專利名稱：在生物液體中測定含有β－內酰胺核的抗生素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)受體在生物液體中測定含有β-內酰胺核的抗生素的快速敏感的新方法。本發(fā)明還涉及用于實施該方法的試劑盒。
目前，抗生素的使用非常廣泛，它不僅在細菌引起的感染疾病的治療中作為治療劑，而且用作食物保存劑和刺激生長的動物飼料添加劑。因此，人們越來越感覺到，需要能夠在復雜的生物液體或緩沖水介質中檢測即使是非常低濃度的抗生素的存在，所述生物液體例如奶、尿、血液、血清、唾液、肉提取物、發(fā)酵液。
一個例子是奶的生產(chǎn)，因為使用抗生素治療奶牛的某些感染疾病是眾所周知的。
然而，由于明顯的醫(yī)學原因，原則上用于人類食用的奶必須沒有任何微量抗生素。而且，在奶產(chǎn)品如奶酪、酸乳等的生產(chǎn)過程中，0.005I.U./ml或更低濃度的青霉素即可產(chǎn)生不利影響。
可設想幾種情況。在第一種情況中，例如為了在裝入貨車前在農(nóng)場中檢測抗生素的存在，將優(yōu)選一種極為快速(少于5分鐘)而簡單的檢驗方法。也可設想在例如用于治療的抗生素已知、而且該檢驗能檢測法定標準的所述抗生素時使用這種快速檢驗。在第二種情況下，當重點不是速度時，重要的是檢測大部分(如果不是全部)法定標準的抗生素。
實際上，一些國家的法律實行非常明確的質量標準。例如美國官方要求奶中下列六種抗生素的濃度不超過非常明確的值青霉素，5 ppb；氨芐青霉素，10 ppb；阿莫西林，10 ppb；氯唑西林，10 ppb；頭孢匹林，20 ppb；頭孢噻呋，50 ppb。歐盟實行如下質量標準青霉素，4 ppb；阿莫西林，4 ppb；氨芐青霉素，4 ppb；氯唑西林，30 ppb；雙氯西林，30ppb；苯唑西林，30 ppb；頭孢匹林，10 ppb；頭孢噻呋，100 ppb；頭孢喹肟20 ppb；萘夫西林30 ppb；頭孢唑啉，50ppb。
因此，具有可檢測大多數(shù)抗生素的檢驗方法是有利的。而且，在乳品加工業(yè)可以認為，由于沒有兼有快速、靈敏和簡便特征的檢驗方法，能最佳組合這三個參數(shù)的檢驗方法將是有利的，即使它們并沒有被完全滿足。
為在生物液體中檢測含有β-內酰胺核的抗生素，已提出了各種類型的檢驗方法。通常這些檢驗所采用的檢測方法使用特異識別抗生素或該抗生素類似物的識別試劑(受體或抗體)和標記試劑(放射性元素、酶、熒光試劑等)。根據(jù)所選試劑不同，可使用所謂的放射免疫分析(RIA)、放射性受體分析(RRA)、酶免疫分析(EIA)等。根據(jù)它們的一般原則，這些檢驗采用上述兩種試劑(檢測試劑)的最小組合，該組合應可獲得其數(shù)值指示存在的抗生素的量的結果。
應當注意，根據(jù)所選擇的檢測方法，標記試劑可與識別試劑偶聯(lián)，或通過識別試劑的識別與抗生素或抗生素類似物偶聯(lián)。也有一些方法，其中識別試劑或抗生素或抗生素類似物本身含有標記試劑(例如放射性標記的抗生素)。
美國專利4,239,852描述了在奶中檢測具有β-內酰胺核抗生素的微生物學方法。根據(jù)該方法，將奶樣品首先在對抗生素高度敏感的微生物特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的細胞部分存在時孵育，然后在標記了放射性元素或酶的抗生素存在下孵育。孵育的條件是允許樣品中可能存在的抗生素和標記的抗生素與細胞部分結合。
孵育后，細胞部分從混合物中分離，然后洗滌。之后測定與細胞部分結合的標記抗生素的量，并與標準品比較。與細胞部分結合的標記抗生素的量與所分析的奶樣品中存在的抗生素的濃度成反比。
