專利名稱：人胎盤泌乳素診斷試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板，具體地說(shuō)是涉及人胎盤泌乳素(HPL)的診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法和應(yīng)用。
人胎盤泌乳素(HPL)是由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的，測(cè)定孕婦血中HPL的含量，能反映胎盤體積和功能的變化，目前多采用放射免疫法，雖測(cè)值可信，但由于放射性衰變和需要貴重的醫(yī)療設(shè)備，不易普及基層醫(yī)院。
本發(fā)明的目的是提供一種在孕晚期、足月或過(guò)期妊娠情況下，測(cè)定HPL值的診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明中人胎盤泌乳素(HPL)診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法采用如下步驟1HPL的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產(chǎn)婦胎盤5-10個(gè)，應(yīng)用組織搗碎機(jī)勻漿，加2倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無(wú)NH+。
1.2 sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規(guī)處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分別收集洗脫液，應(yīng)用HPL血球試劑檢查各管濃度，收集HPL高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無(wú)NH+。
1.3 HPL偶聯(lián)sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產(chǎn)的sepharose4B10-40ml，經(jīng)0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調(diào)PH值，使之維持在5-12左右，反應(yīng)5-20分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經(jīng)0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的HPL抗體攪拌4℃過(guò)夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定280nmOD值，計(jì)算其偶聯(lián)率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入HPL抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時(shí)，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集HPL高濃度區(qū)，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯(lián)sepharose4B親和層析柱制備與HPL抗體偶聯(lián)sepharose4B相同，其偶聯(lián)率為7.28％。將濃縮除鹽HPL樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為HPL純品。
2．HPL抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴結(jié)周圍多點(diǎn)注射，HPL抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml,(每千克體重50-400μgHPL抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經(jīng)5次免疫后，試血效價(jià)達(dá)到1∶64倍時(shí)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)，頸動(dòng)脈放血分離血清。
3．人“O”型紅細(xì)胞的醛化取健康男性“O”型紅細(xì)胞，經(jīng)戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。
4．HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將HPL IgG分別稀釋成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恒溫振蕩水浴下反應(yīng)1-3小時(shí)，經(jīng)含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合IgG，配成1％血球懸液，生產(chǎn)出HPL凍干診斷血球。
5．將HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、150、200倍，于56℃滅活10-40分鐘，分別加入等體積煮沸后冷卻40-70℃的1-4％瓊脂液，混合均勻鋪板。瓊脂厚度1-4mm，打孔直徑1-5mm，孔距0.5-3cm。
本發(fā)明制備的HPL的鑒定1.8％聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳，常規(guī)制備分離膠與濃縮膠，取50μg提純的HPL純品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳，電流2mA/管，用1％氨基黑染色呈現(xiàn)一條帶。
2．免疫電泳結(jié)果表明本室提純的HPL只與HPL抗血清和妊娠全血清呈現(xiàn)一條免疫沉淀弧。
3．雙向免疫交叉試驗(yàn)結(jié)果表明提純的HPL與抗HCG，抗AFP，抗SP，抗人全血清無(wú)免疫沉淀線，而與抗HPL血清和抗妊娠全血清有明顯的沉淀線，從而表明所提純的HPL為胎盤泌乳素純品。
以上三種方法按“實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)技術(shù)”介紹的方法進(jìn)行。
4．檢查單向免疫擴(kuò)散板非特異性取非孕婦女血清9份，男性血清9份，分別加入HPL單向免疫板瓊脂孔內(nèi)各30μl，放置37℃恒溫24小時(shí)判定結(jié)果，均無(wú)沉淀環(huán)出現(xiàn)，說(shuō)明HPL單向免疫板無(wú)非特異性反應(yīng)。
