專利名稱:真菌檢測的制作方法
本發(fā)明涉及動物和人體組織及體液中真菌和藻菌的檢測方法，含適用于該法的螢光增白劑的制劑，和實施該方法的試驗箱。
準(zhǔn)確診斷動物和人體感染的原因，在選擇合適的治療方法時至關(guān)重要。對于可靠的診斷來說，最好的方法是從臨床標(biāo)本中分離出感染的病原細(xì)菌，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。不過，由于分離復(fù)雜，加上鑒定又常常不確切，這樣一種理想情形很少能實現(xiàn)。即使是真菌感染的試驗性診斷，也需要對組織標(biāo)本或體液進(jìn)行全面檢查，例如使用一系列選擇性地識別某些真菌抗原的不同抗體的血清學(xué)試驗。
現(xiàn)在，對快速和可靠的診斷已有了廣泛和迫切的要求，以便能夠取代復(fù)雜而又費時的血清學(xué)試驗，或者至少使它們局限在下述情況，即必須提供引起感染的真菌的屬的準(zhǔn)確信息。例如手述過程中對一些組織物的檢查，用于分析真菌引起的排出物的婦科化驗標(biāo)本的檢查，在可疑性皮真菌病例中皮科化驗標(biāo)本的檢查，兒科化驗標(biāo)本物料和來自新生兒及粘膜上患有一般感染和可疑性霉菌病的虛弱兒童的其它待檢物質(zhì)的檢查，例如兒童中白血病性貧血和其它腫瘤疾患中念珠菌引起的口腔和咽粘膜及食管和氣管粘膜鵝口瘡的檢查?？焖僭\斷對內(nèi)科、腫瘤科，外科臨床中檢查來自可疑性高幾率的真菌感染病人的組織物質(zhì)也是重要的，例如，在識別愛茲病人的病例中，特別是識別食管炎和支氣管炎型的念珠菌病;在用細(xì)胞抑制劑治療腫瘤疾患的病例和使用抗菌素和/或免疫抑制劑治療的病例的檢查中;以及在可疑性霉菌病例特別是念珠菌病;在粘膜鵝口瘡;在老年醫(yī)學(xué)中，當(dāng)檢查抵抗力低下引起的皮膚和/或粘膜擴(kuò)散性霉菌病的病人時，和藻菌引起可疑性的皮膚及器官感染的病例，例如Protothecosis，也是重要的。
在家蓄和愛蓄的治療中，真菌病的診斷也是重要的，例如在研究牛乳腺炎和狗、觀賞鳥類、稀有珍貴動物的真菌病時。在實驗動物中，例如用人工誘發(fā)的真菌感染的小鼠和大鼠以試驗潛在的抗真菌治療劑時，簡單而又可靠的鑒定真菌的方法也是重要的。
本發(fā)明現(xiàn)在提供了這樣一個對真菌感染的快速而又可靠的診斷。本發(fā)明涉及到檢測真菌和藻類的方法，該法的特征在于，動物或人體組織或體液用至少含有四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽處理，并用螢光顯微鏡檢查。
螢光增白劑是無色或輕度有色的有機(jī)化合物，吸收紫外光，例如吸收波長為340nm至400nm的紫外光，并以可見光例如波長為400nm至440nm的可見光的形式再次釋放吸收的能量。好的螢光增白劑可用高的量子產(chǎn)額來鑒識。螢光增白劑屬于，例如二苯乙烯類、香豆素類和喹諾酮類化合物、1，3-二苯基-2-吡唑啉類、萘二甲酰亞胺類，或苯并惡唑基化合物，或其它芳香雜環(huán)取代的芳香化合物或乙烯化合物，而且總是具有共軛的電子體系。
本發(fā)明中的螢光增白劑屬于取代的二苯乙烯類，并含有至少四個，例如四至六個磺基。這些磺基為螢光增白劑帶來了好的水溶度。至少含有四個磺基的該螢光增白劑及其鹽的制備方法是已知的，并在例如綜述和專著中比如“Fluorescent Whitening Agents”(editors R.Anliker and G.Muller，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1975)中已有描述。
含至少四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑的例子是通式(Ⅰ)和(Ⅱ)的化合物
在(Ⅰ)中R1代表至少含有一個磺基的芳香的或芳香雜環(huán)取代基，例如取代的苯基、吡啶基或三唑基，例如磺基取代的4-苯基-1，2，3-三唑-2-基;或代表被至少含有一個磺基的芳基或芳香雜環(huán)基取代的氨基，例如取代的三嗪基氨基，比如至少含一個磺基的2，4-二取代的1，3，5-三嗪基-6-氨基;而且兩個R1基可以相同或不同;
