專利名稱：胺羥酰氯色譜衍生試劑及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高靈敏度液相色譜衍生試劑胺羥酰氯及其制備工藝，該種衍生試劑化學(xué)名稱為2-硝基-4-(2-鄰苯二甲酰基)苯甲酰氯，適用于胺基、羥基及氨基酸類化合物的液相色譜柱前衍生紫外及熒光檢測(cè)。
液相色譜技術(shù)已成為科研和技術(shù)鑒定部門廣泛使用的一種手段，通?？梢匝b配紫外可見、示差折光、熒光、電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器。但迄今為止，還沒有一種通用型高靈敏度的檢測(cè)器能完成所有各類物質(zhì)的定性定量任務(wù)。為了使在這些檢測(cè)器上響應(yīng)很小的化合物也能被檢測(cè)出來(lái)，近年來(lái)發(fā)展了多種衍生化方法。使帶有氨基(-NH2)、羥基(-OH)、羰基(＞C=O)和羧基(-COOH)的化合物及氨基酸，通過(guò)與各類帶有發(fā)色基團(tuán)的衍生化試劑相反應(yīng)，生成的有紫外或熒光吸收的衍生化產(chǎn)物，就能用現(xiàn)有的這幾種高靈敏度檢測(cè)器檢測(cè)。除此之外，通過(guò)被測(cè)化合物能否與特定的衍生化試劑相反應(yīng)，也有利于鑒別這些化合物的結(jié)構(gòu)。因此，液相色譜中的衍生化方法得到了廣泛的應(yīng)用，新的衍生化試劑不斷出現(xiàn)。
2,4-二硝基氟苯(UV350nm)適用于仲胺的衍生，對(duì)硝基苯甲酰氯(UV254nm)適用于伯胺及仲胺的衍生，茚三酮(VS570nm)適用于氨基酸的衍生，這些衍生試劑屬于紫外可見類衍生試劑，一般來(lái)講不及熒光類衍生試劑靈敏度高。常見的熒光類衍生試劑有鄰苯二甲醛、熒光胺、丹酰氯、芴代甲氧基酰氯、吡多醛、丹酰肼和4-溴甲基-7-甲氧基香豆素。鄰苯二甲醛反應(yīng)溫度低、時(shí)間短，對(duì)伯胺和氨基酸的檢測(cè)限可達(dá)10-12～10-15，但在反應(yīng)中需加入硫醇作輔助試劑，并且對(duì)羥基化合物不響應(yīng)。丹酰氯是另一種應(yīng)用最廣泛的熒光衍生試劑，適用于氨基酸、胺類及酚類化合物反應(yīng)的檢測(cè)，但其保存期較短。
本發(fā)明以鄰苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸為主要原料，分兩步合成胺羥酰氯。胺羥酰氯為無(wú)色細(xì)針狀晶體，分子量316，分子式C15H9N2O4Cl，結(jié)構(gòu)式
胺羥酰氯屬于酰氯類化合物，對(duì)于胺基、羥基及氨基酸類化合物具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性。在胺羥酰氯分子中存在著22中心25電子的大分子共軛體系，有利于吸收紫外光并發(fā)射出熒光。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胺羥酰氯對(duì)于300nm紫外光有強(qiáng)吸收特征，并可產(chǎn)生強(qiáng)熒光。當(dāng)與被檢測(cè)物衍生后，由于分子結(jié)構(gòu)的增大，其紫外吸收波長(zhǎng)將產(chǎn)生不同程度的紅移。
丹酰氯是一種常用的衍生試劑，適用于氨基酸及酚類化合物的痕量檢測(cè)，但其同伯胺和仲胺的反應(yīng)速度較慢，并且其為液體保存期較短。與丹酰氯相比，胺羥酰氯不僅適用于氨基酸、胺類及酚類化合物的痕量檢測(cè)，而且其反應(yīng)活性和檢測(cè)靈敏度均大于丹酰氯。胺羥酰氯為固體試劑，在室溫干燥條件下可保存3年以上。
本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容在于1在磁力攪拌條件下，鄰苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸在乙醚介質(zhì)中縮合成2-硝基-4-(2-鄰苯二甲?；?苯甲酸。該操作在室溫溫避光環(huán)境中進(jìn)行，并以金屬鈉作為脫水劑和抗氧化劑。
2將上述所得的2-硝基-4-(2-鄰苯二甲?；?苯甲酸風(fēng)干，以氯仿作介質(zhì)攪拌成懸濁液，加熱至沸騰，以亞硫酰氯進(jìn)行酰氯化?；仞s30分鐘，得胺羥酰氯粗品。
3以氯仿洗滌除去墨綠色雜質(zhì)，活性炭吸附橙色雜質(zhì)，以苯作溶劑進(jìn)行重結(jié)晶得無(wú)色細(xì)針狀晶體。合成產(chǎn)率41.5％，產(chǎn)品于干燥器中密封保存。
