專(zhuān)利名稱：用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有抗原或抗體的醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)制品。
旋毛蟲(chóng)病是由旋毛形線蟲(chóng)(Trichinella spiralis，簡(jiǎn)稱旋毛蟲(chóng))引起的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病，是全國(guó)寄生蟲(chóng)病防治“八·五”計(jì)劃和2000年規(guī)劃的防治重點(diǎn)之一；也是食肉衛(wèi)生檢疫的必檢項(xiàng)目之一目前該病的檢驗(yàn)方法主要有以下幾種壓片鏡檢法剪取膈肌(近肝臟的膈肌腳)，重量不少于30～50g，先撕去肌膜，將肉片向兩端擼開(kāi)，對(duì)光用眼觀察，仔細(xì)觀察有無(wú)一種凸出的卵圓形的針尖大小的膨狀物，呈灰白色折光良好的小節(jié)結(jié)，如有，應(yīng)剪取小節(jié)結(jié)壓片，仔細(xì)觀察有無(wú)旋毛蟲(chóng)囊包或幼蟲(chóng)；如無(wú)，則應(yīng)剪取24塊米粒大小肉粒，同上壓片觀察。該方法雖簡(jiǎn)單，但其漏診、誤診率較高，其陰性率只有50％左右，且不易被病人所接受，所以該方法主要用于病死后的尸檢或屠宰后的衛(wèi)生檢疫。
免疫學(xué)方法該方法包括簡(jiǎn)單的血清沉淀試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等，但這些方法都存在著檢驗(yàn)特異性低的明顯不足。
近年來(lái)發(fā)展了膠乳凝集試驗(yàn)(LAT)及酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)等方法。
(1)膠乳凝集試驗(yàn)(latex agglutination test)取2g膈肌加入胃蛋白酶消化2h，離心收集沉淀，超聲處理后取上清液，加膠乳顆粒和抗旋毛蟲(chóng)抗體致敏，然后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)可分玻片法或試管法。玻片法--取30uL待檢液加10uL胺乳液于玻片上，放入振蕩器振蕩孵育5min，最后讀結(jié)果，有膠乳凝塊者為陽(yáng)性。試管法--取100uL待檢液加10uL膠乳液于試管內(nèi)，于室溫下攪拌孵育15min后讀結(jié)果，膠乳濁度下降并在管底有凝塊者為陽(yáng)性。該方法較為簡(jiǎn)單，快速，其檢驗(yàn)靈敏度是壓片法的6倍，但該方法需超聲破碎儀，且不能定量。
(2)酶聯(lián)免疫吸附檢側(cè)(ELISA)試劑盒試劑盒材料包括旋毛蟲(chóng)蚴蟲(chóng)可溶性抗原致敏的PVC載體(ELISA板)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)、TMB顯色底物。其檢驗(yàn)方法為在PVC載體上每孔放0.2mL適當(dāng)稀釋的待檢血清，于37℃下放置5min或25℃下放置10min，棄血清，常規(guī)洗滌8次后加0.2mL適當(dāng)稀釋的ARP-SPA，于37℃下放置5min，常規(guī)洗滌8次，蒸餾水洗滌1次，再加入0.2mL TMB，放置5～10min顯色，結(jié)果如鮮藍(lán)色為陽(yáng)性，基本無(wú)色為陰性，或590nm比色，以P/N≥2.1為陽(yáng)性。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，且可定量測(cè)定，但操作程序繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，需要酶標(biāo)記讀數(shù)。
本發(fā)明的目的旨在提供一種用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑，該試劑采用基因工程產(chǎn)物代替天然抗原，并在膠乳凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)上引入磁性顆粒，將該試劑用于人畜旋毛蟲(chóng)病的診斷，具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果判斷容易、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所說(shuō)的用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑包含試劑1和試劑2，試劑1為膠乳試劑，即旋毛蟲(chóng)體外排泄-分泌抗原P49,P45,P53中的至少一種抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物致敏的膠乳，由克隆于大腸桿菌中的排泄-分泌抗原P49,P45,P53中的至少一種抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物與膠乳(latex)配制而成。