專利名稱：同時測定多種被分析物的元件和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種同時測定多種被分析物的元件和裝置。
通常借助于一些特殊方法如酶免疫測定法、高效液相色譜法、氣相色譜法、酶法和比色法對結(jié)構(gòu)各異的被分析物進行分析。這些方法多數(shù)是對一種被分析物采用一種測試方法。
分析方法的自動操作常常集中在分批和隨機選取順序采用獨立的試驗方法對單個試樣進行多項分析的分析裝置上。這就需要采用多包專用的試劑盒。此外，還需要使用各類設備如臨床化學分析設備、HPLC、GCMS、自動免疫測定裝置或原子吸收儀器進行分析。
多種被分析物系統(tǒng)應包括能對一個試樣中的各種被分析物同時進行分析的裝置。上述分析應能鑒別出該試樣中的各種被分析物，并能對每種被分析物給出定量結(jié)果。雖然現(xiàn)在常有聲稱為能分析多種分析物的方法，但卻不能滿足上述兩個要求。
在多種被分析物系統(tǒng)中，常規(guī)的基底含有若干獨立的試驗反應位點，每個位點都具有不同結(jié)合的配體。試樣與各反應區(qū)接觸，然后利用一套檢測技術鑒別所存在的被分析物。重要的是所采用的方法應能對每種不同被分析物進行定量分析。
為了在一個基底上產(chǎn)生生物活性配體的空間上不同區(qū)域的多種被分析物陣列，最常用的是采用光刻處理技術。用一種不耐光的連接劑(linker)涂覆上述基底。理論上，上述連接劑應只在用某一適合波長光照射后才對結(jié)合配體產(chǎn)生反應。通過在基底上放置一種物理掩膜片(通常由鉻制成)而獲得空間分辨率。掩膜片中孔的圖形確定了基底上結(jié)合區(qū)域的圖形。
為了固定每個生物配體，一般擬定的步驟是照射第一位點，與待固定的第一配體一起保溫被照射的基底，洗去松散結(jié)合的配體，保護通過上述照射步驟激活的未反應位點，照射待固定的第二生物配體區(qū)，象處理第一配體那樣順序地重復上述步驟。借助于來自激光器的相干紫外線光源或借助于一些物理掩膜片和非相干光源控制照射的位點可確定空間分辨率。這使固定很多生物配體的工作成為一種費時間的過程。上述光刻處理技術的另外的不足之處是需要昂貴的物理掩膜片或激光器光源。此外，具有高度的非特異結(jié)合。
例如采用芳基疊氮化物、氟代芳基疊氮化物和苯酮伴有高度非特異結(jié)合。高度非特異結(jié)合使測定本底高，明顯減少各種被分析物測定的動態(tài)范圍。這種非特異結(jié)合主要由于通過離子相互作用、Van der Waals力等將分子被動吸附到非活化的不耐光交聯(lián)劑表面上而產(chǎn)生的。
WO-A-9516204文獻披露了一種減少與高度非特異結(jié)合有關的問題的光刻處理方法。在該方法中，上述表面結(jié)合分子是親和素，上述不耐光的分子是光生物素或其衍生物。雖然該方法聲稱減少了非特異結(jié)合，但這種技術仍需按上述順序進行，因而也很費時。若對于每個單一待固定配體基本上都需要經(jīng)歷照射、結(jié)合、保護和洗滌步驟，則固定二十個單獨生物配體共需要80步。
通過被動吸附也能獲得空間分辨率。例如，US-A-5432099中公開了通過離子相互作用，疏水性相互作用和Van der Waals力的結(jié)合將配體結(jié)合在基底表面的內(nèi)容。被動吸附過程與pH值、溫度、離子強度和所采用的基底類型的變化有關，這使結(jié)合過程的控制更困難。這種方法的主要缺點是生物測定的洗滌步驟或保溫步驟期間一定比例的弱固定配體容易被解吸，因此內(nèi)部測定精度和相互間的測定精度差。
在很多公開出版物中采用的交聯(lián)劑是戊二醛。這種交聯(lián)劑有很多缺點，其中包括很可能改變蛋白質(zhì)功能的使蛋白質(zhì)交聯(lián)的傾向。另一缺點是，例如若采用氰基硼氫鈉作為還原劑，上述偶聯(lián)過程將包含既費時又可能非常有害的還原步驟。也曾采用異種雙官能連接劑，但在很多情況下，這些連接劑要求在待結(jié)合的蛋白質(zhì)上有自由的硫氫基。這將迫使蛋白質(zhì)在固定之前進行修飾。
在測定多種被分析物時希望既提供定性結(jié)果又提供定量結(jié)果。例如目前多種被分析物測定已經(jīng)用于抗生素的測定。這些測定主要是根據(jù)微生物抑制測定原理進行的，在上述測定中存在于試樣中的抗生素抑制細菌生長并形成一個與試樣中抗生素濃度成正比的間隙區(qū)。但是，這種方法對識別抗生素不能給出任何提示，或者不能精確測定抗生素的濃度。微生物抑制法也很慢，完成全過程需要數(shù)天。
曾力圖使如高效液相色譜法(HPLC)或氣相/液相色譜質(zhì)譜法(GCMS/LCMS)之類的化學篩選方法適用各組抗生素如青霉素、磺胺類、氨基苷類、四環(huán)素等的結(jié)構(gòu)差異性/極性的極端狀態(tài)。此外，色譜法需要徹底的試樣制備，以便獲得能達到所要求的測量極限的信噪比。
可采用的分析多種被分析物的元件包括Triage[見ClinicalChemistry 38(9):1678-1684(1992)]和Advisor[見Clinical Chemistry39(9):1899-1903(1993)]。這些元件僅適用于定性分析。
