專利名稱：制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的制備方法。
抗癌抗體的識別功能和制備方法對于腫瘤的診斷、治療和預防都有著十分重要的意義，因而受到國內(nèi)外生物醫(yī)學界的廣泛關(guān)注，開展了大量的研究工作并取得了一定的進展。現(xiàn)有技術(shù)中制備單克隆抗癌抗體的方法一般包括獲取癌細胞相關(guān)抗原，免疫小鼠和溶合雜交瘤三個步驟，也即首先利用生化和免疫化學等技術(shù)手段獲取攜有癌細胞信息的癌細胞相關(guān)抗原(包括純化的和未純化的)，然后將癌細胞相關(guān)抗原多次重復導人小鼠體內(nèi)，待小鼠免疫一段時間以后，取出其脾臟并分離出帶有癌細胞相關(guān)抗原信息的致敏淋巴細胞，再將致敏淋巴細胞與骨髓瘤細胞溶合成雜交瘤細胞后進行體外擴增或接種于小鼠腹腔內(nèi)，即可從培養(yǎng)上清液或小鼠腹水中獲得所需的單克隆抗癌抗體。
一般來說，起源于同一組織的癌細胞與正常細胞的差異是很小的，因此在制備篩選用于治療腫瘤的抗癌抗體時，必須反復選出與非腫瘤細胞交叉免疫反應最弱的抗癌抗體，以盡量避免抗癌抗體對正常細胞的損傷。采用現(xiàn)有技術(shù)制備的單克隆抗癌抗體很難做到這一點，究其原因主要在于以下兩個方面。首先，由于分子模擬的緣故，抗癌抗體與正常細胞的交叉免疫反應的強弱，不僅取決于癌細胞相關(guān)抗原是否純化，而且與抗原的表位結(jié)構(gòu)有關(guān)，癌細胞相關(guān)抗原與正常細胞抗原的表位結(jié)構(gòu)越是相似，則所制備的單克隆抗癌抗體與正常細胞之間發(fā)生交叉免疫反應的可能性就越大，在這方面，現(xiàn)有技術(shù)制備單克隆抗癌抗體的方法可謂先天不足。其次，現(xiàn)有技術(shù)制備單克隆抗癌抗體的方法本身也存在嚴重的缺陷。眾所周知，生物體內(nèi)的“天然”免疫耐受機制是形成免疫識別“自身”與“非已”的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的單克隆抗癌抗體由于未經(jīng)過個體早期胸腺和骨髓克隆選擇過程，對受者而言，這樣的外源性單克隆抗癌抗體就不能選擇性識別其癌細胞抗原決定簇中的突變點(例如僅有一個氨基酸的改變或僅空間構(gòu)象的改變)，在分子模擬的情況下尤其如此；也不能經(jīng)宿主至調(diào)節(jié)以此點形成免疫優(yōu)勢位點來區(qū)分“自身”與“非已”。正是由于上述兩方面的原因，在很大程度上制約了各種單克隆抗癌抗體的發(fā)展，采用現(xiàn)有技術(shù)所制備的單克隆抗癌抗體很難完全避免與正常細胞發(fā)生交叉免疫反應。
本發(fā)明的目的即在于獲得一種可制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，以使所制備的多克隆抗瘤抗體能特異性識別癌細胞與正常細胞間的微小差異點，并完全避免與正常細胞發(fā)生交叉免疫反應，從而提高多克隆抗癌抗體對癌細胞的特異性識別并避免對正常細胞的損傷。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先從患有早期癌的同品系小鼠a的組織內(nèi)提取與癌細胞起源于同一組織但遠離癌細胞的正常細胞并制成正常細胞懸液，然后將小鼠a的正常細胞懸液導人已懷孕的異品系或雜種鼠B的胚胎b中，以造成小鼠a的正常細胞在胚胎b中的“天然”免疫耐受，從而被出生后的小鼠b的免疫系統(tǒng)視為“自身”，也即在小鼠b的體內(nèi)建立起既能識別“自身”又能識別小鼠a“自身”的雙“自身”模擬免疫監(jiān)視環(huán)境和相應的免疫監(jiān)視系統(tǒng)，為外源性抗癌抗體對小鼠a或其它受者正常細胞的“自身”識別功能奠定基礎(chǔ)。待小鼠b出生后并進入青春期時(免疫監(jiān)視功能最強時)，再將小鼠a的癌細胞懸液注入小鼠b的體內(nèi)。由于在胚胎期建立的“天然”免疫耐受，小鼠b的免疫系統(tǒng)在識別外源性癌細胞抗原的同時，也必須能識別“自身”，包括識別在胚胎期導入的與癌細胞起源于同一組織的正常細胞。