在通式(Ⅱ)中，A代表磺基取代的1，4-亞苯基或4，4′-聯(lián)亞苯基;R2代表磺基、羥基、低級烷氧基，例如甲氧基，羥基-低級烷氧基，例如2-羥基乙氧基、囟素，例如氯、氰基、羧基、低級的烷氧羰基，例如甲氧羰基或乙氧基羰基，或者氨基甲?；蚓哂蠷1的含義，而且R2可以相同或不同，另外也可以出現(xiàn)多次。
低級烷基或低級烷氧基中的低級烷基具有1至7個碳原子，最好具有1至4個碳原子，例如為甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基。苯基、吡啶基、三唑基或三嗪基上的取代基最好是，例如后面提到的R的基團(tuán)。
鹽最好是水溶性鹽，例如堿金屬鹽。象鈉鹽或鉀鹽，但也包括銨鹽。
本發(fā)明的方法中較好的螢光增白劑的通式是
在(Ⅲ)中，R3代表羥基、低級烷氧基、例如甲氧基，羥基-低級烷氧基，例如2-羥基乙氧基，低級烷氧基-低級烷氧基，例如2-甲氧基乙氧基，低級烷基氨基，例如甲氨基，低級的二烷基氨基，例如二甲氨基，羥基-低級烷基氨基，例如2-羥基乙氨基或2-羥基丙氨基，低級的烷基羥基-低級烷基-氨基，例如甲基-2-羥基乙基-氨基，二(羥基-低級烷基)氨基，例如二(2-羥基乙基)氨基或二(2-羥基丙基)氨基，低級烷氧基-低級烷基氨基，例如2-甲氧基乙基氨基，低級烷基-低級烷氧基-低級烷基-氨基，例如甲基-2-甲氧基乙基-氨基，二(低級烷氧基-低級烷基)氨基，例如二(2-甲氧基乙基)氨基，嗎啉代或苯環(huán)上磺基任意取代的苯基氨基，2-，3-，或4-磺基苯基氨基或2，5-二磺基苯基氨基;R4代表磺基，例如2-，3-，或4-磺基;R5代表氫、磺基例如4-或5-磺基或并環(huán)的苯環(huán)，例如2，3-，3，4-或5，6-苯并，而且兩個R3基、兩個R4基和兩個R5基各自可以相同或不同。以及由它們衍生的水溶性鹽，例如堿金屬鹽，象鈉鹽和鉀鹽。
在本發(fā)明的方法中最好的通式(Ⅲ)的二苯乙烯螢光增白劑是(Ⅲ)中的R3代表羥基-低級烷基氨基，例如2-羥基乙基氨基，二(羥基-低級烷基)氨基，例如二(2-羥基乙基)-氨基，或磺基取代的苯氨基，例如3-磺基苯氨基;R4代表磺基，例如2-，3-，或4-磺基，R5代表氫、磺基，例如5-磺基，或者并環(huán)的苯環(huán)，例如2，3-苯并，以及它的水易溶的鹽，例如鈉鹽。
本發(fā)明特別涉及使用通式Ⅲ的化合物的方法，其中，R3代表二-(2-羥基乙基)氨基或3-磺基苯基氨基，R4代表3-磺基，R5代表氫，和它的水溶性鹽，最好是鈉鹽。
特別好的二苯乙烯螢光增白劑稱之為diaethanol，其系統(tǒng)命名為4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺基苯基氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸的鈉鹽。該化合物能按照例如美國專利3，406，118中敘述的方法制備。
能通過本法染色以便檢測真菌和藻類的動物或人體組織，可以來源于機(jī)體的任何器官和部分，例如，以冷凍干燥組織標(biāo)本或埋入石臘中的脫水組織的組織切片形式或以印片標(biāo)本或拭子標(biāo)本的形式進(jìn)行檢查。通過本法可以檢測存在真菌和藻菌的體液是血液、痰，支氣管分泌物、淋巴液、腦脊髓液，和其它穿刺液、汗、淚液、眼內(nèi)液，尿或糞便。
此方法檢測人體組織或體液中真菌和藻類是特別好的。
組織切片，或用一些其它方法制備的標(biāo)本，例如拭子，印片標(biāo)本或從體液中分離的固體組分用含0.05%至5%，最好是0.1%至2%的螢光增白劑的水溶液處理，例如在水中、在鹽溶液中，例如緩沖生理鹽水中，或在組織固定液中，例如在10%甲醛水溶液或醇性水溶液中，在室溫或稍高的溫度下，例如高達(dá)50℃下處理數(shù)分鐘，例如2至30分鐘。如果適宜，過量的螢光增白劑可用水洗除或用鹽溶液，例如緩沖生理鹽水洗除。如果需要，被檢查的標(biāo)本然后可用一種適于組織切片或細(xì)胞成分染色的常用染料復(fù)染，例如用亞甲蘭、甲苯胺蘭、品紅、甲基紫或類似物，但最好是用伊凡斯蘭復(fù)染，以便加強(qiáng)對比度。
