jié)果在內(nèi)部活化途徑的凝結(jié)因子-血漿激肽釋放酶、FⅫa、FⅪa、FⅨa、FⅩa和凝血酶中，只有FⅨa可以被乙醇和乙二醇活化。在血漿激肽釋放酶中存在10-20％乙醇時(shí)觀察到輕微的活化作用。實(shí)施例14乙二醇存在時(shí)pH對(duì)rFⅨa和天然FⅨa活性的影響檢測(cè)混合物(檢測(cè)中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl、pH7.0-10.0-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-1.02mmol/l MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA、MOC-D-Nle-Gly-Arg-
pNA或MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA-25％1,2-乙二醇-0.28umol/l rFⅨa(人)或-0.14umol/l天然FⅨa(人)結(jié)果顯示于表7a-d中。
表7a底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA,rFⅨa(人)<
表7b底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA,native FⅨa(人
表7c底物MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA,rFⅨa(人)<
<p>表7d底物MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA,rFⅨa(人)
結(jié)果如乙二醇作為例子所表明的醇類并未改變r(jià)FⅨa催化活性的pH依賴性。這樣存在25％乙二醇時(shí)在pH7.0和10.0之間的切割速率以相同比率增加。當(dāng)?shù)孜锸荕eSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA時(shí)切割速率增加10倍，當(dāng)?shù)孜锸荕OC-D-Nle-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA，分別增加14倍和20倍。最適pH范圍是pH8.25和8.75之間。最有效切割的底物是MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA。實(shí)施例15對(duì)FⅨa抑制劑的篩選實(shí)驗(yàn)通過(guò)FⅨa活性抑制可以鑒定特異的FⅨa抑制劑。為這個(gè)目的，在缺少和存在要檢測(cè)的物質(zhì)或物質(zhì)混合物時(shí)用R-D-Xxx-Gly-Arg-pNA型(Xxx=疏水型氨基酸)底物測(cè)定FⅨa的活性，并從系數(shù)計(jì)算抑制百分率。從抑制動(dòng)力學(xué)中確定抑制常數(shù)Ki。通過(guò)高濃度的某一種醇類(優(yōu)選乙二醇)的存在擴(kuò)增測(cè)量信號(hào)。測(cè)試原理測(cè)量信號(hào)pNAFⅨa底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(Pefachrom tPA)MOC-D-Nle-Gly-Arg-pNA(Chromozym X)MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNAFⅨa重組合成的rFⅨa(人)測(cè)試混合物200ul緩沖液(100mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、5mmol/lCaCl2、20-40％醇類、pH7-9)，緩沖液含有各種濃度的抑制劑+25ul肽底物+25ul rFⅨa(人)測(cè)試混合物于室溫在微量滴定板中溫育，用ELISA閱讀儀測(cè)定405nm吸光度的改變(ΔA/min)。也可以5-10分鐘后用乙酸(25ul,50％)終止反應(yīng)，在405nm對(duì)照空白試劑測(cè)定吸光度。實(shí)施例16使用不同的pH、醇類和醇類濃度時(shí)已知蛋白酶抑制劑對(duì)rFⅨa活性的影響測(cè)試混合物(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl、pH7.4或8.5-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-底物MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(1.02mmol/l)-0.028-0.57umol/l rFⅨa(人)-4.1％乙醇或33％1,2-乙二醇-以梯度濃度(4.1-163μmol/l)的抑制劑已知的3-咪基苯丙氨酸型合成抑制劑用作抑制劑(Sturzebecher等1，酶學(xué)雜志，抑制9(1995)87和WO92/08709)(1991))。以低和高的醇濃度作為例子檢測(cè)抑制效果。表8a抑制劑Nα-(2,4,6-三異丙基苯磺?；?-3-脒基-(D,L)-苯基丙氨酸-異哌啶酸[TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH]對(duì)因子Ⅸa活性的抑制(以％表示)
表8b抑制劑Na-(2-萘磺酰基)-3-脒基-(D,L)-苯基丙氨酸-1,2,3,4-四羥異喹啉-3-羧酸[βNAPS-(3-Am)Phe-TIC-OH]對(duì)因子Ⅸa活性的抑制(以％)表示