該方法要求相當精確的操作，尤其是在細胞部分從混合物中分離階段。此外，在其最靈敏的版本中，該方法使用放射性元素(14C或125I)標記的抗生素，其中該版本可在牛奶中檢測達0.01 I.U./ml，甚至0.001I.U./ml的青霉素G。在這種情況下，對牛奶中可能存在的抗生素量的測定必需使用特殊儀器例如閃爍計數(shù)器。此外，處理即使非常小量的放射性產(chǎn)品對進行該分析的人員也不是完全沒有危險。
歐洲專利申請593112描述了另一種在奶中檢測抗生素的方法。該方法使用從抗生素敏感微生物如嗜熱脂肪芽孢桿菌中分離的一種蛋白質。該蛋白質還標記了酶如過氧化物酶。
該檢驗按如下進行奶樣品在所述標記蛋白質存在下于一管中孵育；孵育后，將奶轉移至管壁已固定了參照抗生素的第二管中；進行第二次孵育，然后除去管中的內容物；用洗滌溶液洗滌第二管管壁三次，除去洗滌液，然后將第二管中存在的殘余物轉移至一張吸附紙上；再向第二管中加入顯色底物，再次孵育，然后加入終止顯色的溶液；將該管的顯色與用抗生素標準樣品平行進行的相同實驗的顯色比較。支持物上固定的標記蛋白的量，繼而顯色強度與所分析的奶樣品中存在的抗生素的量成反比。
根據(jù)該專利申請的實施例1,該檢驗可檢測濃度低至約5ppb的青霉素G，并可檢測到阿莫西林(5ppb)、氨芐青霉素(10ppb)、頭孢匹林(5ppb)和頭孢噻呋(5ppb)。該檢驗不能檢測高達歐洲法規(guī)所實行水平的青霉素、阿莫西林和氨芐青霉素，另一方面，該檢測相當復雜，不能完全達到本發(fā)明所追求的靈敏和簡便的標準。
還已知另一種酶學方法，該方法可測定奶中低濃度的抗生素(J.M.Frere等，抗微生物藥物和化學療法(Antimicrobial Agents andChemotherapy),18(4),506-510(1980)，以及專利EP 85667和EP 468946)，該方法基于特定酶的使用，即馬杜拉放線菌R39(ActinomaduraR39)產(chǎn)生的可溶性細胞外D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(下文稱作“酶R39”)。酶R39具有水解各種肽的D-丙氨酰-D-丙氨酸基團的特異活性，并能水解某些硫酯。
此外，酶R39與具有β-內酰胺核的抗生素反應迅速形成無活性和基本不可逆的等摩爾酶-抗生素復合物。
該檢驗的最新版本中(EP 468946)，在允許樣品中可能存在的β-內酰胺抗生素與該酶反應形成無活性和基本不可逆的等摩爾酶-抗生素復合物的條件下，將給定體積的待測液體樣品與預定量的酶R39孵育。
然后，在允許硫酯類底物被第一次孵育過程中未與抗生素形成復合物的殘余酶R39水解的條件下，將確定量的硫酯類底物與第一階段獲得的產(chǎn)物孵育。然后采用可通過與巰基鏈烷酸的游離SH基團反應顯色的試劑，經(jīng)比色分析測定由此形成的巰基鏈烷酸的量。顯色強度與預先從含有已知量抗生素的樣品建立的標準比較。定量測定可通過在分光光度計中測量來進行；對于奶，必需預先凈化樣品。
根據(jù)專利EP 468,946的實施例，該方法可在奶中共5分鐘的孵育時間里測定10ppb青霉素G，共15分鐘的孵育時間里測定約2.5ppb青霉素G。
對于在食品中檢測抗生素的方法所必需的快速、簡便和靈敏的標準，本申請人自己設定了探索生物液體中檢測抗生素的更有效的新方法的目標。特別地，申請人自己設定了探索在單次檢驗中測定歐洲和美國政府規(guī)定的大多數(shù)抗生素之方法的目標。而且，所探索的方法應當可以在少數(shù)步驟中獲得該結果，優(yōu)選這些步驟可被非技術人員操作。本申請人還尋求了用比現(xiàn)有方法更短的孵育時間實現(xiàn)這些目標的方法。
