專利名稱：可溶性t細(xì)胞受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非膜結(jié)合重組T細(xì)胞受體(TCRs)并涉及用于生產(chǎn)它們的方法和試劑。
一般背景1．細(xì)胞表面上的抗原呈遞MHC分子是可呈遞通過適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞器而在細(xì)胞表面上識(shí)別的短蛋白質(zhì)片段即肽抗原的特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。
Ⅰ型MHC是一種由可變重鏈和恒定輕鏈組成的二聚化蛋白質(zhì)復(fù)合物即β2微球蛋白。Ⅰ型MHC呈遞可在胞內(nèi)加工、載入MHC中的結(jié)合裂縫并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的肽類，其中所述的復(fù)合物通過MHC重鏈被錨定在膜內(nèi)。肽類通常有8-11個(gè)氨基酸長，這取決于在MHC中結(jié)合時(shí)引入所述肽中的彎曲程度。由MHC重鏈的膜遠(yuǎn)端α1和α2結(jié)構(gòu)域形成的結(jié)合裂縫具有“封閉”端，從而對可以被結(jié)合的肽的長度產(chǎn)生相當(dāng)嚴(yán)格的限制。
Ⅱ型MHC也是一種由α(重)和β(輕)鏈組成的二聚化蛋白質(zhì)，兩者是可變的糖蛋白并通過跨膜結(jié)構(gòu)域貼壁在細(xì)胞中。類似于Ⅰ型MHC,Ⅱ型分子形成結(jié)合裂縫，其中插入了12-24個(gè)氨基酸的較長肽類。使肽類通過胞吞作用從胞外環(huán)境中被吸收并在載入隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的Ⅱ型復(fù)合物前被加工。
各細(xì)胞呈遞高達(dá)6種不同的Ⅰ型分子和大量類似的Ⅱ型分子形式的肽類，所呈遞的MHC復(fù)合物的總數(shù)在105-106/細(xì)胞的范圍。據(jù)估計(jì)存在于Ⅰ型分子中的肽類的多樣性一般在1,000-10,000，它們中的90％以100-1,000個(gè)拷貝/細(xì)胞存在(Hunt,Michel等1992；Chicz,Urban等1993；Engelhard,Appella等1993；Huczko,Bodnar等1993)。認(rèn)為最大量的肽類構(gòu)成所呈遞總肽的0.4-5％，這意味著可能存在高達(dá)20,000個(gè)相同的復(fù)合物。然而，最大量的單一肽復(fù)合物的平均數(shù)可能在2,000-4,000/細(xì)胞的范圍，且可識(shí)別T細(xì)胞表位的一般呈遞水平在100-500個(gè)復(fù)合物/細(xì)胞的范圍(參見(Engelhard 1994)的綜述)。2．抗原呈遞細(xì)胞的識(shí)別大量細(xì)胞可以呈遞抗原(如MHC-肽)并將具有該特性的細(xì)胞稱作抗原呈遞細(xì)胞(APC)?？沙蔬f特殊抗原的細(xì)胞類型取決于抗原如何且在何處首次與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相遇。APCs包括在淋巴結(jié)和脾臟的T細(xì)胞區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的大量鑲嵌樹突細(xì)胞；在皮膚中的朗格漢斯細(xì)胞；在淋巴組織的B細(xì)胞區(qū)域中的小結(jié)樹突細(xì)胞；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞；B細(xì)胞和T細(xì)胞；以及諸如內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞這樣不屬于APCs類別但可以以APC方式起作用的各種其它細(xì)胞。
由在胸腺中成熟的淋巴細(xì)胞亞群(T細(xì)胞)來識(shí)別APCs，其中它們進(jìn)行了所設(shè)計(jì)的選擇過程以便確保根除對自身肽有反應(yīng)的T細(xì)胞(陰性選擇)。此外，不具有識(shí)別所呈遞的MHC變體(在男性中，HLA單元型)能力的T細(xì)胞未能成熟(陽性選擇)。
T細(xì)胞對特異性MHC-肽復(fù)合物的識(shí)別是由α-和β-鏈組成的T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的，所述的α-和β-鏈被錨定在膜中。在類似于對抗體基因所觀察到的重組過程中，TCRα和β基因由在胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生大量多樣性的可變、連接、多樣和恒定的元件重新排列(1013-1015種不同的可能性)。TCRs還以帶有γ和δ鏈的不同形式存在，但它們僅存在于大約5％的T細(xì)胞上。
抗體和TCRs是唯一兩類以特異性方式識(shí)別抗原的分子且由此TCR是對存在于MHC中特定肽抗原具有特異性的唯一受體，外源肽通常是細(xì)胞內(nèi)異常的唯一標(biāo)記。
以大量不同方式表達(dá)TCRS，各TCR對一種或幾種MHC-肽復(fù)合物具有特異性。TCR與MHC-肽配體之間的連接是極其短壽命的，半衰期通常低于1秒。T細(xì)胞與靶細(xì)胞(假定是TCR/MHC-肽)之間的粘附依賴于多種TCR/MHC-肽連接物以及一定量的共同受體-配體連接物的應(yīng)用。
當(dāng)T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)以直接的物理方式連接時(shí)發(fā)生T細(xì)胞識(shí)別且該過程通過抗原特異性TCRs與pMHC復(fù)合物連接而引發(fā)。TCR是一種與涉及介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD3復(fù)合物不變蛋白相關(guān)的免疫球蛋白超家族中的異二聚化細(xì)胞表面蛋白。TCRs以αβ和γδ型存在，它們在結(jié)構(gòu)上相似并具有完全不同的結(jié)構(gòu)位置和可能的功能。所述受體的胞外部分由兩個(gè)膜近端恒定結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)膜遠(yuǎn)端可變結(jié)構(gòu)域組成，其中的兩個(gè)膜遠(yuǎn)端可變結(jié)構(gòu)域具有類似于抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的高度多形態(tài)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。就是這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)可形成TCR分子的MHC-結(jié)合位點(diǎn)并決定肽的特異性。MHC Ⅰ型和Ⅱ型配體也是免疫球蛋白超家族蛋白質(zhì)并對抗原呈遞具有特異性，高度多形的肽結(jié)合位點(diǎn)能夠使它們在APC細(xì)胞表面呈現(xiàn)不同排列的短肽片段。
近來，這些相互作用的實(shí)例已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上特征化(Garboczi,Ghosh等1996；Garcia,Degano等1996；Ding,Smith等1998)。鼠和人Ⅰ型pMHC-TCR復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明了TCR在其pMHC配體內(nèi)的對角方向并顯示出了在其相聯(lián)處具有極差的形狀互補(bǔ)性。CDR3環(huán)狀結(jié)構(gòu)僅連接肽殘基。連接與未連接的TCR結(jié)構(gòu)的比較結(jié)果也提示在TCR CDR環(huán)狀結(jié)構(gòu)中存在彈性程度(Garboczi和Biddison 1999)。
T細(xì)胞激活模型試圖解釋在T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(APC)相聯(lián)處的這類蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用如何引發(fā)諸如殺死病毒感染的靶細(xì)胞這樣的反應(yīng)。在許多這些模型中涉及TCR-pMHC相互作用的物理特性作為關(guān)鍵參數(shù)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCR解離率的定量改變可解釋成受體接合(諸如完全或部分T細(xì)胞激活)或拮抗作用的生物結(jié)果中的定性差異(Matsui,Boniface等1994；Rabinowitz,Beeson等1996；Davis,Boniface等1998)。
已經(jīng)證實(shí)TCR-pMHC相互作用具有低親和性和相對緩慢的動(dòng)力學(xué)特性。許多研究已經(jīng)使用了生物傳感器技術(shù)諸如BiacoreTM(Willcox,Gao等1999；Wyer,Willcox等1999)，該項(xiàng)技術(shù)利用了表面胞質(zhì)共振(SPR)并能夠測定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的直接親和性和適時(shí)的動(dòng)力學(xué)測量(Garcia,Scott等1996；Davis,Boniface等1998)。然而，所研究的受體是同種異體反應(yīng)的TCRs或?qū)θ斯っ庖咴姆磻?yīng)提高的那些TCRs。3．TCR和CD8與MHC-肽復(fù)合物的相互作用大多數(shù)由Ⅰ型MHC-肽復(fù)合物結(jié)合的T細(xì)胞也需要接合共同受體CD8以用于激活，而由Ⅱ型MHC結(jié)合的T細(xì)胞需要結(jié)合CD4。還不完全清楚所述的共同受體在T細(xì)胞激活中的確切功能。兩者均不是控制激活的關(guān)鍵機(jī)理和參數(shù)。然而，CD8和CD4兩者均帶有與激酶p56lck相關(guān)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述的激酶p56lck涉及使T細(xì)胞激活特征化的最早期的酪氨酸磷酸化情況。CD8是一種二聚化受體，它以αα型被表達(dá)或更常見的是以αβ型被表達(dá)。CD4是一種單體。在CD8受體中，僅α-鏈與p56lck相關(guān)。
近期使用可溶性受體形式測定的控制TCR和CD8與MHC結(jié)合的物理參數(shù)已經(jīng)證實(shí)通過TCR的結(jié)合可控制識(shí)別過程。TCR對MHC的親和性明顯高于所述的共同受體(Willcox,Gao等1999；Wyer,Willcox等1999)。
所述受體與MHC的各種相互作用在生理溫度下即37℃下是極為短壽命的。使用對由HLA-A*0201(HLA-A2)呈遞的流感病毒“基質(zhì)”肽具有特異性的人TCR測定的TCR-MHC/肽相互作用半衰期的近似數(shù)值是0.7秒。CD8αα與這種MHC/肽復(fù)合物的相互作用的半衰期低于0.01秒即至少比前者快18倍。4．可溶性MHC-肽復(fù)合物的生產(chǎn)首先通過使用木瓜蛋白酶裂解抗原呈遞細(xì)胞的表面分子來獲得可溶性MHC-肽復(fù)合物(Bjorkman,Strominger等1985)。盡管這種方法產(chǎn)生了結(jié)晶物質(zhì)，但是近年來已經(jīng)通過在大腸桿菌中分別表達(dá)重鏈和輕鏈、隨后在有合成肽存在的情況下重折疊而替代了Ⅰ型分子(Garboczi,Hung等1992；Madden,Garboczi等1993；Garboczi,Madden等1994；Reid,McAdam等1996；Reid,Smith等1996；Smith,Reid等1996；Smith,Reid等1996；Gao,Tormo等1997；Gao,Gerth等1998)。這種方法超過現(xiàn)有方法的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于以較低的成本獲得較高的產(chǎn)率、抗原準(zhǔn)確地控制肽的同一性且終產(chǎn)物更為均勻。此外，可以方便地進(jìn)行對所修飾重鏈或輕鏈的表達(dá)、例如與蛋白標(biāo)記物的融合。5．可溶性TCR目前，還沒有對人TCR-pMHC相互作用的公開數(shù)據(jù)且沒有對天然(例如病毒)表位具有特異性的天然選擇的TCRs進(jìn)行的分析研究。這可以反映出在獲得以毫克量得到且在一定濃度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的適于SPR的蛋白質(zhì)即均勻單體的正確折疊的蛋白質(zhì)中存在的困難性。
有利的是能夠生產(chǎn)非膜結(jié)合(或可溶性)型的重組TCR，它不僅用于研究特異性TCR-pMHC相互作用的目的，而且作為檢測感染或檢測自身免疫疾病標(biāo)記的診斷工具或用于檢測T細(xì)胞疫苗功效?？扇苄訲CR在染色方面也具有實(shí)用性，例如用于對細(xì)胞染色以便確定在MHC范圍內(nèi)呈遞的特殊病毒抗原的存在。類似地，可以將可溶性TCR用于將治療劑例如細(xì)胞毒性化合物或免疫刺激化合物轉(zhuǎn)運(yùn)至呈遞特殊抗原的細(xì)胞上。
由一種以上多肽亞單位構(gòu)成并帶有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能難以產(chǎn)生可溶性形式。這是因?yàn)樵谠S多情況中所述的蛋白質(zhì)被其跨膜區(qū)所穩(wěn)定。這是針對TCR的情況。
近來僅描述了許多方法可生產(chǎn)可溶性TCR。一般來說，所有的方法描述的是截短形式的TCR，它們僅含有胞外域或胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。因此，在所有情況中，跨膜結(jié)構(gòu)域已經(jīng)從所表達(dá)的蛋白質(zhì)中缺失。盡管許多報(bào)導(dǎo)證明按照所述方法生產(chǎn)的TCR可以被TCR特異性抗體所識(shí)別(表明已經(jīng)將由所述抗體識(shí)別的部分重組TCR進(jìn)行了正確折疊)，但是還沒有人能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)在低濃度下保持穩(wěn)定并可以識(shí)別MHC-肽復(fù)合物的可溶性TCR。
第一種生產(chǎn)可結(jié)晶物質(zhì)的方法充分利用了在真核細(xì)胞中的表達(dá)，而生產(chǎn)該物質(zhì)是極其昂貴的(Garcia,Degano等1996；Garcia,Scott等1996)。另一種已經(jīng)生產(chǎn)了可結(jié)晶物質(zhì)的方法充分利用了類似于已經(jīng)預(yù)先用于MHC-肽復(fù)合物的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Garboczi,Ghosh等；Garboczi,Utz等1996)。已經(jīng)證明后一種方法一般不實(shí)用，該方法表達(dá)在與形成鏈間二硫鍵發(fā)生關(guān)聯(lián)、隨后在體外重折疊的半胱氨酸殘基前立即截短的TCR鏈的胞外部分。大多數(shù)異二聚化TCRs在以這種方式生產(chǎn)時(shí)看起來不穩(wěn)定，這是因?yàn)棣僚cβ鏈之間的低親和性所導(dǎo)致的。
此外，存在許多對工程化生產(chǎn)可溶性TCR的其它描述。它們中的某些僅描述了表達(dá)TCR的α或β鏈，由此產(chǎn)生無法保持MHC-肽特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(Calaman,Carson等1993；Ishii,Nakano等1995)。已經(jīng)獲得了不含α鏈的β鏈結(jié)晶它們是獨(dú)立的或與超抗原結(jié)合(Boult,Bentley等1994；Bentley,Boulot等1995；Fields,Malchiodi等1996)。
其它報(bào)導(dǎo)描述了用于表達(dá)異二聚化γ/δ或α/βTCR的方法(Gregoire,Rebai等1991；Necker,Rebai等1991；Eilat,Kikuchi等1992；Weber,Traunecker等1992；Corr,Slanetz等1994；Ishii,Nakano等1995；Gregoire,Malissen等1996；Romagne,Peyrat等1996)。在某些情況中，已經(jīng)將TCR表達(dá)為單鏈融合蛋白(Broker,Peter等1993；Gregoire,Malissen等1996；Schlueter,Schodin等1996)。另一種策略是將TCR鏈表達(dá)為與Ig鉸合部和恒定結(jié)構(gòu)域融合的嵌合蛋白(Eilat,Kikuchi等1992；Weber,Traunecker等1992)。已經(jīng)用所設(shè)計(jì)的可形成彼此具有高親和性和特異性的卷曲螺旋的序列表達(dá)了其它嵌合型TCR蛋白，由此使TCRα-β連接物保持穩(wěn)定并增加可溶性。這種方法由Chang,Bao等(1994)采用，他用由兩種相互發(fā)生作用而形成異二聚化卷曲螺旋的合成肽序列(一種酸性肽和一種堿性肽)組成的亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)取代了所述蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。該作者在分泌異二聚化TCR蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中使用了桿狀病毒(bacculovirus)表達(dá)系統(tǒng)。人工亮氨酸拉鏈肽類有助于TCRα和β鏈的異二聚化，所述的TCRα和β鏈也通過僅在融合點(diǎn)上的鏈間二硫鍵與所述的拉鏈肽類連接。然而，此后證明這些技術(shù)是不成功的且沒有所述的可溶性TCR可以識(shí)別TCR配體的證據(jù)。類似地，Golden,Khandekar等(1997)描述了作為亮氨酸拉鏈融合蛋白的異二聚化T細(xì)胞受體的生產(chǎn)。如Chang等所述，在大腸桿菌中將可溶性TCR表達(dá)為帶有α-β鏈間二硫鍵的分泌的異二聚體。此外，沒有這種易折疊TCR異二聚體能夠與其配體發(fā)生相互作用的證據(jù)。
因此，存在一種對膜結(jié)合TCR的可溶性形式的需求，所述的可溶性形式可正確折疊以便它能夠識(shí)別其天然配體。在一段時(shí)間期限內(nèi)保持穩(wěn)定的TCR的可溶性形式和用于以合理量生產(chǎn)它的方法也是有用的。本發(fā)明的目的在于滿足某些或所有的這些需求。
本發(fā)明本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了一種重折疊的重組T細(xì)胞受體(TCR)，它包括ⅰ)帶有第一種異源C-末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域；和ⅱ)帶有第二種C-末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域，其中所述的第二種C-末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域。
在表達(dá)后重折疊而不分泌成異二聚體的本發(fā)明TCR在構(gòu)象上優(yōu)于以前可得到的可溶性TCR。這一點(diǎn)由其識(shí)別MHC-肽復(fù)合物的能力來證明。它在相對低的濃度下也是穩(wěn)定的。它可以在1mg/ml以下且優(yōu)選在約10μg/ml的濃度下保持穩(wěn)定。
在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種具有生物活性的重組T細(xì)胞受體(TCR)，它包括ⅰ)帶有第一種異源C-末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域；和
ⅱ)帶有第二種C-末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域，其中所述的第二種C-末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域。這類TCR優(yōu)選以一種類似于來源于天然的TCR的方式與MHC-肽復(fù)合物特異性結(jié)合。
在另一方面中，本發(fā)明提供了可編碼如本文所述重組TCR鏈的重組核酸序列?？梢詮腡-細(xì)胞克隆中分離這類核酸序列。另一方面，可以以合成方式、例如通過將異源核酸序列插入可編碼TCR鏈的序列中或通過使編碼TCR鏈的核酸序列發(fā)生突變(通過插入、缺失或置換)來生產(chǎn)它們。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括具有天然TCRs活性和/或結(jié)合特異性的合成肽類。
在另一方面中，本發(fā)明提供了一種重組非膜結(jié)合T細(xì)胞受體的制備方法，該方法包括下列步驟表達(dá)帶有第一種異源C-末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域和帶有第二種C-末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域，其中所述的第二種C-末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域；且在體外使所述鏈彼此重折疊而產(chǎn)生TCR異二聚體。
本發(fā)明的重組TCRs可以用于識(shí)別Ⅰ型MHC-肽復(fù)合物和Ⅱ型MHC-肽復(fù)合物。
優(yōu)選將本發(fā)明的重組TCR異二聚化結(jié)構(gòu)域稱作“卷曲螺旋”或“亮氨酸拉鏈”。將這些術(shù)語用于描述彼此以一種特殊方式發(fā)生相互作用而形成異二聚體的成對的螺旋肽類。所述的相互作用因沿各拉鏈肽一側(cè)存在互補(bǔ)性疏水殘基而發(fā)生。所述肽類的性質(zhì)使得異二聚體的形成比螺旋同二聚體的形成更便利。亮氨酸拉鏈可以是合成的或天然出現(xiàn)的。可以將合成的亮氨酸設(shè)計(jì)成具有更高于天然出現(xiàn)的亮氨酸拉鏈的結(jié)合親和性。實(shí)際上，用于本發(fā)明的優(yōu)選亮氨酸拉鏈?zhǔn)翘烊怀霈F(xiàn)的亮氨酸拉鏈或具有類似結(jié)合親和性的亮氨酸拉鏈。來自c-jun和c-fos蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈?zhǔn)蔷哂泻线m的結(jié)合親和性的亮氨酸拉鏈的一個(gè)實(shí)例。其它合適的亮氨酸拉鏈包括那些來自myc和max蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈(Amati,Dalton等1992)?？梢苑奖愕卦O(shè)計(jì)其它具有合適特性的亮氨酸拉鏈(O’Shea等1993)。
優(yōu)選的情況是，本發(fā)明的可溶性TCRs帶有相當(dāng)于來自c-jun(α鏈)和c-fos(β鏈)的異二聚化結(jié)構(gòu)域的約40個(gè)氨基酸的亮氨酸拉鏈融合物(O’Shea,Rutkowski等，1989；O’Shea,Rutkowski等，1992；Glover和Harrison,1995)。可以使用較長的亮氨酸拉鏈。由于異二聚化特異性看起來甚至被保持在某些亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的十分短小的片段中(O’Shea,Rutkowski等，1992)，所以可能的情況是可以用較短的c-jun和c-fos片段來獲得類似的益處。例如這類較短的片段可以帶有少至8個(gè)氨基酸。因此，所述的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可以在8-60個(gè)氨基酸長的范圍內(nèi)。