Triage元件用于同時從人的尿液中檢測七種濫用藥物。每個元件只能分析一個尿液試樣。在測試過程結(jié)束時，測試人員用肉眼檢查每個藥物特異試驗區(qū)中是否有紅線存在。擬定的所有測試步驟必須由測試者手動完成、也沒有所得試驗結(jié)果的硬拷貝。
Advisor元件與Triage元件的應用類似。Advisor元件可鑒別五種不同類別的濫用藥物。該元件利用凝聚反應測定原理進行操作，對每種藥物采用單獨的通道。擬定的所有測試步驟也由測試者完成。陰性試樣有凝聚顆粒，而陽性藥物試樣提供顆粒的未凝聚圖形。
生物學上應用的大多數(shù)生物傳感器/微型制造元件都采用硅作為基底，另外也有用玻璃或石英作為基底的。硅具有完全可控制的晶體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有準確限定的晶面。硅基底的均勻性使其成為開發(fā)多種被分析物測試元件的理想選擇。
但是象硅這樣的深色基底產(chǎn)生所謂黑體效應。在用熒光檢測的情況中，用特定波長的光激發(fā)熒光團，深色基底可吸收入射的激發(fā)光能，因此減少了來自熒光團的光發(fā)射。
按照本發(fā)明，用于測定多種被分析物的元件包括一個基底和大量離散的反應位點，每個位點支承一個與基底共價結(jié)合的配體，其中所述反應位點之間的基底表面相對于被分析物是惰性的。因此，本發(fā)明提供了一種固態(tài)的多種被分析物的測定元件，這種元件幾乎或根本沒有非特異結(jié)合。
本發(fā)明的元件可以通過激活合適的基底表面并將配體陣列施加到上述表面上的離散位點上而制備。如果需要，可以保護其它活性區(qū)?？梢允股鲜雠潴w在含水系統(tǒng)中施加，若使上述其它區(qū)域成為疏水性的則更好。可以通過連接劑將配體結(jié)合在基底上。具體地說，最好使激活表面順序地與有機硅烷、雙官能連接劑和配體反應。
作為本發(fā)明的一部分，為了在共價固定在微型制造的硅基底或陶瓷基底上的有機硅烷之間提供高效偶聯(lián)化學性質(zhì)，采用了雙官能交聯(lián)劑。因此，可使生物配體固定在多種被分析物的陣列中。
本發(fā)明不需要多種單獨試驗的試劑盒和各類儀器，因此，有利于在一個單個試樣上同時進行多種被分析物測定。本發(fā)明提供了一種單獨一體化的、能同時進行化學的寬范圍測定的分析儀。此外，試驗用試劑可以以用于具體的被分析物組的組合形式提供。
作為本發(fā)明的一部分，借助于在化學激活的基底上的配體微觀流體分配，使若干生物配體以點或線狀空間限定圖形的形式固定。這些生物配體與基底共價結(jié)合。生物配體的偶聯(lián)能力可使化學反應在幾分鐘內(nèi)完成。上述固定過程可以確保生物配體在短期和長期內(nèi)均保持其生物活性。
本發(fā)明還提供一種能同時測定以多種被分析物形式出現(xiàn)的大范圍的被分析物的一體化分析器系統(tǒng)。該系統(tǒng)可給最終使用者帶來極大的方便而且能從每個試樣中鑒別出多種被分析物并給出定量分析。這種優(yōu)選的分析器系統(tǒng)由一個X-Y移動平臺、一個試樣處理單元、液體調(diào)節(jié)/流動控制裝置、一個溫度控制的暗盒、一臺CCD攝相記錄儀和圖象處理軟件組成。上述平臺可與步進電機相連，以便在分析過程的每一階段使定位裝置的定位精度能達到10μm。


圖1示出了不一致的基底表面的形成；圖2示出了基底表面上的基團的化學激活狀況；圖3、5和6示出了配體共價固定在基底表面的狀況；圖4示出了在基底表面使用的膠乳顆粒；
圖7-11示出了用于結(jié)合實現(xiàn)本發(fā)明的基片的元件；圖12-14是適用于本發(fā)明的分析元件的系統(tǒng)示意圖；圖15為由本發(fā)明的裝置測定的被分析物的標定曲線。
用在本發(fā)明的元件中的基底例如可以是硅、石英、玻璃或陶瓷材料的。由于可成功地使用熒光和化學發(fā)光檢測技術，陶瓷基底(氧化鋁)是硅基底的極好的代用品。由于陶瓷材料晶體學不會使其直接選作基底，上述發(fā)現(xiàn)是出人意料的。
可將陶瓷基底加工成具有一定的粒徑(1-30μm)。本發(fā)明中使用的陶瓷基底的優(yōu)選粒徑小于20μm，最好小于10μm。減小粒徑更有利于改進表面均勻度，這反過來又能提高生物測定性能。陶瓷基底的其它重要特性包括表面構(gòu)形公差、空隙率、真空度和不吸水。
優(yōu)選的陶瓷材料含94％的、粒徑范圍在4-8μm的氧化鋁(Al2O3)。這種材料具有真空氣密性，研磨后表面不平度為0.6-0.8μm。通過拋光處理可改善其表面均勻度，以使表面變化為0.4-0.5μm。通過磨光和拋光可進一步改善表面的均勻度，使表面變化性在0.05-0.1μm的范圍。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，某些陶瓷基底的性能與粒徑的特性有關。最大粒徑為8μm(例如粒徑為4-8μm)的陶瓷材料具有優(yōu)良測定性能，較大粒徑的材料則不太滿意。相對于4-8μm基底得到的結(jié)果，評估了粒徑約為1μm的陶瓷基底，沒有得到改善的結(jié)果。由于顆粒非常小的陶瓷其材料費用將大大提高(接近5倍)，所以采用上述粒徑是非常有利的。
