專利名稱：異噁唑與巴豆酰胺衍生物及其在藥學(xué)和診斷學(xué)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的異噁唑與巴豆酰胺衍生物、它們的制備和作為藥物的用途，以及它們作為抗原在制備抗體中的用途和它們在診斷及精制方法中的用途。
異噁唑與巴豆酰胺衍生物已被公開具有抗炎、免疫抑制或抗增生作用(EP0013376；EP0217206；EP0527736)。借助常規(guī)的色譜法，能對動物和人血清中的這些化合物進(jìn)行分析檢測。這些色譜法的缺點是儀器的成本高、樣品制備步驟復(fù)雜和樣品處理量低。
免疫檢測與分析法快速、可靠，是色譜法的替代方法。使用這些替代方法的關(guān)鍵在于制備出適當(dāng)?shù)目贵w。
本發(fā)明通過對異噁唑與巴豆酰胺進(jìn)行改性處理，目的是使該適于制備抗體的化合物能與聚合物偶合，且能被用作放射免疫測定法的示蹤劑。
已發(fā)現(xiàn)式I化合物可實現(xiàn)該目的，其中在苯胺部分的芳環(huán)上，有一個或多個官能團(tuán)，該官能團(tuán)能與聚合物進(jìn)行共價偶合，或者通過一個間隔基偶合。
因此本發(fā)明涉及式I化合物和/或式I化合物生理學(xué)上可允許的鹽，可選地和/或式I化合物的立體異構(gòu)體，
其中R1為式II或式III基團(tuán)
R2為a)-O-(CH2)n-CH＝CH2，其中n為1、2或3的整數(shù)，b)-O-(CH2)m-CH2-鹵素，其中m為1、2或3的整數(shù)，鹵素為氟、氯、溴或碘，c)式V基團(tuán)
其中R3為1)鹵素或2)-NH2，R4為1)氫原子或2)氨基酸殘基，或d)-NH2。在優(yōu)選的式I化合物中，R1為式II或式III基團(tuán)，R2為a)-O-(CH2)m-CH2-鹵素，其中m為整數(shù)2，鹵素為溴或碘，b)-O-CH2-CH＝CH2，或c)-NH-C(O)-CH(R3)(R4)，其中R3為溴、-NH2或氯，R4為氫原子。
尤其優(yōu)選的式I化合物例如2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-烯丙氧基苯基)酰胺，2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(3-碘代丙氧基)苯基)酰胺，2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-氨基乙酰氨基)苯基)酰胺，5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-氨基乙酰氨基)苯基)酰胺，2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-溴乙酰氨基)苯基)酰胺，或5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-溴乙酰氨基)苯基)酰胺。
式I中R2基團(tuán)位于苯環(huán)上“NH”基的間位、鄰位或?qū)ξ?，?yōu)選為對位。
式I化合物可選以光學(xué)異構(gòu)體、非對映體、外消旋物或其混合物的形式存在。對“氨基酸”一詞的理解是其含義包括下列化合物的立體異構(gòu)體，如D型與L型天冬酰胺、纈氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、Nε-乙酰賴氨酸、Nδ-乙酰鳥氨酸、Nγ-乙酰二氨基丁酸、Nα-乙酰二氨基丁酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和酪氨酸。
優(yōu)選L-氨基酸。尤其優(yōu)選為氨基酸殘基Gly。
氨基酸殘基由相應(yīng)氨基酸衍生而來?？砂凑找话懔?xí)慣使用氨基酸的簡記符號。R4基團(tuán)代表氨基酸各自的側(cè)鏈。
式I化合物適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)上可允許的鹽例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽和銨鹽，包括有機(jī)銨堿的鹽和質(zhì)子化的氨基酸殘基的鹽。
本發(fā)明也涉及式I化合物的制備方法和/或式I化合物生理學(xué)上可允許的鹽，可選地和/或式I化合物的立體異構(gòu)體，該制備方法包括a)將式VI化合物
其中R6為OH、Cl或Br，與式VII化合物
其中R7為1)NH2，2)-NH-C(O)-CH2-NH-保護(hù)基，其中保護(hù)基是一種胺保護(hù)基，如Boc，3)-NH-C(O)-CH2-鹵素，或4)-OH，進(jìn)行反應(yīng)得到式I化合物，其中R1為式II基團(tuán)，R2為-NH2、-NH-C(O)-CH2-NH-保護(hù)基、-OH或-NH-C(O)-CH2-鹵素，或b)將由方法a)制得的化合物、其中的R7為-OH，與一種烷基鹵或一種二鹵代鏈烷烴、其中的烷基部分具有2、3或4個碳原子，進(jìn)行反應(yīng)得到相應(yīng)的式I化合物，或c)將由方法a)制得的化合物、其中的R7為-OH，與一種不飽和烷基鹵、其中的烷基部分具有3、4或5個碳原子，進(jìn)行反應(yīng)得到相應(yīng)的式I化合物，或d)將由方法a)制得的化合物、其中的R7為-NH2，與一種諸如溴乙酰溴的羧酸鹵進(jìn)行反應(yīng)得到式I化合物，其中的R2為式V基團(tuán)，R3為鹵素，R4為氫原子，或e)將一種諸如對苯二胺的芳族二胺與一種氨基被保護(hù)起來的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)得到式VII化合物，其中的R7為式V基團(tuán)，R3為-NH2，R4為被保護(hù)的氨基酸，然后按照方法a)進(jìn)行反應(yīng)得到相應(yīng)的式I化合物，或f)除去由方法a)或e)制得的式I化合物的保護(hù)基，或g)使由方法a)-f)制得的化合物、其中的R1為式II基團(tuán)，轉(zhuǎn)化為式I化合物，其中的R1為式III基團(tuán)，或h)將由方法a)-g)制得的式I化合物進(jìn)行分離得到其游離形式，或者可選地在酸根或堿性基的存在下，將其轉(zhuǎn)化為生理學(xué)上可允許的鹽。