5．穩(wěn)定性檢查將HPL單向免疫板存放4℃不同月份進(jìn)行比較，每批均加入相同樣品各30μl，放置37℃恒溫24小時(shí)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)放置6個(gè)月以內(nèi)的免疫板，其沉淀環(huán)大小和清晰度無(wú)差別，而放置6個(gè)月以上的免疫板，沉淀環(huán)清晰度略差，由于免疫板放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致HPL抗血清失活。經(jīng)觀察比較，免疫板使用期限應(yīng)在6個(gè)月以內(nèi)為宜，每批使用前，均用HPL標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明。
1HPL的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產(chǎn)婦胎盤10個(gè)，應(yīng)用組織搗碎機(jī)勻漿，加2倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0分鐘，離心4000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，5000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無(wú)NH+。
1.2 sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規(guī)處理裝柱(2.5×100cm)用0.2mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速60ml/h以每管5ml分別收集洗脫液，應(yīng)用HPL血球試劑檢查各管濃度，收集HPL高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無(wú)NH+。
1.3HPL偶聯(lián)sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產(chǎn)的sepharose 4B30ml，經(jīng)0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調(diào)PH值，使之維持在11左右，反應(yīng)10分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經(jīng)0.1mol/LNaHCO3(PH9)透析的HPL抗體攪拌4℃過(guò)夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定280nmOD值，計(jì)算其偶聯(lián)率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入HPL抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.4)洗脫，流速30ml/h洗至280nmOD值＜0.02時(shí)，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速60ml/h，收集HPL高濃度區(qū)，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯(lián)sepharose4B親和層析柱制備與HPL抗體偶聯(lián)sepharose4B相同，其偶聯(lián)率為7.28％。將濃縮除鹽HPL樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為HPL純品。
2．HPL抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗20mg,10天后向淋巴結(jié)周圍多點(diǎn)注射，HPL抗原加福氏完全佐劑2ml,(每千克體重150μgHPL抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經(jīng)5次免疫后，試血效價(jià)達(dá)到1∶64倍時(shí)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)，頸動(dòng)脈放血分離血清。
3．人“O”型紅細(xì)胞的醛化取健康男性“O”型紅細(xì)胞，經(jīng)戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。
4．HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成5％血球，將HPLIgG分別稀釋成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在45℃恒溫振蕩水浴下反應(yīng)1.5小時(shí)，經(jīng)含有1％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合IgG，配成1％血球懸液，生產(chǎn)出HPL凍干診斷血球。
5．將HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、150、200倍，于56℃滅活10-40分鐘，分別加入等體積煮沸后冷卻56℃的2.4％瓊脂液，混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑4.0mm，孔距1.5cm。
本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例取10μl孕婦血清用1ml鹽水稀釋成100倍等待檢測(cè)用，在V型微量血凝板上，從第1孔到第5孔各加樣品稀釋水25μl，取100倍稀釋的血清25μl加到第1孔，用微量加樣器從第1孔起依次做2倍稀釋到第4孔，第5孔為空白對(duì)照，凍干HPL診斷血球用血球稀釋水2ml溶解并搖勻，4℃過(guò)夜放置后應(yīng)用，取25μl稀釋血球從第1孔到第5孔各加25μl，震勻后放37℃，1小時(shí)取出判定結(jié)果。
判定標(biāo)準(zhǔn)孕婦血清中HPL能與HPL抗體致敏血球出現(xiàn)凝集反應(yīng)(陽(yáng)性)，反之，如血清中不含有或濃度較低，則不出現(xiàn)凝集(陰性)，依據(jù)出現(xiàn)血球凝集的血清最大稀釋倍數(shù)乘以致敏血球的敏感度(0.125μg/ml)，便可確定血清中HPL的濃度。
判定方法血球全部沉入孔底為陰性，根據(jù)凝集程度分為1-4各階段，凝集在2以上可判定為陽(yáng)性。
計(jì)算公式血清中HPL含量(μg/ml)=血球凝集孔的血清稀釋倍數(shù)×診斷血球的敏感度(μg/ml)。