如此處理過的標(biāo)本在顯微鏡下用反射可見蘭色光或紫外光(反射照明光)，最好在340nm至450nm的范圍內(nèi)，觀察。如果觀察到真菌或藻菌的特征結(jié)構(gòu)的綠色的螢光，立即表明這類病原細(xì)菌的存在。在絕大多的數(shù)情形下，是可以從染色的真菌組成的形態(tài)學(xué)推測該真菌的屬和種。如果需要，在顯微鏡下見到的圖象還可用常用的可購得的光敏膠片進(jìn)行拍照。
本發(fā)明描述的方法，以簡單省時的操作和高度的可靠性為特征，并明顯地比其它的診斷真菌感染的方法優(yōu)越。與常規(guī)的染色方法相比，例如習(xí)慣使用的果莫里六五甲基四胺-銀染色法或周期性的酸-西夫鹼染色法比較，本發(fā)明中的方法具有選擇性地使真菌染色的優(yōu)點，螢光染色物在未染色的背景下能很好地突出出來，而且不足2小時即能給出可靠的結(jié)果，而常規(guī)染色方法需要24小時或更長的時間。本發(fā)明的方法明顯優(yōu)于用Blankophor
BA或cakofluor white
M2 R new的染色法，后兩者均為僅含2個磺基的三嗪基氨基二苯乙烯螢光增白劑，并已推薦用于動物及人體組織染色，因為按照本發(fā)明，所有真菌和藻菌均可被選擇性地染色，而剛提到的螢光增白劑對一些真菌并不染色，或染色差，而且染色的真菌在組織中不易識別。
為了實施該方法，所有需要的全是容易得到的試劑和簡單的螢光顯微鏡，后者在微生物或醫(yī)學(xué)實驗室中通常是可以得到的。
使用較好的水溶性螢光增白劑，diaethanol，在所有霉菌病例，例如皮膚的Lobo's霉菌病，肺酵母病，脾毛孢子菌病，腎念珠菌病、肺組織胞漿菌病，肝腹放線菌病，腎曲霉病以及adiaspiromycosis、球孢菌病，隱球酶母病，鼻孢子蟲病是線菌菌病，及許多其它病例中都觀察到了正性螢光。同樣也可使分離的或培養(yǎng)的真菌染色，例如屬于Eumycota屬的一些代表菌，例如接合菌、內(nèi)孢霉、子襄菌、或半知菌類(不完全真菌)，特別是芽酵母屬(dermatidis)，白假絲酵母、煙曲霉、申克側(cè)孢、須發(fā)癬菌、Trichophyton guinckeanum、狗小孢霉、光滑球擬酵母，和其它菌，以及藻菌類例如Prototheca，可是，奇怪的是，在細(xì)菌和寄生蟲的情形中未觀察到染色;特別是下面的細(xì)菌是不染色的葡萄球菌、例如金黃色葡萄球菌K1326，鏈球菌，例如糞鏈，例如大腸桿菌K1322，偽單孢菌，例如偽單孢菌K1407，和分枝細(xì)菌，例如Mycobact smegmatis。值得注的是，一些不屬于真菌的重要的致病菌，例如肺孢子蟲，腸蘭伯氏鞭毛蟲，杜氏利什曼蟲，leish.chagasi和嬰兒利什曼蟲也不被染色本發(fā)明亦包括適用于進(jìn)行該方法的螢光增白劑的制劑。這類制劑是，例如前面談到的至少含四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑的水溶液，以及固體混合物，例如粉狀或顆粒狀混合物。
按照本發(fā)明，水溶液含例如0.05%至5%，最好是0.1%至2%，例如1%二苯乙烯螢光增白劑;如果需要，還可以含其它的化合物，例如鹽類，象氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉，磷酸二氫鈉或鉀、磷酸氫二鈉或二鉀;或其它的緩沖物質(zhì)，例如N-2-羥基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸、3-嗎啉代丙磺酸、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸、或三(羥甲基)氨基甲烷;以及它們的堿金屬鹽，例如鈉鹽類，和/或酸加成鹽類，例如各自的鹽酸化物，變性的和/或溶解的有機(jī)溶劑，例如甲醇或乙醇;和固定化合物，例如甲醛;而且如果需要，也可含稀釋劑，例如脲;濕潤劑，例如脂肪或芳香磺酸鹽;或鈣離子的絡(luò)合劑，例如乙二胺四乙酸鈉，水溶液中二苯乙烯螢光增白劑的濃度亦可高于5%，例如高至20%。這類溶液在按本發(fā)明的方法使用前必須稀釋。
