專利名稱：使用三核苷酸重復(fù)序列診斷神經(jīng)精神疾病的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是使用三核苷酸重復(fù)序列診斷神經(jīng)精神疾病的方法及試劑盒。更具體地說，本發(fā)明涉及基因擴增方法和反向斑點雜交(reversedot hybridization)及寡核苷探針技術(shù)。本發(fā)明的方法和探針是具體來說與檢測SCAIII基因有關(guān)。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，診斷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)精神性疾病很難診斷和治療，因為它們的病因及發(fā)病機制還不清楚。近來發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)精神疾病與特定的基因有關(guān)。因此，利用這些基因準(zhǔn)確診斷這類疾病方面已進行了大量的研究。
三核苷酸重復(fù)序列(TNR)是微衛(wèi)星DNA，這些DNA在基因組中以3-bp前后串聯(lián)方式重復(fù)出現(xiàn)。人類遺傳學(xué)尤其關(guān)注這些微衛(wèi)星DNA，因為它們的長度因人而異，使其在一些遺傳疾病的基因圖譜和臨床診斷或預(yù)測方面非常有用，尤其是神經(jīng)精神疾病。例如，正常個體的基因組DNA有數(shù)十個拷貝的TNR。而據(jù)報道神經(jīng)精神疾病的患者，其特定的TNR與正常個體相比增加幾倍到上百倍。
1991年，在脆性X染色體綜合征患者的基因組中首次報道了CGG重復(fù)序列數(shù)目的增加。從此，有關(guān)三核苷酸序列增多的類似疾病有很多報道，包括在1996年報道的friedreich’共濟失調(diào)，1997年報道的SCAVI和SCAVII綜合征?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)13種疾病與三核苷酸重復(fù)序列增多有關(guān)。
脆性X染色體綜合征的一項研究將患者染色體Xq27.3(FRAXA)基因座克隆，這項研究揭示在患者中FRAXA數(shù)目增加是常見的現(xiàn)象(Yu，S.etal.，Science，2521179-1181，1991)。另外，三核苷酸重復(fù)序列增多也出現(xiàn)于肌強直性營養(yǎng)不良的個體，造成不穩(wěn)定的有絲分裂而導(dǎo)致體細(xì)胞鑲嵌。
另外，TNR增多相關(guān)的疾病還包括Huntington’s疾病，脊髓小腦共濟失調(diào)一型(SCAI)，X聯(lián)鎖的脊髓延髓萎縮(SBMA)，dentatorubraland pallidoluysian萎縮(DRPLA)，脊髓小腦共濟失調(diào)三型(SCAIII)和FRAXE智力發(fā)育遲緩。
近來分子遺傳學(xué)提供很好的證據(jù)說明一些遺傳性神經(jīng)精神疾病主要歸因于TNR數(shù)目的增加。這些包括TNR的基因的表達產(chǎn)物被認(rèn)為是在腦內(nèi)起重要作用的激酶，但是，TNR與發(fā)病機制的相關(guān)性還沒有搞清楚。
由TNR增多引起的疾病具有相對常見的臨床表現(xiàn)。具體地說，這類疾病具有四種常見的臨床表現(xiàn)早現(xiàn)遺傳現(xiàn)象，遺傳傾向(常染色體顯性和性染色體顯性)，神經(jīng)退行性變或智力發(fā)育遲緩，體細(xì)胞鑲嵌。