合成實(shí)例在500ml棕色試劑瓶中，依次加入500ml乙醚(瓶中空氣少，可減輕氧化副反應(yīng))、6.8g 2-硝基-4-氨基苯甲酸，金屬鈉三粒和直徑3mm長(zhǎng)2cm的鐵棒，磁力攪拌至全部溶解，加入鄰苯二甲醛5.0g，加蓋密封。20℃條件下，避光攪拌1h。過(guò)濾，從濾液中回收乙醚，濾渣風(fēng)干，輕壓得白色粉末。
將上述所得白色粉末置于250ml磨口錐形瓶中，加入鐵磁針，數(shù)粒碎瓷片及氯仿200ml，磁力攪拌成懸濁液，加熱至沸騰，回餾，滴加亞硫酰氯20ml?；仞s30分鐘。反應(yīng)的顏色將由暗黃色，經(jīng)紫、深藍(lán)變?yōu)榫G棕色。將回餾裝置改為蒸餾裝置，蒸出氯仿回收。小心蒸餾至溶液粘稠，自然冷卻，得胺羥酰氯粗品。
將粗產(chǎn)品用氯仿洗滌3次(每次10ml)，至晶體呈現(xiàn)淡紫色，加入100ml苯，加熱溶解，調(diào)整苯用量至晶體剛好溶解，加入活性炭1g，微沸5min，用4G砂芯漏斗趁熱抽濾(可提前在烘箱中預(yù)熱砂芯漏斗)，得淺黃色溶液，稍冷后即有沉淀析出。加熱溶解沉淀，調(diào)整苯用量至沉淀剛好溶解，自然冷卻至室溫則有晶體析出。抽出母液，進(jìn)行重結(jié)晶，可得無(wú)色細(xì)針狀晶體4.9g。合成產(chǎn)率41.5％，將產(chǎn)品于干燥器中密封保存。
應(yīng)用實(shí)例之一尿液中痕量多胺的檢測(cè)多胺一般指腐胺、精瞇和精胺，它不僅是重要的代謝調(diào)控物，而且與腫瘤關(guān)系極為密切。
取尿液50μL，加入250μL胺羥酰氯乙腈溶液(5×10-3mol/L),50μL碳酸氫鈉(0.25mol/L)溶液，于室溫下振搖1分鐘進(jìn)行衍生反應(yīng)，取8μL溶液進(jìn)行高效液相色譜分析。以乙腈/水(54/46,v/v)為流動(dòng)相，流量設(shè)定0.8ml/min，選定熒光激發(fā)波長(zhǎng)300nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，上述衍生產(chǎn)物可在島津LC-10A高效液相色譜儀上得到良好分離。在0.4-80ng范圍內(nèi)有良好的定量線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.2ng/g。
應(yīng)用實(shí)例之二土壤中痕量阿特拉津的檢測(cè)阿特拉津?qū)儆谌侯惢衔铮m用于玉米田間除草，1958年申請(qǐng)瑞士專利，1959年投入商業(yè)生產(chǎn)，從九十年代起，該除草劑在中國(guó)得到廣泛應(yīng)用。今年來(lái)發(fā)現(xiàn)阿特拉津可使倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞染色體破裂，已被列為可能的人類致癌物。因此，土壤中阿特拉津的殘留分析受到人們關(guān)注。
取土壤樣品100.00克(40目)，加入甲醇100mL，超聲波震蕩10分鐘，抽濾，濃縮萃取液至1mL，加入胺羥酰氯乙腈液(5×10-3mol/L)1mL，振搖20分鐘，取10μL進(jìn)樣分析。以甲醇/水(80/20,v/v)為流動(dòng)相，流量設(shè)定0.8ml/min，選定熒光激發(fā)波長(zhǎng)312nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，上述衍生產(chǎn)物可在島津LC-10A高效液相色譜儀上得到良好分離。在0.12-100ng范圍內(nèi)有良好的定量線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.0ng/g。
應(yīng)用實(shí)例之三水體中苯酚及鹵代酚的檢測(cè)苯酚及鹵代酚廣泛地應(yīng)用于酚醛樹脂、農(nóng)藥、塑料、染料、殺菌劑等化工產(chǎn)品的生產(chǎn)。進(jìn)入環(huán)境量不斷增加。因其具有生物毒性、降解速度慢及水體中出現(xiàn)概率大等特點(diǎn)而被列在優(yōu)先控制污染物“黑名單”中。
將水樣用G4#沙芯漏斗及0.45μm濾膜過(guò)濾。取50μL過(guò)濾后水樣，加入250μL胺羥酰氯乙腈溶液(5×10-3mol/L)，振搖1分鐘，隨后加入50μL碳酸氫鈉溶液(0.25mol/L)，振搖2分鐘，取10μL進(jìn)樣分析。以乙腈/水(71/29,v/v)為流動(dòng)相，流量設(shè)定1.0ml/min，選定熒光激發(fā)波長(zhǎng)310nm，發(fā)射波長(zhǎng)410nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，苯酚、鄰氯酚、間氯酚、2,4-二氯酚、2,4,5-三氯酚及五氯酚六種衍生產(chǎn)物可在島津LC-10A高效液相色譜儀上得到良好分離。在2.0-120pg范圍內(nèi)有良好的定量線性關(guān)系，檢測(cè)限為15pg/g。