用厚度精確的氧化膜(例如厚100nm的氧化膜公差為±2nm)可制成適合的硅基底。上述氧化膜厚度可為50-500nm，優(yōu)選小于200nm，最好在100nm的范圍。
上述基底可以構(gòu)成固態(tài)微型制造的微型機械元件的一部分，這種元件用于獸醫(yī)和臨床診斷應用的廣泛的評審試驗。每個固態(tài)試驗元件都有一系列反應區(qū)。對于一種單獨的被分析物各反應區(qū)是特定的。上述反應區(qū)可以為點狀、溝道狀、小凹狀，凹坑狀、井道狀或腔室狀。通過將生物分子固定在基底上可制得上述反應區(qū)。
通常，本發(fā)明元件的面積最大達1cm2。每個反應位點的面積常常小于1mm2。
最好將固態(tài)基底制成具有點、腔室、溝、井道、小凹等的交錯網(wǎng)絡。在溝或井道內(nèi)形成柱狀物也是很有利的。這種凹凸不平的結(jié)構(gòu)有利于使結(jié)合的生物配體和試劑之間相互作用的表面面積最大，并能大大縮短在競爭免疫測定法和夾層免疫測定法等中的保溫期。
作為比如說硅或陶瓷基底上的小凹或溝的一種可供選擇的情況或附加情況，其表面可微型制造成腔室/儲器/溝道混合的毫微升和微升的結(jié)合。例如，首先使硅表面氧化形成氧化層。然后沉積一層光刻膠層，從該層形成所需圖形。在上述氧化層上形成圖形后，除去上述光刻膠層，再用例如HF蝕刻硅并除去氧化膜。最后，使氧化膜均勻地生長在整個硅片上。
圖1示出了所說明的過程。在步驟(ⅰ)中，使硅片1氧化，以形成氧化層2；在步驟(ⅱ)中，沉積光刻膠層3；在步驟(ⅲ)中，利用光形成具有圖案的氧化層；在步驟(ⅳ)中，除去光刻膠；在步驟(ⅴ)中，蝕刻片1；在步驟(ⅵ)中，除去氧化膜；在步驟(ⅶ)中再形成連續(xù)的氧化膜2a。
最好使生物配體共價固定?？梢圆捎帽粍游较嗷プ饔?，但被動吸附易受pH值、溫度和離子強度變化的影響，在某些情況下，在保溫步驟和洗滌步驟期間可能釋放弱結(jié)合的配體，從而使測定重復性差。當然希望在固定過程之后，生物配體保持最大的活性。
在任何化學激活之前，應清潔基底表面。上述第一步最好包括在堿性去污劑中通過聲處理清潔表面，接著再用雙倍去離子水徹底清洗。然后用鉻酸溶液對基底進行處理。如圖2所示，鉻酸溶液既能進一步清潔表面又能打開表面環(huán)氧化物基團。當然也可以用其它方式例如進行1小時聲處理打開環(huán)氧化物基團。
這樣形成的表面羥基可供衍生。例如，如圖3所示，反應順序包括采用有機硅烷，然后再用(雜)雙官能交聯(lián)劑Z-R-Y，以形成高活性中間物，最后采用官能配位體，產(chǎn)生共價固定。
更詳細地說，在式(RO)3Si-(CH2)n-X的有機硅烷中，每個R是一個如CH3或CH2CH3之類的烷基或烴基；n是一個整數(shù)，如1至18；X是官能團，如環(huán)氧環(huán)己基，NH2,CHO,OH,SH，對氯芐基，間氯芐基，Br,Cl,-NH-CH2-CH2-NH2,2,3-環(huán)氧丙氧基，-N=C=O,-N=C=S或?qū)β然酋；交?。可選擇這些有機硅烷以提供一種能與生物分子形成共價鍵的反應性端基，或一種反應性較差的部分(如NH2，這時必須進一步用雙官能交聯(lián)劑活化以提供一種合適的端基)。由于可以通過生物配體上的親核基團使生物配體共價固定，所以具有末端親電子官能團的有機硅烷不必用雙官能交聯(lián)劑激活。
在具有親核基團的有機硅烷的情況中，可以采用多種雙官能交聯(lián)劑中的任一種，以提供一種生物分子或配體可通過它共價結(jié)合的很有反應性的化學基團。本發(fā)明包括利用雙官能連接劑，這些連接劑能用于批量生產(chǎn)化學活化基底且足夠穩(wěn)定，因而在生物分子或結(jié)合配體的共價結(jié)合之前可長期保存。最好連接劑在正常大氣情況下不起反應，而在很短的時間內(nèi)(通常＜10分鐘)又能與待固定的生物配體官能團充分反應形成共價鍵。
上述雙官能連接劑例如可以是碳酰氯，二氯硫化碳，N,N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，亞二甲苯基二胺，1,6-二氨基己烷，1,12-二氨基十二烷，1,6-二異氰酸基己烷，1,12-二異氰酸基十二烷，1,4-亞苯基二硫代異氰酸酯、氰尿酰氯，對苯二甲醛，對硝基苯甲酰氯，磺胺酸、對甲苯磺酸2-氟甲基吡啶鎓，3-氨基苯基硼酸，對溴苯基硼酸，焦碳酸二乙酯，氯甲酸乙酯，對溴苯胺，對溴苯基酰肼，對溴苯甲醛，對溴苯甲醛的1,2-亞乙基二醇，N,N’-羰基二咪唑，對苯二甲酰氯，表氯醇，1,4-二碘苯，1,4-二溴苯或例如對氨基苯甲酸、對溴苯基甲酸、對溴苯基乙酸、對溴乙基苯甲酸、對溴甲基苯甲酸、對甲酰苯甲酸、對羥甲基苯甲酸的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物，對甲酰苯甲酸、對溴苯基丙酸或?qū)αu苯基丙酸的1,2-亞乙基二醇。可以用不耐光的交聯(lián)劑與具有親核或親電子基團的有機硅烷反應。上述交聯(lián)劑例如是對疊氮苯甲酸或?qū)Π被酵腘-羥基琥珀酰亞胺。
