專利名稱：檢測伴有溶血磷脂濃度改變的癌癥的方法
I.相互參照有關(guān)的申請本申請是1997年3月21日遞交的共同待審的美國專利申請序號08/822,128的部分繼續(xù)申請。
II.引言本發(fā)明涉及通過檢測受試者體液樣品中的溶血磷脂或它們的成分脂肪酸(constituent fatty acids)的濃度來篩選患有癌癥的受試者的方法，尤其是與溶血磷脂和它們的成分脂肪酸的濃度改變有關(guān)的婦科癌癥和乳腺癌。
III.本發(fā)明背景對于人類各種癌癥的早期檢測，無時不需要癌癥的標(biāo)記物。乳腺癌和婦科癌癥已成為婦女的重要死亡因素并對先前的干預(yù)治療(intervention)提出了挑戰(zhàn)。例如，在婦女中卵巢癌是第四位導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤(American Cancer Society，Cancer J.Clin.，437-26(1993))。卵巢癌患者在早期、更易治療的階段作出診斷可帶來較高的存活率，而目前70％的患者在確診時已處于癌癥晚期。最適用的血清標(biāo)記物CA125并沒有足夠的靈敏性或特異性來保證其在卵巢癌的篩查中作為唯一的標(biāo)記物使用(Einhom等，Obstet.Gynecol.8014-18(1992))。具體地說，在高達(dá)50％的早期卵巢癌患者的血清中未檢測到CA125(Schapira等，Ann.Intern.Med.，118838-843(1993))。沒有可靠的用于檢測宮頸或子宮癌的血漿或血清標(biāo)記物存在。而且，也沒有有效的血清篩選試驗用于檢測乳腺癌的存在。CA125作為標(biāo)記物使用的假陽性率結(jié)果，大約2％，導(dǎo)致每次早期癌癥檢測的大約100例假陽性結(jié)果(Jacobs等，BMJ，313(7069)1355-1358(1996)；Dorum等，E.J.Cancer 32A(10)1645-1651(1996)；Muto等，Gynecologic Oncol.51(1)12-20(1993)；Jacobs等，Lancet 1(8580)268-271(1988))。
為了早期檢測癌癥尤其是婦科癌癥和乳腺癌、確定受試者的預(yù)后和監(jiān)測受試者對這些癌癥治療的反應(yīng)，需要更可靠的標(biāo)記物來經(jīng)濟(jì)、快速地篩查受試者，以改善這些疾病患者的預(yù)后。
磷脂酰膽堿(PC)是多不飽和脂肪酸如花生四烯酸和亞油酸的主要來源之一。前者是具有多種生物活性的類花生酸的前體。PC水解產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)和成分脂肪酸，其與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有聯(lián)系(Asaoka等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，904917-4921(1993)；Yoshida等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，896443-6446(1992))。不斷增加的大量證據(jù)表明，以高濃度存在于氧化的低密度脂蛋白中的LysoPC (參見Steinberg等，Eng.J.Med.320915-924(1989))，可能在動脈粥樣化形成和其他炎性疾病中起著重要的作用。例如，已報道LysoPC在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中增加基團(tuán)編碼血小板衍生生長因子A和B鏈以及肝素結(jié)合表皮生長因子-類蛋白(HB-EGF)的轉(zhuǎn)錄(Kume和Gimbrone，J.Clin.Invest.93907-911(1994))，并且在人單核細(xì)胞中增加mRNA編碼HB-EGF(Nakano等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 911069-1073(1994))。這兩種基因產(chǎn)物都是有效的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的促有絲分裂劑(Higashiyama等，Science 251936-939(1991)；Ross，Nature(Lond.)362801-809(1993))。也已報道LysoPC在體外激活蛋白激酶C(Sasaki等，F(xiàn)EBS Letter 32047-51(1993))、增強(qiáng)人類T淋巴細(xì)胞的活化(Asaoka等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 896447-6451(1992))并且增強(qiáng)由膜滲透的二酰甘油或佛波酯誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化(Asaoka等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 904917-4921(1993))。
LysoPC也可通過由溶血磷脂酶D水解(Tokumura等，Biochim.Biophys.Acta 87531-38(1986))提供生物活性溶血磷脂酸(LPA)的來源(參見Moolenaar等，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.11947-65(1992))。卵巢癌激活因子(OCAF)已從卵巢癌腹水中分離出(Mills等，Cancer Res.481066(1988)Mills等，J.Clin.Invest.86851(1990)和美國專利號5,326,690及5,277,917)并且已證明是由LysoPA的多種形式組成(Xu等，Clin.Cancer Res.11223-1232(1995))。已證明LysoPA在卵巢癌患者的腹水中充當(dāng)有效的腫瘤生長因子(Id.)。先前的研究集中在癌癥患者的紅細(xì)胞和血清中的總?cè)苎字Ｄ憠A(LysoPC)水平上，導(dǎo)致在乳腺癌患者中LysoPC沒有改變的結(jié)論(Kal’nova，Vopr.Onkol.35(7)795-801(1989))。在關(guān)注于紅細(xì)胞和全血的研究中觀察到轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的總?cè)苎字鄬τ诳偭字谋嚷适窃龈叩摹amanskii，Vopr.Onkol.38(10)1194-202(1992)。這些研究沒有評價特殊的溶血磷脂的水平，也沒有進(jìn)行脂肪酸成分的研究。進(jìn)一步說，在乳腺癌患者或其他形式的癌癥患者中，除了在未分離的血液和紅細(xì)胞中之外，他們沒有評價在血清、血漿、尿液或任何其它體液中的溶血磷脂。因此，從這些研究中不能得出癌癥患者血漿/血清中特殊的溶血磷脂變化的結(jié)論或預(yù)言。
IV.本發(fā)明概述因此，本發(fā)明包含了診斷、判定癌癥預(yù)后和監(jiān)測癌癥的方法，包括婦科癌癥，如卵巢癌、子宮癌、輸卵管癌和宮頸癌，以及其它癌癥如乳腺癌，相對于未患癌癥的正常受試者的溶血磷脂水平，這些癌癥與受試者的某些溶血磷脂的濃度的改變有關(guān)。
所述方法通過檢測得自受試者的體液樣品中溶血磷脂的濃度來進(jìn)行。這種檢測方法可視為檢測1)選擇的特殊的溶血磷脂的濃度，如存在于受試者樣品中的LysoPC或LysoPA；2)具有特殊的飽和或不飽和度脂肪酸和/或脂肪酸鏈長度(如棕櫚酰-LysoPC或亞油酰(linoleoyl)-LysoPC)的選擇的溶血磷脂亞型的濃度，或具有與甘油主鏈相連接的特殊的長鏈醇的亞型的濃度；3)存在于樣品中的總?cè)苎字臐舛龋?)得自受試者的單一樣品中的第一種溶血磷脂的濃度，如LysoPC，隨后檢測另一種溶血磷脂的濃度，如LysoPA。采用本發(fā)明的方法同時或依次由單一樣品進(jìn)行不同的溶血磷脂的檢測能改善癌癥檢測的靈敏性和/或特異性，減少假陰性或假陽性結(jié)果的發(fā)生。
此外，在得自受試者和正常人的樣品中可以測定并比較構(gòu)成特殊的溶血磷脂的脂肪酸的特殊成分的濃度比。