膠乳為商品化的各種顏色的膠乳，顆粒直徑最好為0.75～0.90um。其制備方法為1)取0.1～10mg/mL純化后的P49,P45,P53中的至少一種抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物加上1/5～1/20體積的2％～20％的膠乳顆粒，于室溫下振蕩，也可以再經(jīng)超聲處理40～80sec以打破團(tuán)塊。2)加入3～4倍體積的1％～2％carbodiimide，于1～10℃下振蕩，也可以再經(jīng)超聲處理40～60sec 。 3)加乙酸至終濃度0.5～1.5mol/L以終止反應(yīng)。4)用磷酸生理鹽水緩沖液(即PBS)洗滌。5)沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸緩沖液重懸至膠乳濃度為0.01％～1％,1～10℃保存?zhèn)溆谩?br> 試劑2為抗人或家畜免疫球蛋IgG或IgM抗體致敏的磁性顆粒(magnetic beads，又稱磁珠)，其制備方法為1)取磁性顆粒用無(wú)菌水洗滌一次。2)重懸于無(wú)菌水中，加入0.5～1.5倍體積濃度為100～200ug/mL的抗IgG或IgM抗體，于1～10℃下振蕩。3)用磁力裝置收集磁性顆粒。4)依次用磷酸生理鹽水緩沖液、甘氨酸-NaOH和含牛血清白蛋白、吐溫-20及氯化鈉的Tris封閉緩沖液室溫洗滌，再收集磁性顆粒后重懸于含牛血清白蛋白及氯化鈉的Tris貯存緩沖液中，至終濃度為4×104～4×107,1～10℃保存?zhèn)溆谩?br> 將本發(fā)明提供的試劑用于人畜旋毛蟲(chóng)病的檢測(cè)，其檢驗(yàn)步驟如下，取2～20uL試劑1于0.5mL離心管中(或酶標(biāo)板的孔內(nèi))，加2～20uL用甘氨酸緩沖液(即GBS,0.1mol/L甘氨酸，0.9％NaCl(PH8.2)) 1∶10～1∶640稀釋過(guò)的待檢血清，再加2～20uL試劑2及2～20uL的甘氨酸緩沖液，于37℃振蕩5～30min(或室溫下10～90min)，然后置于一磁體上0.5～10min，最后觀察結(jié)果，上清有色者(根據(jù)所用膠乳的顏色)為陰性；上清透明者為陽(yáng)性，也可在一定波長(zhǎng)(根據(jù)所用膠乳的顏色)下讀O.D,P/N≤2.1為陽(yáng)性。
本發(fā)明將基因工程產(chǎn)物用作抗原，代替現(xiàn)有天然抗原制作方法(即裂解蟲(chóng)體或體外培養(yǎng)蟲(chóng)體后收集體外排泄-分泌抗原)，避免天然抗原制備的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，各批次質(zhì)量不均，對(duì)接觸感染性材料的工作人員構(gòu)成威脅等缺點(diǎn)，同時(shí)在膠乳凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)上引入磁性顆粒。用本發(fā)明提供的試劑對(duì)人畜旋毛蟲(chóng)病進(jìn)行檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)便，只要將各種試劑及樣品混合在一起，孵育一定時(shí)間即可，整個(gè)操作時(shí)間不超過(guò)25min，且靈敏度高，結(jié)果判斷容易、準(zhǔn)確，由酶標(biāo)儀讀取O.D值即可定量測(cè)定，另外，將不同顏色的膠乳顆粒分別用不同感染因子的抗原致敏，可由一次檢驗(yàn)而區(qū)分不同感染因子的感染。使用該試劑的檢驗(yàn)方法即可適用于畜牧業(yè)的養(yǎng)殖場(chǎng)或屠宰場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)，也可應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷。
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1，試劑1即膠乳試劑，由旋毛蟲(chóng)體外排泄-分泌抗原P49與膠乳配制而成。其制備方法如下。