本申請人最近發(fā)現(xiàn)在生物液體中檢測含有β-內酰胺核的抗生素的新方法，這些方法可以較好地實現(xiàn)這些目標。
因此，本發(fā)明涉及在生物液體中檢測含有β-內酰胺核的抗生素的新方法，其包括如下步驟a)用一定量的識別試劑接觸確定體積的所述生物液體，并在允許該識別試劑與所述液體中可能存在的抗生素形成復合物的條件下，孵育獲得的混合物；b)在允許參照抗生素與步驟a)中沒有反應的識別試劑形成復合物的條件下，用至少一種固定在支持物上的參照抗生素與步驟a)獲得的混合物接觸；和c)測定結合在支持物上的識別試劑的量，其特征在于識別試劑包括獲自地衣芽孢桿菌并對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體。


圖1描述了一種根據(jù)本發(fā)明可使用的支持物，其是一種檢驗裝置，包括固相支持物(1)及其上附著的膜(2)、(3)和(4)。圖1a是正面圖，圖1b是該檢驗裝置的縱向橫截面圖。
本發(fā)明的方法的優(yōu)越性基于特異識別試劑的使用，該識別試劑包括獲自地衣芽孢桿菌并對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體，即BlaR蛋白，Y.Zhu等(細菌雜志(J.Bacteriol.),1137-1141,(1990))描述了其分離和肽序列，或BlaR-CTD多肽，BlaR-CTD是BlaR的羧基端區(qū)域，B.Joris等(FEMS Microbiology Letters,107-114,(1990))描述了其分離和肽序列。
本發(fā)明使用受體BlaR或BlaR-CDT檢測含有β-內酰胺核的抗生素比迄今所使用的識別試劑具有明顯的優(yōu)點。其理由是受體BlaR或BlaR-CDT能非常迅速地與非常大量的抗生素形成復合物，并且比已知識別試劑例如獲自嗜熱脂肪芽孢桿菌的受體需要更短的孵育時間。
作為通過本發(fā)明的方法可檢測的抗生素的例子，可提到的是如下抗生素芐基青霉素(或青霉素G)，氨芐青霉素，阿莫西林，羧芐西林，甲基西林(methyleillin)，氯唑西林，6-APA，單環(huán)內酰胺(monolactam)，氨曲南，美西林，頭孢氨芐，頭孢來星，頭孢噻啶，nitrocephine,cefatoxime，頭孢呋辛，頭孢噻呋，頭孢匹林，7-ACA。更具體地，本發(fā)明的方法可檢測美國和歐洲政府所控制的低至所能接受的極限閾值的所有抗生素。
本發(fā)明的方法允許在生物液體如奶、尿、血液、血清、唾液、肉提取物、發(fā)酵液，或緩沖水介質中檢測含有β-內酰胺核的抗生素。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，識別試劑以偶聯(lián)標記試劑的形式使用。該標記試劑可是各種性質的。該標記試劑可是微粒型的，例如金屬膠體顆粒(鉑、金、銀等)，硒、碳、硫或碲的膠體顆粒，或有色合成乳膠的膠體顆粒。該標記試劑還可是熒光物質例如活化熒光素(可獲自Boeringher-Mannheim Biochemica)、熒光素異氰酸酯、羅丹明四甲基異氰酸酯、或本領域技術人員已知的任何其它熒光物質。該標記試劑還可是酶，例如β-內酰胺酶、過氧化物酶、磷酸酶等。在這種情況下，受體BlaR或BlaR-CTD可通過化學或遺傳學方法與該酶性質的標記試劑偶聯(lián)形成融合蛋白。
該識別試劑可根據(jù)本領域技術人員已知的傳統(tǒng)方法與標記試劑偶聯(lián)。識別試劑可直接與標記試劑相連，或通過形成中間復合物與之相連。識別試劑和標記試劑之間的偶聯(lián)可在本發(fā)明方法實施過程中的不同時間進行。根據(jù)第一個實施方案，識別試劑和標記試劑之間的偶聯(lián)在識別試劑與待分析的生物液體接觸之前進行。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，識別試劑和標記試劑的偶聯(lián)可在識別試劑與生物液體樣品接觸時或之后進行。優(yōu)選地，識別試劑的標記在識別試劑與待分析樣品接觸之前進行。