在小鼠b免疫系統(tǒng)選擇性識別“自身”和“非已”的機制下，小鼠b的免疫系統(tǒng)對正常細胞與癌細胞完全相同的抗原將不會產(chǎn)生免疫應答，也即被克隆排除，而對于癌細胞抗原、包括癌細胞抗原決定簇中僅有一個氨基酸改變或者僅有空間構(gòu)象改變的差異點，則會在宿主的調(diào)節(jié)下形成免疫優(yōu)勢位點。由于幾乎所有的自身免疫反應都是Th細胞依賴性的，而能夠與正常細胞和癌細胞之間完全相同的抗原(包括與癌細胞抗原相似的正常細胞抗原)發(fā)生免疫反應的相應淋巴細胞或被克隆排除或被抑制，因此正常情況下不會產(chǎn)生針對小鼠a正常細胞的自身抗體。因此，也不會發(fā)生與小鼠a正常細胞的交叉免疫反應。而那些與正常細胞不同的癌細胞異常抗原實為癌細胞的全部異?？乖?包括癌細胞特異性抗原)，都將在小鼠b體內(nèi)刺激并誘導出與之相應的多克隆抗癌抗體。利用生物技術(shù)，如免疫組化中的免疫熒光法或熒光激光細胞分離技術(shù)，可以檢測小鼠b體內(nèi)誘導出的多克隆抗癌抗體分別與小鼠a正常細胞、癌細胞以及正常細胞與癌細胞混合懸液中的抗原的交叉免疫反應，并確認小鼠b體內(nèi)誘導出的多克隆抗癌抗體只與癌細胞發(fā)生免疫反應而不與正常細胞發(fā)生免疫反應。從經(jīng)過確認的小鼠b的脾臟中分離出帶有多克隆抗癌抗體免疫信息的致敏淋巴細胞并采用雜交瘤技術(shù)與骨髓瘤細胞溶合成雜交瘤細胞，將溶合雜交瘤細胞體外擴增或接種于小鼠腹腔內(nèi)，即可從培養(yǎng)上清液或小鼠腹水中源源不斷地獲得能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體。以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法的技術(shù)特征作進一步的詳細說明。
本發(fā)明制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法主要包括建立“天然”免疫耐受、免疫小鼠、檢測和溶合雜交瘤四個步驟。
一，建立“天然”免疫耐受建立“天然”免疫耐受是本發(fā)明最為關(guān)鍵的步驟，其過程是，首先從患有早期癌的同品系小鼠a的某一定特組織內(nèi)提取正常細胞并制成正常細胞懸液，然后將小鼠a的正常細胞懸液導入已懷孕的異品系或雜種鼠B的胚胎b中。
小鼠a所患的癌應為早期癌，例如原位癌，而且越早越好。小鼠a的正常細胞必須與癌細胞起源于同一組織，但又必須遠離腫瘤，以防止正常細胞中混入轉(zhuǎn)化細胞或癌細胞。例如，小鼠a患左腎癌時，則可從右腎中提取正常細胞。小鼠a的正常細胞懸液應在異品鼠或雜種鼠B的胚胎期或者小鼠b的初生期的不同時象多次重復導入，以求建立徹底的“天然”免疫耐受。導入正常細胞懸液時可利用微型注射器在B超監(jiān)視下直接注射或經(jīng)手術(shù)剖腹后注射。導入小鼠a正常細胞懸液的部位最好選在胚胎的胸腺內(nèi)，導入時間和細胞數(shù)量應根據(jù)胚胎期的長短和小鼠B胚胎b的大小精確計算。
上述同品系小鼠a起源于同一組織的正常細胞可用小鼠a正常細胞外膜蛋白或原癌基因產(chǎn)物代替，也可以用同品系小鼠C的正常細胞，正常細胞外膜蛋白或原癌基因產(chǎn)物代替，還可以用不同種屬的動物或人的正常細胞、正常細胞外膜蛋白或原癌基因產(chǎn)物代替。異品系或雜種鼠B的胚胎b或初生期小鼠b可用無免疫缺陷的不同種屬動物B的胚胎b或初生期動物b代替。
二、免疫小鼠免疫小鼠的過程是，待上述接受過小鼠a正常細胞“天然”免疫耐受的小鼠b出生后并進入青春期時，將小鼠a的癌細胞懸液多次重復注入小鼠b體內(nèi)，以使起源于小鼠a同一組織的正常細胞與癌細胞之間原本完全相同的抗原被克隆排除，而與正常細胞不同的異?？乖瓌t被視為“非已”并在小鼠b體內(nèi)誘導出相應的多克隆抗癌抗體。