膠乳試劑的制備取0.2mg/mL經(jīng)純化后的P49抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物→1/5體積的3％的膠乳顆粒(直徑0.75～0.90um)→室溫振蕩10min→超聲處理80sec以打破團(tuán)塊→3倍體積的1％carbodiimide→2℃振蕩過(guò)夜→加乙酸(PH4.0)至終濃度0.6mol/L以終止反應(yīng)→2℃下用PBS(8.4mmol/L Na2HPO4,1.9mmol/L NaH2PO4,150mmol/L NaCl PH7.2)洗滌，緩慢旋轉(zhuǎn)振蕩→2000rpm離心10min→緩慢吸出上清，沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸緩沖液即(0.1mmol/L glycine,0.9％NaCl,1％BSA)重懸至膠乳濃度為0.01％,2℃保存?zhèn)溆谩?br> 試劑2即磁性顆粒的制備過(guò)程磁性顆粒(4×108粒/mL)→無(wú)菌水洗滌一次→重懸于無(wú)菌水中→加入0.5倍體積200ug/mL的抗IgG抗體→2℃下緩慢振蕩24h→磁力裝置磁性顆?！?.5mL 0.1mol/LPBS(PH8.5)洗滌20min→0.5mL 0.2mol/L甘氨酸-NaOH(50mL0.2mol/L glycine,20mL0.2N NaOH，定容至200mL)室溫緩慢洗滌4h→用0.5mL含牛血清白蛋白、吐溫-20及氯化鈉的Tris封閉緩沖液(0.05mol/L Tris、0.1mol/L NaCl,0.1％BSA，臨用前加入0.1％Tween-20)室溫緩沖洗滌4h→同上收集磁性顆粒后重懸于含牛血清白蛋白及氯化鈉的Tris貯存緩沖液(0.05mol/L Tris,0.1mol/L NaCl，0.1％BSA)中．至終濃度為4×104,2℃?zhèn)溆谩?br> 將上述試劑用于旋毛蟲(chóng)病的診斷，其檢驗(yàn)步驟如下取2uL試劑1于0.5mL離心管中，加2uL用甘氨酸緩沖液1∶10稀釋的待檢血清，再加2uL試劑2和5uL甘氨酸緩沖液，37℃振蕩5min，然后置于一磁性裝置上0.5min后觀察結(jié)果。
實(shí)施例2，試劑1的制備，取10mg/mL經(jīng)純化后的P45(或P49和P53)抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物→1/20體積的15％的膠乳顆粒(直徑0.75～0.90um)→室溫振蕩20min→超聲處理40sec以打破團(tuán)塊→4倍體積的2％carbodiimide→l0℃振蕩過(guò)夜→超聲處理60sec→加乙酸(PH4.0)至終濃度1.5mol/L以終止反應(yīng)→10℃下用PBS(8.4mmol/L Na2HPO4，1.9mmol/L NaH2PO4,150mmol/L NaCl PH7.2)洗滌，緩慢旋轉(zhuǎn)振蕩→6000rpm離心3min→緩慢吸出上清，沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸緩沖液即1％BSA-GBS(0.1mmol/Lglycine,0.9％NaCl,1％BSA)重懸至膠乳濃度為1％, 10℃保存?zhèn)溆谩?br> 試劑2的制備過(guò)程取磁性顆粒(4×108粒/mL)→無(wú)菌水洗滌一次→重懸于無(wú)菌水中→加入1.5倍體積100ug/mL的抗IgM抗體→1℃下緩慢振蕩60h→磁力裝置收集磁性顆?！?0mL 0.1mol/L PBS(PH8.5)洗滌2min→10mL 0.2mol/L甘氨酸-NaOH(50mmL0.2mol/L glycine,20mL 0.2NNaOH，定容至200mL，室溫緩慢洗滌0.5h→用10mL含牛血清白蛋白、吐溫-20及氯化鈉的Tris封閉緩沖液(0.05mol/L Tris,0.1mol/LNaCl,0.1％BSA，臨用前加入0.1％Tween-20)室溫緩慢洗滌0.5h→同上收集磁性顆粒后重懸于含牛血清白蛋白及氯化鈉的Tris貯存緩沖液(0.05mol//L Tris,0.1mol/LNaCl,0.1％BSA)中，至終濃度為4×107,10℃?zhèn)溆脤⑸鲜鲈噭┯糜谛x(chóng)病的診斷，步驟如下取20uL試劑1于酶標(biāo)板的孔內(nèi)，加20uL用GBS 1∶640稀釋的待檢血清，再加20uL試劑2和20uL GBS緩沖液，室溫下振蕩90min，然后置于一磁性裝置上10min，最后觀察結(jié)果。
旋毛蟲(chóng)P49,P45,P53抗原基因的克隆以及其產(chǎn)物的純化已為公知技術(shù)，為了進(jìn)一步實(shí)施本發(fā)明，以下給出其實(shí)例。
1．旋毛蟲(chóng)P49抗原基因的克隆1)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的收集將感染旋毛蟲(chóng)40天左右的小鼠用摘眼球取血法處死后，剝皮除去內(nèi)臟和脂肪，將肌肉切碎，用人工胃液(胃蛋白酶1％，活性1∶3000，鹽酸0.7％)于37℃消化6h。