本發(fā)明是基于，至少部分基于這一發(fā)現(xiàn)，即在患有婦科癌癥如卵巢癌和其他癌癥的受試者的體液中，溶血磷脂，如LysoPC和LysoPA有改變。在本發(fā)明的方法中采用的優(yōu)選的溶血磷脂具有甘油主鏈，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，如膽堿、肌醇、乙醇胺、甘油或絲氨酸，并且一條脂肪酸單鏈位于sn-1或sn-2位，通過?；I與甘油主鏈連接，在其它的sn-1或sn-2位連有羥基。
或者，一條長鏈醇在sn-1位通過烷基或鏈烯基鍵與甘油主鏈連接，在sn-2位連有羥基。這些化合物具有下列通式結(jié)構(gòu)sn-1溶血磷脂
sn-2溶血磷脂
其中X是任何脂肪酸或長鏈醇，包括但不限于180、160、181、182、204n-6和226n-3，通過?；?、烷基或鏈烯基鍵連接；R1是任何脂肪酸，包括但不限于棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸(docasahexanoic)，經(jīng)由?；I與所述磷脂的甘油主鏈連接。
R2可以是任何衍生的磷酸酯，包括但不限于氫、膽堿、肌醇、乙醇胺、甘油和絲氨酸。
使用本發(fā)明方法檢測的溶血磷脂包括但不限于LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysopG。
在關(guān)于受試者癌癥預(yù)后的本發(fā)明的另一實施方案中，在患有癌癥的受試者中以連續(xù)的時間間隔檢測溶血磷脂的濃度，并比較不同時期這些化合物的濃度以判定所述癌癥的預(yù)后以及治療是否成功。對于某些癌癥，在近期得自受試者的樣品中溶血磷脂濃度的增加表明存活的腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加，而溶血磷脂濃度的減低表明存活的腫瘤細(xì)胞數(shù)量的下降。
在本發(fā)明方法的另一實施方案中，既可同時，也可依次對得自受試者的樣品檢測第一種類型的溶血磷脂和至少一種其它類型的溶血磷脂的濃度，以改進(jìn)受試者中癌癥檢測的靈敏性和/或特異性。
在本發(fā)明的另一實施方案中，測定另外的癌細(xì)胞標(biāo)記物如CA125的濃度，以進(jìn)一步改進(jìn)癌癥檢測的靈敏性和/或特異性。
在本發(fā)明的特別實施方案中，從得自受試者的血漿樣品中檢測LysoPC和/或LysoPA的濃度以診斷受試者中婦科腫瘤的存在。也可通過測定不同時間受試者樣品中溶血磷脂濃度的變化率來進(jìn)行診斷。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過首先測定受試者體液樣品中特殊脂肪酸在溶血磷脂如LysoPC中的比率，并將這些脂肪酸的比率與未患癌癥的正常受試者樣品中的同樣脂肪酸在溶血磷脂中的比率進(jìn)行比較來診斷癌癥。相對于正常樣品中的脂肪酸在溶血磷脂中的比值，受試者樣品中的脂肪酸在溶血磷脂中的比值的改變表明癌癥的存在。如果受試者樣品中的脂肪酸在溶血磷脂中的比值在一個特別范圍內(nèi)下降，則測定受試者樣品中的不同脂肪酸在溶血磷脂中的比率并與正常樣品中的同樣脂肪酸在溶血磷脂中的比率比較。該第二個比值的改變也表明癌癥的存在。在下述實施例中，使用測試樣品中的脂肪酸在LysoPC中的比率來診斷乳腺癌。
另一個實施方案是診斷試劑盒，其包含檢測溶血磷脂濃度的試劑并且任選包括抗-溶血磷脂抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點在于其能在早期檢測與某些溶血磷脂存在有關(guān)的癌癥，并且增加了檢測的特異性和靈敏性，因此使改善受試者預(yù)后的早期介入變得容易。而且，本發(fā)明的方法能夠減少檢測乳腺癌的假陰性和陽性結(jié)果的數(shù)量。
V.圖的簡述

圖1A-1C.圖形描繪了對照受試者和癌癥患者血漿中磷脂酰膽堿(PC)(1A)和LysoPC(1B)的濃度以及LysoPC/PC的比率(1C)。7例對照和17例卵巢癌患者的數(shù)據(jù)以均數(shù)±SE表示。與對照組相比，可觀察到卵巢癌患者血漿的LysoPC濃度(**p＜0.01)和LysoPC/PC摩爾比(**p＜0.01)均有顯著性差異。
圖2.圖形描繪了對照受試者和卵巢癌患者中血漿PC的脂肪酸成分(總脂肪酸的mol％)。(160＝棕櫚酸；180＝硬脂酸；181＝油酸；182n-6＝亞油酸；204n-6＝花生四烯酸)。
圖3.圖形描繪了對照受試者和卵巢癌患者中血漿LysoPC的脂肪酸成分(總脂肪酸的mol％)。與對照組相比，卵巢癌患者的棕櫚酸(160)(**p＜0.01)和硬脂酸(180)(***p＜0.001)濃度顯著增高，而油酸(181)(*p＜0.05)和亞油酸(182n-6)(***p＜0.001)濃度較低。
圖4.圖形描繪了對照受試者和卵巢癌患者的血漿PC和LysoPC中的160(棕櫚酸)/182n-6(亞油酸)的摩爾比。7例對照和17例卵巢癌患者的數(shù)據(jù)以均數(shù)±SE表示?？捎^察到病例中血漿LysoPC與血漿PC相比具有顯著性差異(***p＜0.001)。
圖5.圖形顯示了卵巢癌患者和對照者(“正常人”)中[LysoPC/PC]×[棕櫚酰-LysoPC(160)/亞油酰-LysoPC(182n-6)]的值。垂直線表示7例對照和17例卵巢癌患者的均數(shù)±SE。與對照組相比，可觀察到卵巢癌患者血漿中的值顯著增高(***p＜0.001)。
圖6.圖形顯示了卵巢癌患者和對照受試者血漿中的LysoPA的濃度。垂直線表示9例對照和52例卵巢癌患者的均數(shù)±SE。與對照組相比，可觀察到卵巢癌患者血漿中的LysoPA的濃度顯著增高(***p＜0.001)。
圖7.圖形描繪了與對照組相比，活動期疾病患者和靜止期疾病患者血漿中LysoPA的濃度。左邊3個直方條表示總LysoPA，右邊3個直方條表示僅有多不飽和脂肪酸的LysoPA。直方條表示9例對照和52例卵巢癌患者的均數(shù)±SE。與靜止期疾病患者相比或與對照組相比，可發(fā)現(xiàn)活動期疾病患者的LysoPA和含有飽和脂肪酸的LysoPA的濃度顯著增高。
VI.本發(fā)明詳述本發(fā)明提供篩查癌癥的方法，所述癌癥與受試者體液樣品中的溶血磷脂的濃度改變有關(guān)，包括但不限于溶血磷脂酸(LysoPA)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)、溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)和溶血磷脂酰甘油(LysoPG)。該方法也包括篩查乳腺癌，通過比較受試者與正常人的溶血磷脂如LysoPC的脂肪酸成分的比率來確定乳腺癌的存在。所述受試者可以是非人類的動物，優(yōu)選人類。
與這些溶血磷脂的濃度增加有關(guān)的癌癥包括但不限于婦科腫瘤，包括卵巢、宮頸和子宮的腫瘤，以及其它癌癥。某些癌癥如白血病與這些溶血磷脂的濃度增加無關(guān)。因此，優(yōu)選使本發(fā)明的方法用于癌癥的檢測，相對于在未患癌癥的受試者(“正常受試者”)體液中所測到的濃度，這些癌癥已知或已顯示出與受試者體液中增高的溶血磷脂的濃度有關(guān)。
用于本發(fā)明方法中的化合物是具有甘油主鏈的溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，如膽堿、肌醇、乙醇胺、甘油或絲氨酸，并且一條脂肪酸單鏈位于sn-1或sn-2位，通過?；I與甘油主鏈連接，在其它的sn-1或sn-2位連有羥基?；蛘?，一條長鏈醇在sn-1位通過烷基或鏈烯基鍵與甘油主鏈連接，在sn-2位連有羥基。
這些化合物具有下列通式結(jié)構(gòu)sn-1溶血磷脂
sn-2溶血磷脂
其中X是任何脂肪酸或長鏈醇，包括但不限于180、160、181、182、204n-6和226n-3，通過?；?、烷基或鏈烯基鍵連接；R1是任何脂肪酸，包括但不限于棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸，經(jīng)由?；I與所述磷脂的甘油主鏈連接。
R2可以是任何衍生的磷酸酯，包括但不限于氫、膽堿、肌醇、乙醇胺、甘油和絲氨酸。