早現(xiàn)遺傳現(xiàn)象是遺傳性疾病在譜系的較近世代中顯示出發(fā)病更早，病情更重的一種現(xiàn)象。即病情在每一代都加重。例如，肌強直性營養(yǎng)不良在一個三代家庭中各代的表現(xiàn)不同。祖父在六七十歲發(fā)病，父親在三四十歲發(fā)病，孫子在十幾歲發(fā)病。DNA序列分析顯示正常個體中CGG重復(fù)序列單位出現(xiàn)50或50以下的拷貝。那些患有脆性X染色體綜合征的個體出現(xiàn)200或更多的CGG重復(fù)序列單位。正常的攜帶者是那些攜帶基因而不發(fā)病的個體，即智力正常而觀察不到典型患者的表現(xiàn)，正常攜帶者中具有中等數(shù)量的重復(fù)序列，從60到200不等。當(dāng)正常攜帶者傳遞基因給下一代時，常出現(xiàn)重復(fù)序列增多，從60-200增加到200以上。脆性X染色體綜合征除了智力發(fā)育遲緩以外，還有以下特點面容異常、耳大、男性青春期后的巨睪癥。大多數(shù)與TNR增多相關(guān)的疾病都觀察到以上情況，所以對這類疾病的預(yù)測是可能的。
作為遺傳學(xué)中一個所謂動態(tài)突變(dynamic mutation)的例子，常染色體顯性或性染色體顯性遺傳是一種現(xiàn)象，其中的遺傳信息本該在連續(xù)的各代保持一致，但遺傳信息就在其下一代發(fā)生改變。
神經(jīng)退行性變或智力發(fā)育遲緩正是患者到醫(yī)院就醫(yī)的原因。智力發(fā)育遲緩是fragile X或FRAXA綜合征的主要癥狀，肌強直性營養(yǎng)不良的主要癥狀是進行性肌肉病變惡化引起的肌張力下降，其它疾病的主要癥狀是共濟失調(diào)。所以，神經(jīng)精神性疾病可以通過檢測那些有癥狀出現(xiàn)的患者的基因來診斷。
神經(jīng)精神性疾病的一個特點-體細(xì)胞鑲嵌是通過患者基因的southern雜交和甲基化分析來檢測的，例如，脆性X染色體綜合征患者或其家庭的檢測結(jié)果是除了一條正常的單一條帶以外還出現(xiàn)一彌散條帶，這一結(jié)果顯示CGG重復(fù)序列單位數(shù)目的增加在各代間是不同的。這要歸因于以下事實，即CGG重復(fù)序列單位的數(shù)目因為有絲分裂和減數(shù)分裂而出現(xiàn)不同程度的增加。據(jù)報道，脆性X染色體綜合征患者的各器官間也具有不同的CGG重復(fù)序列單位數(shù)目。這樣就使得我們很難在產(chǎn)前通過絨毛標(biāo)本來準(zhǔn)確診斷脆性X染色體綜合征。事實上，盡管在外周血中很明顯，但據(jù)報道異常甲基化通過產(chǎn)前診斷并沒有檢測到。
由于TNR數(shù)目增加引起的神經(jīng)精神性疾病有一個共同點，即基因重復(fù)序列存在于幾乎所有病人相同的基因位點上。神經(jīng)精神性疾病的一個原因-基因突變看起來是來源于相同的祖先(建立者效應(yīng)，foundereffect)，因為它可歸因于某一特定基因位點上的異常。相反，引起馬凡氏綜合征的突變或常染色體顯性遺傳的遺傳性肥厚性心肌病的突變在很多外顯子上都可見到。例外的是，發(fā)現(xiàn)脆性X染色體綜合征是一個外顯子的突變引起的，而不是TNR序列引起的。然而，幾乎所有的神經(jīng)精神性疾病都是某一基因位點的突變引起的。
連鎖分析顯示導(dǎo)致神經(jīng)精神性疾病的基因包含數(shù)目增多的TNR從而在染色體上出現(xiàn)相同的多態(tài)性標(biāo)記。
神經(jīng)精神性疾病是某一基因上TNR數(shù)目增加這一簡單機制引起的，利用這一事實可以臨床診斷神經(jīng)精神性疾病。也就是說，可以通過檢查TNR數(shù)目增多的程度而不是所有的外顯子突變來高度準(zhǔn)確地檢測神經(jīng)精神性疾病。脆性X染色體綜合征可常規(guī)地通過檢查來自可疑個體細(xì)胞的X染色體而確定并達到50％的準(zhǔn)確性，其中的細(xì)胞是在缺少葉酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。
檢測與神經(jīng)精神性疾病相關(guān)的TNR的方法已經(jīng)建立并獲得專利(U.S.Patent Nos.5,545,549，5,650,277，5,597,694，5,723,301 and5,582,979，and WO 97/27382)。尤其是與亨廷頓氏病相關(guān)的基因已獲專利(General Hospital Ccrporation；U.S.Patent Nos.5,538,844，5,686,288 and 5,693,757 and EP No.0 814 977)。然而，用含有TNR的基因座位進行反向斑點雜交或聚合酶鏈反應(yīng)-微量板雜交(PCR-MPH)的方法來診斷神經(jīng)精神性疾病還沒有任何報道。