消化后的肉湯用60目的銅篩過(guò)濾除去肉渣，濾液用生理鹽水反復(fù)沉淀洗滌，即可獲得純凈脫囊的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，分裝置液氮中保存?zhèn)溆谩?br> 2)旋毛蟲(chóng)總RNA的提取所用的玻璃器皿、塑料管等用具均用DEPC處理后再高壓消毒，試劑用DEPC處理后的水配置1g旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)加入1mL勻漿液，用玻璃勻漿器勻漿至顯微鏡下看不見(jiàn)完整的蟲(chóng)體或其碎片，室溫靜置5min后加入200mL氯仿，4℃12000rpm離心10min，吸取上清加入、等體積的異丙醇，室溫放置15min,4℃12000rpm離心10min，棄上清，沉淀，用70％的冰乙醇洗滌，室溫晾干沉淀后溶于50uLH2O3)RNA的反轉(zhuǎn)錄及目的基因的擴(kuò)增RNA反轉(zhuǎn)錄按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)特異的反轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物并分別在3’端5’端添加BamHⅠ和EcoRⅠ的位點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄引物為5’GCGAAT TCT GCA GGA TCC AAA CTT TTT TTT TTT TTT T3；PCR上游引物為5’GCG AATTCT GCT ACT GAT GAT ACA GAA TG3’；下游引物為5’GCG AAT TCT GCA GGA TCC AAAC3’。使用的PCR條件為94℃變性5min后加入2.5單位的Taq酶(反應(yīng)總體積為50uL)，94℃ 40sec、58℃ 60sec、72℃ 90sec、35個(gè)循環(huán)。
4)目的基因的克隆及篩選DNA的酶解，回收，連接，細(xì)胞轉(zhuǎn)化以常規(guī)方法進(jìn)行；重組子X(jué)-gal平板篩選及克隆子的質(zhì)粒DNA酶切鑒定按常規(guī)方法進(jìn)行。
2．P49的純化①包涵體蛋白的提取純化1)37℃過(guò)夜培養(yǎng)的二程菌按1∶100接種于1000mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h；2)加入IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)至終濃度0.1mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)7h；3)4℃,3538g離心15min，收集菌體；4)用PBS(磷酸生理鹽水緩沖液)(PH7.2)懸浮菌體，同上離心，棄上清；5)用菌體裂解液懸浮菌體，置于液氮中15min，取出緩慢融化，如此凍融三次；6)超聲破碎菌體，4℃，9829g離心15min 4次，依次用洗液A(蔗糖7％,Tris·HCl(PHH7.2)50mmol/L,EDTA 100mmol/L,NaCl 0.05％，曲拉通X-100 1.0％)、B(蔗糖10％，Tris·HCl(PH7.2)20mmol/L,EDTA 10mmol/L)、C(洗液B-4mol/L脲)懸浮沉淀，最后所得沉淀物即為粗提純化的P49包涵體蛋白；7)洗滌后的包涵體用8mol/L尿素、20mmol/L Tris·HCl溶液、1mmol/L EDTA(PH8.5)懸浮，室溫靜置3h；8)4℃,22116g離心15min，取上清備用②離子交換層析純化變性蛋白1)粗提后的包涵體蛋白溶液，4℃,22116g離心30min，棄沉淀，上清用于柱層析；2)用初始緩沖液平衡Protein-pakTMDEAE-8HR AP-1層析柱(10mm×100mm，Millipore)至基線穩(wěn)定，逐漸增大流速至1.0mL/min；3)將包涵體溶解液經(jīng)上樣孔進(jìn)入柱中，每次0.1mL(約5mg)，在高級(jí)蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上進(jìn)行純化，按MillenniumTM2010人才濟(jì)濟(jì)系統(tǒng)進(jìn)行操作；4)用NaCl連續(xù)濃度梯度(0-1mol/L)洗脫法洗脫蛋白，樣品上樣及洗脫流速均為1.0mL/min，時(shí)間為80min，壓力為382Psi，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；5)分部收集各組分峰，進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)電泳及ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè))檢測(cè)分析，將有活性的組分峰用真空冷凍干燥法濃縮，準(zhǔn)備進(jìn)行下一步純化。
③分子篩純化變性蛋白1)用分子篩層析緩沖液平衡Sephacyral-300層析柱(10mm×200mm)至基線穩(wěn)定，逐漸增大流速至1.0mL/min；2)離子交換層析后的蛋白濃縮液經(jīng)上樣孔進(jìn)入已平衡過(guò)的層析柱中，每次0.1mL(約5mg)，在高級(jí)蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上進(jìn)行純化，按MillenniumTM2010軟件系統(tǒng)進(jìn)行操作；3)樣品上樣及洗脫流速均為1.0mL/min，時(shí)間為40min，壓力為80Psi，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；4)收集目的峰形溶液，用真空冷凍干燥法濃縮，進(jìn)行SDS-PAGE電泳及ELISA檢測(cè)分析后，分裝保存于-20℃，即為純化后的融合蛋白P49。