這些溶血磷脂在體外和體內(nèi)同樣具有對癌細(xì)胞促生長或信號活動的特性。例如，這種活動伴有胞質(zhì)游離鈣增加(Xu等，Clin.Cancer.Res.11223-1232(1995))，或其它信號通道的激活(Moolenaar，CurrentOpinion in Cell Biol.7(2)203-210(1995)；Moolenaar，J.Biol.Chem.270(22)12949-12952(1995)；Jalink等，Biochim.Biophys.Acta1198(2-3)186-196(1994)；和Xu等，Biochem.J.309933-940(1995)。
A.本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明的方法能夠提供許多好處。首先，本方法為大量的受試者提供了一種快速和經(jīng)濟(jì)的篩查方法，有利于癌癥的早期診斷并能導(dǎo)致癌癥患者生活質(zhì)量的改善和更好的存活率。
使用本發(fā)明的方法判斷預(yù)后，醫(yī)務(wù)人員能夠決定患有早期癌癥的受試者是否需要治療或不需要治療。這也能確定受試者可能不宜于特殊形式的治療，如手術(shù)、化療、放射或生物學(xué)治療。這種信息能導(dǎo)致治療方案的改善以獲得更好的治療反應(yīng)，改善癌癥患者的生活質(zhì)量和存活率。
本發(fā)明的方法也可用于確定患者的治療是否應(yīng)由一種藥劑改為另一種藥劑。這就避免了需要“第二步查看(second look)”的侵害過程來決定患者對治療的反應(yīng)，并使特殊形式的治療是否繼續(xù)、終止或改變的決定變得容易。
因為在相當(dāng)多數(shù)的進(jìn)展期癌癥患者中癌癥將要復(fù)發(fā)，使用本發(fā)明的方法早期檢測和定期連續(xù)監(jiān)測，能在它們出現(xiàn)癥狀以前確定早期潛在的(即“隱藏的”)復(fù)發(fā)。本發(fā)明的方法對于這些目的的使用也能導(dǎo)致癌癥患者治療反應(yīng)的改善、生活質(zhì)量的改善以及存活率的改善。
此外，本發(fā)明的方法將使良性及惡性腫瘤的區(qū)分變得容易。使用如超聲的方法或通過體檢能最初查到位于器官如卵巢中的腫塊。此后，可采用本發(fā)明的方法診斷癌癥的存在。這就避免了外科干預(yù)的需要，并且/或者確定了連續(xù)的監(jiān)測是合適的患者，導(dǎo)致癌癥患者早期檢測和存活的改善。
本發(fā)明方法的另一種應(yīng)用是確定未知的原發(fā)腫瘤的來源。使用常規(guī)技術(shù)通常不能確定在腹腔和身體其它部分中的惡性腫瘤的起源組織。這種信息對指導(dǎo)醫(yī)務(wù)工作者對腫瘤進(jìn)行最合適的治療是有用的。采用本發(fā)明的方法測定溶血磷脂和/或某些類型的溶血磷脂的濃度能提供關(guān)于腫瘤組織來源的信息。例如，升高的溶血磷脂濃度能夠區(qū)別淋巴瘤和腸道腫瘤，這兩種腫瘤具有比婦科腫瘤低的溶血磷脂濃度。
除了采用本發(fā)明的方法測定與癌癥有關(guān)的溶血磷脂的濃度，也可檢測其它的癌細(xì)胞標(biāo)記物，包括但不限于CA125、Tac、可溶性IL2α受體、mCSF、OVX1、CEA、PSA、CA15-3、CA19.9，以改善癌癥檢測的靈敏性和/或特異性。
對增加靈敏性特別有用的檢測方法是進(jìn)行不同時間的溶血磷脂和其它癌癥標(biāo)記物濃度的檢測，或以不同時間溶血磷脂的變化率為單位檢測，以減少假陽性的結(jié)果。
而且，通過本發(fā)明方法測定的溶血磷脂濃度的信息，可為設(shè)立另外的方法提供建議，如超聲、活組織檢查、腹腔鏡或外科手術(shù)、乳房X線照相、活組織檢查或MRI(磁共振成像)的應(yīng)用，以改善早期癌癥的檢測和大規(guī)模篩查受試人群癌癥的存在。
就乳腺癌而言，本發(fā)明提供了一種預(yù)篩查的方法，在此方法中最初的陰性結(jié)果(即表示沒有癌癥)可以減少需要進(jìn)一步侵入檢查或需要如乳房X線照相或活組織檢查的婦女的數(shù)量。
B.檢測溶血磷脂和/或它們的成分脂肪酸以診斷癌癥的方法本發(fā)明為診斷受試者癌癥的存在提供了方法。在特別的實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測受試者體液樣品中增高的溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)和溶血磷脂酸(LysoPA)濃度的方法。所述體液可以是血漿、血清、尿液、唾液、腹水、腦脊液或胸水。
本發(fā)明的方法進(jìn)行如下。在脂質(zhì)萃取和分析以后，測定如上述定義的溶血磷脂的濃度，或者通過如以下進(jìn)一步描述的以抗體為基礎(chǔ)的檢測來測定溶血磷脂的濃度。所述檢測方法可視為檢測1)選擇的特殊的溶血磷脂的濃度，如存在于受試者樣品中的LysoPC或LysoPA；2)具有特殊的飽和或不飽和度脂肪酸和/或脂肪酸鏈長度(如棕櫚酰-LysoPC或亞油酰-LysoPC)的選擇的溶血磷脂亞型的濃度，或具有與甘油主鏈相連接的特殊的長鏈醇的亞型的濃度；3)存在于樣品中的總?cè)苎字臐舛龋?)得自受試者的單一樣品中的第一種溶血磷脂的濃度，如LysoPC，隨后檢測另一種溶血磷脂的濃度，如LysoPA。采用本發(fā)明的方法同時或依次由單一樣品進(jìn)行不同的溶血磷脂的檢測能改善癌癥檢測的靈敏性和/或特異性，減少假陰性或陽性結(jié)果的發(fā)生。
溶血磷脂的檢測能作為濃度(即相對于樣品液體體積而存在的溶血磷脂的量，如μmol/ml)來測定，或在標(biāo)準(zhǔn)化為受試者樣品中其它化合物(包括其它的溶血磷脂、磷脂、白蛋白和肌酐)的濃度以后使用。
例如，檢測具有特殊類型的飽和脂肪酸鏈(如硬脂酸或棕櫚酸)的溶血磷脂如LysoPC的濃度，并與具有不同類型的脂肪酸鏈的溶血磷脂(如具有不飽和脂肪酸鏈如油酸和亞油酸的LysoPC)的濃度比較。然后采用樣品中一種成分如磷脂酰膽堿(PC)的總量來標(biāo)準(zhǔn)化這些值。這種檢測方法比僅測定總?cè)苎字鏛ysoPC而不考慮脂肪酸鏈類型的檢測方法能提供更加特異或敏感的癌癥存在的指標(biāo)。然而，溶血磷脂的濃度能與相應(yīng)的磷脂濃度比較，如樣品中LysoPC的濃度能與PC的濃度相比較(參見以下實例和圖1-5)。
起初，在沒有癌癥的受試者中測定溶血磷脂和/或特殊類型溶血磷脂的生理學(xué)(“正?！?濃度。隨后，在受試者體液樣品中檢測溶血磷脂的濃度以篩查癌癥并與已建立的正常受試者的濃度相比較。其中相對于正常濃度升高的溶血磷脂濃度，即可診斷為癌癥存在。此外，如以上所詳述的，所述濃度在標(biāo)準(zhǔn)化以后可與其它化合物的濃度相比較。
如以下所詳述的，通過第一步萃取脂質(zhì)可以檢測受試者樣品中溶血磷脂的濃度。然后采用標(biāo)準(zhǔn)方法，如氣相層析HPLC、ELISA、NMR、使用酶的生化檢測或其它方法來定量溶血磷脂的量。或者，也如以下所描述的，在以抗體為基礎(chǔ)的檢測中采用抗-溶血磷脂抗體來定量樣品中存在的溶血磷脂。溶血磷脂的濃度相對于正常對照明顯增高，如在正常以上一個或多個標(biāo)準(zhǔn)偏差，表示存在癌癥。
作為另外的診斷工具，如以上所描述的，測定并標(biāo)準(zhǔn)化所選擇的溶血磷脂類型的濃度。這些類型的濃度增高表示癌癥的存在。這可增加檢測的靈敏性和特異性。
采用本發(fā)明的方法測定溶血磷脂的濃度，可用于診斷和篩查患有癌癥的受試者，以及判定患有癌癥的受試者的預(yù)后。而且，通過測定不同時間受試者樣品中溶血磷脂的濃度，可以監(jiān)測癌癥對治療的反應(yīng)。
此外，也可測定不同時間溶血磷脂濃度的變化率，并可提供更敏感或特異的癌癥存在的指標(biāo)。