亮氨酸拉鏈配對中的特異性的分子機(jī)理已被充分鑒定(Landschulz,Johnson等，1988；McKnight,1991)且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建亮氨酸拉鏈以形成同二聚體、異二聚體或三聚體復(fù)合物(Lumb和Kim,1995；Nautiyal,Woolfson等，1995；Boice,Dieckmann等，1996；Chao,Houston等，1996)。所設(shè)計(jì)的高于c-jun和c-fos亮氨酸拉鏈親和性的亮氨酸拉鏈(或其它異二聚化結(jié)構(gòu)域)可以對表達(dá)某些系統(tǒng)中的可溶性TCRs有利。然而，正如下面具體描述的，當(dāng)可溶性TCR在體外折疊時(shí)，優(yōu)選將增溶劑導(dǎo)入折疊緩沖液以便減少副產(chǎn)物蛋白質(zhì)聚集體的形成。對這種現(xiàn)象的一種解釋是所述亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的折疊運(yùn)動(dòng)快于TCR鏈，導(dǎo)致未折疊TCRα和β鏈的二聚化，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象。通過減慢折疊過程并通過摻入增溶劑來抑制聚集現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)維持在溶液中直到兩種融合結(jié)構(gòu)域折疊完全為止。因此，親和性高于c-jun和c-fos亮氨酸拉鏈的異二聚化結(jié)構(gòu)域可能需要更高濃度的增溶劑以便實(shí)現(xiàn)可與c-jun和c-fos的產(chǎn)率相比擬的可溶性TCRs產(chǎn)率。
不同生物系統(tǒng)使用不同的方法來形成穩(wěn)定的同型和異型蛋白質(zhì)二聚體，且這些方法中的每一種一般可對將二聚化結(jié)構(gòu)域改造成遺傳修飾的蛋白質(zhì)提供一種選擇。亮氨酸拉鏈(Kouzarides和Ziff 1989)可能是最普通的二聚化組件并已經(jīng)廣泛用于生產(chǎn)遺傳設(shè)計(jì)的二聚化蛋白質(zhì)。因此，已經(jīng)將GCN4的亮氨酸拉鏈(一種來自啤酒糖酵母的轉(zhuǎn)錄激活物蛋白)用于引導(dǎo)大量異源蛋白質(zhì)的同二聚化(Hu,Newell等，1993；Greenfield,Montelione等1998)。優(yōu)選的策略是使用引導(dǎo)異二聚化復(fù)合物諸如Jun/Fos兩氨酸拉鏈對形成的拉鏈(de Kruif和Logtenberg 1996；Riley,Ralston等1996)。
本發(fā)明的重組TCR的異二聚化結(jié)構(gòu)域不限于亮氨酸拉鏈。因此，用形成二硫橋的成分可以使之產(chǎn)生。另一方面，它可以由SH3結(jié)構(gòu)域和疏水/富含脯氨酸的反結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生，其中所述的SH3結(jié)構(gòu)域和疏水/富含脯氨酸的反結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致在涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)中所觀察到的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(由Schlessinger綜述，(Schlessinger1994))。在參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的其它天然蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用依賴于翻譯后修飾的氨基酸與特異性識(shí)別這類修飾殘基的蛋白質(zhì)組件之間的相關(guān)性。這類翻譯后修飾的氨基酸和蛋白質(zhì)組件可以形成本發(fā)明的重組TCR的異二聚化結(jié)構(gòu)域。這類蛋白質(zhì)對的一個(gè)實(shí)例由諸如表皮生長因子受體或血小板衍生生長因子受體這樣的酪氨酸磷酸化受體和GRB2的SH2結(jié)構(gòu)域來提供(Lowenstein,Daly等1992；Buday和Downward1993)。正如在所有的科學(xué)領(lǐng)域中一樣，正在積極地探求新型二聚化組件(Chevray和Nathans1992)且目前已經(jīng)成功地開發(fā)出了用于設(shè)計(jì)完全人工化組件的方法(Zhang,Murphy等1999)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的重組TCR中，在天然α和βTCR鏈中的兩個(gè)半胱氨酸殘基之間以及天然γ和δTCR鏈之間形成的鏈間二硫鍵不存在。這可以例如通過使二聚化結(jié)構(gòu)域與所述半胱氨酸殘基上的TCR受體鏈融合而使在所述的重組蛋白質(zhì)中不包括這些殘基來實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)例中，一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被另一種不涉及二硫鍵形成的氨基酸殘基所取代。不可以引入這些半胱氨酸殘基，這是因?yàn)樗鼈儾焕谠隗w外折疊功能性TCR。
本發(fā)明重折疊的重組TCR的α和β鏈或γ和δ鏈的重折疊在合適的重折疊條件下在體外進(jìn)行。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，通過在含有增溶劑例如尿素的重折疊緩沖液中使增溶的TCR鏈重折疊而獲得具有正確構(gòu)象的重組TCR。有利的是，所述的尿素可以以至少0.1M或至少1M或至少2.5M或約5M的濃度存在。另一種可以使用的增溶劑是胍，其濃度為0.1M-8M，優(yōu)選至少1M或至少2.5M。在重折疊前，優(yōu)選使用還原劑來確保完全還原半胱氨酸殘基。此外，如果必要，可以使用諸如DTT和胍這樣的變性劑。在重折疊步驟前可以使用不同的變性劑和還原劑(例如脲、β-巰基乙醇)。在重折疊過程中可以使用另一種氧化還原對，諸如胱胺/半胱胺氧化還原對、DTT或β-巰基乙醇/空氣氧以及還原和氧化形式的半胱氨酸。
可以用可檢測的標(biāo)記物、例如適合于診斷目的的標(biāo)記物來標(biāo)記本文所述的單體TCR。因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測MHC-肽復(fù)合物的方法，該方法包括使MHC-肽與對所述MHC-肽復(fù)合物具有特異性的本發(fā)明TCR進(jìn)行接觸并檢測所述的TCR與所述的MHC-肽復(fù)合物結(jié)合情況的步驟。在使用生物素化的異二聚體形成的四聚化TCR中，可以將熒光鏈霉抗生物素(商購)用于產(chǎn)生一種可檢測的標(biāo)記物。熒光標(biāo)記的四聚體適用于FACS分析，例如用于檢測攜帶TCR對其具有特異性的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
另一種方式通過使用TCR-特異性抗體、特別是單克隆抗體來進(jìn)行，其中可以檢測所述的可溶性TCR。有許多商購的可分別識(shí)別β和α鏈的恒定區(qū)的抗-TCR抗體，諸如βF1和αF1。
可以使TCR可選擇地或另外與一種治療劑連接，所述的治療劑可以是例如一種例如用于殺死細(xì)胞的毒性部分或一種免疫刺激劑諸如白細(xì)胞介素或細(xì)胞因子。因此，本發(fā)明提供了一種用于將治療劑轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞的方法，該方法包括使?jié)撛诘陌屑?xì)胞與本發(fā)明的TCR在使所述TCR附著在所述靶細(xì)胞上的條件下發(fā)生接觸的步驟，所述的TCR對MHC-肽復(fù)合物具有特異性且所述的治療劑與其相關(guān)。特別地，可以將所述的可溶性TCR用于將治療劑轉(zhuǎn)運(yùn)至呈遞特殊抗原的細(xì)胞的位置上。例如，可以將毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤，由此有助于根除它。這在許多情況中且特別是對腫瘤是有用的，因?yàn)樵谀[瘤中不是所有細(xì)胞均可呈遞抗原且由此不是所有的腫瘤細(xì)胞都可以被免疫系統(tǒng)檢測到。使用可溶性TCR可以轉(zhuǎn)運(yùn)一種化合物，使得它可以在局部發(fā)揮其作用、而不僅是在與之結(jié)合的細(xì)胞上發(fā)揮作用。因此，一種特殊的策略是關(guān)注與對腫瘤抗原具有特異性的T細(xì)胞受體連接的抗腫瘤分子。
為了這一目的可以使用許多毒素，例如放射性化合物、酶類(例如穿孔素)或化療劑(例如順式鉑氨)。為了確保在所需位置上發(fā)揮毒性作用，所述的毒性可以存在于與鏈霉抗生物素連接的脂質(zhì)體內(nèi)以便使所述的化合物得到緩慢釋放。這可防止在身體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的破壞作用并確保所述毒素在TCR與相關(guān)抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合后具有最大的作用。
另一種標(biāo)記或使諸如毒性部分這樣的另一部分與可溶性TCR結(jié)合的方式在于使所述的標(biāo)記物或其它部分并入混合的分子多聚體。這類多聚化分子的一個(gè)實(shí)例是一種含有三個(gè)TCR分子和一個(gè)過氧化物酶分子的四聚體。它可以通過以3∶1的摩爾比混合TCR與所述酶而生成四聚化復(fù)合物并從不含正確比例分子的任意復(fù)合物中分離所述的復(fù)合物來獲得?；旌系姆肿涌梢院腥我饨M合的分子，條件是位阻不損害或不明顯損害所述分子的所需功能。結(jié)合位點(diǎn)在鏈霉抗生物素分子上的定位適合于混合的四聚體，因?yàn)椴豢赡艹霈F(xiàn)位阻。
優(yōu)選的情況是，本發(fā)明的重組TCR鏈帶有位于TCR結(jié)構(gòu)域與二聚化肽之間的彈性接頭。合適的彈性接頭包括含有甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)肽接頭，例如含有甘氨酸和絲氨酸的接頭。認(rèn)為在鄰接可形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基處的C-末端截短是有利的，因?yàn)棣梁挺骆溄?jīng)這些細(xì)胞TCRs中的殘基而非常鄰近。因此，僅要求相對較短的接頭序列產(chǎn)生從TCR鏈到異二聚化結(jié)構(gòu)域的非變形性過渡。優(yōu)選使用Pro-Gly-Gly或Gly-Gly的接頭序列。然而，所述的接頭序列可以改變。例如，可以完全刪除所述的接頭或?qū)⑵溥€原成單個(gè)殘基，在這種情況中更好的選擇是單一甘氨酸殘基。較長的接頭的變化形式也能夠在所述可溶性TCR中被接受，條件是可以防止它們受到蛋白酶的攻擊，所述的蛋白酶攻擊可使二聚化肽類與具有隨后缺失的α-β鏈穩(wěn)定性的TCR的胞外域分離開來。
本發(fā)明的可溶性TCR不一定是α-βTCR。諸如γ-δ、α-δ和γ-βTCR分子這樣的分子以及含有僅在發(fā)育早期表達(dá)的不變?chǔ)伶湹腡CR分子(前TCR)也包括在內(nèi)。前-TCR特指表達(dá)α-β T細(xì)胞受體的細(xì)胞系，與表達(dá)γ-δ T細(xì)胞受體的那些細(xì)胞相反(參見綜述(Aifantis,Azogui等1998；von Boehmer,Aifantis等1998；Wurch,Biro等1998))。通過使用不變前-TCRe鏈的TCRβ鏈配對來表達(dá)前-TCR(Saint Ruf,Ungewiss等1994；Wilson和MacDonald 1995)，看起來所述的不變前-TCRα鏈?zhǔn)顾黾?xì)胞定向于α-β T細(xì)胞系。因此認(rèn)為前-TCR的作用在胸腺發(fā)育過程中是重要的(Ramiro,Trigueros等1996)。
如果合適，可以對本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化修飾。它們包括例如對β鏈恒定區(qū)中的未配對的半胱氨酸殘基進(jìn)行改變以便避免不正確的鏈內(nèi)或鏈間配對。
由于所述的信號(hào)肽無法在成熟受體內(nèi)用于任何目的或因其配體結(jié)合能力，所以它可以被忽略，且實(shí)際上所述的信號(hào)肽可防止TCR能夠識(shí)別配體。在大多數(shù)情況中，將在切割位點(diǎn)處從成熟TCR鏈中除去的信號(hào)肽進(jìn)行推定而不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定。將所表達(dá)的TCR鏈改造成它們在n-末端處有幾個(gè)(即例如達(dá)到約10個(gè))氨基酸長或短這一過程對于所述可溶性TCR的功能性來說沒有意義。可以添加不存在于原始蛋白質(zhì)序列中的某些添加物。例如，可以添加有助于純化所述TCR鏈的短標(biāo)記物序列，條件是它不干擾正確的結(jié)構(gòu)和所述TCR的抗原結(jié)合位點(diǎn)的折疊。
為了在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，可以在所推定的成熟蛋白質(zhì)序列的N-末端起點(diǎn)上改造甲硫氨酸殘基以便能夠引發(fā)翻譯。
遠(yuǎn)離TCR鏈可變結(jié)構(gòu)域中的所有殘基對于抗原特異性和功能性來說是必不可少的。因此，可以在該區(qū)中引入大量突變而不會(huì)影響抗原特異性和功能性。
相反，可以將涉及形成與所述肽抗原或HLA重鏈多肽的連接物的某些殘基(即構(gòu)成TCR鏈的CDR區(qū)的殘基)取代成可提高TCR對配體親和性的殘基。可以將這類使大多數(shù)TCRs對肽-MHC配體產(chǎn)生低親和性的取代用于提高可溶性TCRs的特異性和功能性潛能。在本文的實(shí)施例中，測定了可溶性TCRs對肽-MHC配體的親和性。可以將這類測定方法用于檢測引入所述TCR中的突變作用并由此用于鑒定含有提高所述TCR活性的取代的TCRs。
遠(yuǎn)離TCR鏈恒定區(qū)中的所有殘基對于抗原特異性和功能性來說是必不可少的。因此，可以在影響抗原特異性的該區(qū)中引入大量突變。在下面的實(shí)施例14中，我們已經(jīng)證實(shí)在TCRβ鏈恒定區(qū)中的兩個(gè)氨基酸取代不具有可檢測到的TCR結(jié)合HLA-肽配體的能力的結(jié)果。
所述的TCRβ鏈含有在細(xì)胞或天然TCR中未配對的半胱氨酸殘基。這種殘基的突變提高了體外可溶性TCR重折疊的功效。將這種半胱氨酸殘基取代成絲氨酸或丙氨酸這一過程對體外重折疊的功效具有顯著的正面作用。使用取代成其它氨基酸的方法可以獲得類似的正面作用乃至更好的效果。
如上所述，優(yōu)選在天然TCR中形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基不存在以便避免重折疊的困難。然而，由于這些半胱氨酸殘基的排列是所述TCR中天然設(shè)計(jì)的且也已經(jīng)證實(shí)具有這種排列對c-jun和c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域起作用(O’Shea等，1989)，所以可以含有這些半胱氨酸殘基，條件是所述的TCR可以被重折疊。
因?yàn)樗龅暮愣▍^(qū)不直接包含在與肽-MHC配體的連接物中，所以可以改變C-末端截?cái)帱c(diǎn)而基本上不會(huì)喪失功能性。例如，應(yīng)能夠生產(chǎn)不包括完整恒定區(qū)的功能性可溶性TCRs。一般來說，它更易于表達(dá)并折疊僅含有可變區(qū)或可變區(qū)以及所述恒定區(qū)中唯一短片段的可溶性TCRs，這是因?yàn)樗龅亩嚯念愂禽^短的。然而，這種策略不是優(yōu)選的。這是因?yàn)橥ㄟ^異二聚化結(jié)構(gòu)域?qū)Ζ?β鏈配對增加穩(wěn)定性的條件是復(fù)雜的，因?yàn)楦脑斓膬煞N鏈C-末端具有一定的距離，從而要求較長的接頭序列。在形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸位置前融合異二聚化結(jié)構(gòu)域的優(yōu)點(diǎn)在于保持α和β鏈在細(xì)胞受體內(nèi)鄰近。因此，在該點(diǎn)處的融合幾乎不可能使所述的TCR結(jié)構(gòu)變形。
可以生產(chǎn)具有較大的而非本文優(yōu)選的恒定區(qū)片段的功能性可溶性TCR，即不要求它們的恒定區(qū)在形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸前被截短。例如，可以包含除跨膜結(jié)構(gòu)域外的完整的恒定區(qū)。在這種情況中有利的是使在細(xì)胞TCR中形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸發(fā)生突變。
除通過異二聚化結(jié)構(gòu)域輔助鏈間穩(wěn)定性外，還可以使用引入的可形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。一種可能性是截短鄰近形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基的α和β鏈而不除去它們，從而進(jìn)行正常的鏈間二硫鍵。另一種可能性是僅刪除α和β鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域。如果表達(dá)α和β鏈的較短片段，那么可以以在氨基酸位置上進(jìn)行取代的方式來改造半胱氨酸殘基，其中兩種鏈的折疊使所述的殘基彼此鄰近以適合于二硫鍵形成。
通過許多不同的方式可以進(jìn)行TCR的純化。可以使用另一種離子交換方式或可以使用其它蛋白質(zhì)純化方式諸如凝膠過濾層析法或親和層析法。
在生產(chǎn)本發(fā)明的重組TCR的方法中，通過將某些蛋白質(zhì)成分、例如侶伴蛋白質(zhì)加入到重折疊混合物中也可以提高折疊功效。通過使蛋白質(zhì)經(jīng)過帶有增溶的最小侶伴蛋白質(zhì)的柱已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對重折疊的改進(jìn)(Altamirano,Golbik等1997；Altamirano,Garcia等1999)。
除實(shí)施例中所述的方法外，另一種使所述的TCR生物素標(biāo)記的方式也是可行的。例如，可以使用化學(xué)生物素標(biāo)記法。盡管在生物素標(biāo)記物序列中的某些氨基酸是必需的，但是可以使用另一種生物素標(biāo)記物(Schatz等，1993)。也可以改變用于生物素標(biāo)記的混合物。酶需要Mg-ATP和低離子強(qiáng)度，不過可以改變這兩個(gè)條件，例如能夠使用較高的離子強(qiáng)度和較長的反應(yīng)時(shí)間。能夠使用非抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素的分子以便形成TCR的多聚體。任何以多價(jià)方式結(jié)合生物素的分子都是合適的。另一方面，可以設(shè)計(jì)一種完全不同的鍵(諸如用于螯合鎳離子的聚-組氨酸標(biāo)記物)(Quiagen Product Guide 1999，第三章“蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、缺失和檢測”第35-37頁)。優(yōu)選的情況是，使所述的標(biāo)記物定向于所述蛋白質(zhì)的C-末端以便將與潛在肽-MHC復(fù)合物發(fā)生相互作用中的位阻的量降到最低限度。
用于本發(fā)明TCR的合適MHC-肽靶物的實(shí)例包括但不限于病毒表位諸如HTLV-1表位(例如由HLA-A2結(jié)合的Tax肽；HTLV-1與白血病有關(guān))；HIV表位；EBV表位；CMV表位；黑素瘤表位和其它癌癥特異性表位；以及與諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎這樣的自身免疫疾病相關(guān)的表位。
通過因可溶性TCRs的特異性而將藥物限制在一定區(qū)域可能促進(jìn)大多數(shù)疾病的治療。
藥物對病毒性疾病例如HIV、SIV、CMV的治療得益于所述藥物在受感染細(xì)胞附近釋放。對于癌癥來說，在腫瘤或轉(zhuǎn)移附近的定位會(huì)提高毒素或免疫刺激劑的作用。在自身免疫疾病中，免疫抑制劑藥物可以緩慢釋放，從而在較長的時(shí)間間隔內(nèi)具有更多的局部作用，同時(shí)將對受治療者總體免疫能力的影響降到最低限度。在預(yù)防移植排斥過程中，可以按照同樣的方式使免疫抑制劑藥物的作用達(dá)到最佳效果。為了進(jìn)行疫苗的轉(zhuǎn)運(yùn)，可以將疫苗抗原限制在抗原呈遞細(xì)胞附近，由此提高所述抗原的功效?？梢詫⒃摲椒ㄓ糜诔上衲康摹?br> 本發(fā)明各方面中的優(yōu)選特征在于可以對各其它方面做必要的修改。將本文所述的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)以法律所允許的最完整程度引入。
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不以任何方式來限定本發(fā)明的范圍。
參照下列附圖進(jìn)行描述，其中附

圖1是T-細(xì)胞受體-亮氨酸拉鏈融合蛋白的示意圖。各鏈由兩個(gè)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域、一個(gè)可變(V)區(qū)和一個(gè)恒定(C)區(qū)組成。所述的恒定區(qū)剛好在鏈間半胱氨酸殘基的n-末端被截短并與通過短接頭與來自C-末端約40個(gè)氨基酸的c-Jun(α)或c-Fos(β)的亮氨酸拉鏈異二聚化基序融合。所述的c-Jun(α)或c-Fos(β)各自含有兩個(gè)鏈間二硫鍵并僅通過非共價(jià)連接物配對。α鏈因是一個(gè)較小的恒定區(qū)而比β鏈短。
附圖2是異二聚化JM22zip受體的還原/非還原凝膠分析的照片。將純化TCR-拉鏈的相同樣品在還原條件(泳道2)和非還原條件(泳道4)下上15％丙烯酰胺SDS凝膠。標(biāo)記蛋白如泳道1和3中所示。分子量用千道爾頓表示。在兩組條件下，非共價(jià)結(jié)合的異二聚體被分離成α和β鏈。在泳道4中，各鏈以較高的遷移率移動(dòng)并成為單一帶，這表明存在單一種類的鏈間二硫鍵。這與正確的二硫鍵形成相一致。
附圖3是表示JM22zip TCR與HLA-A2 Flu基質(zhì)(M58-66)復(fù)合物特異性結(jié)合的示意圖。圍繞單一肽類重折疊并在β2-微球蛋白上生物素標(biāo)記的HLA-A2復(fù)合物已經(jīng)被固定在三種鏈霉抗生物素包被的流式細(xì)胞(FC)3上流式細(xì)胞(FC)3上的HLA-A2 POL對照的3770共振單位(RU)；和兩種不同濃度的HLA-A2 M58-66 FLU(FC1上為2970RU且FC2上為4960RU)。已經(jīng)在所有三種流式細(xì)胞上將JM22zip以43μM的濃度連續(xù)注入流動(dòng)相，持續(xù)60秒。在注射過程中，觀察到在HLA-A2 FLU-包被的流式細(xì)胞的反應(yīng)中上述背景值增加，JM22zip分別與流式細(xì)胞1和2特異性結(jié)合的共振單位約為1000RU和700RU。
附圖4表示用于“錨著式擴(kuò)增TCR基因”的合成DNA引物的序列。給用于克隆的DNA限制酶類的識(shí)別位點(diǎn)下劃線。A聚-C“錨定引物”。BTCRα鏈恒定區(qū)特異性引物。CTCRβ鏈恒定區(qū)特異性引物。
附圖5表示用于可編碼c-jun和c-fos40個(gè)氨基酸卷曲螺旋(“亮氨酸拉鏈”)區(qū)的DNA片段的PCR擴(kuò)增的合成DNA引物序列。給用于克隆的DNA限制酶類的識(shí)別位點(diǎn)下劃線。A:c-jun 5’引物”。B:c-jun 3’引物。C:c-fos 5’引物。D:c-fos 3’引物。
附圖6表示作為與TCRs融合的c-fos和c-jun片段的相應(yīng)DNA和氨基酸(一個(gè)字母編碼)序列(pBJ107和pBJ108中的插入片段)。A與TCRα鏈融合的c-jun亮氨酸拉鏈。B與TCRβ鏈融合的c-fos亮氨酸拉鏈。