應(yīng)用這些分子遺傳學(xué)方法可以精確地診斷神經(jīng)精神性疾病。尤其是改良的斑點雜交方法反向斑點雜交，因為是在一個膜上或板上使用多個探針一次操作，可望成為醫(yī)院里有用的常規(guī)篩選方法，這種方法是將探針在膜上或板上固定后，待測DNA與探針雜交并進行定量分析。
使用PCR和反向斑點雜交進行HLA分型的方法已經(jīng)建立起來，而且，日本W(wǎng)akunaga公司已申請專利(Japanese Pat.Appl’n No.Heisei8-83480)。然而，用此方法診斷神經(jīng)精神性疾病還沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人徹底而深入研究的目的是建立有效診斷神經(jīng)精神性疾病的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)精神性疾病相關(guān)基因含有三核苷酸重復(fù)序列，通過反向斑點雜交或PCR-MPH，含有疾病相關(guān)基因的質(zhì)粒載體被用來準(zhǔn)確而簡易地診斷神經(jīng)精神性疾病。
因此，本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題并提供一種診斷神經(jīng)精神性疾病的方法，可用作醫(yī)院中的常規(guī)準(zhǔn)確的篩選方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種診斷遺傳性神經(jīng)精神性疾病的試劑盒，用試劑盒可準(zhǔn)確地診斷疾病并判斷其嚴(yán)重性。
本發(fā)明的一個方面是提供了一種診斷SCAIII綜合征的方法，這種方法包括以下步驟將含有73拷貝CAG重復(fù)序列單位的一段SCAIII基因與底物結(jié)合；在適宜的條件下，用兩條標(biāo)記引物，通過PCR來擴增取自受檢者基因組DNA中含有三核苷酸重復(fù)序列的一段DNA片段；DNA擴增的PCR產(chǎn)物與基因雜交；分析雜交結(jié)果。
本發(fā)明的另一個方面是提供了一種診斷SCAIII綜合征的試劑盒，這種試劑盒包括與含有73拷貝CAG重復(fù)序列單位的一段SCAIII基因相結(jié)合的底物；可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的兩個引物，這兩個引物用來擴增受檢者基因組DNA中含有三核苷酸重復(fù)序列的一段DNA片段；PCR反應(yīng)緩沖液和聚合酶；雜交緩沖液；顯色酶。
本發(fā)明的試劑盒中，神經(jīng)精神性疾病相關(guān)基因是一段或全部含TNR基因的質(zhì)粒載體，寡核苷酸或DNA片段，底物包括膜或微量板，可檢測的標(biāo)記物包括32P同位素標(biāo)記或生物素標(biāo)記。
本發(fā)明的試劑盒還包括洗脫緩沖液，親和素偶聯(lián)的酶和發(fā)色底物，優(yōu)選地，親和素偶聯(lián)的酶是鏈親和素-堿性磷酸酶。
具體地說，SCAIII基因被用作含TNR的基因，兩個寡核苷酸SEQ IDNo.1(5’-CCAGTGACTACTTTGATTCG-3’)和SEQ ID No.2(5’-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’)被用作引物。
本發(fā)明另一方面提供了一種質(zhì)粒載體-pSCAIII 73，其保藏號為No.KCTC0435BP，這種質(zhì)粒含有來自SCAIII綜合征患者基因組的一段SCAIII基因。
本發(fā)明再一方面提供了一種質(zhì)粒載體pSCAIII 8，它含有來自正常個體基因組的一段SCAIII基因。
附圖