作為一種替換或使用雙官能連接劑之外，共價固定一層膠乳顆粒也是很有利的。上述膠乳顆粒的直徑優(yōu)選小于500nm，最好小于150nm。上述膠乳顆粒可以具有一些功能團，如-CH2Cl,-CHO,對氯苯基，對氯苯乙烯基，-N=NH,-NH-NH2或NH2?？梢栽诩s0.5％至1％w/v的濃度下與由合適的有機硅烷改性的基底一起在有或沒有如上所述的雙官能連接劑的條件下保溫上述膠乳顆粒。
圖4示出了固定膠乳的兩種反應示意圖。兩者中任一種反應之后可以是用第二種連接劑激活膠乳并固定生物分子，或者比方說，直接共價固定抗體。
使用聚苯乙烯膠乳顆粒的替換方式是將生物配體共價固定在已與硅烷化基底(Silanated substrate)結(jié)合的聚乙二醇衍生物上。例如，將具有兩種親電子基團(如環(huán)氧或羰基咪唑)的PEG衍生物與具有-NH2端基的硅烷(如APTES)在挑選的基底上進行反應。一種合適的反應順序如圖5所示。
直接將生物配體共價固定在硅烷層上也是很有利的，這樣就不需要用聚合材料或雙官能連接劑激活硅烷。所述有機硅烷應該易受化學基團(如NH2,SH,OH或NH=NH2)的親核攻擊。適用于直接結(jié)合生物配體的有機硅烷可以具有鹵化物，環(huán)氧、異氰酸基、醛或甲苯磺酸酯官能團。這類反應如圖6所示，其中E是有機硅烷上的親電子基團。E的例子是Br,Cl,-O-CH2-CH=CH2,-NCO,-CHO和對氯磺酰苯基。
由于缺少使有機硅烷的甲氧基或乙氧基起反學反應的親核基團，在硅烷化過程中具有親電子基團(如縮水甘油氧基(glycidoxy))的有機硅烷還有不易受聚合作用的影響的優(yōu)點。因此，基底表面不應當含聚合的有機硅烷。
借助于在表面化學官能團和以空間上有利的位置存在于待固定的生物分子上的合適化學基團之間形成共價鍵的快速動力學，上述表面的化學性能可提供一種獲得空間分辨率的途徑。通過微量流動分配器以單獨液滴或形成線狀的一串液滴的形式使生物分子最好出現(xiàn)在基底的表面。被分配的體積在1至100nl的量級，最好低于50nl，例如接近10nl。在表面上蒸發(fā)上述被分配的液滴或線狀液滴之前，形成共價鍵的速度可在數(shù)分鐘內(nèi)實現(xiàn)共價固定。被供給的液滴或線狀液體的位置精度公差應為±20μm。
尤其是如果在水中施加配體，還希望表面是疏水性的，以防止被分配的液滴或液線橫向擴散。這種性質(zhì)可提供極好的點質(zhì)量和再現(xiàn)性，并能在每單位表面面積有較多的待共價固定的生物分子點。
本發(fā)明可克服傳統(tǒng)光刻法所存在的缺陷，通過能形成生物配體的空間上不同的點，不需要紫外光或物理掩膜片。如上所指出的那樣，借助于微量分配技術可得到空間分辨率。共價偶聯(lián)反應的快速動力學是一個重要的因素，以便確保在空間上不同區(qū)內(nèi)高效偶聯(lián)生物配體，消除被固定的生物配體橫向離開。
然后，例如用本領域普通技術人員公知的保護分子可保護基底上未進行反應的化學部分。這類合適的分子包括如酪蛋白，牛血清清蛋白，乳清蛋白等蛋白質(zhì)，或如甘氨酸，谷氨酰胺等低分子量的保護劑。
還可以采用不耐光的連接劑。例如用不耐光的連接劑(如二苯酮，芳基疊氮化物等)在黑暗中與基底表面上的有機硅烷進行反應。然后，如果需要可用生物配體在表面標出點位置，再用紫外線短時間照射或用可見光長時間照射而實現(xiàn)共價結(jié)合。在有紫外線或可見光的情況下，用類似于上面所描述的分子的保護劑保護基底表面的其它區(qū)域。
例如通過在糖溶液(如海藻糖)中短期(1小時)保溫，然后在37℃下干燥16小時，可使基底已固定的生物分子穩(wěn)定。然后將穩(wěn)定處理的基底密封在裝有干燥劑的箔袋中并貯存。將其存放在+2℃至+8℃下時，在6個月或12個月以上(如長達并超過二年)上述被固定的生物分子都是穩(wěn)定的。
可將上述元件安裝在具有控制試劑混合效率的特點的多種不同承載部件內(nèi)。通過毛細吸力，離心力、負壓力或電滲流可使液態(tài)試劑流動。利用電滲流可以不需用閥門，因此不用活動的機械部件。
通過將玻璃片與微型制造的表面結(jié)合可形成閉合的溝道。在與玻璃片結(jié)合之前將生物分子共價固定在上述表面上。一些結(jié)合工藝(如陽極結(jié)合)將使溫度升高，從而可能破壞生物分子。因此，結(jié)合工藝應不使被固定的生物分子變性。一種合適的方法是間接結(jié)合，如通過合適的膠粘劑(如環(huán)氧膠粘劑)將上述晶片與玻璃片結(jié)合。
可將上述元件放在合適的承載部件中，圖7和8示出了不同的承載部件。作為例子，圖8示出的元件的尺寸為48.62mm×48.62mm，它包括一些內(nèi)徑為10mm、外徑為12.82mm的井道。井道中心到中心的距離為15.36mm。
上述元件可具有增強試劑、試樣等混合的特點。圖9中所示的元件包括試劑加入部位11，試劑溝道12和試驗反應位點13。