附圖7表示用于使TCRβ鏈中未配對的半胱氨酸殘基發(fā)生突變的合成DNA引物的序列。設(shè)計(jì)所述的引物以便在用于誘變的“QuickchangTM”法中使用(Stratagene)。A半胱氨酸突變成絲氨酸，正向(有義)引物，表明氨基酸序列和突變。B半胱氨酸突變成絲氨酸，反向(無義)引物。C半胱氨酸突變成丙氨酸，正向(有義)引物，表明氨基酸序列和突變。D半胱氨酸突變成丙氨酸，反向(無義)引物。
附圖8是TCR-拉鏈融合蛋白的代表性示意圖。將4個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域表示為圓頂狀，它們帶有所示的半胱氨酸殘基配對之間的鏈間二硫鍵。數(shù)字表示成熟T-細(xì)胞受體中的氨基酸位置；由于在重組后鏈長發(fā)生了輕度改變，所以鏈長可以在不同TCRs之間輕度改變。用一個(gè)字母編碼表示接頭序列中引入的殘基。
附圖9表示用于TCRα和β鏈的PCR擴(kuò)增的合成DNA引物的序列。給用于DNA限制酶類的識(shí)別位點(diǎn)下劃線并在正向引物序列內(nèi)表示符合相應(yīng)TCR鏈的氨基酸序列。用小寫字母表示相對于不符合TCR基因的TCR基因序列和其它DNA序列的沉默DNA突變。A用于結(jié)合在JM22流感基質(zhì)病毒肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα10.2鏈的5’PCR引物。B用于結(jié)合在JM22流感基質(zhì)病毒肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ17鏈的5’PCR引物。C用于結(jié)合在流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的鼠Vα4鏈的5’PCR引物。D用于結(jié)合在流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的鼠Vβ11鏈的5’PCR引物。E結(jié)合在003 HIV-1Gag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα23鏈的5’PCR引物。F結(jié)合在003 HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ5.1鏈的5’PCR引物。G結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vα2.3鏈的5’PCR引物。H結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vβ12.3鏈的5’PCR引物。I結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vα17.2鏈的5’PCR引物。J結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vβ12.3鏈的5’PCR引物。K一般使用的人Cα鏈的3’PCR引物。L一般使用的人Cβ鏈的3’PCR引物。
附圖10表示作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的TCRα鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖11表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的TCRβ鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。
附圖12表示作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRα鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖13表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自鼠F5受體的結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-fos序列之間的接頭序列。
附圖14表示作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖15表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRβ鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。
附圖16表示作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自考慮A6的結(jié)合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRα鏈(Garboczi,Utz等；1996；Garboczi,Ghosh等，1996)的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖17表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和起B(yǎng)irA替代物作用的生物素標(biāo)記(Barker和Campbell,1981；Barker和Campbell,1981；Howard,Shaw等，1985；Schatz,1993；O’Callaghan,Byford,1999)融合的來自克隆A6(Garboczi,Utz等；1996；Garboczi,Ghosh等，1996)的結(jié)合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用半胱氨酸殘基替換丙氨酸殘基的DNA序列的突變。
附圖18表示作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆M10B7/D3(Ding等，1998)的結(jié)合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRα鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖19表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和起B(yǎng)irA替代物作用的生物素標(biāo)記融合的來自克隆M10B7/D3(Ding等，1998)的結(jié)合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用丙氨酸取代半胱氨酸殘基的DNA序列的突變。為克隆目的和除去Xmal限制位點(diǎn)而引入的兩種沉默突變(P-G密碼子)也用小寫字母表示。
附圖20表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和起B(yǎng)irA替代物作用的生物素標(biāo)記(Barker和Campbell,1981；Barker和Campbell,1981；Howard,Shaw等，1985；Schatz,1993；O’Callaghan,Byford,1999)融合的來自克隆A6(Garboczi,Utz等；1996；Garboczi,Ghosh等，1996)的結(jié)合在突變型可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ鏈的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用半胱氨酸殘基取代丙氨酸殘基的DNA序列的突變。另外用粗體和下劃線表示的是用天冬酰胺殘基取代天冬氨酸，它是一種在對可溶性TCR沒有可檢測到的功能作用的恒定區(qū)中的突變。
附圖21表示用于TCRβ鏈的c-fos-生物素標(biāo)記的融合配偶體的推定的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。給用于DNA限制酶類的識(shí)別位點(diǎn)下劃線并表示兩個(gè)融合結(jié)構(gòu)域的邊緣。用小寫字母表示接頭序列。
附圖22表示用于人JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201的Vβ-c-fos亮氨酸拉鏈片段的PCR擴(kuò)增的合成DNA引物序列。
附圖23是一組凝膠的照片。a．對由SDS-PAGE分析的003 HIV gag肽-HLA-A2復(fù)合物具有特異性的TCR的變性蛋白質(zhì)的制備物。泳道1廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)；泳道2和3用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后的細(xì)菌；泳道4和5在6M胍緩沖液中增溶的純化內(nèi)含體。b．對由SDS-PAGE分析的流感基質(zhì)肽-HLA-A2復(fù)合物具有特異性的生物素標(biāo)記的TCR的變性蛋白質(zhì)的制備物。泳道1廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)；泳道2和3在6M胍緩沖液中增溶的α-和β-鏈的純化內(nèi)含體。c.對由SDS-PAGE分析的HTLA tax肽-HLA-A2復(fù)合物具有特異性的生物素標(biāo)記的TCR的變性蛋白質(zhì)的制備物。泳道1和5廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)；泳道2、3和4用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后的細(xì)菌中α-、β-和突變型β-鏈的表達(dá)；泳道6、7和8在6M胍緩沖液中增溶的α-、β-和突變型β-鏈的純化內(nèi)含體。
附圖24是表示JM22z異二聚體從POROS 10HQ陰離子交換柱上洗脫的層析譜。虛線表示顯示出氯化鈉濃度的傳導(dǎo)性，實(shí)線表示在280nm處顯示出洗脫液中蛋白質(zhì)濃度的光密度。收集含有級分的峰蛋白質(zhì)用于進(jìn)一步分析。插入部分表示從Superdex 200 HR柱上洗脫純化的JM22的層析譜。箭頭指示用公知分子量校準(zhǔn)的柱。通過與這些蛋白質(zhì)比較，重折疊的JM22蛋白質(zhì)具有的分子量約為74kDA，它與異二聚化蛋白質(zhì)一致。
附圖25是表示純化JM22z蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的照片(考馬斯染色)。泳道1和3公知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)(如指示的)；泳道2在上樣前用含有還原劑(DTT)的SDS-樣品緩沖液處理的JM22z蛋白質(zhì)；泳道4在沒有還原劑存在的情況下用SDS-樣品緩沖液處理的JM22z蛋白質(zhì)。
附圖26a．對流感基質(zhì)肽-HLA-A2復(fù)合物具有特異性的重折疊生物素標(biāo)記的TCR的純化。?。畯腜OROS 10HQ柱上洗脫所述蛋白質(zhì)的層析譜。線x表示在280nm處的吸收度且線y表示傳導(dǎo)性(用于洗脫所述蛋白質(zhì)的氯化鈉梯度的測定值)。用垂直線表示級分?jǐn)?shù)量。ⅱ．從柱中洗脫下來的級分的SDS-PAGE如ⅰ中所示。泳道1中含有廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)且泳道2-13中分別含有5μl的級分6-15。ⅲ．對從含有生物素標(biāo)記的flu-TCR的ⅰ中收集的級分的SDS-PAGE分析。泳道1廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)；泳道2生物素標(biāo)記的flu-TCR蛋白質(zhì)。b.對HTLA-tax肽-HLA-A2復(fù)合物具有特異性的重折疊生物素標(biāo)記的TCR的純化。?。畯腜OROS 10HQ柱上洗脫所述蛋白質(zhì)的層析譜。線x表示在280nm處的吸收度且線y表示傳導(dǎo)性(用于洗脫所述蛋白質(zhì)的氯化鈉梯度的測定值)。用垂直線表示級分?jǐn)?shù)量。ⅱ．從柱中洗脫下來的級分的SDS-PAGE如ⅰ中所示。泳道1中含有廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)且泳道2-10中分別含有5μl的級分3-11。ⅲ．對從生物素標(biāo)記的tax-TCR的ⅰ中收集的級分的SDS-PAGE分析。泳道1廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)；泳道2生物素標(biāo)記的tax-TCR蛋白質(zhì)；泳道3突變型生物素標(biāo)記的tax-TCR蛋白質(zhì)。
附圖27是表示在用BirA酶生物素標(biāo)記后從用PBS平衡的Superdex 200 HR柱上洗脫生物素標(biāo)記的可溶性TCR的層析譜。生物素標(biāo)記的TCR在15-16分鐘左右時(shí)洗脫下來且游離的生物素在21分鐘左右時(shí)洗脫下來。收集含有生物素標(biāo)記的可溶性TCR用于進(jìn)一步應(yīng)用。
附圖28是一組凝膠照片。生物素標(biāo)記TCRs的生物素標(biāo)記評估。a．重折疊TCRs和內(nèi)含體制備物的SDS-PAGE。泳道1廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)、泳道2生物素標(biāo)記的flu-TCR、泳道3生物素標(biāo)記的tax-TCR、泳道4生物素標(biāo)記的突變型tax-TCR、泳道5:HIVgag-TCR(未經(jīng)生物素標(biāo)記)；b．將除廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)外與a．相同的凝膠蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行生物素標(biāo)記(Bio-Rad)。用抗生物素蛋白-HRP接合物染色以顯示出生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)并用Opti-4CN(Bio-Rad)顯色。
附圖29解釋了JM22z與不同HLA-A2-肽復(fù)合物的結(jié)合情況(插入部分)。通過將來自使TCR通過用1900RU的HLA-A2-flu包被的流式細(xì)胞的SPR反應(yīng)與來自使TCR通過兩種其它流式細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行比較來證明JM22z與HLA-A2-flu之間相互作用的特異性，其中所述的兩種其它細(xì)胞中的一種用4200RU的HLA-A2-pol包被，而另一種用4300RU的CD5包被。在1700RU的HLA-A2-pol(a)上測定不同JM22z濃度下的背景響應(yīng)值。從對1900RU的HLA-A2-flu(b)測定的特異性響應(yīng)值中扣除背景值并對濃度(c)繪圖。通過非線性曲線配合估計(jì)的13μM的Kd是以相同數(shù)據(jù)的斯卡查德圖為基礎(chǔ)計(jì)算的12μM的Kd。
附圖30是表示對野生型和突變型可溶性生物素標(biāo)記的taxTCR進(jìn)行Biacore 2000TM分析的結(jié)果的示意圖。使5μl、2.2mg/ml濃度的野生型tax TCR且然后使2.4mg/ml的突變型tax TCR流過含有下列與表面結(jié)合的蛋白質(zhì)的流式細(xì)胞A:tax-pMHC復(fù)合物；B/C:flu-pMHC復(fù)合物；D:OX68對照蛋白質(zhì)。野生型和突變型蛋白質(zhì)以類似方式與特異性pMHC復(fù)合物結(jié)合。
附圖31表示可溶性CD8aa結(jié)合對可溶性TCR與相同HLA-A2-flu復(fù)合物結(jié)合的影響。(A)將TCR或TCR加120μM可溶性CD8注入用4100RU的無關(guān)蛋白質(zhì)(CD5)包被的對照流式細(xì)胞和用4700RU的HLA-A2-flu包被的探針流式細(xì)胞。在扣除背景值后，顯示出在不同濃度的單一TCR(空心圓圈)或不同濃度的TCR與120μM可溶性CD8結(jié)合物(實(shí)心圓圈)下計(jì)算的平衡響應(yīng)值。還顯示出的是單一CD8(空心三角形)的值和所計(jì)算的TCR+CD8與單一TCR(實(shí)心正方形)之間的差值。(B)顯示出對在25℃和5μl/分鐘流速條件下單一49μMTCR(實(shí)心圓圈)或與120μM CD8結(jié)合(實(shí)心圓圈)的4700RU的固定化HLA-A2-flu響應(yīng)的時(shí)間依賴性(所述的值與對4100RU的固定化CD5測定的背景值相關(guān))；TCR的偏離比例不會(huì)受到同時(shí)進(jìn)行CD8結(jié)合的影響。
附圖32表示作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的TCRα鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖33表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的TCRβ鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用絲氨酸殘基替換半胱氨酸殘基的DNA序列的突變。這種突變可增加TCR的重折疊效率。
附圖34表示作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和起B(yǎng)irA底物作用的生物素標(biāo)記融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的TCRβ鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間以及c-fos與生物素標(biāo)記之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用絲氨酸殘基取代半胱氨酸殘基的DNA序列的突變。這種突變可增加TCR的重折疊效率。
附圖35是TCR-拉鏈-生物素標(biāo)記融合蛋白的示意圖。
附圖36．用梯度氯化鈉從PORO 10HQ柱上洗脫重折疊的TCR。在約100mM NaCl處TCR洗脫液為單峰。收集含OD(280nm)大于0.1的蛋白質(zhì)的級分并濃縮以便生物素標(biāo)記。
附圖37．通過在Superdex 200HR 10/30柱(Pharmacia)上的凝膠過濾從游離生物素中分離生物素標(biāo)記的TCR。在約15ml時(shí)TCR-生物素洗脫下來，相當(dāng)于69kDa的分子量。(標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)及其洗脫體積甲狀腺球蛋白(669kDa)10.14ml；脫鐵鐵蛋白(134kDa)11.36ml；β-淀粉酶(200kDa)12.72ml；BSA二聚體(134kDa)13.12ml；BSA單體(67kDa)14.93ml；卵清蛋白(43kDa)15.00ml；胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)18.09ml；Rnase A(13.7kDa)18.91ml)。
附圖38．作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆6(Garboczi等1996；Garboczi等1996)的結(jié)合在可溶性HTLA-1Tax/HLA-A2上的TCRα鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間以及c-fos與生物素標(biāo)記之間的接頭序列。用小寫字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大腸桿菌中促進(jìn)基因表達(dá)的突變，正如是TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖39．作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和起B(yǎng)irA底物作用的生物素標(biāo)記融合的來自克隆6(Garboczi等1996；Garboczi等1996)的結(jié)合在可溶性HTLA-1 Tax/HLA-A2上的TCRα鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用丙氨酸殘基替換半胱氨酸殘基的DNA序列的突變。
附圖40．作為與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆M10B7/D3(Ding等，1998)的結(jié)合在可溶性HTLA-1 Tax/HLA-A2上的TCRα鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-jun序列之間的接頭序列。
附圖41．作為與c-fos的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域和起B(yǎng)irA底物作用的生物素標(biāo)記融合的來自克隆m10B7/D3(Ding等1998)的結(jié)合在可溶性HTLA-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ鏈的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼，上部)和DNA序列(下部)。用小寫字母表示TCR與c-fos序列之間的接頭序列。用粗體和下劃線來表示用丙氨酸殘基替換半胱氨酸殘基的DNA序列的突變。為克隆目的和除去Xmal限制位點(diǎn)而引入的兩種沉默突變(P-G密碼子)也用小寫字母表示。
實(shí)施例在下列實(shí)施例中，使用如下列出的一般方法和材料。材料限制酶(Ndel、BamHⅠ、HindⅢ、Bsu36l、XmaⅠ)來自New EnglandBiolabs。
Tris pH 8.1由均來自USB的等份的Tris堿與Tris-HCl制成2M儲(chǔ)備溶液。
將EDTA(Sigma)制成0.5M的儲(chǔ)備溶液并使用5M NaOH(Sigma)將pH調(diào)節(jié)至8.0。
氧化和還原形式的谷胱甘肽來自Sigma。
胱胺和半胱胺來自Sigma。
氯化鈉來自USB并將其制成4M儲(chǔ)備溶液。
用于質(zhì)粒純化的小量制備試劑盒來自Quiagen。
PCR純化試劑盒來自Quiagen。
DTT來自Sigma。
胍來自Fluka。
尿素來自Sigma。
RPMI培養(yǎng)基來自Sigma。
PBS由來自O(shè)xoid的片制成。
甘油來自BDH。一般方法如下制備細(xì)菌培養(yǎng)基(TYP培養(yǎng)基)將160g酵母提取物(Difco)、160g胰化蛋白胨(Difco)、50g NaCl(USB)和25g K2HPO4(BDH)溶于2L脫礦質(zhì)水。將200ml該溶液的等分試樣定量入10×2L錐瓶中并通過添加800ml脫礦質(zhì)水制成1L。將錐瓶用4層鋁箔覆蓋、標(biāo)記并高壓滅菌。在冷卻后，使用前將所述的錐瓶保存在避免日光直接照射的室溫下。
使用Pierce考馬斯結(jié)合檢測法并以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)濃度。簡單地說，由裝在4ml塑料杯中的2mg/ml BSA(Pierce)儲(chǔ)備液制備0-25μg BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶于1ml體積水所得到的溶液。以相同方式用水將約10μg的未知蛋白質(zhì)制成1ml。向各杯中加入1ml Pierce考馬斯試劑并劇烈混合內(nèi)含物。使用Beckman DU-530 UV分光光度計(jì)在595nm處測定15分鐘內(nèi)的光密度。對來自BSA標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果進(jìn)行線性回歸(線性至25μg BSA是良好的)并通過使用這些結(jié)果的內(nèi)插法來估計(jì)未知蛋白質(zhì)的濃度。