根據(jù)本發(fā)明的方法的第一步a)包括將一定體積的生物液體與一定量的識別試劑接觸，并在允許該識別試劑與該生物液體中可能存在的抗生素形成復合物的條件下，孵育獲得的混合物。
生物液體可在4-60℃的溫度范圍內與受體BlaR或BlaR-CTD孵育。優(yōu)選地，該溫度是約47℃。孵育溫度的增加可縮短孵育時間，反之亦然。因此，總是可以通過增加溫度來縮短該方法的時間。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二步b)中，將步驟a)中獲得混合物與至少一種固定在支持物上的參照抗生素接觸。
根據(jù)本發(fā)明可使用的支持物可是多種類型的。它們可是固相支持物，如包被了參照抗生素制品的管、盤或柱。其可是結合了膜的固相支持物形式的檢驗裝置，在一個檢驗區(qū)域放置了一或多種捕獲物質。它們可以是能形成凝膠并固定了參照抗生素的磁性或非磁性珠形式的支持物(瓊脂糖、聚苯乙烯等)。
參照抗生素可通過本領域技術人員已知的方法固定在支持物上，例如通過與支持物共價或非共價吸附，吸附可選擇性地通過間隔子來進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，步驟a)和b)可同時進行。
本發(fā)明的方法的步驟c)包括測定與固定了參照抗生素的固相支持物結合的受體。該測定所用方法與所用標記試劑的類型直接相關。如果標記試劑是酶，測定步驟將涉及與該酶特異的反應，該反應與例如一定顏色的產(chǎn)生相關。如果標記試劑是熒光性質的，該測定將通過簡單測量支持物上的熒光來進行。對于金屬顆?；蛴猩槟z，與支持物結合的受體的存在通過其強度與支持物上結合的受體的數(shù)量成正比的顏色來反映。不管使用何種類型的標記試劑，所檢測的信號強度與分析樣品中存在的抗生素的量成反比。
本發(fā)明還涉及用于測定生物液體中的抗生素的檢驗試劑盒，其包括至少一種識別試劑和至少一種固定在支持物上的參照抗生素，其中該識別試劑包含獲自地衣芽孢桿菌并對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體。
下列實施例闡述了實施本發(fā)明的各方面和實施方式，但其并不限制本本實施例闡述在奶中測定衛(wèi)生部門控制的含有β-內酰胺核的抗生素。本實施例中所描述的檢驗使用與用作標記試劑的金珠偶聯(lián)的BlaR-CTD受體，并使用檢驗裝置形式的支持物，其包含結合了膜的固相支持物。1.1.BlaR-CTD與金珠的偶聯(lián)1.1.1.BlaR-CTD的生物素化將3.79ml BlaR-CTD(濃度6.6mg/ml)識別試劑溶液加至20mM pH7的磷酸鈉緩沖液中。然后向該BlaR-CTD溶液中加入41.71ml的碳酸氫鹽緩沖液(0.1M碳酸氫鈉，pH 9)和2ml同樣溶于碳酸氫鹽緩沖液的2.23mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺6-(生物素酰氨基)己酸酯溶液。室溫避光在LABINCO轉軸管式攪拌器(可獲自VEL，比利時)上以2轉/分鐘的速度溫和攪拌該溶液2小時。在相同條件下將2.5ml Tris緩沖液(1M pH8)與反應混合物孵育30分鐘。由此獲得的溶液對HNM緩沖液(Hepes 100 mM,pH8,NaCl 100mM,MgCl250mM)透析24小時。