④融合蛋白P49的復(fù)性1)將1mL純化的融合蛋白P49稀釋20倍，使蛋白濃度低于100ug/mL尿素濃度保持在1mol/L，加入0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽(G-S-S-G)；1mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)，10℃復(fù)性12h；2)將20mL上述溶液裝入透析袋中，于4℃對(duì)250mLTE溶液透析48h，換液3～4次，至尿素完全透析出；3)取出透析袋中的蛋白懸液，4℃,9829g離心10min去沉淀，上清于4℃用聚乙二醇(PEG)6000濃縮20倍，20℃貯存?zhèn)溆?br> 權(quán)利要求
1．用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑及其制備方法，其特征在于所說(shuō)的試劑包含試劑1和試劑2，試劑1為膠乳試劑，由克隆于大腸桿菌中的排泄-分泌抗原P49,P45,P53中的至少一種抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物與膠乳配制而成；其制備方法為1)取0.1～10mg/mL純化后的P49,P45,P53中的至少一種抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物加上1/5～1/20體積的2％～20％的膠乳顆粒，于室溫下振蕩，2)加3～4倍體積的1％～2％的carbodiimide，于1～10℃下振蕩，3)加乙酸至經(jīng)濃度0.5～1.5mol/L以終止反應(yīng)，4)用磷酸生理鹽水緩沖液洗滌，5)沉淀，用牛血清白蛋白甘氯酸緩沖液，重懸至膠乳濃度為0.01％～1％,1～10℃留存?zhèn)溆?；試?為抗人或家畜免疫球蛋白IgG或IgM抗體致敏的磁性顆粒，其制備方法為1)取磁性顆粒用無(wú)菌水洗滌一次，2)重懸于無(wú)菌水中，加入0.5～1.5倍體積濃度為100～200ug/mL的抗IgG或IgM抗體，于1～10℃下振蕩，3)用磁力裝置收集磁性顆粒，4)依次用磷酸生理鹽水緩沖液、甘氨酸-NaOH和含牛血清白蛋白、吐溫-20及氯化鈉的Tris封閉緩沖液室溫洗滌，再收集磁性顆粒后重懸于含牛血清白蛋白及氯化鈉的Tris貯存緩沖液中，至終濃度為4×104～4×107,1～10℃保存?zhèn)溆谩?br> 2．如權(quán)利要求1所述的用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑及其制備方法，其特征在于所說(shuō)的膠乳為商品化的各種顏色的膠乳，顆粒直徑0.75～0.90um。
3．如權(quán)利要求1所述的用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑及其制備方法，其特征在于所說(shuō)的磁性顆粒為4×108beads/mL。
4．如權(quán)利要求1所述的用于人畜旋毛蟲(chóng)病快速診斷的試劑及其制備方法，其特征在于所說(shuō)的試劑1制備方法中經(jīng)笫1)步驟后，再經(jīng)超聲處理40～80sec，或/和經(jīng)第2)步驟后再經(jīng)超聲處理40～60sec。
全文摘要
涉及一種含有抗原或抗體的醫(yī)藥制品,所說(shuō)的試劑包含試劑1和試劑2,試劑1為膠乳試劑,由克隆于大腸桿菌中的排泄－分泌抗原P49,P45,P53抗原中的至少一種抗原基因體外表達(dá)的產(chǎn)物與膠乳配制而成;試劑2為抗人或家畜免疫球蛋白IgG或IgM抗體致敏的磁性顆粒。用本發(fā)明提供的試劑對(duì)人畜旋毛蟲(chóng)病進(jìn)行檢測(cè),其操作簡(jiǎn)便,只要將試劑及樣品混合孵育一定時(shí)間,即可讀出結(jié)果,整個(gè)操作時(shí)間不超過(guò)25min,且靈敏度高,結(jié)果判斷容易、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N33/532GK1231424SQ9810489
公開(kāi)日1999年10月13日 申請(qǐng)日期1998年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月7日
發(fā)明者宋思揚(yáng), 張偉光, 鄭忠輝, 蔡海松, 黃耀堅(jiān), 林新堅(jiān), 蘇文金 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)