按照本發(fā)明的固體混合物是二苯乙烯螢光增白劑和前面提到的鹽;例如氯化鈉、氯化鉀和/或緩沖鹽，比如磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉，或與有機(jī)固體緩沖化合物，例如與三(羥甲基)氨基甲烷及相應(yīng)的鹽酸化物形成的混合物。這些混合物在用于本發(fā)明的方法前，必須能溶于水中。
較好的制劑是前面提到的較好的二苯乙烯螢光增白劑的水溶液，例如4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯基乙烯-2，2′-二磺酸，稱為diaethanol的水溶液。特別好的是含有0.1%至2%，例如1%的較好的螢光增白劑的這種蒸餾水溶液或磷酸鹽緩沖水溶液。
本發(fā)明中的制劑是根據(jù)溶解、混合、研磨、制粒和/或冷凍干燥等方法制得的。
本發(fā)明也涉及實施本發(fā)明方法的試驗箱。該試驗箱包含，例如具有至少四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑，或前面講到的本發(fā)明的一種劑型，用于復(fù)染的染料或染色液。緩沖化合物或緩沖溶液，以及輔助裝置，例如吸量管、顯微鏡用的載玻片及蓋玻片，實施本發(fā)明的方法的說明書，用于比較的標(biāo)本等等。
本發(fā)明的試驗箱也可包括血清測試液，例如多克隆或單克隆抗體溶液以進(jìn)一步確正，在使用二苯乙烯螢光增白劑染色法首先初步鑒別真菌的屬。這類直接對抗各種真菌屬的標(biāo)記抗原并專一地結(jié)合到相應(yīng)的真菌上去的多克隆或單克隆抗體是已知的，或能按照已知的方法制備。最好是使用螢光標(biāo)記抗體，例如用若丹明-或螢光-異硫氰酸鹽標(biāo)記的抗體，以便使得抗原/抗體反應(yīng)在螢光顯微鏡下容易看見。試驗箱也可包含能專一地與某些細(xì)菌或某些原蟲起反應(yīng)的抗體溶液。最好使用這些螢光標(biāo)記抗體，其螢光顏色能與本發(fā)明的二苯乙烯螢光增白劑的螢光顏色相區(qū)別，例如使用若丹明-異硫氰酸鹽標(biāo)記的抗體，以便能在一次操作中分別篩出真菌、細(xì)菌或原蟲。
下面的實施例僅解釋本發(fā)明，但決不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1組織切片中真菌的染色組織片，例如活檢物，按常法埋入小塊的石蠟中，使石蠟硬化，用切片機(jī)切割該小塊成3至4μm厚的薄片。將石蠟切片置于載玻片上，在水浴中拉伸并干燥，用二甲苯洗3次，然后用乙醇、乙醇/水混合物、水、最后用磷酸鹽酸緩沖鹽水(PBS)洗，以洗掉石蠟。亦有可能不用石蠟切片，而用大約10μm厚的深度冷凍的組織物的組織切片，并用PBS調(diào)制它們。
該組織切片用1%的diaethanol的PBS溶液，于pH7.0飽和。10至30分鐘后，切片用PBS沖洗，然后用0.2%伊凡斯蘭的PBS溶液處理，半分鐘后再用PBS沖洗。將水中的切片置于載玻片上，蓋上，并用嵌漆封住。該組織切片在Olympus BHTU顯微鏡下于表面螢光下觀察。真菌的細(xì)胞壁和胞漿染上綠色或黃綠色螢光，而背景呈棕色，從而產(chǎn)生良好的對比度。用Leica-小型照像機(jī)，采用柯達(dá)彩色膠卷ASA400進(jìn)行顯微照像。