以這種方式獲得溶于HNM-BSA緩沖液(Hepes 500mM,pH8,NaCl 500mM,MgCl2250mM,BSA10mg/ml)中濃度達250μg生物素化BlaR-CTD/ml緩沖液的生物素化BlaR-CTD溶液。該溶液保存于-20℃。1.1.2.標記試劑標記試劑使用沉積了羊抗生物素抗體的直徑40nm的金顆粒，其是溶于2mM四硼酸鈉水溶液(pH7.2)中的懸液形式，采用0.1％疊氮化鈉(可獲自British Biocell(Ref.GAB40))穩(wěn)定化。該懸液在520nm處的光密度約為10，蛋白質濃度約為24μg/ml。1.1.3.生物素化BlaR-CTD與金顆粒偶聯(lián)實施例1.1.1中制備的生物素化BlaR-CTD用HNM-BSA緩沖液(Hepes500mM,pH8,NaCl 500mM,MgCl2250mM,BSA 10mg/ml)稀釋114.7倍。室溫混合22.5份體積的該生物素化BlaR-CTD稀釋溶液、7.5份體積的HNM-BSA緩沖液、9.27份體積用于標記生物素化BlaR-CTD的金顆粒懸液和6份體積的參照金顆粒懸液(見下面實施例1.1.4)1.1.4．獨立參照在該檢驗中還采用一種參照物質，根據(jù)它提供的條帶強度能快速定量樣品中存在的抗生素。
為此，采用其上沉積了羊抗兔免疫球蛋白抗體的40nm金顆粒。該顆粒可從British Biocell(Ref.GAR40)以0.1％疊氮化鈉穩(wěn)定的溶于2mM四硼酸鈉水溶液(pH7.2)的懸液形式獲得。該懸液在520nm處的光密度約為3，蛋白質濃度約為6μg/ml。1.2．檢測裝置所用檢測裝置包括具有第一和第二末端的固相支持物(1)，從第一末端開始其上連續(xù)結合了-用于純化被分析液體的膜(2)，-其上固定了兩種捕獲物質(參照抗生素和能結合獨立參照物的物質)的膜(3)，和-吸附膜(4)。1.2.1組裝分析裝置首先按照下列方法使用Clamshell Laminator型層壓機(可獲自BioDot公司)組裝300×76.2mm大小的卡片裁出300×76.2mm大小的ArCare 8565型長方形塑料支持物(可獲自Adhesive Research)(支持物(1))。然后，裁出300×20mm大小的長方形Leukosorb LK4膜(可獲自Pall Gelman Sciences)(膜(2))、300×25mm大小的長方形Hi-Flow SX膜(可獲自Millipore)(膜(3))、300×40mm大小的長方形3mm纖維素膜(可獲自Whatmann)(膜(4))。
在層壓機下面模型的特定位置接連放上膜(2)和(4)，然后是膜(3)。覆蓋了粘合劑的固相支持物(1)置于該機器的頂蓋上，粘性面朝向空氣。閉合層壓機，將置于下面模型上的膜和粘性支持物接觸；通過真空泵抽氣將膜嚴密固定就位。當真空停止時，獲得了包含固相支持物(1)和其上固定的膜(2)、(3)和(4)的卡片。
然后在膜(3)上沉積下列溶液近側第一捕獲物質；1號帶；遠側第二捕獲物質；2號帶。這些捕獲物質用Bio Dot公司的X-Y PlatformBiojet Quanti-3000型“分配器”沉積。
通過將整個卡片置于60℃壓力熱空氣中1分鐘以迅速蒸發(fā)沉淀的溶液。
用切紙機類設備或旋轉設備(可獲自Bio Dot、Kinematic或Akzo)將組裝后的卡片切成長條。丟棄末端的長條，其它長條備用。
圖1說明了這種分析裝置。
為了保存，該分析裝置置于含有干燥劑的不透光密封容器中(AirSec，法國)。1.2.2．第一捕獲物質-參照抗生素。
在25℃將8ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的213mg人丙種球蛋白(G4386,Sigma)和8.6mg鹽酸2-亞氨基-硫雜戊環(huán)(Aldrich,330S6-6)的溶液孵育1小時。