簡介圖一顯示質(zhì)粒載體pSCAIII 8，pSCAIII 22，pSCAIII 73的構(gòu)建示意圖。
圖二顯示使用質(zhì)粒載體pSCAIII 8，pSCAIII 22，pSCAIII 73與患者和正常個體進行反向斑點雜交的結(jié)果。
A使用正常個體的PCR產(chǎn)物 B使用SCAIII患者的PCR產(chǎn)物圖三顯示本發(fā)明MPH的原理。
實施本發(fā)明的最佳方案本發(fā)明涉及使用TNR對遺傳性神經(jīng)精神性疾病的診斷。為此，使用了反向斑點雜交和PCR-MPH技術(shù)。
斑點印跡雜交中PCR產(chǎn)物被印在膜上，接著與探針雜交，質(zhì)粒探針被印在膜上，接著與在反向斑點雜交中標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進行雜交。
以SCAIII為例，以下詳細(xì)描述一種新的診斷方法和試劑盒。
SCAIII綜合征是一種神經(jīng)精神性疾病，這種疾病是由多聚谷氨酰胺基因上三核苷酸重復(fù)序列CAG數(shù)目增多造成的。正常個體的染色體有13-34拷貝的三核苷酸重復(fù)序列，而病人有68-79拷貝。
首先，用懷疑患有SCAIII綜合征個體的染色體14q24.3位點上的SCAIII基因檢查發(fā)現(xiàn)TNR數(shù)目增多。然后，如圖一所示，SCAIII基因的一個區(qū)段通過PCR擴增后被插入到一個質(zhì)粒上?；加蠸CAIII綜合征個體的SCAIII基因被克隆到質(zhì)粒載體pCR II 2.1-TOPO上的EcoR I限制性酶切位點上，PCR II 2.1-TOPO購自Promega。
得到的質(zhì)粒載體稱為pSCAIII 73并于1998年1月23日根據(jù)布達佩斯條約保藏在韓國典型微生物保藏中心(保藏號為KCTC 0435 BP)。同樣將正常個體的SCAIII基因插入質(zhì)粒載體PCRII 2.1-TOPO而得到質(zhì)粒載體pSCAIII 22和pSCAIII 8。這樣正常個體和患病個體的含有TNR的SCAIII基因部分或全部地插入了質(zhì)粒，所有這些質(zhì)粒都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，與TNR增多相關(guān)的神經(jīng)精神性疾病可通過反向斑點雜交技術(shù)來診斷，為此將制備的含有TNR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后，與使用提取自患者的DNA模板以及帶有可檢測標(biāo)記的引物而獲得的PCR產(chǎn)物雜交。雜交產(chǎn)物通過放射自顯影或顯色等方法來分析。
至于PCR反應(yīng)的引物，它們是用放射性同位素或生物素標(biāo)記的兩條與受檢雙鏈DNA3’末端互補的合成寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，被檢患者含有TNR的SCAIII基因片段使用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2進行擴增。雜交是在含有6×SSC，5×Denhart溶液，0.1％鮭精DNA的緩沖液中進行的。
使用正常個體的質(zhì)粒載體pSCAIII 22和pSCAIII 8和患有神經(jīng)精神性疾病個體的質(zhì)粒載體pSCAIII 73，通過放射自顯影或顯色反應(yīng)都可得到明顯的信號(圖二)。這樣，該方法可用于診斷一個人是否患有神經(jīng)精神性疾病并了解疾病的嚴(yán)重性。
從被檢個體的血液可獲得PCR模板，將從血中分離的基因組DNA經(jīng)過PCR擴增得到目標(biāo)片段。這一DNA片段被加到固定有pSCAIII 8和pSCAIII 73的膜或板上。如果從質(zhì)粒載體pSCAIII 8檢測出明顯的信號則該個體是正常的。另一方面，如果從質(zhì)粒載體pSCAIII 73檢測出明顯的信號則他或她是患者。