能用多種方法進(jìn)行癌癥的診斷和預(yù)后評估。例如，本發(fā)明的體外診斷檢測方法包括生物學(xué)樣品中磷脂的檢測，并因此可作為診斷或預(yù)后技術(shù)的部分使用，借此患者可測試出異常的溶血磷脂濃度。這種檢測方法包括本領(lǐng)域中已熟知的技術(shù)，如氣相層析、NMR和HPLC。例如，可使用萃取方法從測試的體液樣品中萃取脂質(zhì)，如通過引用結(jié)合到本文中的由Bligh和Dyer在Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959)中所描述的那些方法?？墒褂帽訉游龇ǚ蛛x各種磷脂，如通過引用結(jié)合到本文中的由Thomas和Holub在Biochim.Biophys.Acta，108192-98(1991)中所描述的。然后在平板上用紫外線使磷脂和溶血磷脂顯影，如通過引用結(jié)合到本文中的由Gaudette等在J.Biol.Chem.26813773-13776(1993)中所描述的。通過從顯影的磷脂中萃取來測定脂肪酸，并且可采用如氣相層析(參見Skeaff和Holub，In M.Lagarde(ed.)，Biology ofEicosanoids，152卷，63-76頁，Inserm，Paris(1987)，通過引用結(jié)合到本文中)、HPLC或NMR方法來定量脂肪酸。含有脂肪酸的溶血磷脂的濃度能夠從由氣相層析評估的脂肪酸含量中獲得，并用內(nèi)標(biāo)如十七烷酸校準(zhǔn)。或者，在從磷脂分離以后或作為磷脂的一部分，通過NMR或HPLC測定溶血磷脂濃度。
除了通過萃取直接測定溶血磷脂的濃度以外，在檢測中也能采用抗體，如與溶血磷脂反應(yīng)的單克隆抗體，以測定受試樣品中溶血磷脂的濃度。例如，抗-磷脂抗體可使用標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記并在檢測中應(yīng)用，檢測方法包括固相和液相兩種放射免疫測定(RIA)、熒光聯(lián)接測定或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，其中抗體用于測定液體樣品中溶血磷脂的存在(參見Uotila等，J.Immunol Methods 4211(1981))以及熒光技術(shù)(Sikora等，單克隆抗體，32-52頁，Blackwell Scientific出版，1984年)。
在檢測中用于測定溶血磷脂的針對溶血磷脂培育的單克隆抗體可按照已建立的方法生產(chǎn)，例如通過使用溶血磷脂、其碎片或其功能等同物免疫各種宿主動物來生產(chǎn)。該宿主動物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、山羊等。根據(jù)宿主種類，可使用多種佐劑來增加宿主動物體內(nèi)的免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏(完全和不完全佐劑)、無機(jī)凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚以及有可能用于人類的佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。多克隆抗體是得自免疫動物血清的異源性抗體分子種群。
單克隆抗體，其是針對特殊抗原的同源性抗體種群，可以通過培養(yǎng)傳代細(xì)胞系或應(yīng)用噬菌體表型文庫(display libraries)來提供抗體分子產(chǎn)生的任何技術(shù)獲得。這些包括但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(Nature 356495-497(1975))、人類B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 802026-2030(1983))和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁，1985年)。這種抗體可以是任何類型的免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及其任何亞型。雜交瘤產(chǎn)生的mAB可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。
可采用并通過已知技術(shù)生產(chǎn)識別特殊溶血磷脂的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于能通過胃蛋白酶消化所述抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段，以及能通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。或者，構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Science 2461275-1281(1989))以便快速和方便地鑒別具有所需特異性的單克隆Fab片段。
用于上述檢測的抗溶血磷脂抗體的制備方法已有描述，例如，產(chǎn)生磷脂酰肌醇和磷脂酸抗體的方法(參見Keating等，Biochem.J.317(Pt.3)643-646(1996)；Fukami等，Proc.Nat’l.Acad.Sic.USA859057-9061(1988)；Fukami等，Proc.Nat’l.Acad.Sic.USA85(23)9057-9061(1988)和Matuoka等，Science，239(4840)640-643(1988))。
在本發(fā)明的另一實施方案中，預(yù)先篩查受試者以檢測癌癥如乳腺癌。在受試者血清或其它體液樣品中測定特殊溶血磷脂如LysoPC的脂肪酸成分。將溶血磷脂中特殊脂肪酸的比率如棕櫚酸亞油酸(160/182n-6)與得自正常受試者(即未患乳腺癌)樣品的同樣脂肪酸的比率相比較。受試者的比率與正常受試者比率的比值明顯改變表明癌癥的存在。優(yōu)選確定一個測試樣品比率的“截斷值”，在該值以上的樣品定為癌癥陽性。在以下特殊實施方案中，從數(shù)據(jù)建立了至少3.5的截斷值。更優(yōu)選確定一個測試樣品比率的較低值，以使在這一低值和高值之間限定的范圍構(gòu)成“需要進(jìn)一步測試”的結(jié)果。如果在特殊溶血磷脂如LysoPC中脂肪酸的比率降低至該范圍內(nèi)，則需進(jìn)行第二項測試，即在原測試樣品中測定同樣的溶血磷脂中不同脂肪酸的比率與同樣的溶血磷脂中這些脂肪酸的比率的比值。如果測試樣品的第二個比率的比值超過了第二個截斷值，那末該受試者就定為患有癌癥(并且，例如需要進(jìn)一步篩查如乳房X線照相)。在以下特殊實施例中，采用1.00的截斷值指示乳腺癌的存在。這種溶血磷脂如LysoPC中脂肪酸比率的兩步分析提供了較高的靈敏性和較低的假陰性和假陽性結(jié)果。具體地說，本方法可減少需要如乳房X線照相等方法來確定乳腺癌存在的人數(shù)，節(jié)約開支，方便可行。
C.監(jiān)測患有癌癥的受試者的方法本方法也提供了隨訪癌癥患者的方法。例如，測定癌癥患者體液樣品中溶血磷脂如LysoPC的濃度。在較后時間，測定溶血磷脂的濃度并與該患者較早時期測定的濃度比較。如果溶血磷脂的濃度隨時間增加，則可能表明存活的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增加，因此存在于患者體內(nèi)的癌癥也增加。相反，如果溶血磷脂的濃度降低，則可能表明癌癥存在的減少。
此外，每個樣品可進(jìn)行多個類型的溶血磷脂如LysoPA的測定。這些檢測能為醫(yī)務(wù)工作者提供信息以調(diào)整治療，改變、停止或開始使用某種治療藥劑或方法，以改善患者的預(yù)后和存活。
D.診斷試劑盒此處描述的用于檢測受試者體液樣品中溶血磷脂濃度的方法也可通過，例如，采用預(yù)先包裝的診斷試劑盒進(jìn)行。這種試劑盒包括測評溶血磷脂濃度的試劑，例如，從多種液體樣品中萃取脂質(zhì)的試劑。該試劑包括輔助試劑如緩沖劑，以及在轉(zhuǎn)運(yùn)或儲存樣品時抑制隨后溶血磷脂生成或水解的試劑如EDTA?；蛘撸撛\斷試劑盒包括標(biāo)記的抗體試劑如抗-溶血磷脂抗體，或抗體組合物，其可在比如臨床檢測中方便地使用，以診斷癌癥患者。該試劑盒也可包括實施本發(fā)明方法和/或?qū)悠忿D(zhuǎn)送到診斷實驗室處理的裝置或容器，以及進(jìn)行本發(fā)明方法的合適的指示。
給出以下實施例來演示本發(fā)明的方法并幫助普通技術(shù)人員采用這些方法。所述實施例并不意味著以任何方式限制本說明書的范圍或由Letters Patent授予的保護(hù)。