此外，在25℃將20ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的119.8mg頭孢菌素C和54mg磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(sSMCC,22322 Pierce)的溶液孵育1小時。
然后將上述制備的二溶液混合。加入3ml NaH2PO4(500mM)調節(jié)獲得的溶液的pH值至7.1，將該溶液在25℃孵育2小時。孵育后獲得的混合物對1升磷酸鈉緩沖液(10mM,pH7.5)透析3次。將獲得的溶液通過0.22um濾器過濾，然后分成等分試樣凍存于-20℃直至使用。
使用時融化等分試樣，向其中加入食品著色劑，然后將其沉積于膜上，以隨時指示沉積物的確切位置和示蹤物的量。
第一捕獲物質可結合相對于樣品中存在的抗生素的量而言過量的、與金顆粒偶聯(lián)的BlaR-CTD。1.2.3．第二捕獲物質-能結合獨立參照物的物質。
第二捕獲物質可使用兔免疫球蛋白溶液(Sigma I 5006)，在10mM磷酸鈉(pH7.5)、5mg/ml人丙種球蛋白的緩沖液中的免疫球蛋白濃度為0.5mg/ml。當液體沿分析裝置遷移時，該第二捕獲物質可使獨立參照物停留。1.3．測定奶中的抗生素1.3.1．3分鐘檢驗-快速檢驗制備分別含有0、1、2、3、4、5和6ppb青霉素G的7份鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一份溶液取200ul奶樣品和45.27ul實施例1.1.3制備的溶液，放入玻璃瓶中。將該混合物在47℃孵育1分鐘。取一檢驗裝置垂直放入該玻璃瓶中，使檢驗裝置的第一端與混合物接觸，并且第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗裝置上遷移。
下面表1總結了這7個被測樣品的結果。給被測條帶確定一個范圍從0到10的強度值，數(shù)值10是指最強的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號強度與樣品中存在的青霉素G的量成反比。
表1青霉素G 強度(ppb)第一條帶第二條帶0 10 61 962 963 464 065 066 06在該實施例中，當?shù)谝粭l帶的強度比第二條帶的強度低時，檢驗被認為是陽性的。表1中的結果顯示，該檢驗允許在3分鐘內檢測奶樣品中低于4ppb的青霉素G。
還在相同條件下對含有β-內酰胺核的其它抗生素進行了檢測。在3分鐘內進行的該檢驗允許在奶樣品中檢測低至5ppb的阿莫西林、低至5ppb的氨芐青霉素、低于10ppb的氯唑西林、低于20ppb的雙氯西林、低于20ppb的苯唑西林、低至20ppb的頭孢匹林。1.3.2．5分鐘檢驗制備6個分別含0、2、4、6、8和10ppb氯唑西林的鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一個樣品。
取200ul奶樣品和45.27ul實施例1.1.3制備的溶液，置于玻璃瓶中。將該混合物于47℃孵育3分鐘。取一檢驗裝置垂直置于玻璃瓶中，使該檢驗裝置第一端與混合物接觸，第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗裝置上遷移。
下面的表2總結了這6個被測樣品獲得的結果。給被測條帶確定一個范圍從0到10的強度值，數(shù)值10是指最強的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號強度與樣品中存在的氯唑西林的量成反比。