進行PCR-MPH時，含有TNR的探針首先在微量板的孔中被固定。含有TNR的目標(biāo)DNA片段，連同生物素標(biāo)記的引物一起上PCR儀。擴增的DNA片段與固定的探針雜交。雜交后，微量板用緩沖液沖洗并加入鏈親和素-堿性磷酸酶和發(fā)色底物。通過測定450nm吸收可以定量分析酶反應(yīng)的不同顏色。
作為探針，它含有與神經(jīng)精神性疾病相關(guān)的DNA片段，和含有具有上述DNA片段的前后相連的單鏈DNA。為了作為PCR-MPH中的引物，這些寡核苷酸含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的堿基序列并用32P或生物素標(biāo)記在寡核苷酸的5’末端。
正如以上所述，本發(fā)明的反向斑點雜交和PCR-MPH可應(yīng)用不同的引物和探針來診斷所有的遺傳性神經(jīng)精神疾病。
以下展示的例子可用來更好地理解本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
比較實施例一Southern雜交本例中，使用常規(guī)的Southern雜交技術(shù)來診斷神經(jīng)精神性疾病。
從患有神經(jīng)精神性疾病家族的各個成員的外周血中分離出總DNA。這樣獲得的總DNA用EcoR I消化并在0.7％的瓊脂糖凝膠中進行電泳。分離的DNA片段通過雜交被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，如購自Amersham商品名為Hybond N的尼龍膜。在65℃環(huán)境下用含有6×SSC，5×Denhart溶液，0.1％鮭精DNA的緩沖液進行雜交，含有SCAIII基因3’末端的質(zhì)粒載體作為探針，用隨機引物法標(biāo)記上(α-32P)dATP。雜交過程持續(xù)進行12-18小時。緩沖液沖洗后，將膜進行放射自顯影。
實例一反向斑點雜交從證明是SCAIII患者的外周血中分離出總DNA。使用總DNA為模板進行PCR反應(yīng)來擴增SCAIII DNA區(qū)，然后，PCR產(chǎn)物(SEQ ID No.3)按如下方法被插入一個質(zhì)粒載體上，PCR產(chǎn)物的具體序列如下。CCA GTG ACT ACT TTG ATT CGT GAA ACA ATG TAT TTT CCT TAT GAA45TAG TTT TTC TCA TGG TGT ATT TAT TCT TTT AAG TTT TGT TTT TTA90AAT ATA CTT CAC TTT TGA ATG TTT CAG ACA GCA GCA AAA GCA GCA135A CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 181CAG CAG CAG CAG CAG CAG GAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 226CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 271CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 316CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CGG GAC 361CTA TCA GGA CAG AGT TCA CAT CCA TGT GAA AGG CCA 397SCAIII的PCR產(chǎn)物用EcoR I消化后插入到同樣用EcoR I酶切的質(zhì)粒載體PCRII 2.1-TOPO而產(chǎn)生一個新的載體，被稱作pSCAIII 73。對于正常個體，重復(fù)上述制備患者載體的過程，結(jié)果獲得了兩個重組質(zhì)粒，被稱作pSCAIII 22和pSCAIII 8。