圖10中的元件包括試劑貯存部分2l、供給導管22、試劑供給溝道試驗部位23和排除物貯存部分24。圖11示出了具有類似部分的四溝道試驗結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明提供一種用于對分子量在很廣范圍、結(jié)構(gòu)各異且極性的多種被分析物同時進行定量測定的完全成一體的系統(tǒng)。所得到的被分析物組適于臨床/獸醫(yī)診斷或藥物篩選。
根據(jù)被分析物選擇結(jié)合配體，這是本領域普通技術人員所熟知的。合適的被分析物包括抗生素，如四環(huán)素、磺胺類、離子載體類(ionophores)、氨基苷類、青霉素或氟喹諾酮類(fluoro quinolones)；激素，如黃體化激素(LH)，催乳激素(PL)，促卵泡激素(FSH)，或促甲狀腺激素(TSH)；心臟損傷的標記，如肌紅蛋白、碳酸酐酶、肌鈣蛋白I，糖原磷酸化酶BB,CK-MB，脂肪酸結(jié)合蛋白或肌鈣蛋白T；傳染病的標記；過敏反應標記；濫用藥物；酶；病毒；
核苷酸；和肽。
例如，一組是用于檢測磺胺類抗生素。本發(fā)明提供了用于同時定量鑒定比如說多達20種磺胺的方法。其它例子包括心臟病、傳染病和受孕組。
本發(fā)明可以同時測定比如說多達二十種結(jié)構(gòu)上沒有相似性的被分析物?？蓽y試的試樣基質(zhì)包括血清、血漿、尿液、膽汁、糞便、組織、水和食料。試樣的體積要求很小，通常＜1.5μl/被分析物。上述試劑如酶標記抗體、酶標記半抗原、熒光標記抗體或熒光標記半抗原可以全部盛放在一個單一的試劑容器中，可明顯降低處理液體的要求。
在對例如黃體化激素、促卵泡激素、催乳激素、促甲狀腺激素等的夾層測定中，將上述試樣與測定緩沖劑一同加入并進行短時間保溫，通常保溫時間少于30分鐘，最好少于10分鐘。緊接著是洗滌步驟，加入標記的測定抗體的混合物并再保溫一段時間。這段時間通常也短于30分鐘，最好短于10分鐘。然后對元件進行洗滌，以便除去任何未結(jié)合的標記物并量化上述信號。
對某些測定來說，為了除去潛在的干擾物如類風濕因子的干擾在微型制造的元件中采取某種手段是有利的。例如在試樣與反應區(qū)接觸之前通過將試樣與固定的免疫球蛋白的區(qū)域結(jié)合可以除去類風濕因子。
另一例子是HAMA(人抗小鼠抗體)干擾，這類抗體在利用單克隆小鼠抗體的測定性能方面可引起嚴重問題。為了消除這些問題，傳統(tǒng)的辦法是在試劑中加入昂貴的添加劑。在本發(fā)明中，具有通過使試樣與微型制造的元件上的一些區(qū)域接觸而除去HAMA干擾的優(yōu)點，從而可在試樣達到反應區(qū)之前除這些抗體。
通常，可使配體覆蓋元件的部分，它們能結(jié)合污染物。這對于在元件表面(如溝道中)限定地散布的情形是很重要的。這種去除干擾成分的能力可提高試驗結(jié)果的精度。
也可使上述測定標記固定在枝狀物分子表面。事實上，上述枝狀物分子是聚合的，由小結(jié)構(gòu)分子反復偶聯(lián)而合成。它們可從AldrichChemicals購得，其分子量在一定范圍并對端官能基團有所選擇，如選擇NH2或COOH。然后與傳統(tǒng)的偶聯(lián)化學方法一起采用雜雙官能連接劑制備測定標記綴合物。對于小的半抗原分子(如β-興奮劑，促蛋白合成甾類或抗生素)，最好使小的枝狀物(最好不大于16個表面基團)與大的枝狀物(通常大于64個表面基團)偶聯(lián)。上述小分子量半抗原(小于1000道爾頓)與小枝狀物上的化學基團偶聯(lián)，隨后是測定標記物的共價結(jié)合?？梢酝ㄟ^透析和凝膠滲透色譜法對枝狀物綴合物進行純化。
適用于特定試驗組的試劑含有多種組分(例如酶標記抗體、熒光標記抗體、膠乳固定抗體、枝狀物抗體-熒光團綴合物、枝狀物抗體-熒光團綴合物、枝狀物抗體-酶綴合物、酶標記半抗原、熒光標記半抗原等)?？赡艿脑囼灲M是很不同的，可以根據(jù)臨床診斷(或獸醫(yī)診斷)選擇合適的組。例如需要用于檢查傳染性疾病(如肝類、HIV、梅素等)的組。其它組包括孕激素(fertility hormones)、心臟標記、過敏反應蛋白等。除臨床參數(shù)外，還可以測定藥物殘余物的大組。
本發(fā)明可以辨別如抗生素之類的各種成分。例如，通常在數(shù)分鐘的時間范圍內(nèi)在表面面積為1cm2的元件上可同時定量分析多達20種抗生素，其靈敏度超過HPLC/GCMS方法，并可與傳統(tǒng)的單參數(shù)酶免疫測定法相比。這種方法可以簡單地擴展用于促蛋白合成甾類、β-興奮劑，β-保護劑、殺蟲劑、治療用藥物等。
為了進行分析，化學發(fā)光、生物發(fā)光或熒光也是適合的。檢測系統(tǒng)最好裝有一臺電荷耦合元件(CCD)攝相記錄儀以便測量熒光和化學發(fā)光。簡單地說，上述CCD攝相記錄儀收集從微型制造的元件上的試驗區(qū)域發(fā)出的光信號，并將上述光信號轉(zhuǎn)變成相對光單位(RLUs)。
采用用于標記的熒光團的濾光器可以直接察看以熒光為基礎的檢測系統(tǒng)。