在安裝有計(jì)算機(jī)控制器的Pharmacia FPLC系統(tǒng)上進(jìn)行凝膠過濾層析。使用用于測定280nm波長處吸收度的UV-MⅡ系統(tǒng)監(jiān)測蛋白質(zhì)的洗脫。對于小規(guī)模分離來說，使用Superdex 200HR 10/30柱并使用1ml環(huán)上樣。在運(yùn)轉(zhuǎn)前用30ml的PBS平衡柱并使含有所收集的1ml級分的樣品以0.5ml/分鐘流出。對于大規(guī)模分離來說，使用Superdex 75或200PG 26/60柱與10ml超大環(huán)。在這種情況中，收集5或10ml樣品并以4ml/分鐘流過柱。所有分離均在室溫下進(jìn)行。
在Biocad Sprint系統(tǒng)(Perkin-Elmer)上進(jìn)行離子交換層析。對于陽離子交換來說，使用20HS或50HS柱。對于陰離子交換來說，使用10HQ、20HQ或50HQ柱。使用可通過6路混合器的所建議的緩沖液過柱。使用5ml注射環(huán)注射少量樣品(5-25ml)。使用一種緩沖液管注射大量樣品(＞100ml)。在柱運(yùn)轉(zhuǎn)的洗脫步驟中收集1ml級分。通過280nm處的線內(nèi)吸光度來測定蛋白質(zhì)洗脫液。
使用Bio-Rad Mini-ProteanⅡ凝膠組件進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。在應(yīng)用前使用下列程序傾出凝膠。制備凝膠板組件并檢驗(yàn)以確保不滲漏。然后制備下列混合物12％丙烯酰胺/二丙烯酰胺(由30％丙烯酰胺/0.8％二丙烯酰胺儲(chǔ)備溶液(NationalDiagnostics)制備)；0.375M Tris pH 8.8(由1.5M具有相同pH的儲(chǔ)備溶液制備)；0.1％SDS(由10％的SDS儲(chǔ)備溶液制備)；0.05％過硫酸銨(由保存在4℃下的10％的相同儲(chǔ)備溶液制備)；和0.1％TEMED(Sigma)。立即將該混合物傾入凝膠板組件并使水飽和的丁醇在上部分層以確保上表面平坦。在凝膠已經(jīng)固定后(最少10-15分鐘)，如下混合積層凝膠。4％丙烯酰胺(由如上所述的儲(chǔ)備溶液制備)；0.125MTris pH6.8(由具有相同pH的0.5M儲(chǔ)備溶液制備)；0.1％SDS；0.05％過硫酸銨；和0.2％TEMED。通過在薄織物上吸附而從再溶解的凝膠表面除去丁醇并將積層凝膠混合物傾在再溶解的凝膠上部。立即插入凝膠蜂窩體，注意避免將氣泡引入凝膠；并使積層凝膠固定最少5分鐘。
然后將該凝膠裝入凝膠裝置并將流動(dòng)的緩沖液(3g/L Tris-堿、14.4g/L甘氨酸、1g/L SDS(由10×濃縮儲(chǔ)備溶液稀釋))在陽極和陰極傾入所述裝置。在除去凝膠蜂窩體后，用流動(dòng)的緩沖液洗去孔中物以防止殘留的丙烯酰胺混合物固定在孔的底部。通過按1∶1混合蛋白質(zhì)與下列混合物來制備樣品4％SDS；0.125M Tris pH 6.8；20％甘油；10％β-巰基乙醇；1％溴酚藍(lán)(Sigma)。接著將樣品加熱到95℃、持續(xù)2分鐘并在加樣至25μl前冷卻入積層凝膠中的孔中。通常加約1-10μg的蛋白質(zhì)以確保良好的染色和凝膠的流動(dòng)性。在加樣后，以200V的恒定電壓使凝膠泳動(dòng)約40分鐘或直到溴酚藍(lán)染料距凝膠末端約5mm為止。
在完成電泳后，從裝置中取出凝膠并仔細(xì)滴入0.1％的考馬斯R-250(Sigma)溶于10％乙酸、40％甲醇、50％水所得到的溶液。然后在幾種10％乙酸、40％甲醇、50％水的變化溶液中脫色前將凝膠緩慢攪拌至少30分鐘，直到凝膠背景清澈為止。接著將凝膠保存在水中并使用由發(fā)光盒、數(shù)字照相機(jī)和感熱式印字機(jī)組成的UVP凝膠記錄系統(tǒng)進(jìn)行記錄。實(shí)施例1-重組可溶性TCR將重組可溶形式的異二聚化TCR分子如附圖1中所述改造。各鏈由通過短彈性接頭與有助于穩(wěn)定異二聚體的卷曲螺旋基元融合的膜遠(yuǎn)端和膜近端免疫球蛋白區(qū)組成。
在半胱氨酸殘基體外形成鏈間二硫鍵前立即將TCR恒定區(qū)截短。因此，兩鏈通過非共價(jià)四元連接物配對且這由附圖2b來證明。當(dāng)fos-jun拉鏈肽異二聚體也能夠立即形成與所用接頭連接的鏈間二硫N-末端(O’Shea等1989)時(shí)，預(yù)計(jì)彼此相對的兩鏈的排列是最佳的情況。需要將融合蛋白以與各單獨(dú)成分相容的方式連接，從而避免破壞各結(jié)構(gòu)。
通過如上所述的錨式PCR(Moss等1991)從Vβ17+人CTL克隆(JM22)獲得編碼對HLA-A2中流感基質(zhì)蛋白58-66表位具有特異性的TCRα和β鏈的cDNA。
通過使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)擴(kuò)增各鏈中的可變區(qū)和恒定區(qū)并在亮氨酸拉鏈上剪接分別來自真核轉(zhuǎn)錄因子Jun和Fos的產(chǎn)物來分別構(gòu)建α和βTCR-拉鏈構(gòu)建體pJM22α-Jun和pJM22β-Fos(參見附圖1)。已經(jīng)證實(shí)這些40個(gè)氨基酸長度的序列在從合成肽類中重折疊時(shí)特異性地異二聚化而不需共價(jià)鏈間鍵(O’Shea等1989)。
將引物設(shè)計(jì)成將高AT含量立即引入起始密碼子的3’端(以使mRNA二級結(jié)構(gòu)脫穩(wěn)定)并使用大腸桿菌密碼子選擇以便最大程度地進(jìn)行表達(dá)(Gao等)。使TCRβ恒定區(qū)中的備用半胱氨酸突變成絲氨酸以確保防止在重折疊過程中不正確的二硫鍵合。
將DNA構(gòu)建體單獨(dú)連入大腸桿菌表達(dá)載體pGMT7。質(zhì)粒消化和DNA測序證明該構(gòu)建體是正確的。
所用的程序具體描述如下。
TCR拉鏈的表達(dá)和變性內(nèi)含體的純化將分別含有JM22α-Jun和JM22β-Fos的pGMT7表達(dá)質(zhì)粒GFG020和GFG021分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21pLysS并在用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)前在37℃下使單一氨芐西林抗性克隆在TYP(氨芐西林100μg/ml)培養(yǎng)基中生長至OD600為0.4。通過在Beckman J-6B中以4000rpm離心30分鐘而誘導(dǎo)3小時(shí)后收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于含有50mM Tris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mm NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮化鈉、10mM DTT的緩沖液(pH8.0)中。在過夜冷凍-融化步驟后，使用標(biāo)準(zhǔn)12mm直徑探針在Milsonix XL2020超聲波儀中將重新懸浮的細(xì)胞用1分鐘脈沖超聲處理、總計(jì)約10分鐘。通過在Beckman J2-21離心機(jī)中以13000rpm離心30分鐘來回收內(nèi)含體沉淀。然后進(jìn)行三次洗滌劑洗滌以除去細(xì)胞碎片和膜成分。通過在Beckman J2-21中以13000rpm離心15分鐘而沉淀前，每次將內(nèi)含體沉淀在Triton緩沖液(50mMTris-HCL、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮化鈉、2每DTT,pH8.0)中勻漿。接著通過用下列緩沖液進(jìn)行類似洗滌而除去洗滌劑和鹽50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)疊氮化鈉、2mM DTT,pH8.0。最后，在4℃下分別將JM22α-Jun和JM22β-Fos內(nèi)含體沉淀溶于尿素溶液(50mM MES、8M尿素、10mMNaEDTA、2mM DTT,pH6.5)3-4小時(shí)。通過在Beckman J2-21中以13000rpm離心30分鐘沉淀不溶性物質(zhì)并將上清液分成1ml的等分試樣并在-70℃下冷凍。用Bradford染料結(jié)合試驗(yàn)(Biorad)對溶于尿素中的內(nèi)含體進(jìn)行定量。對各鏈來說，從1升培養(yǎng)物中獲得約100mg純化內(nèi)含體的產(chǎn)量。以約20mg/ml的濃度使各內(nèi)含體(JM22α-Jun和JM22β-Fos)溶于尿素溶液中并根據(jù)凝膠分析估計(jì)這種形式的純度約為90％(未給出數(shù)據(jù))。TCR-拉鏈融合蛋白的共重折疊使用標(biāo)準(zhǔn)重折疊緩沖液(100mM Tris pH8.5、1M L-精氨酸、2mMEDTA、5mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、0.2mMPMSF)進(jìn)行的初始重折疊實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)急劇沉淀，這種沉淀情況視存在的拉鏈結(jié)構(gòu)域而定。這種現(xiàn)象發(fā)生在低于拉鏈二聚化的解離恒定值的濃度下這一事實(shí)(即當(dāng)預(yù)計(jì)大多數(shù)拉鏈螺旋是單體的情況時(shí))提示另外有力量使錯(cuò)折疊的種類保持穩(wěn)定。最可能的解釋是完整的α-螺旋拉鏈結(jié)構(gòu)域首先折疊且其瞬時(shí)異二聚化可誘導(dǎo)更為復(fù)雜的免疫球蛋白區(qū)的部分折疊的中間體發(fā)生鏈間聚集。由此將重折疊緩沖液改變成包括5M尿素以便防止部分折疊免疫球蛋白區(qū)之間的疏水相互作用并在異二聚化前使各鏈完全折疊。該步驟足以防止沉淀發(fā)生且使用下列方案得到裝配有合適產(chǎn)量的正確折疊的TCR-拉鏈異二聚體。
通過稀釋共重折疊來復(fù)原TCR-拉鏈JM22α-Jun和JM22β-Fos的尿素增溶的儲(chǔ)備物。從冷凍的儲(chǔ)備物中融化約30mg(即1μ摩爾)的各增溶的內(nèi)含體鏈并加入進(jìn)一步脈沖的DTT(4μ摩爾/ml)以確保完全還原半胱氨酸殘基。然后混合樣品并將混合物稀釋成15ml的胍溶液(6M鹽酸胍、10mM乙酸鈉、10mM EDTA)，從而確保完整鏈的變性。接著將含有全部還原并變性TCR-拉鏈的胍溶液注入1升的下列重折疊緩沖液中100mM Tris pH 8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、5M尿素、0.2mMPMSF。使該溶液維持24小時(shí)。然后將重折疊物透析兩次，第一次對10升的100mM尿素透析，第二次對10升的100mM尿素、10mM TrispH 8.0透析。在6-8℃下進(jìn)行重折疊和透析步驟。重折疊的TCR-拉鏈的純化使用BioCad工作站(Perseptive Biosystems)、通過將透析的重折疊物以7個(gè)200ml的等分試樣上POROS 10HQ分析型陰離子交換柱并用0-400mM NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)50個(gè)體積以上而從降解產(chǎn)物和雜質(zhì)中分離TCR-拉鏈JM22zip。在單峰中以約100mM NaCl洗脫非共價(jià)結(jié)合的異二聚體。收集和濃縮前，將峰級分(一般含有100-300μg/ml濃度的異二聚體)保存在4℃下。異二聚體的產(chǎn)率約為15％。重折疊TCR-拉鏈JM22zip的鑒定通過陰離子交換洗脫的JM22zip異二聚體從Superdex 200凝膠過濾分級柱(Pharmacia)上洗脫為約70kDa蛋白質(zhì)。特別重要的是在表面胞質(zhì)共振結(jié)合分析前包括凝膠過濾步驟，因?yàn)榫_的親和性和動(dòng)力學(xué)測定值依賴于發(fā)生單體的相互作用。在這種方式中，用于分析的可溶性蛋白質(zhì)級分中不包括更高級別的聚集物。特別地，聚集物人為地產(chǎn)生可檢測的緩慢結(jié)合和解離率的恒定值。
通過附圖2中的還原/非還原凝膠分析檢驗(yàn)了各鏈的氧化態(tài)。在SDS存在的情況下，非共價(jià)結(jié)合的異二聚體被解離成α和β鏈。如果將DTT用于上樣緩沖液，那么兩鏈通過任何一側(cè)的31kDa標(biāo)記。在沒有這類變性劑存在的情況下，兩鏈仍然起單一種類的作用，而各鏈的遷移率增加，這提示各鏈已經(jīng)形成了單一的二硫鍵結(jié)合的種類(Garboczi等1996)。
已經(jīng)使用Biacore 2000機(jī)(Biacore)上的表面胞質(zhì)共振檢測了重折疊受體的抗體反應(yīng)性。使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶合法在pH5.5下將TCR-拉鏈JM22z固定在葡聚糖基質(zhì)(CM嵌片)結(jié)合表面上。對β鏈(Vβ17)具有特異性的可變區(qū)抗體特異性地與所固定的受體結(jié)合，這意味著正確的構(gòu)象。穩(wěn)定性表達(dá)為α-jun和β-fos亮氨酸拉鏈融合體的可溶性TCRs在數(shù)個(gè)月的期限內(nèi)是穩(wěn)定的且由此適合于檢測由Ⅰ型MHC呈遞的特異性抗原。實(shí)施例2-人TCR-病毒肽-MHC的動(dòng)力學(xué)和親和性研究重折疊TCR-拉鏈與肽-MHC復(fù)合物的特異性結(jié)合將表面胞質(zhì)共振生物傳感器(Biacore)用于分析TCR-拉鏈(JM22zip，對HLA-A2流感基質(zhì)蛋白M58-66復(fù)合物具有特異性)與其肽-MHC配體的結(jié)合情況(參見附圖3)。我們通過生產(chǎn)可以以半定向的方式固定在鏈霉抗生物素包被的結(jié)合表面上的單一pMHC復(fù)合物(如下所述)而促進(jìn)了這一分析，從而可有效地檢測可溶性T-細(xì)胞受體同時(shí)與高達(dá)4種不同pMHC(固定在單獨(dú)的流式細(xì)胞上)的結(jié)合情況。手工注射HLA復(fù)合物使得可方便地操作精確水平的固定化Ⅰ型分子。
這類固定化復(fù)合物能夠結(jié)合T-細(xì)胞受體(參見附圖3)和共同受體CD8αα，可以將兩者注入流動(dòng)相。甚至在低濃度(至少40μg/ml)下也獲得了TCR-拉鏈的特異性結(jié)合，這意味著TCR拉鏈?zhǔn)窍鄬Ψ€(wěn)定的。如果將TCR用于流動(dòng)相或固定相，那么可近似定性和定量地觀察到JM22z的pMHC結(jié)合特性。這是對可溶性物質(zhì)的部分活性的重要控制并且還提示生物素標(biāo)記的pMHC復(fù)合物與非生物素標(biāo)記的復(fù)合物同樣具有生物活性?；瘜W(xué)生物素標(biāo)記的HLA復(fù)合物的制備已經(jīng)描述了用于生產(chǎn)可溶性重組Ⅰ型單一肽HLA復(fù)合物的方法(Garboczi 1992)。已經(jīng)將它們進(jìn)行了修飾以便生產(chǎn)具有以化學(xué)方式生物素標(biāo)記且由此可以被固定在鏈霉抗生物素包被的結(jié)合嵌片上并用于表面胞質(zhì)基因結(jié)合研究的β-2-微球蛋白結(jié)構(gòu)域的HLA復(fù)合物。
表達(dá)β-2-微球蛋白并基本上如上所述(Garboczi 1992)在標(biāo)準(zhǔn)重折疊緩沖液(100mM Tris pH 8.0、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、0.1mM PMSF)中重折疊40mg的β-2-微球蛋白。在任意的凝膠過濾步驟后，將蛋白質(zhì)交換成0.1M硼酸鈉(pH 8.8)且最終濃縮至5-10mg/ml。另外使用Bradfod測定法(Biorad)來對β-2-微球蛋白進(jìn)行定量。從制成的10mg/ml的DMSO儲(chǔ)備溶液中添加5摩爾過量的生物素羥基琥珀酰亞胺(Sigma)。在室溫下將該反應(yīng)維持1小時(shí)并用20μl的1M氯化銨/250μg所用的生物素酯來終止反應(yīng)。使用Superdex 200凝膠過濾分級柱(Pharmacia)從游離生物素和游離生物素標(biāo)記的β-2-微球蛋白中分離重折疊的HLA復(fù)合物。通過標(biāo)準(zhǔn)胺偶合法來固定鏈霉抗生物素。結(jié)論因此，實(shí)施例1中所述的蛋白質(zhì)重折疊法生產(chǎn)了穩(wěn)定的、正確折疊的功能性重組受體融合蛋白，它適合于使用光學(xué)生物傳感器進(jìn)行的生物物理學(xué)分析。該方法已經(jīng)提供了一種用于進(jìn)行人TCR-pMHC相互作用的具體親和性和動(dòng)力學(xué)分析的試劑。已經(jīng)另外研究了T-細(xì)胞共同受體-MHC和TCR-pMHC的相互作用對彼此的影響。所用的重組技術(shù)一般適用于鼠和人TCRs(結(jié)合在Ⅰ型和Ⅱ型上的)且能夠?qū)CRs的范圍進(jìn)行類似的分析。這會(huì)產(chǎn)生各種問題，諸如TCR親和性在抗病毒反應(yīng)中的范圍；區(qū)域選擇性受體的特性和受體觸發(fā)的動(dòng)力學(xué)要求。該方法還提供了一種在結(jié)晶試驗(yàn)前檢驗(yàn)TCR配體特異性的方式并還對其它細(xì)胞表面受體的重組生產(chǎn)具有意義。實(shí)施例3-可溶性T-細(xì)胞受體的生物素標(biāo)記和四聚體化如實(shí)施例1中所述制備的2.5ml純化的可溶性TCR(～0.2mg/ml)是使用PD-10柱(Pharmacia)交換成生物素標(biāo)記反應(yīng)緩沖液(10mMTris pH 8.0、5mM NaCl、7.5mM MgCl2)的緩沖液。使用centricon濃縮器(Amicon)將含有10kDa截止分子量的洗脫液(3.5ml)濃縮成1ml。用從儲(chǔ)備溶液(調(diào)節(jié)至pH 7.0的0.1g/ml)添加的ATP將其制成5mM。加入蛋白酶抑制劑的混合物亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和PMSF(0.1mM)；隨后加入1mM生物素(從0.2M儲(chǔ)備溶液中添加)和5μg/ml酶(來自0.5mg/ml儲(chǔ)備溶液)。然后在室溫下將該混合物培養(yǎng)過夜。通過對10mM Tris pH 8.0、5mM NaCl(200個(gè)體積，在4℃下改變兩次)透析而從該溶液中除去過量的生物素。接著通過在硝化纖維上印跡、隨后用5％脫脂乳粉封閉并且使用鏈霉抗生物素-HRP接合物(Biorad)進(jìn)行檢測來檢驗(yàn)蛋白質(zhì)中存在的結(jié)合生物素。使用外抗生物素蛋白(extravidin)-RPE或外抗生物素蛋白(extravidin)-FITC接合物(Sigma)使生物素標(biāo)記可溶性TCR四聚化。使用考馬斯結(jié)合蛋白測定法(Pierce)測定生物素-可溶性TCR的濃度，并計(jì)算外抗生物素蛋白(extravidin)接合物與0.224mg可溶性TCR/mg TCR之比以便實(shí)現(xiàn)用生物素標(biāo)記TCR飽和外抗生物素蛋白(extravidin)的比例為1∶4。以添加總量的十分之一的等分試樣在冰上添加外抗生物素蛋白(extravidin)接合物，每個(gè)等分試樣至少持續(xù)15分鐘(以確保飽和外抗生物素蛋白(extravidin))。將可溶性TCR四聚體保存在4℃下的暗處。該四聚體在數(shù)個(gè)月的期限內(nèi)極為穩(wěn)定。實(shí)施例4-來自公知特異性的T細(xì)胞系或T細(xì)胞克隆的T細(xì)胞受體基因的分子克隆用于從細(xì)胞中分子克隆TCR基因的方法和程序分別與用于所有α鏈和所有β鏈的方法和程序相同且由此僅在本實(shí)施例中描述。
用來自‘mRNA捕捉試劑盒’(Boehringer Mannheim)的裂解緩沖液裂解合適數(shù)量的T細(xì)胞、一般為1-5百萬個(gè)。通過使生物素標(biāo)記的寡-dT與mRNA的聚腺苷酸尾雜交而用試劑盒試劑分離mRNA。然后通過使生物素與用鏈霉抗生物素包被的PCR管結(jié)合來捕捉雜交的復(fù)合物。mRNA在PCR管中固定后，如上所述(‘mRNA捕捉試劑盒’的Boehringer Mannheim使用指南)使用AMV逆錄酶(Stratagene)生成cDNA。
在cDNA仍然固定的情況下，使用末端轉(zhuǎn)錄酶(BoehringerMannheim)在3’末端生成聚腺苷酸尾。然后加入PCR反應(yīng)混合物，包括高保真度的熱穩(wěn)定聚合酶pfu(克隆的，Stratagene)，使用所述的反應(yīng)混合物以便使PCR產(chǎn)物中的誤差的危害降低到最低限度。使用在相應(yīng)TCR恒定區(qū)中退火的聚-C‘錨定引物’(附圖4A)和α或β鏈特異性引物(分別是附圖4B和C)來進(jìn)行PCR反應(yīng)。進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的由在95℃下變性1分鐘、在50℃下退火1分鐘和在72℃下延伸5分鐘組成的PCR反應(yīng)以便擴(kuò)增TCR基因片段。
使用在PCR引物中含有的XhoⅠ和XamⅠ限制酶位點(diǎn)(所有酶均來自New England Biolabs)將PCR產(chǎn)物連入Bluescript測序載體(pBluescript Ⅱ KS-,Stratagene)。在大腸桿菌菌株XL-1 Blue中轉(zhuǎn)染連接混合物后，選擇各鏈的幾個(gè)克隆以用于在ABI 377 Prism自動(dòng)測序儀上使用BigDyeTM終止子(Applied Biosystems Inc.)進(jìn)行DNA測序。實(shí)施例5-編碼c-jun和c-fos的40個(gè)氨基酸卷曲螺旋(‘亮氨酸拉鏈’)區(qū)的DNA片段的分子克隆使用人cDNA作為模板和附圖5中所示的引物、通過PCR反應(yīng)來生成編碼c-jun和c-fos的40個(gè)氨基酸卷曲螺旋(‘亮氨酸拉鏈’)區(qū)的DNA片段。在包括克隆的pfu聚合酶(Stratagene)的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，所述的循環(huán)由在95℃下變性1分鐘、在58℃下進(jìn)行引物退火1分鐘和在72℃下延伸2分鐘組成。
使用唯一的XhoⅠ和XmaⅠ限制位點(diǎn)將c-jun和c-fos片段連入pBluescriptⅡKS-(Stratagene)以分別獲得構(gòu)建體pBJ107和pBJ108(附圖6)。通過在ABI 377 Prism自動(dòng)測序儀上使用BigDyeTM終止子(Applied Biosystems Inc.)進(jìn)行的DNA測序來檢驗(yàn)c-jun和c-fos片段的DNA序列。
然后使用唯一的XmaⅠ和BamHⅠ限制位點(diǎn)將測序的c-jun和c-fos片段亞克隆入T7聚合酶表達(dá)載體pGMT7(Studier,Rosenberg等1990)的多接頭區(qū)。實(shí)施例6-用于生產(chǎn)穩(wěn)定的可溶性TCRs的TCR-亮氨酸拉鏈融合蛋白的設(shè)計(jì)用于共重折疊TCRα和β鏈的胞外片段的嘗試產(chǎn)生了有限的成功，其中將所述的α和β鏈截短使得它們含有可體內(nèi)形成二硫鍵的半胱氨酸殘基(數(shù)據(jù)未顯示，參見實(shí)施例9對用于重折疊條件的表達(dá)方法和一般方法和物質(zhì)的描述)。然而，當(dāng)剛好在形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基前，即其N-末端一側(cè)將TCRα和β鏈截短時(shí)，在Superdex G-75柱(Pharmacia)上的分析型層析表明少量級分蛋白質(zhì)(用于重折疊反應(yīng)的約1-2％的量)已經(jīng)折疊成截短的α/β異二聚體的預(yù)期分子大小的復(fù)合物(另外參見(Garboczi,Utz等1996)參考文獻(xiàn)中涉及的方法)。