結(jié)果可以在各種pH值和各種酶含量(優(yōu)選乙醇或1,2-乙二醇)下檢測(cè)合成抑制劑所產(chǎn)生的對(duì)rFⅨa的抑制。已發(fā)現(xiàn)抑制劑TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH對(duì)rFⅨa50％的抑制即IC50值在20和50umol/l，對(duì)于βNAPS-(3-Am)Phe-TIC-OH,IC50值在60和150umol/l之間。在高濃度1,2-乙二醇和pH8.5下可以最敏感檢測(cè)到抑制效應(yīng)。因?yàn)橹恍枰獦O低量的rFⅨa并且高醇濃度有利于要檢測(cè)物質(zhì)的溶解，所以這個(gè)方法適合作為尋找FⅨa抑制劑的篩選方法。實(shí)施例17根據(jù)DIXON的方法測(cè)定解離常數(shù)Ki測(cè)試混合液(測(cè)試中的濃度)-42mmol/l Tris-HCl,pH8.5-82mmol/l NaCl-4.1mmol/l CaCl2-33％1,2-乙二醇-以梯度濃度的抑制劑(0,20.4和40.8μmol/l)-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(1.02,0.51和0.25mmol/l)-0.14μmol/l rFⅨa(人)或-MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA(1.02,0.51和0.25mmol/l)-0.07μmol/l天然的FⅨa(人)
或-MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA(1.02,0.51和0.25mmol/l)-0.14μmol/l rFⅨa(人)TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH作為抑制劑，并且在最適條件(pH8.5、33％1,2-乙二醇下)以兩種底物作為例子測(cè)定抑制效應(yīng)。
表9a底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA,0.14μmol/l rFⅨa
表9b底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA,0.07μmol/l天然的FⅨa
表9c底物MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA,0.057μmol/l rFⅨa
結(jié)果在pH8.5和最適1,2-乙二醇濃度(33％)下，根據(jù)DIXON方法測(cè)定TIPPS-(3-Am)Phe-iNiP-OH對(duì)重組或天然人FⅨa的抑制的解離常數(shù)Ki。使用總結(jié)在表9a和9b中的值繪圖測(cè)定對(duì)重組和天然FⅨa抑制的類似Ki值(分別是12和9μmol/l)。對(duì)rFⅨa的抑制當(dāng)使用底物MeSO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA和MeSO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA時(shí)也得到類似的Ki值(分別是12和16μmol/l)。具有高1,2-乙二醇濃度的篩選混合物尤其適合于測(cè)定抑制常數(shù)，因?yàn)樾枰蛂FⅨa濃度。此外高醇濃度有利于要檢測(cè)物質(zhì)的溶解。參考文獻(xiàn)Bang,N.U.，等，EP0191606Bergmeyer,H.U.(編緝)酶分析方法第5卷，第3章，第三版，Academic Press,New York(1983)Bharadwaj,D.，等，生物化學(xué)雜志270,6537-6542(1995)Blow,D.M.,Acc.Chem.Res.,9,145-152(1976)Brinkmann,U.，等，基因85,109114(1989)Dayie,E.W.，等，生物化學(xué)30,10363-10379(1991)Esmon,C.T.，凝血酶原活化，博士論文，華盛頓大學(xué)，St.Louis,MO(1973)歐洲專利申請(qǐng)96109288.9歐洲專利申請(qǐng)96110959.2歐洲專利EP-B0034122Fujikawa,K.，等，生物化學(xué)，11,4892-4898(1972)Furie,B.；Furie,B.C.，細(xì)胞，53,505-518(1988)Grodberg,J.；Dunn,J.J.，細(xì)菌學(xué)雜志，170,1245-1253(1988)Hagen,F.S.，等，EP0200421Hertzberg,M.S.，等，生物化學(xué)雜志，267,14759-14766(1992)Holly,R.D.；Foster,D.C.,WO93/13208Hopfner,K.-P.；Kopetzki,E.，歐洲專利申請(qǐng)96110959.2Kopetzki,E.，等，WO 93/09144Laemmli,U.K.，自然，227,680-685(1970)Lin,S.W.，等，生物化學(xué)雜志，265,144-150(1990)McGraw,R.A.，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)82,2847-2851(1985)Medved,L.V.，等，生物化學(xué)雜志，270,13652-13659(1995)Nicolaisen,E.M.，等，WO 88/10295Pedersen,A.H.，等，生物化學(xué)，28,9391-9336(1989)Polgar,L.，絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能，于蛋白作用機(jī)制，BocaRaton,Florida,CRC Press，第3章(1989)Rezaie,A.R.，等，生物化學(xué)雜志，268,8176-8180(1993)Rezaie,A.R.；Esmon,C.T.，生物化學(xué)雜志，269；21495-21499(1994)Sambrook,J.