VII.實施例卵巢癌患者血漿中LYSOPC和其成分脂肪酸的檢測A.實驗對象本實施例包括允許進(jìn)入多倫多綜合醫(yī)院的17例診斷患有卵巢上皮癌的受試者，年齡為36到74歲(平均55歲)。這些受試者中有7例診斷為活動期疾病。9例受試者在測試期間接受以順鉑為基礎(chǔ)的化療。也包括用于對比的6例患有活動期白血病的受試者，他們在M.D.Anderson癌癥中心(Houston，Texas)處于化療的周期之間。對照受試者是7例健康婦女，年齡為46到63歲(平均52歲)。
B.血漿樣品血液(7ml)被抽進(jìn)含有EDTA的真空容器(vacutainers)(BectonDickinson和Company，Rutherford，New Jersey)中并分離血漿(1，600xg，15分鐘)。該血漿在-20℃保存并在7天內(nèi)測試。
C.脂質(zhì)萃取和磷脂分析通過有某些修改的Bligh和Dyer在Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959)中的方法(通過引用結(jié)合到本文中)來萃取血漿脂質(zhì)。向每個0.5ml的血漿樣品中加入3.75ml氯仿/甲醇(1∶2v/v)，并將該內(nèi)容物渦流1分鐘。在大部分血漿蛋白離心成團(tuán)以后，將氯仿/甲醇萃取物轉(zhuǎn)移到新的試管中并用1.25ml氯仿完全混合。加入1.75ml H2O，將該內(nèi)容物短暫渦流，通過離心完成各層的分離。在除去較低的氯仿層(第一份萃取物)以后，將2.5mI氯仿和63μl濃HCl加入到余下的含水相中。離心以后收集氯仿層(第二份萃取物)。在氮氣下濃縮第一份和第二份(酸化的)氯仿萃取物并在硅膠板(硅膠60)(EM Science，Gibbstown，New Jersey)上點樣。按照Thomas和Holub(Biochim.Biophys.Acta，108192-98(1991)，通過引用結(jié)合到本文中)的方法，通過雙相TLC分離磷脂[相1氯仿/甲醇/14.8N氫氧化銨65∶35∶5.5(v/v/v)和相2氯仿/甲醇/88％甲酸/水55∶28∶5∶1(v/v/v/v)]。在兩次層析步驟之間，于氮氣下將TLC板在40℃干燥30分鐘。通過用0.1％8-苯胺基-1-萘-磺酸(ANS)(Sigma，St.Louis，Missouri)水溶液噴灑該板并在紫外線下觀察來檢測磷脂(Gaudette等，J.Biol.Chem.，26813773-13776(1993))。將相對于PC和LysoPC的斑點從板上刮下，并使用2ml乙酰氯/甲醇5∶50(v/v)于85℃在硅膠存在下甲基轉(zhuǎn)移2小時。采用已知量的十七烷酸(17∶0)作為內(nèi)標(biāo)。在甲基轉(zhuǎn)移作用以后，用石油醚萃取脂肪酸甲酯，并如前所述采用5890A型氣相層析儀(Hewlett Packard，Wilmington，Delaware)定量(Skeaff和Holub，In M.Lagarde，(ed)，Biology of Eicosanoids，152卷，63-76頁，Inserm，Paris(1987)，通過引用結(jié)合到本文中)。此處給出的PC和LysoPC的濃度是通過氣相層析(GC)測評由脂肪酸內(nèi)容物獲得，并用十七烷酸校準(zhǔn)。
通過Student’st-檢驗分析數(shù)據(jù)，當(dāng)p＜0.05時表示顯著性差異。
D.結(jié)果1.血漿PC和LysoPC濃度盡管卵巢癌受試者的血漿PC濃度(1.08±0.07μmol/ml，均數(shù)±SE)比正常對照(1.26±0.17μmol/ml)平均低14％，但差異并不顯著(p＜0.2)(圖1A)。相反，卵巢癌受試者的血漿LysoPC濃度比對照組明顯增高(平均43％；p＜001)(圖1B)。對照組和卵巢癌受試者的對應(yīng)的值是125.6±7.1nmol/ml(均數(shù)±SE)和179.7±10.0nmol/ml。卵巢癌患者的LysopC對PC的摩爾比率(0.17±0.01，均數(shù)±SE)與對照受試者(0.11±0.02)相比也顯著增高(圖1C)。
在對照和卵巢癌受試者兩組中有分別超過98％和88％的由本方法獲得的總血漿PC和LysoPC被萃取到第一次氯仿中(中性萃取物)。盡管在總血漿PC中僅占很少量，但是可觀察到卵巢癌受試者血漿的酸化萃取物比正常對照者顯著增多(21.6對14.4nmol/ml；p＜0.05)。
2.血漿PC和LysoPC的脂肪酸成分血漿PC的脂肪酸成分在對照組和卵巢癌患者之間沒有顯著性差異(圖2)。相反，按照總脂肪酸的mol％，卵巢癌受試者的血漿LysoPC含有比對照組顯著增高的棕櫚酰-和硬脂酰-LysoPC濃度以及較低的油酰-及特別是亞油酰-LysoPC濃度(圖3)。卵巢癌受試者中血漿棕櫚酰-對亞油酰-LysoPC的摩爾比率(5.3±0.3，均數(shù)±SE)比對照組(3.0±0.4)顯著增高(圖4)。
3.血漿棕櫚酰-LysoPC對亞油酰-LysoPC濃度摩爾比率的比較作為卵巢癌指標(biāo)的可能性與正常對照組相比，盡管卵巢癌受試者中血漿LysoPC濃度(圖1B)和LysoPC(圖1C)及棕櫚酰-LysoPC/亞油酰-LysoPC(圖4)的摩爾比率顯著增高；分別為p＜0.01，p＜0.01和p＜0.001，但是某些從受試者獲得的數(shù)據(jù)與對照組仍有重疊。因此，計算[LysoPC/PC摩爾比率]×[棕櫚酰-LysoPC/亞油酰-LysoPC摩爾比率]的值。對照組的值(0.324±0.054，均數(shù)±SE)與卵巢癌受試者(0.928±0.092，均數(shù)±SE)相比較。如圖5所示，卵巢癌受試者的平均值比對照組顯著增高(p＜0.001)。進(jìn)一步說，17例受試者中有15例具有比對照組的均數(shù)±1SD(0.0450)高的值，以及17例受試者中有13例具有比對照組的均數(shù)±2SD(0.596)高的值。
VIII.實施例卵巢癌患者血漿中LYSOPA和其成分脂肪酸的檢測A.實驗對象和血漿樣品從Toronto醫(yī)院婦科腫瘤門診部連續(xù)收集52例卵巢癌患者的血樣。血樣被收集在含有EDTA的試管中以減少溶血磷脂或磷脂的代謝或產(chǎn)生。從9例健康志愿者獲取正常樣品作為對照。如上所述離心樣品除去血小板和其它血液成分，并在-20℃冷凍血漿。如以下所述，測試血漿的LysoPA和其它的溶血磷脂。以臨床發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)評估患者存在活動期或靜止期疾病。
B.LysoPA純化如以上關(guān)于LysoPC所描述的方法純化LysoPA，但是僅測試酸化的氯仿萃取物或第二次酸化的氯仿萃取物。
C.LysoPA脂肪酸分析使用2ml乙酰氯/甲醇5∶50(v/v)在85℃于硅膠存在下將由TLC溶解的LysopA甲基轉(zhuǎn)移2.5小時。采用十七烷酸(17∶0)作為內(nèi)標(biāo)。如Skeaff和Holub(Skeaff和Holub，InM.Lagarde(ed.)，血液和血管細(xì)胞中類二十烷酸及相關(guān)物質(zhì)的生物學(xué)，152卷，63-76頁，Inserm，Paris(1987)，通過引用結(jié)合到本文中)所描述的，在甲基轉(zhuǎn)移作用以后，用石油醚萃取脂肪酸甲酯，該脂肪酸甲酯得自LysoPA中包含的脂肪酸，并通過在5890A型氣相層析僅(Hewlett Packard，Wilmington，Delaware)上氣相層析(GC)定量。此處給出的所有LysoPA的濃度是通過GC測評由脂肪酸內(nèi)容物獲得，并用十七烷酸校準(zhǔn)。
D.結(jié)果本實施例表明，與正常受試者相比卵巢癌患者的總LysoPA濃度顯著升高(如圖6所示)。然而，當(dāng)評定得自圖6所示的患者的血漿樣品是否存在活動期或靜止期疾病時，總LysoPA和具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的量比正常受試者血漿中這些化合物的相同物質(zhì)濃度明顯增高。如圖7所示，在某些靜止期疾病患者中具有多不飽和脂肪酸鏈的LysoPA的濃度是增加的。由于卵巢癌常常復(fù)發(fā)，這些結(jié)果可以反映患者通過臨床分析所不能檢測到的潛藏的腫瘤的存在。