合適的化學發(fā)光試劑是在波長為433-445nm的條件下可進行分析的魯米諾。用1,2-dioxetane借助于測定堿性磷酸酶標記的生物分子也可觀察到化學發(fā)光。
為了方便地測定被分析物，本發(fā)明最好利用采用了CCD的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)。為了在由化學發(fā)光反應發(fā)出的上述光波波長(在魯米諾的情況下約433-445nm)條件下改進俘獲效率，最好是一臺背照式攝相記錄儀(back-illuminated camera)。
整個系統(tǒng)可以由個人計算機操作，特殊設計的程序控制X-Y平臺、分配器單元、試樣處理、溫度控制、保溫時間和CCD攝相記錄儀。圖12-14示出了這種系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。
圖12示意地示出了具有兩個控制單元31、32的個人計算機(PC)的相互配合情況。單元31與用標號33代表的CCD成像系統(tǒng)相連。單元32與分別用標號34和35代表的分配器單元和帶有試樣盤的X-Y移動平臺相連。
圖13示意地示出了X-Y移動平臺，該圖示出了一個裝在線性致動器42上的試樣平臺41。X-Y移動在分別與驅(qū)動機構(gòu)45、46相連的步進電機43、44的控制下。上述移動由“原位”傳感器47、48限制。
標記生物分子和某些未標記生物分子對光的敏感性要求在沒有光的條件下進行測定。通過形成不透光的方式實現(xiàn)無光條件。最好對不透光的環(huán)境進行溫度控制，例如控制在溫度變化±0.2℃或優(yōu)選±0.1℃的范圍，以確保滿意的測定準確度和精度。
圖14示出了裝置的透視圖、局部平面圖和剖切的側(cè)視圖。具體地說，圖14A示出了試劑存貯容器51、不透光的門52和帶有可取下的罩54的攝相記錄儀機身53。攝相記錄儀的主要部件可放在上述殼體的外部。攝相記錄儀的鏡頭放在殼體上的孔中。
圖14B示出了處于試樣盤55上的試樣輪廓，概括地示出了廢料區(qū)56和成像區(qū)57。攝相記錄儀53裝于這些區(qū)域的上方。圖14C除容器51、照相記錄儀53、X-Y平臺41和步進電機43之外，還示出了分配器泵58。
圖14示出的系統(tǒng)是根據(jù)在任何時候都能固定20個3×3的試樣固定底架而設計的。這意味著如果在每1cm2的微型制造元件上有20個獨立反應區(qū)，在一個試樣上可同時完成總數(shù)為3600個分析。也可選擇同時分析180個試樣的20個不同試驗參數(shù)。
如上所述，可以對被分析物進行標記。也可對配體進行標記，這樣可通過部分占有率進行分析。
下面的實例舉例說明了本發(fā)明。
例1磺胺類測定在該例中，通過接觸的相互作用將12種抗體共價結(jié)合固定在具有化學改性表面的平陶瓷(氧化鋁)基底的離散區(qū)，所有每種抗體對單獨的一種磺胺是特異的。利用競爭性免疫測定方式完成成多種被分析物的測定。
更詳細地說，用堿性去污劑(RBS35,5％v/v)接著再用兩倍去離子水對陶瓷基底(1cm×1cm)進行超聲清洗，然后再放入6M HCl中達16小時。再把上述片放入超聲槽中的鉻酸中達1小時。
用雙倍去離子水和丙酮對基底進行徹底清洗，然后將上述基底放入爐中在120℃條件下干燥兩小時。經(jīng)這種預處理后，用有機硅烷Y-縮水甘油氧基三甲氧基硅烷(10％V/V)在無水甲苯、4-二甲氨基吡啶(1.25g/L)和三乙胺(1％V/V)中使上述基底硅烷化。使這種混合物回流四小時，然后在室溫下放置過夜?；自?20℃下固化四小時之前，用甲苯和丙酮對該基底進行洗滌。
固化步驟之后，將上述基底存放于容器中并貯存在室溫下，直到需要標出磺胺類抗體的點位置為止。用BIODOT XY3000分配器標出磺胺抗體的點位置。被測定的十二種磺胺是周效磺胺、磺胺甲噻二唑、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧嗪、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺地索辛和磺胺嘧啶。
對于每種磺胺抗體采用的分配體積約為20nl。在1cm2的基底上形成12個離散區(qū)的12種磺胺抗體在37℃下保溫2小時。用含有2％酪蛋白(w/v)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.2)清洗基底，并在+2-8℃下放在同樣的緩沖劑中保護過夜。用含PEG300(0.05％v/v)的PBS清洗以后，將元件放在承載部件上。
將多種磺胺標樣(200μl)和磺胺辣根過氧化物酶綴合物的混合物(100μl)加入合適的元件上的反應井道中，并在室溫下保溫15分鐘。對于上述12種磺胺的每一種，上述標樣包括5、10、50和100ng/ml。
用PBS/PEG緩沖液清洗多種磺胺元件以除去過量的試劑，并將300μl化學發(fā)光基質(zhì)[魯米諾(1.4mM)/尿素過氧化氫(9.6mM)]引入每個元件。用曝光時間長達4分鐘的CCD照相記錄儀使上述元件成像。對12種磺胺的每一種均可獲得標準曲線。圖15中的曲線分別表示12種磺胺中每一種的校準曲線。繪制在Y軸上的％B/Bo值代表由每種磺胺標樣(作為1og10繪制在X軸上)引起的零標樣RLU(相對光單位)值的抑制％。