實施例2肉湯培養(yǎng)物或體液標(biāo)本的染色將被檢物鋪于載玻片上，空氣干燥，用火加熱固定并用甲醇復(fù)蓋1分鐘。該載玻片用一層0.1%的diaethanol水溶液復(fù)蓋。5分鐘后，傾掉染色液，載玻片用水沖洗，空氣干燥。該標(biāo)本用蓋玻片蓋上，并在放大40倍的Dialux-20顯微鏡下用反射紫外光(反射照明光)觀察，該紫外光通過H2濾光片(波長390至490nm)。當(dāng)用螢光增白劑染色的樣品在干燥前用0.2%伊凡斯蘭的水溶液處理半分鐘，并用水洗后，可改善對比度。
實施例3作為真菌染色劑的螢光增白劑的檢查白色念珠菌 K1133，Aspergillus fumigatus K76及狗小芽孢菌K240在Mycophil瓊脂中培養(yǎng)，混懸到生理鹽水中作一系列測試，并且與等量的摘除的小鼠腎的懸浮液混合。每次滴1滴該混合物于載玻片上，空氣干燥，在火焰上方返回三次，以便固定，用甲醇復(fù)蓋1分鐘，并用蒸餾水洗。該固定的真菌樣品用1%待測的螢光增白劑水溶液復(fù)蓋5分鐘，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗，用0.2%的伊凡斯蘭的PBS溶液復(fù)蓋半分鐘，用PBS洗，用蓋玻片蓋上。該樣品用放大40倍的Dialux-20顯微鏡在反射紫外光(反射照明，390至490nm)下觀察。
相對于背景器官細(xì)胞染色的真菌螢光強(qiáng)度，可按任一標(biāo)度比較。每種真菌都進(jìn)行了2-3個實驗，并計算平均值。得到下述結(jié)果極好的染色效果使用4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽(diaethanol)，和4，4′-雙[2，4-二(3-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽。
好的染色效果使用4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(4-磺基-1-萘氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽。
4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(2，5-二磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽，4，4′-雙[2-(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽，和4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(4-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽。
中等染色效果使用4-[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-甲氧基-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-4′-[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(2-磺基乙氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽，4，4′-雙[2-嗎啉代-4(2，5-二磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽4，4′-雙[2-二(2-羥基丙基)氨基-4-(3-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽，和4，4′-雙[2-二(2-羥基丙基)氨基-4-(4-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽。
僅含兩個磺基，或用羧基或銨基取代磺基的二苯乙烯螢光增白劑及不含2，4-二取代的1，3，5-三嗪基-6-氨基的二苯乙烯螢光增白劑，染色差或根本不染色。