E.討論溶血磷脂(LPAs)，如LysoPC和LysoPA是人類血漿的正常成分。血漿中大部分的LysoPC與白蛋白結(jié)合(Skipski等，Biochem.J.104(2)340-52(1967))。健康個體的血漿中LysoPC的絕對濃度在各研究之間有相當(dāng)大的變化(Skipski等，supra；Philips和Dodge，J.LipidRes.8676-681(1967)；Gillet和Besterman，Atherosclerosis 22111-124(1975)；Kriat等，J.Lipid Res.341009-1019(1993))。這種可變性似乎反映了研究人群之間總的血漿脂質(zhì)含量的不同，因為當(dāng)以總的血漿磷脂的百分比來表示時，始終觀察到LysoPC以大約6.5％的比率存在。在健康對照者中血漿LysoPC的估計值(假定PC占總血漿磷脂的68％；Skipski等，supra；Gillett和Besterman，supra)是總磷脂的7.5±1.0％(均數(shù)±S.E.)，該值通常與以前文獻(xiàn)報道的值相一致。在本研究中適度升高的值反映了第二個酸化萃取步驟的應(yīng)用，在該步驟中獲得大約總LysoPC的12％。相比而言，LysoPC以總磷脂的11.8±0.8％存在于卵巢癌患者的血漿中。并且，LysoPA以總磷脂的0.05％存在于卵巢癌患者的血漿中。在相應(yīng)的LysoPC的基礎(chǔ)上，與健康對照相比，卵巢癌患者血漿中棕櫚酰和硬脂酰-LysoPC種類增加，油酰和亞油酰-LysoPC種類降低，而花生四烯酰-LysoPC不變。
從這些實施例的結(jié)果明顯看出，與正常對照的血漿相比，卵巢癌患者血漿中LysoPA，特別是具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度是升高的。LysoPA，特別是具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度的升高，在患有活動期疾病的個體中更顯著，該活動期疾病既可通過腹水的存在、疾病的X線照片證據(jù)也可通過體檢來確定。在顯著比例的卵巢癌患者中，從顯示LysoPA濃度升高的散布區(qū)域(圖6)可看出這種增高是明顯的。當(dāng)患者被分為當(dāng)前活動期疾病和當(dāng)前非活動期疾病時，這種增高更明顯(圖7)。顯著比例(大約50％)的那些患有非活動期或靜止期疾病的受試者將在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。這可通過圖7中所示的增高的LysoPA濃度，特別是具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度來表明。因此，檢測血漿中LysoPA的濃度，特別是具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度可為指示治療反應(yīng)以及復(fù)發(fā)的早期檢測提供一種方法。假定在進(jìn)行治療的患者或靜止期疾病患者中檢測CA125的濃度能被推斷為診斷前患者的研究項目，這些結(jié)果表明，檢測LysoPA的濃度，特別是具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度將提供足夠的靈敏性和特異性，可用于早期篩查患有卵巢癌受試者的本發(fā)明的方法中。
LysoPA濃度，特別是具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度的檢測，既可單獨使用，也可與研究的多種標(biāo)記物結(jié)合使用，包括但不限于LysoPC、其它溶血磷脂、CA125、mCSF、TAC、可溶性IL2α受體和其它已知和未知的標(biāo)記物，為早期卵巢癌的檢測提供高度的靈敏性和/或特異性。
上述結(jié)果表明溶血磷脂水平的檢測能在早期、可治愈階段鑒別癌癥患者。溶血磷脂的水平也能提供一種診斷標(biāo)記物或確定患者對特殊形式治療的可能的反應(yīng)。而且，這種測定有助于為個體患者制定治療方案，并能在以前治療的患者中鑒別疾病的復(fù)發(fā)。
然而并不希望受任何特別的理論束縛，可能是在某些癌癥中LysoPC和LysoPA產(chǎn)生的增加引起這些脂質(zhì)的血漿和血清濃度的升高。然而引起卵巢癌患者血漿中LysoPC和LysoPA升高的來源和機(jī)制并不清楚，申請人則認(rèn)為卵巢癌細(xì)胞可能是增加的溶血磷脂的來源。增高的磷脂酶A1(PLA1)或PLA2或PLD活性與本實施例中所觀察到的LysoPC和LysoPA的血漿濃度的升高相一致。由于PLA2從PC的sn-2位上解離脂肪酸生成主要含有飽和脂肪酸的LysoPC，這就可以解釋飽和型的LysoPC(棕櫚酰和硬脂酰)增加。由于PLA1從sn-1位上解離脂肪酸，這就可以解釋LysoPA主要具有不飽和脂肪酸(亞油酰、花生四烯酸、DHA)。這暗示了磷脂酶的作用，即，當(dāng)主要含有飽和脂肪酸的LysoPC增加時，是磷脂酶A2(PLA2)的作用，而當(dāng)含有不飽和脂肪酸的LysoPA增加時，則是PLA1的作用。PLD可能在LysoPC、LysoPS、LysoPI、LysoPE和LysoPG向LysoPA的轉(zhuǎn)化中起作用。PLD的功能活性有可能改變存在于血清或血漿中的LysoPC的水平。在卵巢癌患者中，PLD活性的降低能導(dǎo)致LysoPC水平的增高。
已提出LysoPC和LysoPA能從許多細(xì)胞系中激活細(xì)胞。以上實施例證明，相對于正常對照來說，卵巢癌患者血漿中LysoPC和LysoPA濃度顯著增高。這種現(xiàn)象似乎并非是所有癌癥所共有的，比如6例測試的白血病患者中有5例的血漿LysoPC水平比正常對照樣品明顯降低(低于正常的一半)。在卵巢癌患者的血漿中，棕櫚酰-和硬脂酰-LysoPC種類的百分比顯著升高，而油酰，特別是亞油酰-LysoPC比對照受試者顯著降低。與對照受試者相比，卵巢癌患者血漿中LysoPC/PC和棕櫚酰-LysoPC/亞油酰-LysoPC的摩爾比率也顯著升高。此外，與對照組相比，患者血漿[LysoPC/PC]×[棕櫚酰-LysoPC/亞油酰-LysoPC]的計算值也顯著升高。最后，卵巢癌患者血漿中LysoPA和具有多不飽和脂肪酸的LysoPA的濃度也較高。這些值可作為指標(biāo)用于卵巢癌患者的早期診斷、預(yù)后判斷和治療監(jiān)測。
IX.實施例確診患有乳腺癌疾病的患者血清中LYSOPC的脂肪酸成分的變化A.實驗對象在MD Anderson癌癥中心(Houston，Texas)就診的23例確診患有乳腺癌的患者(采血樣前平均已確診6.9年)提供了分析用的血樣。采用在Guelph大學(xué)(Guelph，Ontario，加拿大)進(jìn)行營養(yǎng)/鍛煉研究的24例健康婦女作為對照受試者。乳腺癌患者的平均年齡為59歲(范圍30-77)，而對照受試者為36歲(范圍27-55)。
B.血清樣品將血液(7ml)抽進(jìn)不含抗凝劑的真空容器中，并在室溫放置20分鐘使其發(fā)生凝結(jié)。通過離心(1600xg，15分鐘)分離血清并儲存在-20℃直至分析。
C.脂質(zhì)萃取和磷脂分析如上述實施例中所描述的進(jìn)行脂質(zhì)萃取和磷脂分析，但是按照Holub和Skeaff在Methods Enzymol.141234-244(1987)中描述的方法(通過引用結(jié)合到本文中)，通過單相層析使用氯仿/甲醇/冰乙酸/水50∶37.5∶3.5∶2 v/v/v/v溶劑系統(tǒng)來分離磷脂。
從板上刮下對應(yīng)于PC和LysoPC的帶，并在甲醇中使用2ml濃硫酸于85℃在硅膠存在下甲基轉(zhuǎn)移3小時。
D.結(jié)果
LysoPC/PC的比率在對照組和乳腺癌組之間非常相似(分別為0.093±0.004和0.106±0.005)。兩組間LysoPC的脂肪酸成分不同。特別是，160與182n-6(棕櫚酸與亞油酸)的比率在對照組(2.32±0.13)和乳腺癌組(5.48±0.30)之間有顯著性差異(p＜0.01)。設(shè)定3.50的值作為該比率的“截斷點”，這樣如果測試的受試者的樣品提供了一個至少3.50的160/182n-6的值，則認(rèn)為他們患有乳腺癌。如果測試的受試者的樣品提供了一個低于3.5的該比率的值，則認(rèn)為她沒有乳腺癌。在本實施例中，2/23或8.7％的受試者為假陰性(即患有乳腺癌但不超過截斷點，并因此歸為沒有乳腺癌的一類)。未發(fā)現(xiàn)有假陽性。