提取小鼠a的癌細胞和制備癌細胞懸液時，應盡量清除其它雜質(zhì)細胞并進行體外培養(yǎng)。利用小鼠a癌細胞懸液免疫小鼠b的時間最好選擇在小鼠b的青春期，此時小鼠b的免疫識別功能最強。由于不同品系，不同種屬和不同個體的動物對不同組織來源的癌細胞的免疫識別功能存在差異，因此小鼠b也應篩選那些無免疫缺陷、免疫監(jiān)視功能強的健康活潑的小鼠。免疫小鼠b的過程也應多次重復進行，以求在小鼠b體內(nèi)產(chǎn)生更多更具有特異性識別功能的多克隆抗癌抗體，癌細胞抗原量也應精確計算。同品系小鼠a的癌細胞可用小鼠a癌細胞外膜蛋白或由原癌基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物代替，也可以由同品系小鼠d的癌細胞，癌細胞外膜蛋白或由原癌基因轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物代替，還可以由不同種屬的動物或人的癌細胞，癌細胞外膜蛋白或由原癌基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物代替。
三、檢測檢測過程是，從免疫小鼠b的血清中提取多克隆抗癌抗體，并觀測多克隆抗癌抗體分別與小鼠a的正常細胞，癌細胞以及正常細胞與癌細胞混合液中抗原的免疫反應，以確認免疫小鼠b體內(nèi)產(chǎn)生的多克隆抗癌抗體只與癌細胞發(fā)生免疫反應而不與正常細胞發(fā)生免疫反應。
從免疫小鼠b血清中提取多克隆抗癌抗體可采用常規(guī)方法，制備小鼠a的正常細胞懸液，癌細胞懸液以及正常細胞與癌細胞混合懸液也可采用常規(guī)方法，但必須精確測定各種細胞懸液中正常細胞和癌細胞的數(shù)量。觀測多克隆抗癌抗體與各種細胞懸液中抗原的免疫反應的方法很多，例如可采用免疫熒光法或熒光激光細胞分離技術(shù)，觀測結(jié)果可用同一波長熒光標記的多克隆抗癌抗體分別與三種細胞懸液中抗原結(jié)合的陽性率百分比來表示。
四、溶合雜交瘤雜交瘤技術(shù)是現(xiàn)有的制備單克隆抗體的常規(guī)技術(shù)，它將帶有免疫信息的B細胞與可大量產(chǎn)生Ig的骨髓瘤細胞溶合在一起作為表達抗體基因的載體。應用到本發(fā)明中時，先從經(jīng)過確認的免疫小鼠b的脾臟中取出帶有多克隆抗癌抗體免疫信息的致敏淋巴細胞并與骨髓瘤細胞溶合成雜交瘤細胞，然后將溶合雜交瘤細胞體外擴增或接種于小鼠腹腔內(nèi)，即可從培養(yǎng)上清液或小鼠腹水中源源不斷地獲得能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體。
在本發(fā)明中，建立“天然”免疫耐受是制備多克隆抗癌抗體的關(guān)鍵性步驟。建立“天然”免疫耐受和免疫小鼠雖然都是以一只小鼠a對一只小鼠b的方式進行，但在實際操作中應該以若干只小鼠a對若干只小鼠b的方式進行，才能保證其成功率。其中小鼠a與小鼠b的差異性越大，最終產(chǎn)品的精確度也越高。
利用本發(fā)明制備多克隆抗癌抗體不需要體外擴增和純化抗原，因而簡便易行。所制備的多隆抗癌抗體攜帶有起源于同一組織的正常細胞與癌細胞之間的全部抗原差異信息，因而具有能全方位選擇性識別癌細胞的功能，它只與癌細胞發(fā)生交叉免疫反應，而不與正常細胞發(fā)生交叉免疫反應，采用本發(fā)明所獲得的多克隆抗癌抗體除可直接用于白血病治療中的骨髓凈化，轉(zhuǎn)移癌的診斷和癌癥的導向治療外，還可改制成腫瘤疫苗或?qū)詫ふ野┘毎禺愋钥乖２捎帽景l(fā)明獲得的特異性抗癌抗體還可用于腫瘤基因治療，在構(gòu)建新型靶向型載體時，將特異性的小型抗癌抗體基因片段插入或取代病毒ENV基因，可使病毒能夠特異性感染癌細胞。
權(quán)利要求
1.一種制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于包括建立“天然”免疫耐受、免疫小鼠、檢測和溶合雜交瘤四個步驟，即首先從患有早期癌的同品系小鼠a的體內(nèi)提取與癌細胞起源于同一組織的正常細胞并制成正常細胞懸液，在特定的時間內(nèi)將小鼠a的正常細胞懸液多次導人已懷孕的異品系或雜種鼠B的胚胎b中，以造成小鼠a的正常細胞在胚胎b中的“天然”免疫耐受；在小鼠b出生后并進入青春期時，再將小鼠a的癌細胞懸液多次重復注入小鼠b體內(nèi)，在隨后發(fā)生的免疫反應中使起源于小鼠a同一組織的正常細胞與癌細胞之間原本完全相同的抗原被克隆排除，而與正常細胞不同的異?？