因?yàn)樾纬刹徽_的二硫鍵可以在體外重折疊過程中導(dǎo)致不可逆的錯(cuò)折疊，所以通過使在細(xì)胞TCR中未配對的TCRβ恒定區(qū)中的半胱氨酸殘基發(fā)生突變來尋找發(fā)生這種情況的可能性以便將其降低到最低限度。用半胱氨酸殘基替換絲氨酸或丙氨酸殘基。用于三個(gè)突變步驟的合成DNA引物如附圖7中所示。剛好在形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基前被截短的TCRα和突變的β鏈的共同重折疊表明異二聚體、即一般構(gòu)成15-30％總蛋白的正確分子量的蛋白質(zhì)級分的產(chǎn)量顯著提高。然而，當(dāng)將這些可溶性TCRs保存過夜時(shí)，蛋白質(zhì)分析證明具有符合異二聚化TCR的分子量的級分已經(jīng)分裂成符合單體TCRα和β鏈的兩個(gè)分子量的峰。在對可溶性TCRs稀釋時(shí)進(jìn)行類似的觀察，表明α/β鏈的穩(wěn)定性較低且不足以進(jìn)行需要時(shí)間間隔長于有限的小時(shí)數(shù)或蛋白質(zhì)稀釋度的分析。總之，這些用于生產(chǎn)可溶性TCR的方法僅生成具有極為有限穩(wěn)定性的受體。
為了改進(jìn)TCRα和β鏈的穩(wěn)定性并在重折疊過程中能夠有助于異二聚體的形成，使TCR鏈與公知優(yōu)選形成異二聚體的c-jun和c-fos的‘亮氨酸拉鏈’結(jié)構(gòu)域融合(O’Shea,Rutkowski等1989；Schuermann,Hunter等1991；O’Shea,Rutkowski等1992；Glover和Harrison 1995)。對用于融合TCRs的兩種設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。
在一種設(shè)計(jì)中，僅在半胱氨酸殘基形成TCRα和β鏈中的鏈間二硫鍵后使亮氨酸拉鏈與C-末端融合。當(dāng)c-jun和c-fos亮氨酸拉鏈肽類也能夠立即形成與所用接頭N-末端連接的鏈間二硫化物時(shí)(O’Shea,Rutkowski等1989)，推定彼此相對且與鏈間二硫鍵相對的兩鏈排列是最佳的。
在另一種設(shè)計(jì)中，亮氨酸拉鏈剛好融合到在TCRα和β鏈中形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基前，即該半胱氨酸殘基的N-末端(附圖8)。因此，在第二種設(shè)計(jì)中，從重組受體中刪除了半胱氨酸殘基。
在使用這些設(shè)計(jì)的TCR-拉鏈(TCR-z)鏈進(jìn)行的重折疊實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)從TCRα和β鏈中刪除形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基時(shí)異二聚化可溶性受體的產(chǎn)量更高，正如附圖8中所示的設(shè)計(jì)。實(shí)施例7-用于TCR-亮氨酸拉鏈蛋白的DNA表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例描述了用于5種TCRs的α和β鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建。所述的策略和設(shè)計(jì)應(yīng)適合于任何人或動(dòng)物的TCR基因。盡管本文所述的5種TCRs均被MHCⅠ型表位所結(jié)合，但是同樣可以將本方法用于克隆和構(gòu)建結(jié)合在MHCⅡ型上的TCRs的表達(dá)載體。所有載體均表達(dá)目的在于重折疊附圖9中所示設(shè)計(jì)的可溶性TCR的蛋白質(zhì)，但是不包括用C-末端生物素標(biāo)記序列表達(dá)的兩種TCRs(參見如下和附圖17、18和19)?？寺〔呗苑謩e與所有的TCRα和β鏈的克隆策略相同。
根據(jù)對獲自含有TCR錨定PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒的序列數(shù)據(jù)的分析來推定TCRα和β鏈的前導(dǎo)區(qū)的范圍或信號(hào)肽序列(參見實(shí)施例4)。以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生表達(dá)不含前導(dǎo)區(qū)序列的TCR鏈的PCR片段的5’引物(附圖9)。所有的5’引物均編碼恰在成熟TCR蛋白質(zhì)序列前的甲硫氨酸殘基以便在大腸桿菌中翻譯。用C或G堿基替換A或T(附圖9)的沉默突變引入大量基因的5’近端密碼子以便減少形成二級mRNA結(jié)構(gòu)的傾向，二級mRNA結(jié)構(gòu)的形成對抑制大腸桿菌中的表達(dá)不利(PCT/GB 98/03235；(Gao,Tormo等1997；Gao,Gerth等1998))。
通過使用含有如實(shí)施例6中所述生成的TCR錨定PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒的PCR來擴(kuò)增可編碼結(jié)合在人JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201(肽序列GILGFVFTL)上的TCR的Vα0.2和Vβ17鏈、結(jié)合在003 HIV-1Gag肽-HLA-A0201(肽序列SLYNTVATL)上的TCR的人Vα23和Vβ5.1鏈以及F5 NP肽-H2-Db(肽序列ASNENMDAM)的鼠Vα4和Vβ11鏈的基因。以用于生成構(gòu)建這些TCR鏈的表達(dá)載體的PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒形式(Garboczi,Utz等1996；Ding,Smith等1998)獲得用于人A6(Vα2.3/Vβ12.3)和B7(Vα17.2/Vβ12.3)TCRs的基因，其中所述的人A6(Vα2.3/Vβ12.3)和B7(Vα17.2/Vβ12.3)TCRs是由HLA-A0201(肽序列LLFGYPVYV)呈遞的特異性HTLV-1 Tax肽。將用于這些TCRs的基因克隆入含有c-fos亮氨酸拉鏈-生物素標(biāo)記融合片段的序列的表達(dá)載體中(參見實(shí)施例8)。
在標(biāo)準(zhǔn)緩沖條件下(Stratagene)使用克隆的pfu聚合酶并使用由在95℃下變性1分鐘、在60℃下進(jìn)行引物退火1分鐘和在72℃下延伸6分鐘組成的25個(gè)循環(huán)來進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物用酶NdeⅠ和XmaⅠ進(jìn)行限制消化并連入含有c-jun(TCRα鏈)和c-fos(TCRβ鏈)插入片段的pGMT7載體中(參見實(shí)施例5)。
附圖10-19表示TCR-z插入片段的序列和由pGMT7載體表達(dá)的推定的蛋白質(zhì)序列。附圖20表示在恒定區(qū)中含有突變而不以可檢測到的方式影響可溶性TCR的折疊和功能的A6 TCRβ鏈的序列(參見實(shí)施例9和10)。實(shí)施例8-用于與c-fos亮氨酸拉鏈-生物素標(biāo)記片段融合的TCRβ鏈表達(dá)的DNA載體的構(gòu)建為了能夠固定可溶性TCRs或能夠檢測或連接所述受體，如果使用另外的功能性融合成分來生產(chǎn)蛋白質(zhì)，那么是有用的。這能夠得到可溶性TCR諸如作為多聚體被生產(chǎn)或能夠進(jìn)行高度敏感性的檢測或使其它功能結(jié)合到受體/受體復(fù)合物上。
本實(shí)施例表明了用于TCRβ鏈表達(dá)載體的構(gòu)建，在所述經(jīng)改造的TCRβ鏈上，在體內(nèi)大腸桿菌中或體外用酶BirA可以使一種融合多膚特異性生物素標(biāo)記(Barker和Campbell 1981；Barker和Campbell 1981；Howard,Shaw等1985；Schatz 1993；O’Callaghan,Byford等1999)。正如實(shí)施例10和11中所示，可以表達(dá)這些可溶性TCR融合物并以相同方式和以類似于不與‘生物素標(biāo)記’(BT-tag)融合的TCRβ鏈的產(chǎn)量使其與α鏈一起重折疊。這些結(jié)果證明本文所述的可溶性TCR能夠適合于用作為融合配偶體的大量不同的多肽類來表達(dá)。
如下使用與fos亮氨酸拉鏈序列C-末端連接的生物素-標(biāo)記序列將T細(xì)胞受體β-鏈亞克隆入pGMT7表達(dá)載體起始-TCRβ-鏈-fos拉鏈-生物素-標(biāo)記-終止所述構(gòu)建體末端的確切序列如下(還參見附圖21)接頭→｜fos拉鏈→｜BamHⅠ｜←接頭→｜←生物素標(biāo)記將兩種手段用于生產(chǎn)帶有生物素標(biāo)記的可溶性TCRs。就結(jié)合在人JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201上的TCR而言，使用附圖22中所示的合成DNA引物在3’-末端修飾克隆的β-鏈-c-fos亮氨酸拉鏈融合物以便使用與pfu聚合酶(Stratagene)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)引導(dǎo)BamHⅠ位點(diǎn)替換HindⅢ位點(diǎn)。
將含有NdeⅠ位點(diǎn)的原始5’引物(參見附圖9)用作正向引物。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物克隆入含有生物素-標(biāo)記序列(附圖21)的修飾的pGMT7載體中以便形成上述構(gòu)建體。將該質(zhì)粒稱作JMB002。
使用與附圖9中所示正向和反向引物的PCR將對結(jié)合在HLA-A0201上的HTLV-1表位LLFGYPVYV具有特異性的克隆的TCR、稱作A6 tax TCR(Vα2.3/Vβ12.3)截短。將這種TCRβ-鏈克隆入含有c-fos-BT片段的pGMT7載體(JMB002)的NdeⅠ和XamⅠ位點(diǎn)。
在構(gòu)建融合表達(dá)載體后，進(jìn)行DNA測序以便確保在亞克隆程序中沒有引入錯(cuò)誤(所有測序過程均在牛津大學(xué)化學(xué)系DNA測序?qū)嶒?yàn)室中使用ABI377 Prism測序儀和ABI BigDye熒光終止劑來進(jìn)行)。與公開的序列相比和進(jìn)一步的研究中，顯現(xiàn)出在所述的tax TCRβ-鏈中存在兩個(gè)錯(cuò)誤，我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)錯(cuò)誤存在于我們得到的原始質(zhì)粒中。由于這兩個(gè)錯(cuò)誤是在TCRβ-鏈中唯一的Bsu36Ⅰ位點(diǎn)的3’端，所以將它用于克隆入(正確的)JMB002質(zhì)粒中。表達(dá)兩個(gè)版本的tax TCRβ-鏈并使它們與α-鏈重折疊并使用Biacore進(jìn)行比較。兩個(gè)版本的蛋白質(zhì)特異性地與具有類似表觀親和性的tax肽-MHCⅠ型分子結(jié)合(參見實(shí)施例17)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，僅使用正確版本的β-鏈。實(shí)施例9-大腸桿菌中TCR鏈的表達(dá)和內(nèi)含體的純化在TYP培養(yǎng)基中和載體pGMT7的控制下在大腸桿菌菌株BL21DE3pLysS中分別表達(dá)TCRα和β鏈，當(dāng)在600nm處的光密度(OD)達(dá)到0.2-0.6時(shí)，使用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。使誘導(dǎo)過程持續(xù)過夜并通過在Beckman J-6B離心機(jī)中以4000rpm離心來收集細(xì)菌。
然后將細(xì)菌細(xì)胞沉淀重新懸浮于‘裂解緩沖液’(10mM Tris pH8.1、10mM EDTA、150mM NaCl、2mM DTT、10％甘油)。將該混合物在冰上冷卻且隨后加入20μg/ml溶菌酶、10mM MgCl2、和20μg/ml DnaseⅠ；接下來在冰上最少培養(yǎng)1小時(shí)。
接著使用12mM探針超聲波儀(Milsonix XL2020)在全功率下對所述的混合物進(jìn)行超聲處理、在30秒的間隔進(jìn)行5個(gè)30秒的脈沖猝發(fā)，從而使所述的混合物冷卻下來。在該過程中使用冰-水混合物來維持溫度。然后用5個(gè)體積的‘Triton洗滌緩沖液’(50mM Tris pH8.1、0.5％Triton X-100、100mM NaCl、0.1％疊氮化鈉、10mM EDTA、2mM DTT)稀釋該混合物。冰上最少培養(yǎng)1小時(shí)后，在BeckmanGS-6R離心機(jī)中以3,500rpm離心該混合物并棄去上清液。使用小塑料一次性移液管將沉淀重新懸浮于‘重新懸浮緩沖液’(50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、2mM DTT)中。然后在Beckman J2-21離心機(jī)中以8,000rpm離心該混合物并棄去上清液。使用手控勻漿器將沉淀重新懸浮于‘胍緩沖液’(50mM Tris pH 8.1、6.0M鹽酸胍、100mM NaCl、10mM EDTA、2mM DTT)中。在低速離心以除去不溶性物質(zhì)后，將上清液等分并保存在-70℃下。通常獲得約100mg/升細(xì)菌培養(yǎng)物的產(chǎn)量。
通過在胍緩沖液中用SDS-PAGE樣品緩沖液稀釋2μl的內(nèi)含體制備物、隨后加熱至100℃ 2分鐘來進(jìn)行對純化內(nèi)含體制備物的SDS-PAGE分析。將樣品加到凝膠上，同時(shí)仍然加溫以防止胍/SDS混合物在上樣過程中沉淀。通過以該方式進(jìn)行的SDS-PAGE的考馬斯染色將以該方式純化的內(nèi)含體蛋白質(zhì)鑒定約為90％的純度(參見附圖23)。實(shí)施例10-TCRz異二聚體的重折疊和純化在37℃下，在‘胍緩沖液’(6.0M鹽酸胍、10mM乙酸鈉pH5.5、10mM EDTA、2mM DTT)中進(jìn)一步使等比例的尿素增溶的蛋白質(zhì)變性。以60mg/L的總蛋白質(zhì)濃度將該蛋白質(zhì)混合物注入冰冷的重折疊緩沖液(50mM Tris pH8.1、0.4M L-精氨酸-HCl、5.0M尿素、5mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽)中以確?？焖倩旌?。冰上至少培養(yǎng)5小時(shí)以便重折疊后，將該混合物對10個(gè)體積的脫礦質(zhì)水透析24小時(shí)且然后對10個(gè)體積的10mM Tris pH8.1透析24小時(shí)。
接著通過0.45μ硝化纖維膜(Whatman)過濾透析的重折疊蛋白質(zhì)以便除去聚集的蛋白質(zhì)(在重折疊過程中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生)。然后通過上在連接有Biocad Sprint系統(tǒng)的POROS 20HQ柱來進(jìn)行生物素標(biāo)記的可溶性TCR的純化。每次運(yùn)轉(zhuǎn)可以加約500ml的重折疊蛋白質(zhì)溶液并通過在Bis-Tris-丙烷緩沖液(pH8.0)中氯化鈉的梯度來洗脫所述的蛋白質(zhì)。使以約100mM氯化鈉洗脫的蛋白質(zhì)和相關(guān)級分立即在冰上驟冷并加入蛋白酶抑制劑混合物。通過考馬斯染色的SDS-PAGE來分析級分。實(shí)施例11-帶有可生物素標(biāo)記的β鏈的TCRz異二聚體的重折疊和純化將生物素標(biāo)記的TCRβ鏈與表達(dá)并純化為可溶性TCR細(xì)胞受體的等量α-鏈混合。按照與實(shí)施例10對TCRz所述相同的程序來重折疊異二聚化的TCRz-β-BT(參見附圖26)。實(shí)施例12-生物素標(biāo)記的可溶性TCRz-BT的生物素標(biāo)記使用10K截止離心濃縮器(Ultrafree,Millipore)將含蛋白質(zhì)的級分濃縮至2.5ml。使用用10mM Tris pH8.1、5mM NaCl平衡的PD-10脫鹽柱來交換緩沖液；進(jìn)一步加入蛋白酶抑制劑混合物并再次使用離心濃縮器將蛋白質(zhì)濃縮至～1ml。向1ml的生物素標(biāo)記的可溶性TCR中加入下列物質(zhì)7.5mM MgCl2、5mM ATP(pH8.0)、1mM生物素、2.5μg/ml BriA生物素標(biāo)記酶.然后使該生物素標(biāo)記反應(yīng)在室溫下(20-25℃)進(jìn)行過夜。
接著通過在連接有Pharmacia FPLC系統(tǒng)的Superdex 200HR柱(Pharmacia)上進(jìn)行凝膠過濾而從殘留的未反應(yīng)的生物素中分離酶促生物素標(biāo)記的可溶性TCR(參見附圖27)。用PBS平衡該柱并收集1ml級分，使其立即在冰上驟冷并再次用蛋白酶抑制劑混合物對其進(jìn)行保護(hù)。使用考馬斯結(jié)合試驗(yàn)(Pierce)來估計(jì)蛋白質(zhì)濃度且然后將生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)在4℃下保存達(dá)1個(gè)月或在-20℃下保存更長的期限。
使用生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法來檢驗(yàn)生物素標(biāo)記反應(yīng)的功效。在使用SemiPhor半干電印跡裝置(Hoefer)將凝膠印跡在PVDF膜(Bio-Rad)上、但不進(jìn)行染色前，使用所述方法來使SDS-PAGE凝膠運(yùn)動(dòng)。該印跡堆積物由切成所述凝膠大小并浸入了轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris堿、150mM甘氨酸)的6層濾紙(Whatman 4M)組成，隨后將PVDF膜用甲醇預(yù)濕潤且然后浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，接著在轉(zhuǎn)移緩沖液中將凝膠、隨后是6層以上的浸泡濾紙緩慢攪拌5分鐘。使用試驗(yàn)管壓制所述的堆積物以便壓出任何氣泡并加入約10ml的附加轉(zhuǎn)移緩沖液以輔助傳導(dǎo)。將陰極置于所述的堆積物之上并以50mA的恒定電流使電流通過裝置1小時(shí)。然后在室溫和緩慢攪拌條件下將膜在明膠(Bio-Rad)溶于PBS-T緩沖液(PBS+0.05％吐溫-20)所得到的2％溶液中培養(yǎng)＞1小時(shí)。過夜的培養(yǎng)還包括使用0.01％疊氮化鈉以抑制細(xì)菌生長。將該膜用幾種(4-5種)改變的PBS-T洗滌，隨后在室溫和緩慢攪拌條件下用在明膠溶于PBS-T得到的1％溶液中按1∶1000稀釋的抗生物素蛋白-HRP接合物(Sigma)染色＞30分鐘。在用Opti-4CN(Bio-Rad)檢測前用幾種(4-5種)改變的PBS-T洗滌該膜。這是一種在有HRP存在的情況下反應(yīng)形成不溶性藍(lán)色染料的試劑，所述的藍(lán)色染料可在一定位置上對所述的膜染色，在該位置上有如存在的結(jié)合HRP指示的相關(guān)蛋白質(zhì)。當(dāng)將抗生物素蛋白-HRP接合物用于染色時(shí)，它由此表明存在含有生物素的蛋白質(zhì)。
附圖28表示以這類方式對幾種生物素標(biāo)記的TCRs進(jìn)行的印跡。涉及該印跡的標(biāo)準(zhǔn)品是生物素標(biāo)記的廣范圍分子量標(biāo)記(Bio-Rad)。該印跡清楚地表明了含有已經(jīng)與BirA酶反應(yīng)的生物素標(biāo)記的TCRs的高水平生物素標(biāo)記。實(shí)施例13-生物素標(biāo)記的可溶性MHC-肽復(fù)合物的生產(chǎn)生物素標(biāo)記的可溶性MHC-肽復(fù)合物可以如上述實(shí)施例2中所述來生產(chǎn)。實(shí)施例14-對可溶性TCR與MHC-flu-肽之間的特異性結(jié)合的檢測可溶性TCR分子JM22z對可呈遞由流感基質(zhì)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基58-66(GILGFVFTL)組成的免疫顯性抗原的HLA-A2 MHC分子具有特異性。JM22z的克隆、表達(dá)和純化如實(shí)施例4、7、9和10以及附圖24和25中所述。在Biacore 2000TM表面胞質(zhì)共振(SPR)生物傳感器上分析JM22z與其配體/MHC復(fù)合物(HLA-A2-flu)或無關(guān)HLA-A2肽結(jié)合物之間的相互作用(它們的生產(chǎn)如實(shí)施例13中所述)。SPR測定接近傳感器表面的小流式細(xì)胞內(nèi)用響應(yīng)單位(RU)表示的折射率的改變，這是一種可以用于檢測受體配體相互作用并分析其親和性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的機(jī)理。通過在分離的流式細(xì)胞中經(jīng)交聯(lián)在β2m上的生物素與已經(jīng)以化學(xué)方式與激活的流式細(xì)胞表面交聯(lián)的鏈霉抗生物素之間的結(jié)合而固定各個(gè)HLA-A2-肽復(fù)合物來制備探針流式細(xì)胞。然后通過使JM22z以恒定的流速經(jīng)過不同流式細(xì)胞表面來進(jìn)行檢測，從而測定在實(shí)施這類步驟中的SPR響應(yīng)值。最初，通過使28μM JM22z以5μl/分鐘的恒定流速經(jīng)過三種不同的表面來檢驗(yàn)所述相互作用的特異性；其中一種表面用2800RU的HLA-A2-flu包被、第二種表面用4200RU的經(jīng)來自HIV逆錄酶的無關(guān)肽折疊的HLA-A2-flu(HLA-A2-pol:ILKEPVHGV)包被、且第三種表面用4300RU的CD5包被(附圖29a插入部分)。將以恒定流速和超過HLA-A2-pol的不同濃度注射的可溶性JM22z用于定義背景共振(附圖29a)。將這些對照測定值從用HLA-A2-flu(附圖29b)獲得的值中扣除并用于計(jì)算表示為解離恒定值Kd(附圖29c)的結(jié)合親和性。在37℃下將JM22z和相關(guān)MHC分子的Kd測定為15±4μM(n=7)并且在25℃下測定為6.6±2μM(n=14)。在25℃下使用在探針流式細(xì)胞中固定的TCR和可溶性MHC-肽復(fù)合物進(jìn)行的測定得到類似的Kd為5.6±4μM(n=3)。在37℃下測定的相互作用的正常速率為6.7×104-6.9×104M-1S-1，而非正常速率為1.1s-1(Willcox,Gao等1999)。實(shí)施例15-對可溶性鼠TCR與鼠MHC H2-Db-NP之間的特異性結(jié)合的檢測在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用對來源于由鼠H2-DbMHC分子(H2-Db-NP)呈遞的流感病毒核蛋白(aa.366-374:ASNENMDAM)肽具有特異性的鼠TCR即F5。輕度修飾所用的MHC重鏈基因，其意義是它可僅編碼天然蛋白質(zhì)的第1-280位氨基酸和由BirA酶識(shí)別的第13位氨基酸序列?？梢砸悦复俜绞绞顾玫牡鞍踪|(zhì)被生物素標(biāo)記(Schatz1993；O’Callaghan,Byford等1999)。使用對固定化H2-Db-NP具有特異性的可溶性TCR在Biacore 2000TMSPR生物傳感器上進(jìn)行的SPR分析證明它可特異性地結(jié)合配體MHC-肽結(jié)合物(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例16-生物素標(biāo)記的可溶性tax-TCR與生物素標(biāo)記的可溶性突變型tax TCR結(jié)合的比較如實(shí)施例9-11中所述制備生物素標(biāo)記的可溶性tax-TCRs并如實(shí)施例14中所述使用用流感基質(zhì)肽(GILGFVFTL)或HTLV tax 11-19肽(LLFGYPVYV)重折疊的生物素標(biāo)記的pMHC復(fù)合物來進(jìn)行Biacore 2000分析。使生物素標(biāo)記的可溶性TCRs以5μl/分鐘流過所有的細(xì)胞，總計(jì)1分鐘。附圖30表示首先是生物素標(biāo)記的可溶性tax-TCR且然后是生物素標(biāo)記的可溶性突變型tax-TCR與HTLV tax 11-19肽-MHC復(fù)合物(A)的結(jié)合情況。野生型和突變型tax-TCR均沒有表現(xiàn)出與流感基質(zhì)肽-MHC復(fù)合物(B/C)或OX68單克隆抗體對照物(D)的結(jié)合。因此，我們推斷顯然野生型和突變型生物素標(biāo)記的可溶性TCRs均可有效而特異性地與tax-pMHC復(fù)合物結(jié)合并在結(jié)合程度上幾乎沒有顯示出差異。實(shí)施例17-同時(shí)與固定化MHC肽復(fù)合物結(jié)合的TCR-和CD8共同受體的分析CD8和CD4是通過同時(shí)結(jié)合與TCR相同的MHC分子而認(rèn)為對TCRs起共同受體作用的表面糖蛋白。CD8是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特征且它與MHCⅠ型分子結(jié)合，而將CD4在輔助系T細(xì)胞上表達(dá)且它結(jié)合MHCⅡ型分子。CD8是由兩個(gè)相同的α-鏈組成或由一個(gè)α-鏈和一個(gè)β-鏈組成的二聚體。如上所述(PCT/GB98/03235；(Gao,Tormo等1997；Gao,Gerth等1998))生產(chǎn)異二聚化αα-CD8分子。在本實(shí)施例中，我們描述了可溶性TCR和CD8分子同時(shí)與固定化HLA-A2-flu復(fù)合物結(jié)合。正如在附圖31A中所觀察到的，結(jié)合響應(yīng)是單純附加的。從合并的響應(yīng)值(實(shí)心圓圈)中扣除TCR響應(yīng)值(空心圓圈)得到接近于單獨(dú)120μM CD8響應(yīng)值(空心三角形)的值(空心正方形)。附圖31B表示TCR-MHC-肽相互作用的動(dòng)態(tài)特性不受同時(shí)進(jìn)行的CD8結(jié)合的影響。所觀察到的附加性結(jié)合(biding)表明TCR和CD8在分離的界面上結(jié)合MHC肽復(fù)合物。本實(shí)施例還解釋了在某些情況中一個(gè)分子的特異性結(jié)合不會(huì)影響另一個(gè)分子的特異性結(jié)合，對于分子的其它結(jié)合情況來說，最可能的情況就是不同。實(shí)施例18-可溶性α/βTCR的表達(dá)、重折疊和位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記a)TCRα和β鏈的改造如附圖36中所述改造重組可溶性形式的異二聚化TCR分子。各鏈由通過短彈性接頭與有助于穩(wěn)定所述異二聚體的卷曲螺旋基序融合的遠(yuǎn)端和近端免疫球蛋白區(qū)組成。