利用印跡方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning)，將所有的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，這些商品名為Hybond N的尼龍膜購自Amersham。按以下實例二的方式進行PCR擴增SCAIII DNA區(qū)，其中，來自受檢者的DNA作為模板，含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2堿基序列用32P或生物素標(biāo)記的寡核苷酸作為引物。然后，按比較實例一的方式將PCR產(chǎn)物與印跡的質(zhì)粒載體雜交，接著，雜交物進行放射自顯影和顯色分析。
對于正常個體，印有pSCAIII 22和pSCAIII 8的膜顯示很強的信號，而對于病人來說，印有pSCAIII 73的膜顯示很強的信號。因此，就可診斷是否患病和疾病的嚴(yán)重程度。
實例二聚合酶鏈反應(yīng)從患者外周血中分離出基因組DNA作為模板進行PCR來擴增SCAIII基因的TNR序列，兩條寡核苷酸作為引物，一條的堿基序列是5’-CCAGTGACTACTTTGATTCG-3’(SEQ ID No.1，MJD52)和另一條的堿基序列是5’-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’(SEQ ID No.2，MJD25)。這兩條引物已經(jīng)在Nature Gentics Vol.8，pp221-228(1994)發(fā)表.。
混合基因組DNA100ng，引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各0.5μM，dATP，dGTP，dTTP，各200μM，dTTP50μM，Ci(α-32P)-dCTP 0.3μ，加入1×PCR緩沖液(50mM氯化鉀，10mMTris-Hcl PH8.3，1.5mM氯化鎂)至終體積20μl。以上混合物于95℃變性5分鐘后加入2U Taq酶來熱啟動。PCR進行30個循環(huán)，其中，每一次變性過程為95℃1分鐘，每一次退火過程為55℃1分鐘，每一次延伸過程為72℃1分鐘。
由此得到的PCR產(chǎn)物上測序膠(6％聚丙烯酰胺/8M尿素)進行電泳來確定堿基序列。
實例三用TNR進行PCR-MPH含有具有TNR的前后相連的探針的ssDNA在微量板上固定。在微量板中加入受檢者的基因組DNA。在微量板孔中用5’末端標(biāo)有生物素的序列I和序列II作為引物進行PCR反應(yīng)來擴增SCAIII基因區(qū)。得到的PCR產(chǎn)物進行雜交。隨后，用TMAC緩沖液進行沖洗(3M氯化四銨，50mM Tris-HclPH7.5，2mM EDTA)。加入顯色底物和鏈親和素-堿性磷酸酶與PCR產(chǎn)物反應(yīng)。樣品孔在450nm的吸光度可通過微量板讀數(shù)儀進行觀察。(圖三)神經(jīng)精神疾病SCAIII綜合征可通過檢測SCAIII基因特征性的TNR數(shù)目增多的程度而有效地進行診斷，檢測TNR數(shù)目是利用反向斑點雜交或PCR-MPH進行的。用分子遺傳學(xué)方法分析TNR數(shù)目來診斷神經(jīng)精神疾病的準(zhǔn)確性可達到99％或更高，比其他方法的準(zhǔn)確性高。正常攜帶者，即那些帶有問題基因而不發(fā)病者，比正常個體擁有更多TNR拷貝。TNR數(shù)目越多，疾病越嚴(yán)重。根據(jù)以上事實，可以進行神經(jīng)精神疾病的預(yù)測研究，這種研究對治療疾病很有幫助。所以，本發(fā)明提供的方法可進行神經(jīng)精神疾病的診斷也可以對神經(jīng)精神疾病家族的成員是否會患病進行預(yù)測診斷。另外，本方法可推測出何時會患病或發(fā)病程度如何，所以，該方法可作為神經(jīng)精神疾病診斷和治療的通用篩選方法。
已經(jīng)用示例性方法描述了本發(fā)明，本發(fā)明使用的術(shù)語應(yīng)該理解為具有描述的性質(zhì)而不是進行限定。依照以上敘述，可對本發(fā)明進行改進和變化。所以，本發(fā)明的范圍由以下權(quán)利要求限定，而不局限于具體敘述。
序列表(1)一般信息(i)申請人SAMAUNG FINE CHEMICALS CO.，LTD.