實施例4在磷酸鹽緩沖鹽水中的diaethanol溶液10g 4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺基苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-二磺酸鈉鹽(diaethanol，不含氯化鈉)，0.2g氯化鉀，8.0g氯化鈉，1，44g含兩分子結(jié)晶水的磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，溶于1升蒸餾水中。
相同的溶液亦可用含13%氯化鈉和5%至10%水的diaethanol粗品制備，但diaethanol的用量要作相應(yīng)的調(diào)整。
實施例5試驗箱用于真菌染色的大劑量的試驗箱包含含250毫升1%diaethanol磷酸鹽緩沖鹽水溶液的螺旋帽玻璃瓶。
含250毫升0.2%伊凡斯蘭磷酸鹽緩沖鹽水溶液的螺旋帽玻璃瓶。
進(jìn)行染色方法的說明書。
實施例6試驗箱用于真菌染色的小劑量試驗箱包含20個鋁泊包衣的聚乙烯撕裂式包裝袋，每袋含1ml1% diaethanol的磷酸鹽緩沖溶液。
20個鋁泊包衣的聚乙烯撕裂式包裝袋，每袋含1ml0.2%伊凡斯蘭的磷酸鹽緩沖溶液。
實施染色方法的說明書。
權(quán)利要求
1.檢測真菌和藻菌的方法，其特征為動物或人體組織或體液用至少含四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽處理，并用螢光顯微鏡檢查。
2.按權(quán)利要求
1的方法，其特征是以含四至六個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽進(jìn)行染色處理。
3.按權(quán)利要求
1的方法，其特征是以通式(Ⅰ)的螢光增白劑進(jìn)行染色處理。在(Ⅰ)中，R′代表至少含有一個磺基的芳香或芳香雜環(huán)取代
基或代表被至少含一個磺基的芳香或芳香雜環(huán)取代的氨基，且兩個R′基可以相同或不同;或以通式(Ⅱ)的螢光增白劑進(jìn)行染色處理，在(Ⅱ)中，
A代表磺基取代的1，4-亞苯基或4，4-聯(lián)亞苯基，R2代表磺基、羥基、低級的烷氧基，羥基-低級烷氧基，囟素、氰基、羧基、低級的烷氧羰基，或氨基甲?；蚓哂蠷1的含義，R2基可以相同或不同，另外，可出現(xiàn)多次，或以它們的鹽進(jìn)行染色。
4.按照權(quán)利要求
1的方法，其特征在于用通式(Ⅲ)的螢光增白劑進(jìn)行染色。在通式(Ⅲ)中，
R3代表羥基、低級烷氧基，羥基-低級烷氧基，低級烷氧基-低級烷氧基，低級烷氧基氨基，二-低級烷氧基氨基，羥基-低級烷氧基-氨基，低級烷基-羥基-低級烷基-氨基，二(羥基-低級烷基)氨基，低級烷氧基-低級烷基氨基，低級烷基-低級烷氧基-低級烷基-氨基，二(低級烷氧基-低級烷基)氨基，嗎啉代或苯環(huán)上磺基任意取代的苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氫，磺基或并環(huán)的苯環(huán)，而且兩個R3基，兩個R4基及兩個R5基各自可以相同或不同?；蚴褂盟鼈兊乃苄喳}進(jìn)行染色。
5.按照權(quán)利要求
1的方法，其特征在于，使用通式(Ⅲ)的化合物進(jìn)行染色，在(Ⅲ)中，R3代表羥基-低級烷基氨基，二(羥基-低級烷基)氨基，或磺苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氫，磺基或并環(huán)的苯環(huán)?；蛴盟鼈兊乃苄喳}進(jìn)行染色。
6.按照權(quán)利要求
1的方法，其特征在于使用通式(Ⅲ)的化合物進(jìn)行染色，在(Ⅲ)中，R3代表二(2-羥基乙基)氨基，或3-磺苯基氨基，R4代表3-磺基，R5代表氫?；蛴盟鼈兊乃苄喳}進(jìn)行染色。
7.按照權(quán)利要求
1的方法，其特征在于用4，4′-雙[2-二(羥基乙基)氨基-4-(3-磺苯基氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽進(jìn)行染色處理。