附圖32-34和38-41表示各種來自具有不同特異性的TCR的TCRα和β鏈的DNA編碼序列和相應(yīng)的氨基酸序列。本實(shí)施例集中在由附圖32-34的序列所代表的TCR上，而可以使用附圖38-41中給出的TCRs類似地實(shí)施所公開的方法。
TCR恒定區(qū)剛好在體內(nèi)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸前已經(jīng)被截短。結(jié)果是兩鏈通過非共價(jià)的四元連接物配對。當(dāng)Fos-Jun拉鏈肽異二聚體也能夠立即形成與所用接頭(O’Shea等1989)連接的鏈間二硫化物N-末端時(shí)，推定彼此相對兩鏈的排列是最佳的。需要以與各單獨(dú)成分相容的方式連接融合蛋白以便避免破壞各結(jié)構(gòu)。
通過如上所述的錨定PCR(Moss等1991)從Vβ17+人CTL克隆(JM22)中獲得編碼對HLA-A2中流感基質(zhì)蛋白質(zhì)58-66表位具有特異性的TCR的α和β鏈的cDNA。
通過使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)擴(kuò)增各鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)并在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域上剪接分別來自真核轉(zhuǎn)錄因子Jun和Fos的產(chǎn)物來分別構(gòu)建α和βTCR-拉鏈構(gòu)建體pJM22α-Jun和pJM22β-Fos。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)從合成肽類中重折疊時(shí)這40個(gè)氨基酸長度的序列可特異性地異二聚化而不需共價(jià)鏈間鍵(O’Shea等1989)。
將引物設(shè)計(jì)成立即將高AT含量引入起始密碼子的3’端(以便使mRNA二級結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定性)并使用大腸桿菌密碼選擇以便最大限度地表達(dá)(Gao等1998)。使TCRβ恒定區(qū)中剩余的半胱氨酸突變成絲氨酸以確保防止重折疊過程中不正確的二硫鍵形成。
附圖32和33表示了融合的DNA和蛋白質(zhì)序列。為了使這種TCRβ鏈的位點(diǎn)特異性地被生物素標(biāo)記，將編碼稱作“生物素-標(biāo)記”的DNA序列改造成可表達(dá)可溶性Vβ17的基因的3’端。使用下列PCR引物進(jìn)行這種DNA構(gòu)建體的改造5’-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3’和5’-GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTTCAGACCACCACCGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3’。
將所得的PCR產(chǎn)物用限制酶NdeⅠ和HindⅢ(New EnglandBiolabs)消化并用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連入載體pGMT7(Studier等1990)中。附圖3表示在該構(gòu)建體中插入片段的DNA序列和推斷的蛋白質(zhì)序列。b)TCR鏈的表達(dá)如下進(jìn)行具有對由HLA-A*0201呈遞的流感病毒基質(zhì)肽特異性的TCR的表達(dá)和重折疊
在TYP培養(yǎng)基(1.6％細(xì)菌用胰蛋白胨、1.6％酵母提取物、0.5％NaCl、0.25％K2HPO4)中在載體pGMT7的控制下分別將TCRα和β鏈在大腸桿菌菌株BL21DE3pLysS中進(jìn)行表達(dá)。在對數(shù)中期用0.5mMIPTG來誘導(dǎo)表達(dá)并在3-5小時(shí)后通過離心收集細(xì)菌。通過下列步驟來裂解細(xì)菌細(xì)胞在‘裂解緩沖液’(10mM EDTA、2mM DTT、10mMTris pH8.1、150mM NaCl、0.5mM PMSF、0.1mg/ml溶菌酶、10％甘油)中重新懸??；隨后加入10mM MgCl2和20μg/ml DNase；在冰上培養(yǎng)20分鐘并使用探針超聲波儀以10×30秒脈沖進(jìn)行超聲處理。然后通過下列步驟來純化內(nèi)含體中的蛋白質(zhì)使用Triton緩沖液(0.5％Triton-X100、50mM Tris pH8、100mM NaCl、0.1％疊氮化鈉、10mMEDTA、2mM DTT)的幾次洗滌(通常為3次)、使用15,000rpm離心20分鐘以沉淀內(nèi)含體和使用‘dounce’勻漿器來重新懸浮它們。從單獨(dú)用50mM Tris pH8、100mM NaCl、10mM EDTA、2mM DTT洗滌的制備物中除去洗滌劑并用‘尿素緩沖液’(20mM Tris pH8、8M尿素、10％甘油、500mM NaCl、10mM EDTA、2mM DTT)使蛋白質(zhì)增溶。在4℃下徹底混合過夜后，通過離心使溶液澄清并在-70℃下保存增溶的蛋白質(zhì)。通過考馬斯結(jié)合試驗(yàn)(Pierce)來測定蛋白質(zhì)濃度。c)TCR的重折疊在37℃下，在‘胍緩沖液’(6M鹽酸胍、10mM乙酸鈉pH5.5、10mM EDTA、2mM DTT)中進(jìn)一步使等比例的尿素增溶的蛋白質(zhì)變性。在冰上將該溶液加入到重折疊緩沖液(5M尿素、100mM Tris pH8、400mM L-精氨酸、5mM還原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、0.1mM PMSF)中以確?？焖倩旌?。在4℃下＞12小時(shí)后，將該溶液對10個(gè)體積的水、且然后對10個(gè)體積的10mM Tris pH8、100mM尿素進(jìn)行透析。在所有階段均加入蛋白酶抑制劑PMSF以使TCR上的生物素標(biāo)記的蛋白水解損失降到最低限度。d)TCR的純化通過0.45微米的濾膜過濾稀釋的TCR溶液以便除去聚集的蛋白質(zhì)且然后將該溶液加到POROS 20HQ柱上。用10mM Tris pH8中的氯化鈉的梯度來洗脫重折疊的TCR并收集1ml級分且通過SDS-PAGE分析(參見附圖36)。收集含有TCR的級分并使用30kDa截止離心濃縮器將該級分濃縮至1ml。e)TCR的生物素標(biāo)記使用緩沖的ATP、5mM MgCl2、1mM生物素將1ml TCR溶液制成7.5mM ATP并加入包括PMSF、亮抑蛋白酶肽和抑胃酶肽在內(nèi)的蛋白酶抑制劑的混合物。最后，將酶BirA加至5μg/ml的終濃度并使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行過夜。然后通過凝膠過濾從游離的生物素中分離TCR(參見附圖37)。收集含有生物素標(biāo)記的TCR的級分并加入蛋白酶抑制劑混合物。還測定了蛋白質(zhì)濃度。附圖35表示可溶性生物素標(biāo)記的TCR的示意圖。
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序列表<110>Avidex Ltd.<120>可溶性T細(xì)胞受體<130>NJL/P21736WO<140>PCT/GB99/01588<141)1999-05-19<150>GB/9810759.2<151>1998-05-19<160>85<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述使用末端轉(zhuǎn)移酶對在帶有一段G-殘基序列的3′-末端伸展的cDNAs進(jìn)行PCR擴(kuò)增的正向聚-C“錨定”引物。(附圖4A)<400>1taaatactcg aggcgcgccc cccccccccc ccc33<210>2<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人TCRα鏈恒定區(qū)3′-特異性引物。(附圖4B)<400>2atataacccg gggaaccaga tccccacagg aactttctgg gctgggga 48<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人TCRβ鏈恒定區(qū)3′-特異性PCR引物。atataacccg gggaaccaga tccccacagt ctgctctacc ccaggcc 47<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-jun亮氨酸拉鏈5′-特異性PCR引物。<400> 4catacacccg ggggtagaat cgcccggctg gag 33<210>5<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-jun亮氨酸拉鏈3′-特異性PCR引物。(附圖5B)<400>5gtgtgtgctc gaggatccta gtagttcatg actttctgtt taagctgtgc 50<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-fos亮氨酸拉鏈5′-特異性PCR引物。(附圖5C)<400>6catacacccg ggggtctgac tgatacactc caagcggag 39<210>7<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-fos亮氨酸拉鏈3′-特異性PCR引物。(附圖5D)<400>7tgtgtgctcg aggatcctag taagctgcca ggatgaactc tagtttttc49<210>8<211>120<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>編碼與TCRβ鏈融合的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的部分人c-fos序列。(附圖6B)<400>8ctgactgata cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 60accgagattg ccaacctgct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagcttac 120<210>9<211>120<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>編碼與TCRα鏈融合的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的部分人c-jun序列。(附圖6A)<400>9agaatcgccc ggctggagga aaaagtgaaa accttgaaag ctcagaactc ggagctggcg 60tccacggcca acatgctcag ggaacaggtg gcacagctta aacagaaagt catgaactac 120<210>10<211)40<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>與TCRα鏈融合的C-jun亮氨酸拉鏈氨基酸序列。(附圖6A)<400>10Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn1 5 10 15Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln20 25 30Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr35 40<210>11<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>與TCRβ鏈融合的C-fos亮氨酸拉鏈氨基酸序列。(附圖6B)<400>11Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys1 5 10 15Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys20 25 30Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr35 40<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ鏈的未配對半胱氨酸突變成絲氨酸的正向PCR引物(附圖7A)。<400>12 26gactccagat acagcctgag cagccg26<210>13<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>未配對半胱氨酸突變成絲氨酸后的人TCRβ鏈的氨基酸序列(附圖7A)。<220><223>人工序列描述未配對半胱氨酸突變成絲氨酸后的人TCRβ鏈的氨基酸序列(附圖7A)。<400>13Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser1 5<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ鏈的未配對半胱氨酸突變成絲氨酸的反向PCR引物(附圖7B)。<400>14 26cggctgctca ggctgtatct ggagtc26<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ鏈的未配對半胱氨酸突變成丙氨酸的正向PCR引物(附圖7C)。<400>15gactccagat acgctctgag cagccg 26<210>16<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述未配對半胱氨酸突變成丙氨酸后的人TCRβ鏈的氨基酸序列(附圖7C)。<400>16Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser1 5<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ鏈的未配對半胱氨酸突變成丙氨酸的反向PCR引物(附圖7D)。<400>17cggctgctca gagcgtatct ggagtc 26<210>18<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于結(jié)合在JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα10.2鏈的5′PCR引物(附圖9A)。<400>18gctctagaca tatgcaacta ctagaacaaa gtcctcagtt tctaagcatc caagagg 57<210>19<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在人JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201上的TCR的截短的Vα10.2鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9A)<400>19Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu1 5 10 15<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于結(jié)合在JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ17鏈的5′PCR引物。(附圖9B)<400>20gctctagaca tatggtggat ggtggaatca ctcagtccc 39<210>21<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>結(jié)合在人JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201上的TCR的截短的Vβ17鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9B)<220><223>人工序列描述結(jié)合在JM22流感基質(zhì)肽-HLA-A0201上的TCR的截短Vβ17鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9A)<400>21Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser1 5<210>22<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述結(jié)合在流感核蛋白肽-H2Db上的TCR的鼠Vα4鏈的5′PCR引物(附圖9C)。<400>22gctctagaca tatggattct gttactcaaa tgcaaggtca agtgaccctc tcatcag 57<210>23<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述結(jié)合在鼠流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的截短Vα4鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9C)<400>23Met Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu Ser Ser1 5 10 15<210>24<211>53<212>DNA<213>小鼠<220><223>結(jié)合在流感核蛋白肽-H2Db上的TCR的鼠Vβ11鏈的5′PCR引物。(附圖9D)<400>24gctctagaca tatggaacca acaaatgctg gtgttatcca aacacctagg cac 53<210>25<211>14<212>PRT<213>小鼠<220><223>結(jié)合在流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的截短鼠Vβ11鏈的新型N-末端氨基酸序列。<400>25Met Glu Pro Thr Asn Ala Gly Val Ile Gln Thr Pro Arg His1 5 10<210>26<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在003HIV-1GAGag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα23鏈的5′PCR引物。(附圖9E)<400>26ggaattccat atgaaacaag aggttacaca aattcc 36<210>27<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在003HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的截短人Vα23鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9E)<400>27Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile1 5<210>28<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在003HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ5.1鏈的5′PCR引物。(附圖F)<400>28ggaattccat atgaaagctg gagttactca aactcc 36<210>29<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在003HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的截短人Vβ5.1鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9F)<400>29Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr1 5<210>30<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6TCR的人Vα2.3鏈的5′PCR引物。(附圖9g)<400>30cccccccata tgcagaagga agtggagcag aac 33<210>31<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的TCR的截短的人V22.3鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9G)。<400>31Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Lys1 5<210>32<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vβ12.3鏈的5′PCR引物。(附圖9H)<400>32cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag acc 33<210>33<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的截短的人Vβ12.3鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9H)<400>33Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr1 5<210>34<211>48<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>5′PRC<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vα17.2鏈的5′PCR引物。