表2氯唑西林 強度(ppb)第一條帶第二條帶0 10 62 6 64 5 66 3 68 3 610 3 6在該實施例中，當?shù)谝粭l帶的強度比第二條帶的強度低時，檢驗被認為是陽性的。表2中的結果顯示，該檢驗允許在5分鐘內檢測奶樣品中低于4ppb的氯唑西林。
還在相同條件下對含有β-內酰胺核的其它抗生素進行了檢測。在5分鐘內進行的該檢驗允許在奶樣品中檢測低至3ppb的青霉素G、低至4ppb的阿莫西林、低至4ppb的氨芐青霉素、低至8ppb的雙氯西林、低至8ppb的苯唑西林、低至16ppb的頭孢匹林、低至100ppb的頭孢噻呋、低于20ppb的頭孢喹肟、低至20ppb的萘夫西林、低至60ppb的頭孢唑啉。
該檢驗特別適于在將運奶貨車倒空至倉庫之前作為分類檢驗。1.3.3．9分鐘檢驗制備6個分別含0、4、6、8、10和12ppb頭孢匹林的鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一個樣品。
取200ul奶樣品和45.27ul實施例1.1.3制備的溶液，置于玻璃瓶中。將該混合物于47℃孵育7分鐘。取一檢驗裝置垂直置于玻璃瓶中，使該檢驗裝置第一端與混合物接觸，第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗裝置上遷移。
下面的表3總結了這6個被測樣品獲得的結果。給被測條帶確定一個范圍從0到10的強度值，數(shù)值10是指最強的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號強度與樣品中存在的頭孢匹林的量成反比。
表3頭孢匹林(ppb) 強度第一條帶第二條帶0 10 64 6 66 5 68 4 610 3 612 3 6在該實施例中，當?shù)谝粭l帶的強度比第二條帶的強度低時，檢驗被認為是陽性的。表3中的結果顯示，該檢驗允許在9分鐘內檢測奶樣品中低于6ppb的頭孢匹林。
還在相同條件下對含有β-內酰胺核的其它抗生素進行了檢測。在9分鐘內進行的該檢驗允許在奶樣品中檢測低至3ppb的青霉素G、低至4ppb的阿莫西林、低至4ppb的氨芐青霉素、低至4ppb的氯唑西林、低于8ppb的雙氯西林、低于8ppb的苯唑西林、低至80ppb的頭孢噻呋、低于20ppb的頭孢喹肟、低于20ppb的萘夫西林、低至45ppb的頭孢唑啉。
因此，在9分鐘內進行的該檢驗允許檢測所有歐洲政府當前控制的低至這些政府實行的法定極限的抗生素。1.3.4．20分鐘檢驗制備6個分別含0、20、30、40、50和60ppb頭孢噻呋的鮮奶樣品。然后以下列方式分析每一個樣品。
取200ul奶樣品和45.27ul實施例1.1.3制備的溶液，置于玻璃瓶中。將該混合物于47℃孵育18分鐘。取一檢驗裝置垂直置于玻璃瓶中，使該檢驗裝置第一端與混合物接觸，第二端靠在玻璃瓶壁上。將該裝置在47℃孵育2分鐘，讓混合物在檢驗裝置上遷移。
下面的表4總結了這6個被測樣品獲得的結果。給被測條帶確定一個范圍從0到10的強度值，數(shù)值10是指最強的條帶，數(shù)值0是指最弱的條帶。根據(jù)該度量法，參照條帶給出數(shù)值6。第一條帶中觀察到的信號強度與樣品中存在的頭孢噻呋的量成反比。
表4頭孢噻夫 強度(ppb)第一條帶第二條帶0 10620 6 630 5 640 4 650 3 660 3 6在該實施例中，當?shù)谝粭l帶的強度比第二條帶的強度低時，檢驗被認為是陽性的。表中的結果顯示，該檢驗允許在20分鐘內檢測奶樣品中低于30ppb的頭孢噻呋。