8.按照權(quán)利要求
1至7中之任一方法對人體組織或體液中的真菌和藻菌進(jìn)行染色。
9.用以檢測真菌和藻菌的方法中使用的制劑，它含有至少有四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽和載體。
10.按照權(quán)利要求
9的水溶液型的制劑。
11.按照權(quán)利要求
9的水溶液型的制劑，它含有0.05%至5%之間的二苯乙烯螢光增白劑及其鹽，有機(jī)緩沖劑，有機(jī)溶劑和/或固定劑。
12.按照權(quán)利要求
9、10或11含通式(Ⅲ)的螢光增白劑的制劑，在通式(Ⅲ)中，R3代表羥基低級烷氧基，羥基-低級烷氧基，低級烷氧
基-低級烷氧基，低級烷基氨基，二-低級烷基氨基，羥基-低級烷基-氨基，低級烷基-羥基-低級烷基-氨基，二(羥基-低級烷基)氨基，低級烷氧基-低級烷基氨基，低級烷基-低級烷氧基-低級烷基-氨基，二(低級烷氧基-低級烷基)氨基，嗎啉代或苯環(huán)上磺基任意取代的苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氫，磺基或并環(huán)的苯環(huán)，而且兩個R3基，兩個R4基和兩個R5基各自可以相同或不同。或它們的水溶性鹽。
13.按照權(quán)利要求
9、10或11的制劑，它含通式(Ⅲ)的化合物，在通式(Ⅲ)中R3代表羥基-低級烷基氨基，二(羥基-低級烷基)氨基，或磺苯基氨基，R4代表磺基，R5代表氫、磺基或并環(huán)的苯環(huán)，或其水溶性鹽。
14.按照權(quán)利要求
9、10或11的制劑，它含通式(Ⅲ)的化合物，在通式(Ⅲ)中，R3代表二(2-羥基乙基)氨基或3-磺基苯基氨基，R4代表3-磺基，R5代表氫，或其水溶性鹽。
15.按照權(quán)利要求
9、10或11的制劑，它含4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺苯氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽。
16.按真菌和藻菌檢測方法使用的制劑的制備方法，其特征在于至少含四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽與載體混合。
17.按照檢測動物和人體組織或體液中真菌和藻菌方法使用的試驗箱，它含有至少四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽。
18.按照權(quán)利要求
17的試驗箱，該箱含至少有四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑，或其鹽，以及染料和/或血清測試液和/或?qū)嵤┰摲椒ǖ恼f明書。
19.按照權(quán)利要求
17或18的試驗箱，該箱含有以象權(quán)利要求
9至15中任一要求的制劑形式的二苯基乙烯螢光增白劑。
20.按權(quán)利要求
17，18或19的試驗箱，該箱含4，4′-雙[2-二(2-羥基乙基)氨基-4-(3-磺基苯基氨基)-1，3，5-三嗪基-6-氨基]-二苯乙烯-2，2′-二磺酸鈉鹽。
21.在用以檢測動物或人體組織或體液中真菌和藻菌的方法中，使用含至少四個磺基的二苯乙烯螢光增白劑或其鹽的用法。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種檢測動物或人體組織和體液中真菌和藻菌的方法，含適用于本方法的熒光增白劑的制劑，和實施該方法的試驗箱。被檢測的組織切片或體液樣品用熒光增白劑處理，并用熒光顯微鏡觀察。本發(fā)明可以對真菌感染作出快速可靠的診斷。
文檔編號G01N33/48GK87101986SQ87101986
公開日1987年11月18日 申請日期1987年3月22日
發(fā)明者赫伯特·安東·科赫 申請人:希巴—蓋吉股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan