專利名稱：檢測睪酮用的酶免疫分析測試盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是用酶免疫分析方法檢測睪酮含量用的測試盒。更具體講是一種采用第二抗體包被的方式檢測睪酮用的酶免疫分析測試盒。
睪酮是廣泛存在于人和動物體內(nèi)的一種類固醇類激素，準(zhǔn)確檢測其在生物體內(nèi)的含量，在判定其生殖性能、正常生理指數(shù)及病理濃度而用于疾病的診治、計(jì)劃生育、動物的繁殖與育種等方面都有重要的作用；在監(jiān)測食品，特別是動物食品中這種激素的含量，保障食品衛(wèi)生與人類健康方面也有重要的意義和作用。目前對睪酮激素檢測所采用的，仍多是自60年代發(fā)展起來的放射免疫分析法。由于其必須使用放射性標(biāo)記物，檢測設(shè)備復(fù)雜，必需用專門的放射性探測器對檢測結(jié)果進(jìn)行測定。同時(shí)，對操作人員也存在有放射性污染與傷害，需要特殊的防護(hù)和去污設(shè)備。此外，因所使用放射性標(biāo)記物的放射性核素時(shí)刻都在發(fā)生衰變，特別是如常用的碘-125，碘-131和磷-32等半衰期短的核素，其保存時(shí)期不長，也給使用帶來了不便。因此，用酶免疫法取代放射性免疫法進(jìn)行檢測是發(fā)展方向。目前對類固醇激素檢測所建立和使用的酶免疫分析方法，多是首先用抗該激素的抗體，即所謂的第一抗體對所用酶免疫滴定板的板孔進(jìn)行包被，然后向板孔中加入酶標(biāo)激素、標(biāo)準(zhǔn)激素或待測樣品等進(jìn)行免疫反應(yīng)。由于經(jīng)若干小時(shí)的包被和清洗后，實(shí)際被吸附和固定在各孔孔壁的該第一抗體的分子數(shù)量常存在有較明顯的差異，實(shí)測其變異系數(shù)約為5％～20％會直接影響測定的精密度(即重現(xiàn)性)。此外，其測定本底的吸光率數(shù)值常較高，約為0.10～0.20，對測定的準(zhǔn)確度或可信度也有影響。因此，B.S.Prakash與H.H.Meyer等人在J.Steroid Biochem.VoL.28,No.6,623-7,1987等文獻(xiàn)中已有采用第二抗體包板進(jìn)行的酶免疫檢測方法的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是針對上述情況，提供一種采用以第二抗體包板的方式檢測睪酮用的酶免疫分析測試盒，使其具有更高的精密度、靈敏度和穩(wěn)定性，以及能有更好的特異性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明檢測睪酮用的酶免疫分析測試盒，由免疫反應(yīng)滴定孔板和檢測試劑兩部分組成。其中的免疫反應(yīng)滴定板可采用每板48孔或96孔等酶免疫分析測試中所通用的PVC等各種形式的滴定板。檢測試劑包括作為第二抗體的羊抗兔免疫球蛋白G、作為第一抗體的抗睪酮抗體、酶標(biāo)睪酮、標(biāo)準(zhǔn)睪酮、顯色用的底物液、終止液及分析緩沖液等試劑。檢測試劑的具體組成為a)羊抗兔免疫球蛋白G凍干品，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解(可于4℃至-20℃溫度條件下保存)，b)抗睪酮抗體凍干品，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解(可于4℃至-20℃溫度條件下保存)，c)酶標(biāo)睪酮用辣根過氧化物酶標(biāo)記的睪酮-羧甲基肟的凍干品，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解(可于4℃至-20℃溫度條件下保存)，d)標(biāo)準(zhǔn)睪酮，e)底物液由顯色劑與含量為0.004％的過氧化氫溶液共同組成，f)終止液濃度為4M的硫酸，g)分析緩沖液由40mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉與0.14M氯化鈉和0.1％牛血清白蛋白(BSA)組成，pH7.2.