JIN，Dong Kyu(ii)發(fā)明名稱使用三核苷酸重復(fù)序列診斷神經(jīng)精神疾病的方法和試劑盒(iii)序列數(shù)3(v)計算機可讀形式(A)類型軟盤(B)計算機兼容IBM PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件KOPatentIn#1.0(vi)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)栁粗?B)申請日本文提交日(C)分類未知(viii)律師/代理人信息(A)姓名KIM，Dong Wan(B)登記號碼544(C)參考/文檔號MK-66/SS/PCT(ix)電信信息(A)電話82-2-553-1062(B)電傳82-2-569-2522(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID No.1
CCAGTGACTA CTTTGATTCG(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID No.2TGGCCTTTCA CATGGATGTG AA(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)長度397bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID No.3CCA GTG ACT ACT TTG ATT CGT GAA ACA ATG TAT TTT CCT TAT GAA 45TAG TTT TTC TCA TGG TGT ATT TAT TCT TTT AAG TTT TGT TTT TTA 90AAT ATA CTT CAC TTT TGA ATG TTT CAG ACA GCA GCA AAA GCA GCA 135A CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 181CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 226CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 271CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 316CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CGG GAC 361CTA TCA GGA CAG AGT TCA CAT CCA TGT GAA AGG CCA 39權(quán)利要求
1.診斷SCAIII綜合征的方法，包括以下步驟將含有73拷貝三核苷酸重復(fù)序列單位(CAG)的一段SCAIII基因(SEQID NO3)連接到底物上；在適當(dāng)?shù)臈l件下，用兩個標(biāo)記的引物(SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2)，將取自受檢者基因組DNA含有三核苷酸重復(fù)序列單位的DNA進行PCR擴增；DNA擴增的PCR產(chǎn)物與基因雜交；分析雜交結(jié)果。
2.SCAIII綜合征的診斷試劑盒，包括與含有73拷貝三核苷酸重復(fù)序列單位(CAG)的一段SCAIII基因(SEQID No.3)相連的底物；可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的兩個引物，這兩個引物是用來擴增受檢者基因組DNA中含有三核苷酸重復(fù)序列單位的一段DNA片段；PCR反應(yīng)緩沖液和聚合酶；雜交緩沖液；顯色酶。
3.權(quán)利要求2中所說的診斷試劑盒，其中的SCAIII基因以質(zhì)粒載體，寡核苷酸或DNA片段形式存在。
4.權(quán)利要求2中所說的診斷試劑盒，其中的底物包括膜或微量板。
5.權(quán)利要求2中所說的診斷試劑盒，其中的可檢測標(biāo)記物包括32P放射性標(biāo)記或生物素標(biāo)記。
6.權(quán)利要求2中所說的診斷試劑盒，還包括洗脫緩沖液，及親和素偶聯(lián)的酶和生色底物。
7.保藏號為KCTC0435BP的質(zhì)粒載體pSCAIII 73，其包括從SCAIII綜合征患者基因組中制備的一段SCAIII基因(SEQ ID No.3)。
8.質(zhì)粒載體pSCAIII 8，其包括來自正常個體基因組的一段SCAIII基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷SCAⅢ綜合征的方法及試劑盒。本方法包括將含有73拷貝三核苷酸重復(fù)序列單位(CAG)的一段SCAⅢ基因與底物結(jié)合;在適當(dāng)?shù)臈l件下,用兩個被標(biāo)記的引物將取自受檢者基因組DNA含有三核苷酸重復(fù)序列單位的DNA進行PCR擴增;DNA擴增得到的PCR產(chǎn)物與基因雜交;分析雜交結(jié)果。SCAⅢ綜合征患者可通過檢測疾病相關(guān)基因特征性的TNR數(shù)目增多的程度而有效地進行診斷,檢測是利用反向斑點雜交或PCR－MPH進行的?？捎糜谠\斷的試劑盒包括底物、兩個帶有可檢測標(biāo)記物的引物,這兩個引物是用來擴增取自受檢者基因組DNA含有三核苷酸重復(fù)序列單位的一段DNA片段的,還包括PCR反應(yīng)的緩沖液和聚合酶、基因雜交的緩沖液和顯色的酶。
文檔編號G01N33/53GK1256714SQ99800161
公開日2000年6月14日 申請日期1999年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月26日
發(fā)明者陳東奎 申請人:三星精密化學(xué)株式會社, 陳東奎