在本實施例中，通過建立一個從3.00到3.50的160/182n-6比率值的范圍，可進(jìn)一步精揀這些結(jié)果。具有降低到這一范圍的值的測試樣品可受益于第二個試驗，該試驗測定受試樣品中的LysoPC中不同的脂肪酸成分的比率，并與得自對照受試者的值相比較。在本實施例中，對一例癌癥患者和四例對照受試者進(jìn)行了脂肪酸181/182n-6(油酸/亞油酸)的比率值的測定，這些樣品所得到的脂肪酸160/182n-6的值均降至所述范圍內(nèi)。對于第二個比率，則建立了1.0的截斷值(即至少1.0的比率才表示乳腺癌的存在)。使用這一試驗，假陰性的數(shù)量減至1或4.3％，而假陽性率仍為0。
這些結(jié)果證明，通過分析血清溶血磷脂如LysoPC的脂肪酸成分并將得自該受試者的值與得自對照受試者的值相比較，在確診患有疾病的受試者中檢測乳腺癌的存在是可能的。附加的第二個試驗(即從脂肪酸成分的不同組合得到的第二個比率)增加了本方法的整體檢測能力。
X.實施例新近診斷患有乳腺癌的婦女血清中LYSOPC的脂肪酸成分的變化A.實驗對象最近診斷患有乳腺癌的15例婦女在外科手術(shù)前采取血樣，并將血清送到Sante Publique du Quebec中心(Beauport Quebec)。15例沒有癌癥的年齡相當(dāng)?shù)呐詫φ帐茉囌咄瑯硬杉鍢悠匪屯撝行?。受試者的平均年齡為54歲(范圍32-73)。
如上述實施例8所描述的進(jìn)行血清樣品和脂質(zhì)萃取以及磷脂分析。
B.結(jié)果盡管有關(guān)LysoPC的量在癌癥受試者和正常受試者之間未觀察到不同，但血清LysoPC的脂放酸成分則不同。癌癥受試者中160/182n-6的比率(4.62±0.35)與對照組(2.94±0.32)相比顯著增大(p＜0.05)。采用LysoPC中的160/182n-6為3.50的截斷值(即需要至少3.5的值來表示乳腺癌的存在)，通過本試驗15例乳腺癌受試者中有4例被錯誤確定為沒有乳腺癌(假陰性率＝26.7％)。15例中有2例被錯誤確定為患有乳腺癌(假陽性率＝13.3％)。對于160/182n-6的值降至3.00到3.50范圍內(nèi)的樣品采用第二個試驗，測定LysoPC中181/182n-6的值，并確定截斷點為至少1.00，假陰性率則減少至0(所有LysoPC的160/182n-6比率在3.00至3.50的范圍內(nèi)的四例受試者，其LysoPC的181/182n-6比率均大于1.00)。假陽性的數(shù)量增至十五分之三或20％。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法在新近診斷患有疾病的患者(即轉(zhuǎn)移前的大部分病例)中能檢測出乳腺癌的存在。這就允許在進(jìn)一步采用侵入性方法以前，篩查可能有乳腺癌存在的婦女人群。
在這些檢測乳腺癌的實施例中，采用乳腺癌受試者和正常受試者可獲得的數(shù)據(jù)建立截斷點和脂肪酸的比率值的范圍，據(jù)此進(jìn)一步測試樣品以確定另外的患有癌癥的受試者。溶血磷脂如LysoPC中脂肪酸的特殊組合的截斷點可以由得自正常受試者和那些新近診斷患有乳腺癌的受試者的另外的數(shù)據(jù)建立。選擇所述截斷點以使假陰性結(jié)果減至最少(例如低于10％)而不產(chǎn)生不能接受的水平的假陽性結(jié)果(例如大于30％)。也即，測定所述截斷點，以使降至截斷點以下并因此鑒定為沒有癌癥的癌癥患者的數(shù)量減至最少，并且也使在截斷點以上但卻沒有癌癥的受試者的數(shù)量減至最少。除了將受試者的LysoPC中兩種脂肪酸的比值與正常受試者的LysoPC中這些脂肪酸的比值相比較，還能將脂肪酸的一種組合的比值與脂肪酸的第二種組合的比值相比較。此外，在本實施例中采用LysoPC中脂肪酸的特殊組合形成用于比較的比率，即160/182n-6和181/182n-6，其它脂肪酸的組合也可用于該比率?？赏ㄟ^測定脂肪酸來選擇另外的脂肪酸組合，與正常樣品中這些同樣的脂肪酸的量相比，該脂肪酸在乳腺癌樣品中是以變化的量存在。
此處引用的各種出版物通過全篇參考結(jié)合到本文中。
如本領(lǐng)域中從事本發(fā)明的技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明可以以不同于以上那些特別公開的而又不違反本發(fā)明的精神或潛在特性的形式來表達(dá)。因此，以上所述的本發(fā)明的具體實施方案無論從那一方面來看均認(rèn)為是說明性的而不是限制性的。本發(fā)明的范圍顯示在所附的權(quán)利要求和其等同條款中，而不限于前述中所包含的實施例。
權(quán)利要求
1.在受試者中檢測與溶血磷脂濃度改變有關(guān)的癌癥存在的方法，包含測定得自所述受試者的體液樣品中溶血磷脂的濃度，并且將該溶血磷脂濃度與沒有癌癥的正常受試者樣品中的溶血磷脂濃度相比較，憑借所述受試者樣品中溶血磷脂的濃度相對于正常受試者樣品中溶血磷脂濃度的改變來指示癌癥的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測定樣品中至少一種其它類型的溶血磷脂濃度的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測定樣品中所述溶血磷脂亞型濃度的步驟。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在受試者樣品中檢測棕櫚酰-X、硬脂酰-X、油酰-X、亞油酰-X、花生四烯酰-X和二十二碳六烯酰-X酯肪酸濃度的步驟，此處X選自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPI、LysoPE和LysoPG溶血磷脂，并將所述濃度與對照濃度比較。
5.權(quán)利要求4的方法，該方法進(jìn)一步包括測定樣品中棕櫚酰-X對亞油酰-X的摩爾比值，并將所述比率與對照比率比較。
6.權(quán)利要求4的方法，該方法進(jìn)一步包括測定受試者樣品中[X/PC]×[棕櫚酰-X/亞油酰-X]的值，并將所述值與對照值比較。
7.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測定受試者樣品中其它的癌細(xì)胞標(biāo)記物濃度的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述其它的癌細(xì)胞標(biāo)記物選自CA125、Tac、可溶性IL2α受體、mCSF、OVX1、CEA、PSA、CA15-3和CA19.9。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是選自卵巢癌、輸卵管癌、子宮癌、腹膜內(nèi)癌(intraperitoneal carcinomatosis)和宮頸癌的婦科癌癥。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定溶血磷脂濃度的步驟包含將所述樣品與抗-溶血磷脂抗體接觸以結(jié)合溶血磷脂，并檢測所述結(jié)合的抗體。
11.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測定樣品中所述溶血磷脂的脂肪酸成分和溶血磷脂的所述脂肪酸濃度的步驟。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主鏈的sn-1或sn-2溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1或sn-2位有一條通過?；I連接的脂肪酸單鏈，而且有一個羥基位于其它的sn-1或sn-2位。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主鏈的sn-1溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1位有一條通過烷基或鏈烯基鍵連接的長鏈醇位，而且有一個羥基位于sn-2位。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述溶血磷脂具有下列通式結(jié)構(gòu).sn-1溶血磷脂
sn-2溶血磷脂
其中X是一條單鏈脂肪酸或長鏈醇，R1是一條單鏈脂肪酸，并且其中R2是衍生的磷酸酯。