在按照a)的方法步驟中，例如根據(jù)文獻(xiàn)中已知的方法，可將異噁唑-4-羧酸(R6為-OH)轉(zhuǎn)化為一種酰基氯。例如在一種非質(zhì)子傳遞溶劑(如甲苯、四氫呋喃(THF)或氯代烴)中將前者轉(zhuǎn)化為亞硫酰氯或磷酰氯，然后在一種諸如THF或氯代烴的偶極性非質(zhì)子傳遞溶劑中，使其與一種可選以適當(dāng)方式被取代的芳胺外加一種諸如叔胺(如三乙胺或N-乙基嗎啉)的有機(jī)堿進(jìn)行反應(yīng)。另一種方法是，添加一種肽化學(xué)中已知的縮合劑、如二環(huán)己基碳二亞胺從羧酸直接生成酰胺。第二種方法特別適用于進(jìn)一步含有氨基或醇羥基的芳胺。
在b)或c)的方法步驟中進(jìn)一步通過苯胺部分引入羥基的作用是1)與一種烷基鹵或諸如1，3-二碘代丙烷的二鹵代鏈烷烴外加一種有機(jī)堿或諸如碳酸鉀的無機(jī)堿反應(yīng)，得到相應(yīng)取代的araliphatic醚，其中在后一種情況下，通過使用適當(dāng)過量的烷基化試劑或?qū)⑼榛噭┯米魅軇?，可以避免二聚作用的產(chǎn)生，以使產(chǎn)物中烷基鹵還保留有進(jìn)一步使產(chǎn)物與固定相偶合的作用，或2)在類似條件下，在一種諸如四氫呋喃(THF)、丙酮或氯代烴的偶極性非質(zhì)子傳遞溶劑中與一種不飽和烷基鹵反應(yīng)，如烯丙基鹵或炔丙基鹵，優(yōu)選為烯丙基溴，反應(yīng)得到烯丙基醚或炔丙基醚，其中若將丙酮用作溶劑、碳酸鉀用作堿。反應(yīng)同時伴有如g)所述的異噁唑部分(式II基團(tuán))的開環(huán)反應(yīng)。
在步驟d)中，在一種諸如THF或氯代烴的偶極性非質(zhì)子傳遞溶劑中，使氨基與一種諸如溴乙酰溴的羧酸鹵外加一種諸如叔芳胺(如三乙胺或N-乙基嗎啉)的有機(jī)堿反應(yīng)。
在步驟e)中，使用一種諸如二環(huán)己基碳二亞胺的縮合劑將諸如對苯二胺的芳族二胺轉(zhuǎn)化為單酰胺，轉(zhuǎn)化的方法是使用一種氨基被保護(hù)的氨基酸、如N-Boc-甘氨酸，然后如步驟a)所述生成N-某酰苯胺，最終在肽化學(xué)已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下除去一直存在的胺保護(hù)基(步驟f))。
在步驟g)中，使由a)-f)制得的化合物發(fā)生堿誘導(dǎo)的異噁唑部分的開環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)優(yōu)選在一種水/有機(jī)溶劑混合物中進(jìn)行，如THF/水或乙醇/水，并使用過量的有機(jī)或無機(jī)堿，如NaOH、氨水溶液或碳酸鉀。
所提供的通式I化合物呈非對映異構(gòu)體或?qū)τ丑w的形式，在所選擇的合成方法中得到的是其混合物，純立體異構(gòu)體是在可選地手性材料上通過色譜法進(jìn)行分離得到的，或者，只要式I的外消旋化合物能夠成鹽，通過使其與一種光學(xué)活性的堿或酸助劑生成非對映體的鹽，然后對鹽進(jìn)行分步結(jié)晶，也能分離得到純立體異構(gòu)體。另一種方法與之原理相同，使用光學(xué)活性的酸，如(+)-樟腦-10-磺酸、D-及L-酒石酸、D-及L-乳酸或(+)-及(-)-扁桃酸，可將含有諸如氨基的堿基的式I外消旋化合物轉(zhuǎn)化為純對映體。
本發(fā)明也涉及藥物，該藥物含有有效量的至少一種式I化合物和/或式I化合物的立體異構(gòu)體和/或式I化合物的生理學(xué)上可允許的鹽，此外還含有藥學(xué)上適用且生理學(xué)上可允許的賦形劑、添加劑和/或活性化合物及助劑。按照本發(fā)明的藥物可經(jīng)靜脈內(nèi)、胃腸外、局部、直腸或口服給藥。
按照本發(fā)明的藥物優(yōu)選適用于癌癥、炎癥和自體免疫疾病的預(yù)防和/或治療。
這些疾病例如包括風(fēng)濕病、急性及慢性的肌肉、關(guān)節(jié)或胃腸道炎癥、過敏性氣管疾病、牛皮癬或自體免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、II型糖尿病、重癥肌無力、斯耶格倫綜合征、皮膚肌炎、硬化性皮炎或多發(fā)性硬化(MS)。癌癥例如包括肺癌、白血病、淋巴結(jié)癌、腦瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或皮膚癌。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的藥物的制備方法，該方法包括使用一種藥學(xué)上適用且生理學(xué)上可允許的賦形劑，如果合適的話，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)幕钚曰衔铩⑻砑觿┗蛑鷦?，將至少一種式I化合物制成適當(dāng)?shù)慕o藥方式。
適當(dāng)?shù)墓腆w或液體藥物劑型例如包括顆粒、粉末、包衣片、片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、藥汁、懸浮液、乳液、滴劑或注射溶液，以及可持續(xù)釋放活性化合物的制劑，在這些制劑中加入常規(guī)的助劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶漲劑、滑動劑或潤滑劑、矯味劑、甜味劑及增溶劑。經(jīng)常被提到的助劑例如滑石，淀粉，碳酸鎂，二氧化鈦，乳糖，甘露糖醇及其它糖類，乳蛋白，明膠，纖維素及其衍生物，動物油及植物油，如鱈魚肝油、葵花油、花生油或芝麻油，聚乙二醇，和溶劑，如滅菌水和單醇或多元醇、如甘油。
藥物制劑優(yōu)選以劑量單元的方式制備和給藥，每個單元含有一定劑量按照本發(fā)明的式I化合物作為活性成分。在諸如片劑、膠囊、包衣片或栓劑的固體劑量單元的情況下，劑量可高達(dá)約1000mg，不過優(yōu)選約為50至300mg，在安瓿注射溶液的情況下，劑量可高達(dá)約300mg，不過優(yōu)選約為10至100mg。在人和動物的前提下，若要治療體重約70kg的成年病人，根據(jù)式I化合物的功效不同，口服每日劑量約為50至3000mg活性化合物，優(yōu)選約為150至1000mg，靜脈內(nèi)給藥的每日劑量約為50至1000mg，優(yōu)選約為100至300mg。不過在某些情況下，每日劑量稍高或稍低也是可以的。每日劑量的服用可通過以單個劑量單元或若干小劑量單元進(jìn)行單次給藥來完成，或者通過細(xì)分的劑量以特定時間間隔進(jìn)行多次給藥來完成。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及的式I化合物可選地通過橋連原子與聚合物或固體偶合。