(附圖9I)<400>34cccccccata tgcaacaaaa aaatgatgac cagcaagtta agcaaaat 48<210>35<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的截短的人Vα17.2鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9I)<400>35Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn1 5 10<210>36<211>45<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vβ12.3鏈的5′PCR引物(附圖9J)。<400>36cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag accccaaaat tccag 45<210>37<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>結(jié)合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的截短的人Vβ12.3鏈的新型N-末端氨基酸序列。(附圖9J)<400>37Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln1 5 10<210>38<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>一般使用的人Cα鏈的3′PCR引物(附圖9K)。<400>38catacacccg ggggaacttt ctgggctggg gaagaagg 38<210>39<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>一般使用的人Cβ鏈的3′PCR引物(附圖9L)。<400>39catacacccg gggtctgctc taccccaggc ctc 33<210>40<211>744<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>與人c-jun“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的TCRα鏈的突變DNA序列。(附圖10)<400>40atgcaactac tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720aaacagaaag tcatgaacta ctag744<210>41<211>247<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>與c-jun的“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自JM22的結(jié)合在可溶性HLA-A2/flu基質(zhì)上的α鏈的推定氨基酸序列。(附圖10)<400>41Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly1 5 10 15Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu20 25 30Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr35 40 45Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln50 55 60Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln65 70 75 80Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly85 90 95Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile100 105 110Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 120 125Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu145 150 155 160Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg195 200 205Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser210 215 220Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu225 230 235 240Lys Gln Lys Val Met Asn 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160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285<210>44<211>795<212>DNA<213>人工序列<220><223>與c-jun“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自鼠F5受體的結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRα鏈的DNA序列。(附圖12)<220><223>人工序列描述編碼與人c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的截短的鼠F5TCRα鏈的融合基因。<400>44atgaactatt ctccagcttt agtgactgtg atgctgtttg tgtttgggag gacccatgga 60gactcagtaa cccagatgca aggtcaagtg accctctcag aagacgactt cctatttata 120aactgtactt attcaaccac atggtacccg actcttttct ggtatgtcca atatcctgga 180gaaggtccac agctcctttt gaaagtcaca acagccaaca acaagggaat cagcagaggt 240tttgaagcta catatgataa aggaacaacg tccttccact tgcagaaagc ctcagtgcag 300gagtcagact ctgctgtgta ctactgtgtg ctgggtgatc gacagggagg cagagctctg 360atatttggaa caggaaccac ggtatcagtc agccccaaca tccagaaccc agaacctgct 420gtgtaccagt taaaagatcc tcggtctcag gacagcaccc tctgcctgtt caccgacttt 480gactcccaaa tcaatgtgcc gaaaaccatg gaatctggaa cgttcatcac tgacaaaact 540gtgctggaca tgaaagctat ggattccaag agcaatgggg ccattgcctg gagcaaccag 600acaagcttca cctgccaaga tatctccaaa gagaccaacg ccacctaccc cagttcagac 660gttcccgggg gtagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac 720tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa 780gtcatgaact actag 795<210>45<211>264<212>PRT<213>人工序列<220><223>與c-jun“亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)域融合的來自鼠F5受體的結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的α鏈的推定氨基酸序列。(附圖12)<220><223>人工序列描述由與人c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的截短的鼠F5TCRα鏈組成的融合蛋白。<400>45Met Asn Tyr Ser Pro Ala Leu Val Thr Val Met Leu Phe Val Phe Gly1 5 10 15Arg Thr Mis Gly Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu20 25 30Ser Glu Asp Asp Phe Leu Phe Ile Asn Cys Thr Tyr Ser Thr Thr Trp35 40 45Tyr Pro Thr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Pro Gln50 55 60Leu Leu Leu Lys Val Thr Thr Ala Asn Asn Lys Gly Ile Ser Arg Gly65 70 75 80Phe Glu Ala Thr Tyr Asp Lys Gly Thr Thr Ser Phe His Leu Gln Lys85 90 95Ala Ser Val Gln Glu Ser Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Gly100 105 110Asp Arg Gln Gly Gly Arg Ala Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val115 120 125Ser Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu130 135 140Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe145 150 155 160Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile165 170 175Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn180 185 190Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile195 200 205Ser Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Gly Gly210 215 220Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn225 230 235 240Set Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln245 250 255Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr260<210>46<211>864<212>DNA<213>人工序列<220><223>與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合來自鼠F5受體的結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ鏈的DNA序列。(附圖13)<220><223>與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ鏈的序列。<400>46atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta ctag864<210>47<211>287<212>PRT<213>人工序列<220><223>與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自鼠F5受體結(jié)合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ鏈的氨基酸序列。(附圖13)<400>47Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys Thr Arg1 5 10 15Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser20 25 30Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe35 40 45Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg50 55 60Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser65 70 75 80Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe85 90 95Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285<210>48<211>747<212>DNA<213>人工序列<220><223>與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003r的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα鏈的DNA序列。(附圖14)<220><223>人工序列描述與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα鏈的DNA序列。<400>48atgaaacaag aagttacaca gattcctgca gctctgagtg tcccagaagg agaaaacttg 60gttctcaact gcagtttcac tgatagcgct atttacaacc tccagtggtt taggcaggac 120cctgggaaag gtctcacatc tctgttgctt attcagtcaa gtcagagaga gcaaacaagt 180ggaagactta atgcctcgct ggataaatca tcaggacgta gtactttata cattgcagct 240tctcagcctg gtgactcagc cacctacctc tgtgctgtga ccaacttcaa caaattttac 300tttggatctg ggaccaaact caatgtaaaa ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 480ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600agcccagaaa gttcccccgg gggtagaatc gcccggctgg aggaaaaagt gaaaaccttg 660aaagctcaga actcggagct ggcgtccacg gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag 720cttaaacaga aagtcatgaa ctactag 747<210>49<211>248<212)PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα鏈的氨基酸序列。(附圖14)<400>49Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr20 25 30Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu35 40 45Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn50 55 60Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala65 70 75 80Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Asn Phe85 90 95Asn Lys Phe Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asn Val Lys Pro Asn100 105 110Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser115 120 125Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn130 135 140Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val145 150 155 160Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp165 170 175Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile180 185 190Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly195 200 205Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn210 215 220Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln225 230 235 240Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245<210>50<211>864<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003的結(jié)合在可溶性HLA-2/HIV-1 Gag上的TCRβ鏈的DNA序列。附圖15<400>50atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta crag864<210>51<211>287<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自患者003的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRβ鏈的氨基酸序列。附圖15<400>51Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Lys Thr Arg1 5 10 15Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser20 25 30Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe35 40 45Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg50 55 60Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser65 70 75 80Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe85 90 95Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285<210>52<211>750<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆A6的結(jié)合在可溶性HTLV1 Tax/HLA-AZ上的TCRα鏈的DNA序列。附圖16<400>52atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750<210>53<211>249<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆A6的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRα鏈的氨基酸序列。附圖16<400>53Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser85 90 95Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro100 105 110Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys115 120 125Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr130 135 140Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr145 150 155 160Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala165 170 175Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser180 185 190Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly195 200 205Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln210 215 220Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala225 230 235 240Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245<210>54<211>928<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和BirA生物素化標(biāo)記融合的來自克隆A6的結(jié)合在可溶性HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRβ鏈的DNA序列。<400>54atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca 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cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta ctag864<210>68<211>287<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的結(jié)合在人HLA-A2/flu基質(zhì)肽上的JM22 TCRβ鏈的氨基酸序列。<400>68Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys1 5 10 15Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp20 25 30Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu50 55 60Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val65 70 75 80Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser85 90 95Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285<210>69<211>918<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和BirA生物素化標(biāo)記融合的結(jié)合在人HLA-A2/flu基質(zhì)肽上的JM22 TCRβ鏈的基因。