15.權(quán)利要求14的方法，其中X選自180、160、181、182、204n-6和226n-3。
16.權(quán)利要求14的方法，其中R1選自棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸。
17.權(quán)利要求14的方法，其中R2選自氫、膽堿、肌醇、乙醇胺、甘油和絲氨酸。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶血磷脂選自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
19.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測定具有特殊的飽和或不飽和度脂肪酸和/或脂肪酸鏈長度的溶血磷脂的濃度的步驟。
20.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測定具有特殊的長鏈醇的溶血磷脂的濃度的步驟。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品選自血漿、血清、尿液、唾液、腹水、腦脊液和胸水。
22.權(quán)利要求1的方法，其中相對于沒有癌癥的正常受試者的樣品而言，所述癌癥伴有受試者中增高的溶血磷脂濃度的存在。
23.在得自受試者的體液樣品中檢測癌癥存在的方法，該方法包括含以下步驟(a)測定所述受試者體液樣品中的溶血磷脂的濃度；(b)測定所述受試者樣品中的所述溶血磷脂的脂肪酸濃度；和(c)將步驟a和b中獲得的值與得自對照組的值相比較，憑借步驟a和b中獲得的值相對于得自對照組的值的改變來指示癌癥的存在。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述濃度被標(biāo)準(zhǔn)化為選自其它溶血磷脂、磷脂、白蛋白和肌酐的化合物的濃度。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述溶血磷脂選自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述癌癥是婦科癌癥。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶血磷脂的濃度以連續(xù)的時間間隔測定，以確立溶血磷脂濃度隨時間而改變的比率。
29.監(jiān)測受試者中不同時期癌癥存在的方法，包括a)首次測定得自所述受試者的體液樣品中的溶血磷脂的濃度；b)在以后時間測定得自所述受試者的體液樣品中的溶血磷脂的濃度；和c)比較步驟a和b中獲得的濃度，以決定在以后時間得自所述受試者的樣品中溶血磷脂的濃度相對于首次得自所述受試者的樣品中溶血磷脂的濃度是否增高或降低，來檢測癌癥的存在。憑借在所述以后時間的樣品中溶血磷脂濃度的增高來指示存活腫瘤細(xì)胞的數(shù)量的增加，而該溶血磷脂濃度的降低則指示存活腫瘤細(xì)胞的數(shù)量的減少。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述腫瘤是選自卵巢癌、輸卵管癌、子宮癌、腹膜內(nèi)癌和宮頸癌的婦科癌癥。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述腫瘤是乳腺癌。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述測定溶血磷脂濃度的步驟包括將所述樣品與抗-溶血磷脂抗體接觸。
33.權(quán)利要求29的方法，該方法進(jìn)一步包括測定樣品中所述溶血磷脂的脂肪酸成分和溶血磷脂的所述脂肪酸濃度的步驟。
34.權(quán)利要求29的方法，該方法進(jìn)一步包括測定具有特殊的長鏈醇的溶血磷脂的濃度的步驟。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主鏈的sn-1或sn-2溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1或sn-2位有一條通過?；I連接的脂肪酸單鏈，而且有一個羥基位于其它的sn-1或sn-2位。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主鏈的sn-1溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1位有一條通過烷基或鏈烯基鍵連接的長鏈醇，而且有一個羥基位于sn-2位。
37.權(quán)利要求29的方法，其中所述溶血磷脂選自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
38.在受試者中檢測婦科癌癥的方法，包括測定得自所述受試者的體液樣品中溶血磷脂的濃度，并且將該溶血磷脂濃度與沒有癌癥的正常受試者樣品中的溶血磷脂濃度相比較，憑借所述受試者樣品中溶血磷脂的濃度相對于正常受試者樣品中溶血磷脂濃度的增加來指示婦科癌癥的存在。
39.在受試者中檢測癌癥的方法，包括在得自受試者的體液樣品中測定溶血磷脂中的脂肪酸的濃度比值，并與得自沒有癌癥的正常受試者樣品中的溶血磷脂中相同脂肪酸的濃度比值相比較，憑借受試者樣品中的比值相對于正常受試者樣品中的比值的改變來指示癌癥的存在。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述改變是增高。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述癌癥是乳腺癌，并且所述溶血磷脂是LysoPC。
42.權(quán)利要求40的方法，其中在所述受試者樣品中的LysoPC中脂肪酸的所述濃度比值至少是3.4。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述LysoPC中的所述脂肪酸是棕櫚酸和亞油酸。
44.權(quán)利要求41的方法，其中當(dāng)所述受試者樣品中的LysoPC中脂肪酸的所述濃度比值小于3.4而大于3時，測定所述體液樣品中的LysoPC中不同脂肪酸的比值，憑借至少1個所述不同脂肪酸的比值來指示乳腺癌的存在。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述脂肪酸是油酸和亞油酸。
46.權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥是選自卵巢癌、輸卵管癌、子宮癌、腹膜內(nèi)癌和宮頸癌的婦科癌癥。
47.權(quán)利要求39的方法，其中所述溶血磷脂選自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
48.權(quán)利要求38的方法，其中所述溶血磷脂的濃度以連續(xù)的時間間隔測定，以在所述受試者中確立溶血磷脂濃度隨時間而改變的比率。
49.在得自受試者的體液樣品中測定溶血磷脂濃度的診斷試劑盒，以檢測受試者相對于沒有癌癥的正常受試者，其與溶血磷脂濃度改變有關(guān)的癌癥，所述試劑盒包含檢測得自受試者的體液樣品中的溶血磷脂濃度的試劑。
50.權(quán)利要求49的診斷試劑盒，其中所述試劑包括抗-溶血磷脂抗體。
51.權(quán)利要求49的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括在轉(zhuǎn)運(yùn)或儲存期間抑制樣品中溶血磷脂的產(chǎn)生或水解的試劑。
全文摘要
本發(fā)明是在受試者中檢測癌癥存在的方法,通過測定得自受試者的體液樣品中溶血磷脂的濃度,并將這些濃度與得自沒有癌癥的正常受試者的樣品中存在的濃度相比較,觀察溶血磷脂水平的改變來指示癌癥是否存在。該方法可用于受試者中癌癥如婦科癌癥和乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷,并能監(jiān)測不同時期的治療效果。
文檔編號G01N33/574GK1269014SQ98805125
公開日2000年10月4日 申請日期1998年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月21日
發(fā)明者G·B·米爾斯, B·J·霍勒布, D·C·高德特 申請人:阿泰爾金生物技術(shù)公司, 圭爾夫大學(xué)