它們是式IV化合物
其中R1為式II或式III基團(tuán)
L為橋連原子，來自a)-O-，
b)-NR5-，其中R5為氫原子，c)-O-(CH2)n-CH2-，其中n為1、2或3的整數(shù)，
其中R3為a)共價鍵或b)-NH-，R4為a)氫原子或b)氨基酸殘基，或e)定義同a)至d)的橋連原子L，且具有一個間隔基，其中的間隔基為1)-NH-(CH2)m-S-，其中m為1至12的整數(shù)，X為聚合物或固體。
式IV中“L-X”基團(tuán)可以位于苯環(huán)上“NH”基的間位、鄰位或?qū)ξ?，?yōu)選在對位。對“聚合物”一詞的理解是其含義為合成或天然聚合物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、膠乳、多糖、瓊脂糖、蛋白質(zhì)、脂類、硅酸鹽或核酸。聚合物可選地具有一個或多個選自-OH、-COOH、-NH2及-CO-的官能團(tuán)，以便該聚合物能與式I化合物進(jìn)行偶合。式I化合物與固體偶合的一般方法例如BI申請手冊，Ed.1994，圖4.1(Merk AB，Uppsala，Sweden)所述。“固體”一詞代表不溶物，它可被粒子化，或可形成諸如管狀、珠狀或微量滴定盤的幾何形狀。
優(yōu)選的式IV化合物是式I化合物與固體或聚合物偶合后所形成的化合物。式IV化合物尤其優(yōu)選為諸如5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-溴乙酰溴)苯基)酰胺或2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-溴乙酰溴)苯基)酰胺的式I化合物與固體或聚合物偶合后所形成的化合物。
式IV化合物也適用于從細(xì)胞提取物、血清、血液或滑液中發(fā)現(xiàn)特殊結(jié)合蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)的精制、微量滴定盤的校準(zhǔn)或色譜原料的制備，尤其適用于親和色譜法原料的制備。用于精制的蛋白質(zhì)直接與結(jié)合在聚合物或固體上的式I化合物發(fā)生相互作用。化合物也適用于診斷學(xué)領(lǐng)域。
一個特別恰當(dāng)?shù)氖絀V化合物固體是BIA Core CM5片或固定相，供色譜研究或分離及微量滴定盤之用。
例15-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-溴乙酰溴)苯基)酰胺步驟a)5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-氨基苯基)酰胺將10.1g(0.08mol)5-甲基異噁唑-4-羧酸與8.65g(0.08mol)對苯二胺溶于300ml四氫呋喃，并加入18.05g(0.088mol)二環(huán)己基碳二亞胺。5小時(h)后，用空吸法濾除所沉淀出來的沉淀物，有機(jī)相濃縮，產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜，用乙酸乙酯/石油醚外加1％冰醋酸洗脫，然后從乙酸乙酯/石油醚中結(jié)晶。產(chǎn)出6.8g乙酸鹽，熔點123℃至128℃。
步驟b)5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-溴乙酰溴)苯基)酰胺首先將2.17g(0.01mol)來自步驟a)的產(chǎn)物與1.9g(0.016mol)N-乙基嗎啉導(dǎo)入50ml四氫呋喃中，在冰水浴中，再滴加2.4g(0.012mol)溴乙酰溴溶液，然后在室溫下將混合物攪拌5h。加入5ml水后，用1N的HCl酸化至pH2，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用水洗滌，干燥并濃縮。產(chǎn)物從乙酸乙酯/石油醚中結(jié)晶。產(chǎn)出2.0g，熔點179℃。1H-NMR(DMSO-d6)2.7(s，3H)，4.05(s，2H)，7.5-7.75(m，4H)，9.1(s，1H)，10.1與10.45(每個均為sb，1H)例22-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-溴乙酰溴)苯基)酰胺將0.5g(0.0015mol)例1產(chǎn)物溶于10ml四氫呋喃，在冰冷卻下加入2ml 1N的NaOH水溶液。反應(yīng)在TLC的監(jiān)視下進(jìn)行，反應(yīng)完成后(大約60-90min后)，用2.25ml1N鹽酸水溶液酸化并加入100ml水，使產(chǎn)物沉淀出來，過濾、用水洗滌，然后邊攪拌邊用少量乙酸乙酯洗滌，再減壓干燥。產(chǎn)出0.28g，熔點大于210℃。1H-NMR(DMSO-d6) 2.28(s，3H)，4.04(s，2H)，7.4-7.7(m，4H)，8.5-10(sb，1H)，10.4(sb，2H)例3鹽酸5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-溴乙酰溴)苯基)酰胺步驟a)2-叔丁氧基羰基氨基乙酰氨基-對苯二胺將8.65g(0.08mol)對苯二胺與15.3g(0.088mol)N-Boc-甘氨酸溶于300ml無水四氫呋喃(THF)，再分次加入18.05g(0.088mol)二環(huán)己基碳二亞胺。5h后，用空吸法濾除所沉淀出來的沉淀物，濾液濃縮，產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜法精制，用乙酸乙酯/甲醇/乙酸洗脫，然后從乙酸乙酯/石油醚中結(jié)晶。
產(chǎn)出13.5g，熔點144℃。
步驟b)5-甲基異噁唑-4-碳酰氯首先將127.1g(1.0mol)5-甲基異噁唑-4-羧酸導(dǎo)入11甲苯中，再滴加129.8g(1.1mol)亞硫酰氯，然后將混合物加熱至80℃達(dá)6h。減壓濃縮至約一半體積，所得甲苯溶液直接用于下面的反應(yīng)。