<400>69atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta cggatccggt ggtggtctga acgatatttt tgaagctcag 900aaaatcgaat ggcattaa 918<210>70<211>305<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和BirA生物素化標(biāo)記融合的結(jié)合在人HLA-A2/flu基質(zhì)肽上的JM22 TCRβ鏈的氨基酸序列。<400>70Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys1 5 10 15Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp20 25 30Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu50 55 60Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val65 70 75 80Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser85 90 95Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly275 280 285Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp290 295 300His305<210>71<211>750<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆A6的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRα鏈的基因。<400>71atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750<210>72<211>249<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆A6的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRα鏈的氨基酸序列。<400>72Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser85 90 95Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro100 105 110Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys115 120 125Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr130 135 140Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr145 150 155 160Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala165 170 175Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser180 185 190Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly195 200 205Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln210 215 220Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala225 230 235 240Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245<210>73<211>928<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和BirA生物素化標(biāo)記融合的來自克隆A6的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRβ鏈的基因。<400>73atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcaggccggg actagcggga 300gggcgaccag agcagtactt cgggccgggc accaggctca cggtcacaga ggacctgaaa 360aacgtgttcc cacccgaggt cgctgtgttt gagccatcag aagcagagat ctcccacacc 420caaaaggcca cactggtgtg cctggccaca ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 480tggtgggtga atgggaagga ggtgcacagt ggggtcagca cagacccgca gcccctcaag 540gagcagcccg ccctcaatga ctccagatac gctctgagca gccgcctgag ggtctcggcc 600accttctggc agaacccccg caaccacttc cgctgtcaag tccagttcta cgggctctcg 660gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt928<210>74<211>307<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和BirA生物素化標(biāo)記融合的來自克隆A6的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRβ鏈的氨基酸序列。<400>74Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr1 5 10 15Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr20 25 30Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His35 40 45Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly50 55 60Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu65 70 75 80Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro85 90 95Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg100 105 110Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala115 120 125Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr130 135 140Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser145 150 155 160Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro165 170 175Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu180 185 190Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn195 200 205His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu210 215 220Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu225 230 235 240Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala245 250 255Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile260 265 270Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala275 280 285Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile290 295 300Glu Trp His305<210>75<211>765<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的來自克隆M10B7/D3的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRα鏈的基因。<400>75atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765<210>76<211>254<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述與c-jun亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域融合的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRα鏈的氨基酸序列。<400> 76Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser1 5 10 15Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr20 25 30Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu35 40 45Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu50 55 60Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser65 70 75 80Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Ala Met Glu Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg100 105 110Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Ash Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln115 120 125Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp130 135 140Phe Asp Ser Gln Thr Ash Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr145 150 155 160Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg ser Met Asp Phe Lys Ser165 170 175Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn180 185 190Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro195 200 205Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys210 215 220Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu225 230 235 240Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245 250<210>77<211>925<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述編碼與c-fos亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和BirA生物素化標(biāo)記融合的來自克隆M10B7/D3的結(jié)合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRβ鏈的基因。<400>77atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840ctagagttca tcctggcagc Mtacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900cagaaaatcg aatggcatta agctt 925<210>78<211>306<212>PRT<213>流感病毒<400>78Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr1 5 10 15Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr20 25 30Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His35 40 45Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly50 55 60Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu65 70 75 80Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr85 90 95Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu100 105 110Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln165 170 175Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu245 250 255Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala260 265 270Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu290 295 300Trp His305<210>79<211>9<212>PRT<213>流感病毒<220><223>來源于流感病毒基質(zhì)蛋白質(zhì)并作為肽抗原由HLA-A0201呈遞的肽。這種HLA/肽結(jié)合物結(jié)合JM22TCR。<400>79Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1 5<210>80<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷1型病毒<220><223>來源于HIV-1 Gag蛋白質(zhì)并作為肽抗原由HLA-A0201呈遞的肽，這種HLA/肽結(jié)合物結(jié)合來自病人003的克隆的TCR。<400>80Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu1 5<210>81<211>9<212>PRT<213>流感病毒<220><223>來源于流感病毒核蛋白并作為肽抗原由鼠H2-Db呈遞的肽。這種HLA/肽結(jié)合物結(jié)合鼠F5 TCR。<400>81Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met1 5<210>82<211>9<212>PRT<213>人T-細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞1型病毒<220><223>來源于HTLV-1 Tax蛋白質(zhì)并作為肽抗原由HLA-A0201呈遞的肽。這種HLA/肽結(jié)合物結(jié)合A6和B7 TCRs。<400>82Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val1 5<210>83<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220><223>來源于HIV-1 Pol蛋白質(zhì)并作為肽抗原由HLA-A0201呈遞的肽。<400>83Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val1 5<210>84<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR擴(kuò)增與BirA生物素化標(biāo)記融合的人Vβ17鏈的引物。<400>84gctctagaca tatgggccca gtggattctg gagtcac<210>85<211>90<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR擴(kuò)增與BirA生物素化標(biāo)記融合的人Vβ17鏈的引物。<400>85gggggaagct taatgccatt cgattttctg agcttcaaaa atatcgttca gaccaccacc 60ggatccgtaa gctgccagga tgaactctag 90
權(quán)利要求
1．一種重折疊的重組T細(xì)胞受體(TCR)，它包括ⅰ)帶有第一種異源C-末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域；和ⅱ)帶有第二種C-末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域，其中所述的第二種C-末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域。
2．一種具有生物活性的重組T細(xì)胞受體(TCR)，它包括ⅰ)帶有第一種異源C-末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域；和ⅱ)帶有第二種C-末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域，其中所述的第二種C-末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的重組TCR，其中存在于與胞質(zhì)域鄰接的α與β或γ與δ鏈之間天然TCRs中的二硫鍵不存在。
4．根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的重組TCR，其中所述的異二聚化結(jié)構(gòu)域是一種卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組TCR，其中所述的二聚化肽類是c-jun和c-fos二聚化肽類。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的重組TCR，它包括位于TCR鏈與異二聚化肽類之間的彈性接頭。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的重組TCR，將它在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組TCR，它在C-末端為生物素標(biāo)記的。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的重組TCR，將它用一種可檢測的標(biāo)記物來標(biāo)記。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的重組TCR，將它與一種諸如細(xì)胞毒性劑或免疫刺激劑的治療劑連接。
11．編碼權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組TCR的重組TCR鏈的核酸序列。
12．一種根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸序列，它位于大腸桿菌表達(dá)載體中。
13．一種重組非膜結(jié)合T細(xì)胞受體的制備方法，該方法包括表達(dá)ⅰ)帶有第一種異源C-末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域；和ⅱ)帶有第二種C-末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域，其中所述的第二種C-末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域；并且在體外使所述鏈彼此重折疊而產(chǎn)生TCR異二聚體。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中重折疊步驟在含有增溶劑的重折疊緩沖液中進(jìn)行。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的增溶劑是濃度至少為0.1M的尿素。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的增溶劑是濃度約為5M的尿素。
17．根據(jù)權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中使所述的鏈在重折疊前在變性緩沖液中變性。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的變性緩沖液含有DTT或胍作為還原劑。
19．根據(jù)權(quán)利要求13-18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的TCR是權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組TCR。
20．一種通過權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的重組TCR。
21．一種權(quán)利要求20所述的TCR的多聚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組可溶性T細(xì)胞受體。該T細(xì)胞受體是重折疊的并包括帶有第一種異源C－末端二聚化肽的重組TCRα或γ鏈胞外域以及帶有第二種C－末端二聚化肽的重組TCRβ或δ鏈胞外域,其中所述的第二種C－末端二聚化肽特異性地與第一種二聚化肽異二聚化而形成異二聚化結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域可以是卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了可編碼所述重組TCR的核酸序列和一種用于制備所述重組TCR的方法。所述的TCR可以用一種檢測用標(biāo)記物來標(biāo)記以便能夠檢測特異性MHC－肽復(fù)合物。另一方面,可以將它與一種治療劑諸如一種細(xì)胞毒性劑或一種免疫刺激劑連接以便將這類活性劑輸送到特異性MHC－肽復(fù)合物的位置上。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1306572SQ99807608
公開日2001年8月1日 申請日期1999年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月19日
發(fā)明者B·K·杰克伯森, J·I·貝爾, 高福, B·E·威爾考克斯, J·M·博爾特 申請人:阿維德克斯有限公司