上述的磷酸鹽緩沖液由40mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉和0.14M的氯化鈉組成，pH7.2。
檢測試劑中作為第二抗體的羊抗兔免疫球蛋白G可以為山羊抗兔免疫球蛋白G，或是綿羊抗兔免疫球蛋白G，可用目前的常規(guī)方法自行制備，如將正常家兔血漿中制取的IgG以多次免疫注射入成年的山羊或綿羊體內(nèi)，4個(gè)月后收集山羊或綿羊的血清，用常用免疫吸附劑(如兔IgG-瓊脂醣凝膠-CL-6B等)純化制得，凍干保存于-20℃?zhèn)溆?，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解。此外，也可選用市購的該免疫球蛋白G成品。提高所用的該羊抗兔免疫球蛋白G第二抗體的純度，有利于保證和提高測試的效果。
檢測試劑中所用的抗睪酮抗體可以采用常規(guī)方法自行制備，如，用蛋白縮合劑碳化二亞胺將牛血清白蛋白(BSA)與睪酮-3-羧甲基肟連接制成抗原，對家兔進(jìn)行免疫，經(jīng)7個(gè)月后即可獲得特異性強(qiáng)的抗血清，凍于低溫保存，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解。此外，也可以采用市購的成品。提高所用抗睪酮抗體的滴度可以提高檢測的特異性與準(zhǔn)確性。試驗(yàn)表明，檢測試劑中所用的抗睪酮抗體使用時(shí)的工作濃度以在1∶54000以上為宜。
檢測試劑中所說的酶標(biāo)睪酮，可以采用常規(guī)用辣根過氧化物酶對睪酮-3-羧甲基肟進(jìn)行標(biāo)記的方式。例如，可以采用常規(guī)的DEAE-瓊脂醣凝膠純化8毫克辣根過氧化物酶，取收集液中峰值部分，加入300微升二甲替甲酰胺；另將3毫克睪酮-3-羧甲基肟溶于300微升二甲替甲酰胺中，加入3微升甲基嗎啉，冷卻至-15℃，再加入3微升氯甲酸異丁酯，與酶液混合，在-15℃攪拌1小時(shí)，0℃2～3小時(shí)，然后在蒸餾水中透析15小時(shí)以上，用葡聚糖凝膠G-25層析純化，凍干保存于低溫，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解。
檢測試劑中底物液中所說的顯色劑，可以為酶免疫分析中常用的各種顯色劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，其中以采用在0.05M磷酸鹽-檸檬酸組成的pH5.0的緩沖液中含量為0.01％(重量％)的四甲基聯(lián)苯胺的效果為佳。
由于本發(fā)明檢測藥盒使用時(shí)采用的是以第二抗體對免疫反應(yīng)滴定孔板進(jìn)行包被，因此，所說的免疫反應(yīng)滴定孔板既可以在臨用時(shí)才用該第二抗體進(jìn)行包被，也可以由生產(chǎn)者預(yù)先對該滴定孔板用所說的該第二抗體進(jìn)行了包被處理后再與試劑組成藥盒提供給用戶使用。
本發(fā)明檢測藥盒的使用操作程序建議可按下述方式進(jìn)行1)將用適當(dāng)磷酸鹽緩沖液溶解的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)與濃度為50mM碳酸氫鈉，pH9.6的常規(guī)包被緩沖液混勻，按約1～1.2微克IgG/孔的量注入滴定板的各孔，0℃-4℃孵育過夜；棄去孔內(nèi)液體，按250微升/孔加入分析緩沖液，室溫孵育40～50分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，保存于0℃或-20℃，即為已用第二抗體包被的滴定板，保存?zhèn)溆谩?br> 2)將上述已包被了第二抗體的滴定板可按300微升/孔的量用0.05％吐溫(Tween)-80洗液洗板孔兩次。
3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，將以所說的分析緩沖液按所需梯度稀釋的睪酮標(biāo)準(zhǔn)液50微升，酶標(biāo)睪酮50微升和抗睪酮抗體50微升先后加入各板孔，在0℃-4℃條件下孵育2～3小時(shí)或過夜。
檢測時(shí)，以同樣用分析緩沖液稀釋的待測樣品溶液50微升替換上述制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的睪酮標(biāo)準(zhǔn)液，其余操作方法和要求均與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相同。
4)棄去孔內(nèi)液體，用上述洗液洗孔4次，可按常規(guī)方式以150微升/孔的量加入底物液(臨用前將0.004％的過氧化氫液加入顯色劑)，室溫下閉光放置30～40分鐘。
5)按常規(guī)方式向每孔加入終止液50微升，用酶免疫測定儀在450nm處測定各孔的吸光率，計(jì)算測定結(jié)果。
以本發(fā)明上述檢測藥盒按上述程序進(jìn)行測定所用的時(shí)同較短，一批測定一般在3～4小時(shí)內(nèi)即可完成。