例2激素測定在本例中，對三種大分子量激素(即催乳激素(PL)、促卵泡激素(FSH)和黃體化激素(LH))進行多種被分析物的測定。該例顯示出用于夾層基礎免疫測定(Sandwich-based immunoassay)的多種分析物測定。在同一組中測定上述三種激素時，看不出明顯的交叉反應性。
化學預處理和硅烷化過程完全如例1中所描述的那樣。在經(jīng)化學改性的基底的離散區(qū)域上固定PL、FSH或LH單克隆抗體(被分配的抗體約20nl)。在具有如例1所述的環(huán)氧化物表面的硅基底和陶瓷基底兩者上均進行多種分析物的測定。
在測定中，將150μl多LH/PL/FSH血清基標樣和150μl稀釋測定緩沖劑加入上述元件中，并在室溫下保溫15分鐘。清洗步驟之后，將300μlLH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO綴合物的單綴合物混合物加入并保溫15分鐘。然后再對元件進行洗滌，以除去過量的試劑，并將化學發(fā)光試劑[魯米諾(1.4mM)/尿素過氧化氫(9.6mM)]引入。用曝光時間長達4分鐘的CCD攝相記錄儀使上述元件成像。對圖像進行處理后，對每種激素繪制出標準曲線。
例3磺胺測定與例1相反，用微型溝道進行多種磺胺測定。元件如圖11所示。在該例中，試劑加入容器21為2mm×2mm、300μm深(體積1.2μl)，溝道23各為5mm長、200μm寬和100μm深(體積100nl)，容器24為1.9mm×8.6mm,300μm深(體積4.9μl)。
如例1所述對表面進行化學改性。將抗體加入各溝道中并在37℃下保溫2小時。然后象例1一樣對基底進行保護和洗滌。將多種磺胺標樣(200μl)和磺胺辣根過氧化物酶綴合物(100μl)混合。將所得到的試劑1μl吸移到上述各容器中，以供給用于每種磺胺的抗體涂覆的溝道。合適的試樣含所有磺胺類10或100ng/ml。
借助于毛細作用可使試劑流動。保溫2分鐘后，用PBS/PEG對基底清洗5次，并加入化學發(fā)光試劑[魯米諾(1.4mM)/尿素過氧化氫(9.6mM)]。
用曝光時間長達4分鐘的CCD攝相記錄儀使上述元件成像。表1給出了四種磺胺曲線的％B/Bo值。
表1
通過生物分子在不耐光(用二苯酮處理過的)基底上的非特異吸附的程度證實了與光刻法相比本發(fā)明的效用。
其結(jié)果列在表2中。
表2
利用通過CCD照相記錄儀檢測的化學發(fā)光、利用抗小鼠HRPO綴合物檢測小鼠IgG。當在沒有光的情況下進行反應時，具有固定的二苯酮不耐光連接劑的硅或陶瓷基底應當不結(jié)合小鼠IgG。因為在紫外光下進行小鼠IgG結(jié)合時獲得的灰度均值RLU的約80％是由于被動結(jié)合相互作用，因此出現(xiàn)非特異性結(jié)合。事實證明，按照本發(fā)明，通過共價相互作用固定的一系列生物分子更加特殊。
下面討論的例子提供了共價結(jié)合的證據(jù)。在第一種情況中，用APTES對陶瓷基底進行硅烷化，然后與生物素-LC-磺基NHS進行反應。對照陶瓷基底不被APTES硅烷化，因此不形成與生物素衍生物的琥珀酰亞胺基酯反應的親核-NH2端基。然后使上述基底與抗生物素蛋白-FITC綴合物反應，通過CCD攝相記錄儀測定熒光。其結(jié)果列在表3中。
表3
NS=沒有檢測到熒光信號這清楚地證實了生物素-LC-NHS的特異固定化。由于500μg/ml基底的RLU結(jié)果沒有增加，被固定的生物素-LC-NHS的最高濃度約為100μg/ml。
在另一例中，使由APTES硅烷化的陶瓷基底與二酰肼連接劑反應。用高碘酸鈉處理磺胺抗體，以使它們對酰肼連接劑活化。用乙酸鈉緩沖劑pH5.5簡單透析對照磺胺抗體。RLU結(jié)果列在表4(未處理)和表5(用高碘酸鹽法處理)中。這些結(jié)果清楚地表明酰肼連接劑成功地與陶瓷表面結(jié)合。與共價固定磺胺抗體相比，上述對照抗體(不用高碘酸鹽活化)的標準曲線很差。
由于共價或被動相互作用的結(jié)合％列在表6和7中。共價相互作用平均來說占總體結(jié)合的81.8％，這清楚地指示出磺胺抗體的共價結(jié)合。
表4
表5
表6
<p>表7
共價固定直接定位在縮水甘油氧基硅烷表面上。
被動固定直接定位在二氯二甲基硅烷反應表面上。
顯然，共價法結(jié)果優(yōu)于被動法。借助于磺胺抗體的酸預處理，被動法的結(jié)果可以提高約2倍，但仍然劣于共價法。
還利用X射線光子光譜學(XPS)在化學改性的硅和陶瓷基底上進行確證分析。從每個基底試樣的兩個任選的表面化學成分已確定的區(qū)域記錄所測量的光譜，其結(jié)果見表8(給出原子％)。
表8<
原子組成結(jié)果表明具有APTES有機硅烷的母體硅和陶瓷基底的非常好的轉(zhuǎn)換性，對每個試樣的兩個試驗區(qū)都顯示出表面組成的良好的再現(xiàn)性。上述FITC標記的基底表明硅和陶瓷的標記分別為70％和77％。