步驟c)5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-叔丁氧基羰基氨基乙酰氨基)苯基)酰胺首先將13.5g(0.05mol)的步驟a)產(chǎn)物與7.6ml(0.06mol)N-乙基嗎啉導(dǎo)入100mlTHF中，再在0℃下滴加30ml來自步驟b)的溶液(相應(yīng)為0.06mol)?；旌衔镞M(jìn)一步在室溫下攪拌5h，用檸檬酸水溶液進(jìn)行水解，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，用硫酸鈉干燥并減壓濃縮。產(chǎn)出12g，熔點139℃。
步驟d)鹽酸5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-氨基乙酰氨基)苯基)酰胺將6g(0.017mol)的步驟c)產(chǎn)物溶于180ml二氯甲烷，并加入18ml三氟乙酸。混合物在室溫下攪拌1h，濃縮，溶于乙醇后加入過量乙醇HCl并濃縮，邊攪拌邊用乙酸乙酯洗滌殘余物，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽。產(chǎn)出2.5g，熔點210℃。1H-NMR(DMSO-d6) 2.7(s，3H)，3.7-3.9(m，2H)，7.6與7.72(每個均為2H，AA′BB′)，8.25(sb，2H)，9.3，10.2與10.75(每個均為s，1H)例4三氟乙酸2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-氨基乙酰氨基)苯基)酰胺將6g(0.017mol)的例3步驟c)產(chǎn)物溶于20ml 1N氫氧化鈉溶液/2ml乙醇，混合物在室溫下攪拌，直至完成開環(huán)反應(yīng)(大約3h)。用檸檬酸酸化后，得到固態(tài)Boc-被保護(hù)的產(chǎn)物，在空吸濾器上過濾并干燥(熔點189℃，產(chǎn)出5.5g)。將5g該中間產(chǎn)物在二氯甲烷中用三氟乙酸處理，方法與例3d)相似，借助于乙酸乙酯與石油醚使所得產(chǎn)物從乙醇中以三氟乙酸鹽的形式結(jié)晶析出。產(chǎn)出5.0g，熔點209℃。1H-NMR(DMSO-d6) 2.15(s，3H)，3.7-3.85(m，2H)，7.49(s，4H)，8.1(sb，3H)，10.3與11.2(每個均為sb，1H)例52-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(3-碘代丙氧基)苯基)酰胺步驟a)5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(3-碘代丙氧基)苯基)酰胺將6.5g(0.03mol)5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-羥苯基)酰胺溶于57ml(0.5mol)1，3-二碘代丙烷，在劇烈攪拌下加入26.2g(0.19mol)精細(xì)研磨過的碳酸鉀。大約4h后反應(yīng)完全。通過過濾、濃縮和借助于乙酸乙酯/石油醚1∶1外加1％冰醋酸而進(jìn)行的硅膠色譜完成操作。產(chǎn)出6.7g。
步驟b)2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(3-碘代丙氧基)苯基)酰胺將5.5g的步驟a)產(chǎn)物在200ml約1N的甲醇銨溶液中處理，直至完成開環(huán)反應(yīng)，混合物濃縮，將殘余物溶于稀乙酸，借助于乙酸乙酯/石油醚外加1％冰醋酸進(jìn)行色譜分離，然后使產(chǎn)物從乙酸乙酯/石油醚中結(jié)晶析出。產(chǎn)出2.3g，熔點149℃。1H-NMR(DMSO-d6)2.1-2.4(m，2H與s，3H，2.3ppm)，3.4與4.02(每個均為t，2H)，6.92與7.42(每個均為2H，AA′BB′)，7.2-8.5(ssb，1H)，10.2(s，1H)例62-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-烯丙氧基苯基)酰胺將1.5g(0.0068mol)5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-羥苯基)酰胺溶于丙酮，加入5.8ml(0.068mol)烯丙基溴并在劇烈攪拌下加入9.3g(0.068mol)精細(xì)研磨的碳酸鉀，然后混合物在室溫下攪拌過夜。過濾后的濾液濃縮，將殘余物溶于水，從乙酸乙酯/石油醚中重結(jié)晶。產(chǎn)出0.8g，熔點162℃至164℃。1H-NMR(DMSO-d6)2.3(s，3H)，4.45-4.63(m，2H)，5.15-5.38(m，2H)，5.9-6.2(m，1H)，6.95與7.42(每個均為2H，AA′BB′)，10.0(sb，1H)，12.5-14.5(ssb，1H)藥理實驗用體外增生試驗細(xì)胞培養(yǎng)物測定式I化合物的活性。
例7增生試驗將101含有L-谷氨酰胺、不含NaHCO3的粉末型Clicks/RPMI 1640培養(yǎng)基(50∶50)(Seromed，Biochrom，Berlin，F(xiàn)RG)溶于91重蒸餾水，無菌過濾后灌瓶，每瓶裝900ml。
洗滌培養(yǎng)基將900ml基本培養(yǎng)基用9.5ml 7.5％增強(qiáng)型碳酸氫鈉溶液和5mlHEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)(Gibco，Eggenstein，F(xiàn)RG)進(jìn)行緩沖處理。
實用培養(yǎng)基向900ml基本培養(yǎng)基中加入19mlNaHCO3溶液(7.5％；10mlHEPES溶液和10mlL-谷氨酰胺溶液(200mM))。
該用于促細(xì)胞分裂劑誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基是實用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基用1％熱滅活的(30min，56℃)胎牛血清(FCS)增菌。
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為維持腫瘤細(xì)胞和雜交瘤的生長，制得含有5％FCS的實用培養(yǎng)基細(xì)胞系培養(yǎng)基為維持細(xì)胞系的生長，將900ml含有10％FCS的實用培養(yǎng)基、10ml NEA(非必需氨基酸)溶液(Gibco)、10ml丙酮酸鈉溶液(100mM，Gibco)和5ml10-2M巰基乙醇混合。
用于促細(xì)胞分裂劑誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增生的脾細(xì)胞的獲得和處理將小鼠用頸脫位法處死，在無菌條件下取出脾。脾在80目無菌篩上切碎，再用塑料注射器(10ml)的活塞小心地將其濾入含有實用培養(yǎng)基的佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿中。為除去脾細(xì)胞懸浮液中的紅細(xì)胞，將混合物在室溫下恒溫約1min，同時在低滲的0.17M氯化銨溶液中不時振搖。紅細(xì)胞在此過程中被溶解了，而淋巴細(xì)胞的存活性與反應(yīng)性均不受影響。離心(7min/340g)后，棄去溶解物，將細(xì)胞洗滌兩次，再溶于各自的試驗培養(yǎng)基中。
促細(xì)胞分裂劑誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增生將來自雌性NMRI小鼠的5×105個處理過的脾細(xì)胞與各種促細(xì)胞分裂劑和制劑(式I化合物)一起用移液管移入平底微量滴定盤每個小穴的200μl試驗培養(yǎng)基中。使用下列濃度的促細(xì)胞分裂劑和制劑伴刀豆球蛋白A(Serva)0.5-0.25-0.12μg/ml脂多糖(Calbiochem) 1.0-0.5-0.1μg/ml植物血凝素(Gibco) 0.5-0.25-0.12％儲備溶液美洲商陸促細(xì)胞分裂劑(Gibco)化合物1或250，25，10，7.5，5，2.5，1，0.5，0.1μmol加入促細(xì)胞分裂劑而不含制劑的組定義為陽性對照。陰性對照是含有制劑而沒有促細(xì)胞分裂劑加入的培養(yǎng)基細(xì)胞。對于所有濃度的制劑，每個濃度的促細(xì)胞分裂劑均試驗四次。以37℃/5％CO2恒溫48h后，向細(xì)胞中加入具有0.25μCi/穴(9.25×103Bq)活性的25μl/穴氚-胸苷(Amersham)。然后在同樣條件下進(jìn)一步恒溫16h。為對一批試驗進(jìn)行評價，用細(xì)胞收集器(Flow實驗室)將細(xì)胞收集在濾紙上，將沒有結(jié)合進(jìn)來的胸苷單獨收集在一個廢瓶中。濾紙干燥、穿孔，再與2ml閃爍劑(Rotiszint 22，Roth)一起加入到閃爍劑容器中，然后將該容器在4℃下進(jìn)一步冷卻2h。用β-計數(shù)器(Packard，Tricarb-460c)定量測量細(xì)胞所具有的放射性。
腫瘤細(xì)胞的制備與增生試驗所用的細(xì)胞系試驗所用腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系取自處于對數(shù)生長期的儲備溶液，用洗滌介質(zhì)洗滌兩次，并使其懸浮在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中。
增生試驗的進(jìn)行與評價在圓底微量滴定盤中進(jìn)行增生試驗。將式I化合物與白細(xì)胞間介素分別溶于50μl/穴的適當(dāng)介質(zhì)中，用100μl/穴調(diào)整細(xì)胞數(shù)量(5×105)，使最終體積為200μl/穴。在全部試驗中，各試驗數(shù)據(jù)均測定四次。不含制劑也不含生長因子的細(xì)胞定義為陰性對照，不含制劑而含有生長因子的細(xì)胞作為陽性對照。從所有測定值中減去陰性對照值，并將陽性對照與陰性對照之差設(shè)為100％。
將微量滴定盤以37℃/5％CO2恒溫72h，測定相應(yīng)的促細(xì)胞分裂劑誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增生的增生率。細(xì)胞系由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。
表1為達(dá)到50％抑制時的濃度
例8將例2化合物結(jié)合在BIA core CM5基質(zhì)上的方法原料是來自Pharmacia Biosensor公司的CM5片，它具有一個羧甲基葡聚糖表面(BI申請手冊，Ed.1994，Merk AB，Uppsala，Sweden)。偶合步驟均在5μl/min的流速下進(jìn)行。所有步驟均在25℃下進(jìn)行，并使用pH7.4的Hepes緩沖鹽水(HBS)作為操作緩沖液。
第1步用35μl 0.05M的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)與0.2M的EDC(N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亞胺)的1∶1混合物活化基質(zhì)片的表面。
第2步35μl 40mM二鹽酸胱胺溶液用0.1M硼酸鈉緩沖至pH8.5。
第3步用35μl pH8.5的鹽酸乙醇胺飽和基質(zhì)結(jié)構(gòu)中未被占用的部分。
第4步35μl 0.1M二硫蘇糖醇用0.1M硼酸鈉緩沖至pH8.5。
第5步35μl含有例2化合物的溶液(10mg/ml)用0.1M硼酸鈉緩沖至pH7.5。
例9用于分析的BIA core法基本上按照《Current Biology》(3卷12期，1993，913-915頁)所述方法進(jìn)行分析。
系統(tǒng)BIA core 2000及相應(yīng)軟件，Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden片 CM5傳感片，Pharmacia Biosensor AB覆蓋同例8操作緩沖液HBS緩沖液，由BIA認(rèn)證，Pharmacia Biosensor AB流速10μl/min注射每50μl供分析的樣品有5min的締合期沖洗時間180sec 3min離解期再生2×15sec，用0.05％十二烷基硫酸鈉A)不同血清白蛋白的結(jié)合
“共振單元”一詞指的是與蛋白質(zhì)結(jié)合數(shù)量成比例的量化單元數(shù)。
B)不同脫氫酶的結(jié)合
DH代表由酶決定的脫氫酶。
在指定的蛋白質(zhì)濃度下，將所研究的脫氫酶成鍵強(qiáng)度彼此之間進(jìn)行了比較。蛋白質(zhì)濃度為1μM時，二氫乳清酸DH成鍵能力最強(qiáng)，其后是乳酸DH、磷酸甘油醛DH和丙酮酸激酶。
例10親和色譜法例1化合物通過其中的可反應(yīng)性的溴與載體基質(zhì)偶合。所用載體基質(zhì)為FractogelEMD-SH(Merk KGaA，Darmstadt)。按照DE4310964中所說明的標(biāo)準(zhǔn)條件形成共價鍵。將所得到的凝膠裝入Superformance(1cm×5cm)柱(Merk KGaA)，再連接在高效液相色譜(HPLC)上。
可溶性細(xì)胞蛋白質(zhì)的獲得將RAW264.7株(ATCC菌種保藏中心)培養(yǎng)48小時(h)，直至出現(xiàn)細(xì)胞融合時為止，用冷的4℃PBS緩沖液洗滌三次，洗去培養(yǎng)基，再將細(xì)胞移至PBS緩沖液中，以200g離心10min。在4℃下進(jìn)行細(xì)胞處理。再將細(xì)胞團(tuán)懸浮在緩沖液A中，緩沖液A由20mM的tris堿、2mM的MgCl2×6H2O與1mM二硫蘇糖醇(DTT)組成。加入各種蛋白酶抑制劑，以防止發(fā)生由細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶引起的質(zhì)子遷移作用。然后將混合物在玻璃罐中攪勻。然后將懸浮液在4℃下以22000g離心30min，得到可溶性蛋白質(zhì)。
立即將上清液用于親和色譜法分析。將上清液等分兩份，一份留作參照，另一份泵入親合柱。
HPLC親和色譜法使用意大利米蘭Kontron儀器公司的設(shè)備。系統(tǒng)的組成為自動進(jìn)樣器465、HPLC泵422與422S、高壓混合閥M800、Besta馬達(dá)閥和二極管矩陣檢測器440。數(shù)據(jù)的記錄和分析由數(shù)據(jù)系統(tǒng)450-MT2/DAD系列完成。細(xì)胞上清液用水稀釋至體積為30ml，以1ml/min的流速注入。收集流出液，在4℃下貯藏，作為餾分直至色譜完成。
下列緩沖液用于蛋白質(zhì)的梯度洗脫P(yáng)BS緩沖液的組成NaCl 8.00g/lKCl 0.20g/lKH2PO40.20g/lNH2HPO4×7H2O 2.16g/l表2中所用緩沖液的組成緩沖液 組成1 PBS2 PBS+0.5M NaCl3 PBS+150mM A771726b(N-(4-三氟甲苯基)-2-氰基-3-羥基巴豆酰胺的鈉鹽)4 H2O5 6M尿素6 60％乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)注入蛋白質(zhì)溶液后，以3ml/min的流速開始如表2所示的梯度洗脫。
表2
各欄中的數(shù)字與所用緩沖液有關(guān)。
收集餾分，在4℃下以水滲析48h(不受所用6000-8000Da滲析膜的限制)(與乙腈餾分無關(guān))，然后冷凍干燥。
蛋白質(zhì)測定冷凍干燥后，將蛋白質(zhì)溶于1ml 1％十二烷基硫酸鈉(SDS)并用水稀釋至SDS濃度為0.5％。取該溶液的等分試樣用于蛋白質(zhì)測定，測定時使用BCA試驗(Pierce)。將蛋白質(zhì)蒸干(UNIVASPO 150H，UniEquip Power Heater，Martinsried，Germany)，然后溶于適當(dāng)體積的樣品緩沖液，該緩沖液由10g蔗糖、9ml 0.25M tris/1M甘氨酸溶液、7.8ml 10％SDS、2.5ml溴酚藍(lán)(0.1％)、4ml β-巰基乙醇和1.7ml水組成。
SDS-PAGE為制備具有10-17％聚丙烯酰胺梯度的SDS凝膠，制得下列溶液。
A B5ml 丙烯酰胺(30％，0.5％)8.5ml 丙烯酰胺(30％，0.5％)
3.75ml tris(3M，pH8.8)3.75ml tris(3M，pH8.8)6.12ml水 3.275ml甘油0.15ml SDS0.15ml SDS加入100μl 10％APS與12.5μl TEMED后即開始進(jìn)行聚合反應(yīng)。由3ml丙烯酰胺(10％，0.5％)、1.36ml水、1.45ml 0.5M tris(pH6.8)、60μl 10％SDS、106μl 10％APS與9μl TEMED制得收集用凝膠。
為制備分析凝膠，每道(track)裝入10μg蛋白質(zhì)，得100μg制備凝膠。
通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行對比，測定分子量。
序列蛋白質(zhì)餾分在分析凝膠中表現(xiàn)為濃縮的蛋白質(zhì)帶，以制備級水平進(jìn)行分離，分離后的蛋白質(zhì)吸留在PVDF膜(Millipore)上固定。蛋白質(zhì)用考馬斯染料(Coomassie)染色，使其顯色，然后直接進(jìn)行埃德曼(Edman)降解反應(yīng)。在考馬斯染色過的凝膠上進(jìn)行電泳，之后小心地切斷被保護(hù)的N-末端，再用水洗至中性。用兩片孔徑分別為100μm和32μm的鋼篩彼此疊在一起，將凝膠壓成小片狀，使其均化。將該軟膏樣物質(zhì)在UNIVAPO150H(UniEquip Power Heater，Martinsried，Germany)中干燥至較少水分殘留。在一種由pH8.5的25mM HCl tris與1mM EDTA組成的緩沖液中，將如此得到的蛋白質(zhì)與LysdC內(nèi)蛋白酶(Boehringer Mannheim)(酶與蛋白質(zhì)的比例約為110)在37℃下恒溫7h，使蛋白質(zhì)斷裂為肽。
所得肽用1ml 60％乙腈和1ml 0.1％TFA在37℃下洗脫兩次，時間為4h。合并洗脫液，在UNIVAPO中蒸干，所得肽用反相色譜法分離。色譜分離用LiChroCART125-2 Superspher60柱，所用線性梯度(1％/min)為A0.1％TFA水溶液至B0.1％TFA乙腈溶液，時間為70min。
精制過的肽的氨基酸序列按照埃德曼降解反應(yīng)原理用477A氣相序列分析儀(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。PTH-AA用120A苯硫乙內(nèi)酰脲氨基酸分析儀(Applied Biosystems)在269nm下進(jìn)行鑒別。
Western斑點分析將蛋白質(zhì)從SDS凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上后，使未被覆蓋的區(qū)域與5升、pH7.4的2.5％雞白蛋白(Sigma)的TBS溶液恒溫2h，將該區(qū)域保護(hù)起來，TBS由45g NaCl、30.3g tris堿組成。
第一種抗體用保護(hù)緩沖液稀釋至適當(dāng)比例，恒溫1h。然后用TBS與0.1％吐溫20洗滌斑點三次，時間為5min，再與POD標(biāo)記的第二種抗體恒溫1h。重復(fù)洗滌過程，借助于60mg 4-氯-1-萘酚、20ml甲醇、100ml TBS與200μl過氧化氫(30％)的溶液使結(jié)合抗體顯色。
借助于7至14氨基酸長度的肽可對NaCl(3)與A771726b(5)餾分中所得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒別(見表2)。若蛋白質(zhì)為22kDa，所測氨基酸序列可能被確定為兩種蛋白質(zhì)，MSP23與NKEF-A。其原因在于這兩種蛋白質(zhì)序列的高度同源性，為93％。親和色譜法的序列結(jié)果總結(jié)在表3中。表3
根據(jù)表2，餾分編號以柱的餾分進(jìn)行劃分。
對鑒別出來的蛋白質(zhì)的說明濃縮餾分(3)中的18kDa蛋白質(zhì)經(jīng)鑒別為環(huán)啡林A。環(huán)啡林A屬于一大類肽基丙基順式/反式異構(gòu)酶，該類酶與很多免疫抑制劑的作用機(jī)理有關(guān)，如環(huán)孢菌素A。
在餾分(3)中還鑒別出了乳酸脫氫酶，它是一種厭氧的糖原酵解酶，該種酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸反應(yīng)的進(jìn)行。乳酸脫氫酶在動物組織中至少具有五種同功酶的形式。骨骼肌中的同功酶一般含有四個A鏈，而心臟中的同功酶主要含有四個B鏈。本試驗中鑒定出來的是一種來自乳酸脫氫酶A鏈的肽。
在餾分(5)中鑒別出來的兩種蛋白質(zhì)屬于熱激蛋白質(zhì)。熱激蛋白質(zhì)HSP70主要存在于真核生物中，是多基因類蛋白質(zhì)的一種。
熱激蛋白質(zhì)HSP90是一種即使在正常條件下也被表達(dá)的胞液蛋白質(zhì)。它由兩個分離的基因成分組成，HSP84與HSP86，二者彼此的序列同源性為86％。已知HSP90與固醇類激素受體形成配合物，并以此方式干預(yù)某些基因的轉(zhuǎn)錄。
在餾分(5)中另外還發(fā)現(xiàn)了三種糖原酵解的蛋白質(zhì)，它們是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、丙酮酸激酶M2和磷酸甘油酸變位酶。這三種酶來自糖原酵解初期，在天然條件下存在于多酶配合物中。
在餾分(5)中還有一條非常明顯的濃縮帶，經(jīng)鑒別為延伸因子(EF-1α)。EF-1α是一種真核生物重要的轉(zhuǎn)譯因子。其作用與原核生物延伸因子EF-Tu相當(dāng)，在GTP依賴的蛋白質(zhì)生物合成過程中將氨?；?tRNA從胞液中轉(zhuǎn)運至其在核糖體上的受體部位。
另外在餾分(5)中還可能檢測到肌動蛋白。肌動蛋白是一種大量存在于真核生物中幾乎各處的蛋白質(zhì)。它是肌肉組織和細(xì)胞骨架的主要成分。肌動蛋白多基因類代碼有至少四種肌肉肌動蛋白形式和兩種細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白形式(β-與γ-肌動蛋白)。此處的肌動蛋白為細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白形式的γ鏈。
還鑒別出檸檬酸循環(huán)酶、蘋果酸-天冬氨酸往復(fù)酶和蘋果酸脫氫酶。蘋果酸脫氫酶存在于動物組織胞液與線粒體的異構(gòu)重整方式中。蘋果酸-天冬氨酸在胞液與線粒體之間往復(fù)，在此過程中這兩種同功酶與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶起到重更作用。
餾分(5)中22kDa蛋白質(zhì)根據(jù)肽片段的序列被確認(rèn)為兩種蛋白質(zhì)巨噬細(xì)胞23kDa應(yīng)激蛋白(MSP23)，也被稱為成骨細(xì)胞特異因子3(OSF-3)，和“自然殺傷細(xì)胞促進(jìn)因子-A”(NKEF-A)。巨噬細(xì)胞被激活后產(chǎn)生反應(yīng)性氧化合物，如H2O2和O2。由于它們本身耐受該氧化應(yīng)激反應(yīng)，它們必須具有保護(hù)系統(tǒng)的作用，以保護(hù)它們不受這些反應(yīng)性化合物的影響。NKEF是一種來自人紅細(xì)胞的胞液蛋白質(zhì)，能提高自然殺傷細(xì)胞的活性。作為淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞激動素的刺激下，能夠識別大量腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行破壞?！白匀粴?xì)胞促進(jìn)因子”的分子量為44kDa，由兩種同等大小的亞單元組成(NKEF-A與NKEF-B)，二者的相互序列同源性較好，為88％。
例11沒有刺激物作用的、用LPS刺激的、和用LPS刺激并用來氟米物(leflunomide)處理的RAW264.7胞液提取物的親和色譜法比較用脂多糖刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞系，作為體外炎癥模型。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌外膜結(jié)構(gòu)的必要組成成分，幾乎所有的免疫細(xì)胞都能識別它。尤其是巨噬細(xì)胞在被LPS刺激作用激活后，合成大量細(xì)胞激動素，如TNF-α、IL-1和IL-6。在使用脂多糖的同時給以免疫調(diào)節(jié)劑來氟米物，可以防止刺激作用可能引起的蛋白質(zhì)類型的變化。
RAW264.7細(xì)胞用10ng LPS/ml培養(yǎng)基恒溫24小時。對于用LPS刺激并用來氟米物處理的細(xì)胞，同時用60μM A771726B恒溫24小時。細(xì)胞經(jīng)處理得到的胞液提取物用于親和色譜法研究，按照例10借助于Fractogel柱進(jìn)行色譜分析。這三批試驗制得的餾分上樣到分析梯度凝膠中，彼此進(jìn)行比較。
在35kDa附近的帶特別增強(qiáng)了，經(jīng)序列分析鑒別為蘋果酸脫氫酶。與另一條蛋白質(zhì)的帶相比，這些帶的強(qiáng)度顯著提高了，而用LPS與A771726B恒溫的另一條帶強(qiáng)度較弱。
權(quán)利要求
1.式I化合物和/或式I化合物生理學(xué)上可允許的鹽，可選地和/或式I化合物的立體異構(gòu)體，