；Fritsch,E.F.；Maniatis,T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港出版社，冷泉港，New York,(1989)Sheehan,J.P.，等，生物化學(xué)雜志，268,3639-3645(1993)Svendsen,L.G.，歐洲專利EP-B0034122Thogersen,H.C.，等，WO94/18227Stürzebecher，等，酶學(xué)雜志，抑制，9(1995)87Stüirzebecher，等，WO92/08709,1991Van Dam-Mieras,M.C.E.，等血凝結(jié)因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ用合成底物測(cè)定。于Bergmeyer,H.U.(編輯)酶分析方法，第Ⅴ卷，酶3肽酶、蛋白酶和它們的抑制劑，365-394，第三版，學(xué)術(shù)出版社，New York(1983)Wolf,D.L.，等，生物化學(xué)雜志，266,13726-13730(1991)Yee,J.，等，生物化學(xué)雜志，269,17965-17970(1994)Zhong,D.G.，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，91,3574-3578(1994)
序列表(1)基本信息(ⅰ)申請(qǐng)人BOEHRINGER MANNHEIM(A)街道Sandhoger STR.116(B)城市mannheim(C)國(guó)家德國(guó)(D)郵政編號(hào)D-68305(E)電話08856/60-3446(F)傳真08856/60-3451(ⅱ)發(fā)明名稱測(cè)定因子Ⅸa催化活性的方法(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30B(EPO)(2)關(guān)于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/dese=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AAAAAACCAT GGTTGTTGGT GGAGAAGATG CCAAACC 37(2)關(guān)于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)氨基酸(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:AAAAAAAAGC TTCATTAAGT GAGCTTTGTT TTTTCCTTAA TC 42(2)關(guān)于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)氨基酸(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:AAAAAACCAT GGATGTAACA TGTAACATTA AGAATGGCA 39(2)關(guān)于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GGGTTCGTCC AGTTCCAGAA GGGC 2權(quán)利要求
1．在含有因子Ⅸa或其中形成或消耗因子Ⅸa的樣品溶液中測(cè)定因子Ⅸa的方法，其中向所述樣品溶液中加入可測(cè)定的因子Ⅸa的底物和能與水混溶形成單一相的醇類，利用因子Ⅸa的底物的切割作為因子Ⅸa活性的量度標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定因子Ⅸa對(duì)所述底物的催化效果。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用N末端含有疏水D-氨基酸三肽作為底物。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中使用環(huán)己基取代的疏水D-氨基酸。
4．鑒定調(diào)節(jié)因子Ⅸa活性的物質(zhì)的方法，其特征在于a)在能與水混合形成單一相的醇類的存在時(shí)，用規(guī)定濃度的具有因子Ⅸa活性的多肽切割因子Ⅸa的底物并測(cè)定所述底物的切割速率作為因子Ⅸa活性的量度標(biāo)準(zhǔn)，b)在待測(cè)物質(zhì)存在時(shí)測(cè)定所述活性，c)比較存在和不存在待測(cè)物質(zhì)時(shí)的活性，并且d)活性的差異用作待測(cè)物質(zhì)調(diào)節(jié)活性的量度標(biāo)準(zhǔn)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的方法，其中使用甲醇、乙醇、正或異丙醇、叔丁醇、甘油或特別地1,2-乙二醇作為能與水混合形成單一相的醇類。
6．測(cè)定樣品溶液中因子Ⅸa的試劑，含有可以被因子Ⅸa切割的生色底物、能與水混合形成單一相的醇類和pH7和10之間的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定樣品溶液中因子IXa的方法,該方法使用可測(cè)定的因子IXa的底物和水混溶的乙醇并測(cè)定因子IXa的底物的切割作為因子IXa活性的指示。所述方法對(duì)于直接測(cè)定因子IXa是最適當(dāng)?shù)摹?br> 文檔編號(hào)G01N33/86GK1235643SQ97199323
公開(kāi)日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1997年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月31日
發(fā)明者J·斯圖澤比徹 申請(qǐng)人:羅切診斷學(xué)有限公司