將在深色硅基底上熒光測量的定量法與在白色陶瓷(氧化鋁)基底上的熒光測量定量法進行比較。將上述由CCD測量到的共價結(jié)合到各基底上的熒光分子(FITC)的RLU結(jié)果與用Hook等人的方法(Langmuir 1991 Vol.7,142-151)除去FITC分子之后的定量方法進行比較。
表9
通過從基底除去FITC標記并由CCD照相記錄儀測量信號而獲得的熒光標記的定量分析表明，盡管陶瓷的信號增加超過硅1000倍，實際上在硅基底上存在有多得多的FITC分子。
表10的結(jié)果反映出這種現(xiàn)象的另一實例，該結(jié)果是用熒光膠乳顆粒與催乳激素測定抗體結(jié)合作為檢測系統(tǒng)在硅和陶瓷基底上進行催乳激素測定而得出的。給出RLU值(曝光時間20秒)。
表10
用這種熒光測定方法，測定結(jié)果表明陶瓷性能優(yōu)于硅。此外，通過采用化學發(fā)光作為測定方法可解決用熒光在硅上的黑體效應問題。用化學發(fā)光測定對在硅和陶瓷上進行的FSH相同測定進行比較，前者需要的曝光時間比在陶瓷上獲得相同的RLU值所需的時間長兩倍。
在本說明書中，所使用的縮寫說明如下APTES=氨丙基三乙氧基硅烷；CK-MB=肌酸激酶MB亞基；HRPO=辣根過氧化物酶LC-磺基-NHS=長鏈磺基-N-羥基琥珀酰亞胺；FITC=異硫甲氨酸熒光素。
權利要求
1．一種用于對多種被分析物進行測定的固態(tài)元件，它包括一個基底和許多離散的反應位點，每個位點支承一個與基底共價結(jié)合的配體，其中在上述反應位點之間的基底表面相對于被分析物是惰性的。
2．如權利要求1所述的元件，其中基底的表面是不一致的，從而從配體-被分析物相互作用中可獲得增強的信號。
3．如權利要求2所述的元件，該元件包括一系列反應溝道、隆起、柱狀物、點狀物、腔室、小凹、井道或凹坑。
4．如上述任一項權利要求所述的元件，其中所述基底材料是陶瓷、玻璃、石英或硅。
5．如上述任一項權利要求所述的元件，該元件的面積小于1cm2。
6．如上述任一項權利要求所述的元件，其中各反應位點的面積小于1mm2。
7．如上述任一項權利要求所述的元件，該元件可通過對基底表面進行活化并在表面上的一些離散區(qū)域上施加一系列配體的方法而獲得。
8．如權利要求7所述的元件，其中所述方法還包括對其它活性區(qū)域進行保護。
9．如權利要求7或8所述的元件，其中所述方法包括使所述其它區(qū)域成為疏水性的，并且配體是在水中施加的。
10．如權利要求7至9中任一項所述的元件，其中加入配體包括使被活化的表面與有機硅烷接觸的初始步驟。
11．如權利要求10所述的元件，其中所述有機硅烷具有式(RO)3Si-(CH2)n-X，式中每個R是烴基，n是整數(shù)，X是官能團。
12．如權利要求10或11所述的元件，其中所述方法包括使用能促進生物配體與有機硅烷共價結(jié)合的雙官能交聯(lián)劑。
13．如權利要求10至12中任一項所述的元件，其中用不耐光的交聯(lián)劑與具有親核或親電子端基的有機硅烷反應。
14．如權利要求1至8中任一項所述的元件，該元件可通過在用大分子如聚苯乙烯膠乳顆粒、枝狀物或含有能促進配體共價結(jié)合的化學基團的聚乙二醇衍生的表面上固定配體來獲得。
15．如上述任一項權利要求所述的元件，該元件還包括結(jié)合那些干擾測定被分析物的材料的配體。
16．將上述任一項權利要求所述的元件用于測定多種被分析物。
17．如權利要求16所述的應用，該應用包括觀察與被分析物結(jié)合和/或未結(jié)合的位點陣列，并使上述信息與配體發(fā)生聯(lián)系。
18．如權利要求16或17所述的應用，該應用包括用適于從化學發(fā)光光反應中測定光線的背照式電荷耦合元件(CCD)成象，被測定光的波長小于450nm。
19．如權利要求16至18中任一項所述的應用，其中所述被分析物從抗生素、激素、心臟損傷的標記、傳染病標記、過敏反應標記、濫用藥物、酶、病毒、核苷核和肽中選取。
20．如權利要求16至19中任一項所述的應用，其中所述被分析物處于全血、血清、血漿、尿液、糞便、膽汁、組織或食料的試樣中。
21．一種分析多種被分析物的系統(tǒng)，它包括如權利要求1至15中任一項所述的元件，一個移動平臺、一個試樣處理系統(tǒng)、一個液體試劑輸送系統(tǒng)、一個溫度控制的暗盒、一個CCD攝相記錄儀和圖像處理裝置。
全文摘要
一種用于測定多種被分析物的固態(tài)元件,它包括一個基底和許多離散的反應位點,每個位點支承一個與基底共價結(jié)合的配體,其中在上述反應位點之間的基底表面相對于被分析物是惰性的。通過激活基底表面并將一系列配體施加到上述表面上的離散區(qū)的方法可以獲得這種元件。
文檔編號G01N33/74GK1215167SQ9811525
公開日1999年4月28日 申請日期1998年4月21日 優(yōu)先權日1997年4月21日
發(fā)明者S·P·菲茨格拉德, J·V·拉蒙特, R·I·麥克康耐爾, E·O·本齊克 申請人:蘭道克斯實驗有限公司