乖瓌t被視為“非已”并在小鼠b體內(nèi)誘導出相應的多克隆抗癌抗體；然后從上述免疫小鼠b的血清中提取多克隆抗癌抗體并觀察多克隆抗癌抗體分別與上述小鼠a的正常細胞、癌細胞及正常細胞與癌細胞混合懸液中抗原的免疫反應，以確認上述免疫小鼠b體內(nèi)的多克隆抗癌抗體不與正常細胞發(fā)生免疫反應而只與癌細胞發(fā)生免疫反應；然后從經(jīng)過確認的上述免疫小鼠a的脾臟中取出帶有多克隆抗癌抗體的致敏淋巴細胞并與骨髓瘤細胞溶合成雜交瘤細胞，將溶合成的雜交瘤細胞體外擴增或接種于小鼠腹腔內(nèi)，即可從培養(yǎng)上清液或小鼠腹水中源源不斷地獲得能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于所述的同品系小鼠a起源于同一組織的正常細胞和癌細胞可分別用小鼠a的正常細胞外膜蛋白和癌細胞外膜蛋白代替。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于所述的同品系小鼠a起源于同一組織的正常細胞和癌細胞可分別用小鼠a的原癌基因產(chǎn)物和由其轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物代替。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的一種制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于所述的同品系小鼠a起源于同一組織的正常細胞和癌細胞可分別用同品系小鼠c相同組織的正常細胞，正常細胞外膜蛋白、原癌基因產(chǎn)物和同品系小鼠d相同組織的癌細胞、癌細胞外膜蛋白、由原癌基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物代替。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于所述同品系小鼠a起源于同一組織的正常細胞，正常細胞外膜蛋白、原癌基因產(chǎn)物和癌細胞、癌細胞外膜蛋白、由原癌基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物可分別用不同種屬的動物或人的起源于同一組織或相同組織的正常細胞，正常細胞外膜蛋白、原癌基因產(chǎn)物和癌細胞、癌細胞外膜蛋白、由原癌基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的癌基因產(chǎn)物代替。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于所述的建立“天然”免疫耐受是將小鼠a與癌細胞起源于同一組織的正常細胞懸液導人異品系或雜種鼠B的初生期小鼠b體內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、6所述的制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法，其特征在于所述異品系或雜種鼠B的胚胎b或初生期小鼠b可用無免疫缺陷的不同種屬動物B的胚胎b或初生期動物b代替。
全文摘要
制備能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的方法涉及一種能全方位選擇性識別癌細胞的多克隆抗癌抗體的制備方法,包括建立“天然”免疫耐受、免疫小鼠、檢測和溶合雜交瘤四個步驟。所制備的多克隆抗癌抗體具有全方位選擇性識別癌細胞的功能,因而只與癌細胞發(fā)生免疫反應而不與正常細胞發(fā)生免疫反應,除可用于白血病治療中的骨髓凈化、轉(zhuǎn)換癌的診斷和癌癥的導向治療外,還可改制成腫瘤疫苗或?qū)詫ふ野┘毎禺愋钥乖?br> 文檔編號G01N33/577GK1195773SQ98100700
公開日1998年10月14日 申請日期1998年3月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月4日
發(fā)明者王勝軍 申請人:王勝軍