用毛細(xì)玻璃管取孕婦耳垂血0.1ml，分離出血清，用微量加樣器吸取15微升加入瓊脂孔內(nèi)(注意不要溢出孔外)，加樣完畢后，放置20-30分鐘，待孔內(nèi)血清沉淀完后再補(bǔ)加15微升血清，總計(jì)為30微升，蓋好塑料板，水平放人溫盒內(nèi)，在37℃條件下擴(kuò)散24小時(shí)觀察結(jié)果，分別記錄所測(cè)樣品的免疫沉淀環(huán)直徑(mm)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出HPL值，即得該樣品的HPL含量。通過(guò)應(yīng)用HPL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定出血球敏感度為0.025μg/ml，確定孕38周以上大于5μg/ml為正常值，5μg/ml為警界值，小于5μg/ml為危險(xiǎn)值。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法是在瓊脂板孔內(nèi)分別加入4個(gè)不同濃度的HPL標(biāo)準(zhǔn)液，每孔加樣30μl，放人37℃恒溫24小時(shí)后觀察沉淀環(huán)直徑，發(fā)現(xiàn)選擇150倍稀釋后所做的瓊脂板，免疫沉淀環(huán)直徑比較清晰，其擴(kuò)散環(huán)直徑分別為9mm、6.5mm、5.2mm、4.7mm，以標(biāo)準(zhǔn)含量為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液免疫沉淀環(huán)直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。(參考德國(guó)Benring研究所的HPL標(biāo)準(zhǔn))
權(quán)利要求
1.一種人胎盤泌乳素診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法，該方法采用如下步驟(1)HPL的提純(1.1)飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產(chǎn)婦胎盤5-10個(gè)，應(yīng)用組織搗碎機(jī)勻漿，加2倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無(wú)NH+。(1.2)sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規(guī)處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分別收集洗脫液，應(yīng)用HPL血球試劑檢查各管濃度，收集HPL高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無(wú)NH+。(1.3)HPL偶聯(lián)sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產(chǎn)的sepharose4B10-40ml，經(jīng)0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調(diào)PH值，使之維持在5-12左右，反應(yīng)5-20分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經(jīng)0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的HPL抗體攪拌4℃過(guò)夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定280nmOD值，計(jì)算其偶聯(lián)率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入HPL抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時(shí)，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集HPL高濃度區(qū)，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。(1.4)抗人全血抗體偶聯(lián)sepharose4B親和層析柱制備與HPL抗體偶聯(lián)sepharose4B相同，其偶聯(lián)率為7.28％。將濃縮除鹽HPL樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為HPL純品。(2)HPL抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴結(jié)周圍多點(diǎn)注射，HPL抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml,(每千克體重50-400μgHPL抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經(jīng)5次免疫后，試血效價(jià)達(dá)到1∶64倍時(shí)(雙向瓊脂擴(kuò)散法)，頸動(dòng)脈放血分離血清。(3)人“O”型紅細(xì)胞的醛化取健康男性“O”型紅細(xì)胞，經(jīng)戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。(4)HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將HPLIgG分別稀釋成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恒溫振蕩水浴下反應(yīng)1-3小時(shí)，經(jīng)含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合IgG，配成1％血球懸液，生產(chǎn)出HPL凍干診斷血球。(5)將HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、150、200倍，于56℃滅活10-40分鐘，分別加人等體積煮沸后冷卻40-70℃的1-4％瓊脂液，混合均勻鋪板。瓊脂厚度1-4mm，打孔直徑1-5mm，孔距0.5-3cm。
2.一種人胎盤泌乳素診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板在判定胎盤功能方面的應(yīng)用。
全文摘要
一種人胎盤泌乳素診斷血球、單向免疫擴(kuò)散板的制備方法和應(yīng)用,是應(yīng)用免疫學(xué)原理,從人胎盤提取HPL,經(jīng)兩次親和層析后獲得高純度的HPL,分別制成診斷血球和擴(kuò)散板,本發(fā)明的HPL純品為單一成份,無(wú)非特異性,并與HPL抗血清有免疫反應(yīng),而與抗HCG、抗AFP、抗人全血清無(wú)免疫反應(yīng),應(yīng)用本發(fā)明,方法簡(jiǎn)單,操作方便,性能穩(wěn)定,結(jié)果準(zhǔn)確,一般實(shí)驗(yàn)室均可操作,在臨床上對(duì)妊娠高血壓綜合癥、胎兒發(fā)育遲緩、死胎、過(guò)期妊娠等異常疾病的診斷有較大參考意義,是圍產(chǎn)期監(jiān)護(hù)的最佳診斷試劑。
文檔編號(hào)G01N33/554GK1289926SQ99113260
公開日2001年4月4日 申請(qǐng)日期1999年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月24日
發(fā)明者王曉東 申請(qǐng)人:吉林省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所