如前述，由于在目前用第一抗體包板的酶免疫分析法中，固定在各板孔壁的抗體分子數(shù)量差異的變異系數(shù)可達(dá)5％-20％，是影響測量精密度的一個(gè)重要因素。而在本發(fā)明的檢測藥盒中采用的是以1～1.2微克/孔過量的羊抗兔IgG第二抗體包板，其結(jié)合位點(diǎn)大大超過第一抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。即使各孔中被吸附、固定的第二抗體分子有一定的差異，也影響不大。在以后向各孔加入第一抗體抗睪酮抗體時(shí)，經(jīng)過一定的孵育時(shí)間，一般都能與已被固定于孔壁上的第二抗體發(fā)生反應(yīng)而被結(jié)合、固定在孔壁上。因此只要操作時(shí)向各孔中加入的第一抗體溶液的體積相同，在孔壁上被固定的第一抗體的分子數(shù)量就基本相同，各孔間的差異大大減小，實(shí)測表明其變異系數(shù)一般均＜3％，從而能顯著提高測定的精密度。與此同時(shí)，對睪酮抗體的用量也只需以第一抗體包板方法用量的4％～25％，大大節(jié)約了這一珍貴的試劑。
經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明上述檢測藥盒在用于睪酮含量測定時(shí)的方法學(xué)鑒定數(shù)據(jù)可以達(dá)到如下的指標(biāo)和水平靈敏度-最小可測量1pg/孔；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可為0～40pg/孔，并可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。比目前直接以第一抗體包板的酶免疫分析法一般在5-40pg/孔范圍的最小可測量值的測量靈敏度高5～40倍；比最小可測量值為10-50pg/孔的放射免疫分析法高出10～50倍。
特異性——與不同類固醇激素的交叉反應(yīng)率為睪酮100％，雄酮0.1％，孕酮、孕烯醇酮、雌酮、雌二醇、雌三醇及皮質(zhì)酮均＜0.1％。
精密度——測定的批內(nèi)變異系數(shù)為6.8％(n=8)，批間變異系數(shù)為9.5(n=8)，均符合公認(rèn)的免疫測定標(biāo)準(zhǔn)，表明本發(fā)明藥盒在檢測試驗(yàn)中可具有很好的重復(fù)性。
準(zhǔn)確性——向血清中添加標(biāo)準(zhǔn)睪酮后的回收率為98％～110％。
此外，由于本發(fā)明藥盒中采用了過量的第二抗體包板，并又有分析緩沖液中的牛血清白蛋白(BSA)液的封閉，使其本底測定數(shù)值可均在0.08以下的水平，明顯優(yōu)于目前以第一抗體包板的酶免疫分析法0.10～0.20的測定本底。
試驗(yàn)表明，實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明測試盒對人或各種動物的血、尿、糞等樣品中的睪酮激素進(jìn)行測定時(shí)，只需取極少量(0.1～10微升)的樣品即可進(jìn)行，對被檢測的人或動物體的健康毫無損害。因此，在提高疾病診斷、開展計(jì)劃生育、動物繁殖與育種等方面的質(zhì)量與水平，以及保障食品衛(wèi)生與人類健康上都有著積極的意義。
權(quán)利要求
1．檢測睪酮用的酶免疫分析測試盒，由免疫反應(yīng)滴定孔板和包括抗睪酮抗體、酶標(biāo)睪酮、標(biāo)準(zhǔn)睪酮、顯色用的底物液、終止液及分析緩沖液在內(nèi)的檢測試劑共同構(gòu)成，其特征在于檢測試劑中還有由羊抗兔免疫球蛋白G構(gòu)成的第二抗體，檢測試劑的具體組成為a)羊抗兔免疫球蛋白G凍干品，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解，b)抗睪酮抗體凍干品，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解，c)酶標(biāo)睪酮用辣根過氧化物酶標(biāo)記的睪酮-羧甲基肟的凍干品，使用前可用磷酸鹽緩沖液溶解，d)標(biāo)準(zhǔn)睪酮，e)底物液由顯色劑與含量為0.004％的過氧化氫溶液共同組成，f)終止液濃度為4M的硫酸，g)分析緩沖液由40mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉與0.14M氯化鈉和0.1％牛血清白蛋白組成，pH7.2，上述的磷酸鹽緩沖液由40mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉和0.14M的氯化鈉組成，pH7.2。
2．如權(quán)利要求1所述的酶免疫分析測試盒，其特征在于所說的羊抗兔免疫球蛋白G為山羊抗兔免疫球蛋白G。
3．如權(quán)利要求1所述的酶免疫分析測試盒，其特征在于所說的羊抗兔免疫球蛋白G為綿羊抗兔免疫球蛋白G。
4．如權(quán)利要求1至4之一所述的酶免疫分析測試盒，其特征在于所說的檢測試劑中所用的抗睪酮抗體使用時(shí)的工作濃度在1∶54000以上。
5．如權(quán)利要求1至4之一所述的酶免疫分析測試盒，其特征在于所說的底物液中的顯色劑為在由0.05M磷酸鹽-檸檬酸組成的pH5.0的緩沖液中含量為0.01％(重量％)的四甲基聯(lián)苯胺。
6．如權(quán)利要求1至4之一所述的酶免疫分析測試盒，其特征在于所說的免疫反應(yīng)滴定孔板的板孔中預(yù)先用所說的羊抗兔免疫球蛋白G第二抗體包被。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測睪酮用的酶免疫分析測試盒，由免疫反應(yīng)滴定孔板和由羊抗兔免疫球蛋白G構(gòu)成的第二抗體、抗睪酮抗體、酶標(biāo)睪酮、標(biāo)準(zhǔn)睪酮、顯色用的底物液、終止液和分析緩沖液組成的檢測試劑共同構(gòu)成。
文檔編號G01N33/64GK1227350SQ98121838
公開日1999年9月1日 申請日期1998年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月10日
發(fā)明者郭大智 申請人:郭大智