其中R1為式II或式III基團(tuán)
R2為a)-O-(CH2)n-CH＝CH2，其中n為1、2或3的整數(shù)，b)-O-(CH2)m-CH2-鹵素，其中m為1、2或3的整數(shù)，鹵素為氟、氯、溴或碘，c)式V基團(tuán)
其中R3為1)鹵素或2)-NH2，R4為1)氫原子或2)氨基酸殘基，或d)-NH2。
2.如權(quán)利要求1的式I化合物，其中R1為式II或式III基團(tuán)，R2為a)-O-(CH2)m-CH2-鹵素，其中m為整數(shù)2，鹵素為溴或碘，b)-O-CH2-CH＝CH2，或c)-NH-C(O)-CH(R3)(R4)，其中R3為溴、-NH2或氯，R4為氫原子。
3.如權(quán)利要求1或2的式I化合物，其中式I的R2基團(tuán)位于苯環(huán)上“NH”基的間位、鄰位或?qū)ξ?，?yōu)選為對位。
4.如權(quán)利要求1的式I化合物，是2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-烯丙氧基苯基)酰胺，2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(3-碘代丙氧基)苯基)酰胺，三氟乙酸2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-氨基乙酰氨基)苯基)酰胺，鹽酸5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-氨基乙酰氨基)苯基)酰胺，2-氰基-3-羥基丁-2-烯羧酸(4-(2-溴乙酰氨基)苯基)酰胺，或5-甲基異噁唑-4-羧酸(4-(2-溴乙酰氨基)苯基)酰胺。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項的式I化合物的制備方法，該方法包括a)將式VI化合物
其中R6為OH、Cl或Br，與式VII化合物
其中R7為1)NH2，2)-NH-C(O)-CH2-NH-保護(hù)基，其中保護(hù)基是一種胺保護(hù)基Boc，3)-NH-C(O)-CH2-鹵素，或4)-OH，進(jìn)行反應(yīng)得到式I化合物，其中R1為式II基團(tuán)，R2為-NH2、-NH-C(O)-CH2-NH-保護(hù)基、-OH或-NH-C(O)-CH2-鹵素，或b)將由方法a)制得的化合物、其中的R7為-OH，與一種烷基鹵或一種二鹵代鏈烷烴、其中的烷基部分具有2、3或4個碳原子，進(jìn)行反應(yīng)得到相應(yīng)的式I化合物，或c)將由方法a)制得的化合物、其中的R7為-OH，與一種不飽和烷基鹵、其中的烷基部分具有3、4或5個碳原子，進(jìn)行反應(yīng)得到相應(yīng)的式I化合物，或d)將由方法a)制得的化合物、其中的R7為-NH2，與一種諸如溴乙酰溴的羧酸鹵進(jìn)行反應(yīng)得到式I化合物，其中的R2為式V基團(tuán)，R3為鹵素，R4為氫原子，或e)將一種諸如對苯二胺的芳族二胺與一種氨基被保護(hù)起來的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)得到式VII化合物，其中的R7為式V基團(tuán)，R3為-NH2，R4為被保護(hù)的氨基酸，然后按照方法a)進(jìn)行反應(yīng)得到相應(yīng)的式I化合物，或f)除去由方法a)或e)制得的式I化合物的保護(hù)基，或g)使由方法a)-f)制得的化合物、其中的R1為式II基團(tuán)，轉(zhuǎn)化為式I化合物，其中的R1為式III基團(tuán)，或h)將由方法a)-g)制得的式I化合物進(jìn)行分離得到其游離形式，或者可選地在酸根或堿性基的存在下，將其轉(zhuǎn)化為生理學(xué)上可允許的鹽，或i)由于式I化合物具有非對映異構(gòu)體或?qū)τ丑w形式的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將由方法a)-h)制得的式I化合物通過在可選的手性材料上進(jìn)行色譜分析的方法分離為純立體異構(gòu)體，或者，通過使能夠成鹽的式I外消旋化合物與一種光學(xué)活性的堿或酸助劑生成非對映體的鹽，然后對鹽進(jìn)行分步結(jié)晶，分離得到純立體異構(gòu)體，或者，使用光學(xué)活性的酸，如(+)-樟腦-10-磺酸、D-及L-酒石酸、D-及L-乳酸或(+)-及(-)-扁桃酸，將含有諸如氨基的堿基的式I外消旋化合物轉(zhuǎn)化為純對映體。
6.一種藥物組合物，該藥物組合物含有如權(quán)利要求1至4中任一項的式I化合物與一種藥學(xué)上可允許的賦形劑。
7.如權(quán)利要求1至4中任一項的式I化合物的用途，用于制備治療癌癥、炎癥或自體免疫性疾病的藥物組合物。
8.式IV化合物
其中R1為式II或式III基團(tuán)
L為橋連原子，來自a)-O-，b)-NR5-，其中R5為氫原子，c)-O-(CH2)n-CH2-，其中n為1、2或3的整數(shù)，d)-NH-C(O)-CH-(R4)(R3)，其中R3為a)共價鍵或b)-NH-，R4為a)氫原子或b)氨基酸殘基，或e)定義同a)至d)的橋連原子，且具有一個間隔基，其中的間隔基為1)-NH-(CH2)m-S-，其中m為1至12的整數(shù)，X為聚合物或固體。
9.如權(quán)利要求8的式IV化合物的用途，用于從細(xì)胞提取物、血清、血液或滑液中發(fā)現(xiàn)特殊結(jié)合的蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的精制，用于微量滴定盤的校準(zhǔn)或用于色譜原料的制備，尤其是親和色譜法原料的制備。
10.如權(quán)利要求8的式IV化合物在診斷學(xué)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的異噁唑與巴豆酰胺衍生物、它們的制備和作為藥物的用途,以及它們作為抗原在制備抗體中的用途和它們在診斷及精制方法中的用途。
文檔編號G01N33/68GK1189491SQ9810367
公開日1998年8月5日 申請日期1998年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月28日
發(fā)明者S·馬勒納, B·柯什博姆, W·施瓦伯 申請人:赫徹斯特股份公司