應(yīng)用實(shí)例四茶葉中苯甲醇及水楊醇的檢測(cè)苯甲醇及水楊醇是不僅可用作香料中的調(diào)香劑，而且還是很好的定香劑。茶葉中苯甲醇及水楊醇含量的多少可作為其質(zhì)量判別的標(biāo)準(zhǔn)之一。
將茶葉研細(xì)，過(guò)40目篩，取1.000克，加5.0mL乙腈，超聲波震蕩15分鐘，離心分離。取離心清液1.0mL，加入1.0mL胺羥酰氯乙腈溶液(5×10-3mol/L)，振搖5分鐘，取10μL進(jìn)樣分析。以乙腈/水(49/51,v/v)為流動(dòng)相，流量設(shè)定1.0ml/min，選定紫外吸收波長(zhǎng)300nm，使用ODS柱(12.5×0.46)，苯甲醇及水楊醇的衍生產(chǎn)物可在島津LC-10A高效液相色譜儀上得到良好分離。在0.5-110ng范圍內(nèi)有良好的定量線性關(guān)系，檢測(cè)限為2.0ng/g。
除上述樣品中的被檢測(cè)物外，胺羥酰氯還可用于亞硝胺、脂肪胺、芳香胺、脂肪醇、芳香醇及多種氨基酸的衍生檢測(cè)。
綜上所述，本發(fā)明所制備的胺羥酰氯試劑，已具有優(yōu)良的反應(yīng)活性和檢測(cè)靈敏度，適用于胺基、羥基及氨基酸類化合物的液相色譜柱前衍生紫外及熒光檢測(cè)，而且制備工藝簡(jiǎn)便，產(chǎn)品易于保存。
權(quán)利要求
1 一種高靈敏度紫外、熒光檢測(cè)液相色譜衍生化試劑—胺羥酰氯及其制備工藝。其特征在于，胺羥酰氯的化學(xué)名稱為2-硝基-4-(2-鄰苯二甲?；?苯甲酰氯，無(wú)色細(xì)針狀晶體，分子量316，分子式C15H9N2O4Cl。結(jié)構(gòu)式
胺羥酰氯的制備工藝包括第一步，鄰苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸縮合成2-硝基-4-(2-鄰苯二甲?；?苯甲酸；第二步，以亞硫酰氯進(jìn)行酰氯化得粗產(chǎn)品；第三步，經(jīng)分離提純得到無(wú)色細(xì)針狀胺羥酰氯產(chǎn)品。
2 按照權(quán)利要求1所述的制備工藝，在第一步鄰苯二甲醛和2-硝基-4-氨基苯甲酸縮合成2-硝基-4-(2-鄰苯二甲酰基)苯甲酸的反應(yīng)中，反應(yīng)條件為乙醚作反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度20℃，反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)，避光、攪拌，并以金屬鈉作為吸水劑和抗氧劑。
3 按照權(quán)利要求1所述的制備工藝，在第二步以亞硫酰氯進(jìn)行酰氯化的反應(yīng)中，以氯仿作介質(zhì)，亞硫酰氯逐滴加入并回餾30分鐘。
4 按照權(quán)利要求1所述的制備工藝，在第三步分離提純工藝中，先用氯仿洗滌，再用活性炭脫色，最后用苯重結(jié)晶。
5 按照權(quán)利1～4所述制備的胺羥酰氯試劑用于痕量胺基、羥基及氨基酸類化合物的液相色譜柱前衍生紫外及熒光檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高靈敏度紫外及熒光檢測(cè)液相色譜衍生化試劑－胺羥酰氯及其制備工藝。胺羥酰氯化學(xué)名稱為2－硝基－4－(2－鄰苯二甲?；?苯甲酰氯。本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是如何用簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的工藝條件來(lái)制備反應(yīng)活性好、檢測(cè)靈敏度高、易于保存的酰氯類色譜衍生試劑。本發(fā)明的主要工藝技術(shù)特征在于:在乙醚介質(zhì)中,鄰苯二甲醛和2－硝基－4－氨基苯甲酸縮合成2－硝基－4－(2－鄰苯二甲?；?苯甲酸。然后,在氯仿介質(zhì)中以亞硫酰氯進(jìn)行酰氯化得粗品。經(jīng)分離提純最終得到無(wú)色細(xì)針狀產(chǎn)品,合成產(chǎn)率41.5%。該衍生試劑在室溫干燥條件下可保存3年以上,廣泛適用于痕量胺基、羥基及氨基酸類化合物的液相色譜衍生化紫外和熒光檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1210262SQ9811777
公開日1999年3月10日 申請(qǐng)日期1998年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月18日
發(fā)明者葉常明, 弓愛君 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心