因此，在20分鐘內進行的該檢驗允許在單次檢驗中檢測所有歐洲和美國政府當前控制的低至這些政府實行的法定極限的抗生素。實施例2．測定奶中6種抗生素該實施例闡述檢測奶中美國政府控制的6種含有β-內酰胺核的抗生素。該實施例所描述的檢驗使用與β-內酰胺酶融合的融合蛋白形式的受體BlaR-CTD，并使用磁珠形式的支持物。2.1．BlaR-CTD-β-內酰胺酶融合蛋白。
BlaR-CTD-β-內酰胺酶融合蛋白通過受體BlaR-CTD(B.Joris等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,107-114,1990)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的Znβ-內酰胺酶(M.Hussain等，1985，細菌學雜志，164:l,223-229,1985)之間的遺傳偶聯(lián)來獲得。
偶聯(lián)按以下方式進行2.1.1．質粒的構建在B1aR-CTD多肽和β-內酰胺酶的兩基因之間進行l(wèi)/1的偶聯(lián)β-內酰胺酶編碼基因按編碼框導入在BlaR-CTD基因之后。攜帶該遺傳融合物的質粒顯示卡那霉素抗性。下文將融合蛋白稱作Fus 1。2.1.2．生產(chǎn)-菌株將攜帶該融合基因的質粒導入大腸桿菌。在LB+Km(50ug/ml)中篩選攜帶重組質粒的克隆。-篩選用放射性抗生素標記細胞提取物，之后變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示大部分該蛋白質以分子量約50,000的融合蛋白質形式產(chǎn)生。然而，翻譯后蛋白水解似乎將非常小比例(2％)的這些分子分解為兩種不同的活性。-培養(yǎng)將儲存于-70℃的重組細胞接種在500ml LB+Km(50ug/ml)培養(yǎng)基中。預培養(yǎng)物于37℃225rpm振蕩培養(yǎng)過夜。用600nm光密度為4的該500ml預培養(yǎng)物接種18升LB+Km(50ug/ml)培養(yǎng)基。當該18升培養(yǎng)物的光密度值達到6時，停止培養(yǎng)。2.1.3．抽提終止培養(yǎng)后，立即過濾并離心細胞。在破碎儀中裂解細胞沉淀，保留上清液。該上清液中含有融合蛋白FUS1。2.1.4．純化-所用緩沖液●緩沖液A:20mM pH8.0 Tris,10％1,2-乙二醇,50um DTT；●緩沖液B緩沖液A+1M NaCl。
通過離子層析和分子篩部分純化該融合蛋白。抽提物沉積在QSFF柱(Pharmacia,Upsala)上，以緩沖液A洗滌后，用線性梯度的緩沖液B洗脫FUS1。然后將活性部分(±0.25M NaCl)合并，并沉積在G-100分子篩(Pharmacia,Upsala)上；用緩沖液A將其洗脫?；厥詹糠值钠骄然罟烙嫗?0％。2.1.5．β-內酰胺酶的抑制融合蛋白(9/10體積)與50mM EDTA(1/10體積)于37℃孵育45分鐘。使用溶于10mM pH6.0的二甲胂酸鹽緩沖液的nitrocefine檢驗抑制情況。在存在或不存在Zn的情況下，信號應分別是陽性或陰性的。抑制后，基于β-內酰胺酶活性測量的有效濃度是7.74pmol/ul。2.2固相支持物磁珠-頭孢菌素C(參照抗生素)。
使用BioMag 4100顆粒(獲自DRG Instrument GmbH,Marburg，德國，貨號AM 4100 B)，其NH2末端按如下方式以戊二醛活化-一體積的BioMag 4100顆粒初始溶液用5體積的0.01M pH6.0嘧啶緩沖液漂洗4次。將這些顆粒懸浮在2.5體積的溶于嘧啶緩沖液的5％戊二醛中，室溫旋轉攪拌3小時。然后，用2體積的0.01M pH7.0 Kpi緩沖液洗滌10次。然后將該顆粒重懸在1體積的溶于Kpi緩沖液的0.1M頭孢菌素C中，4℃旋轉攪拌過夜。進行最終的洗滌直到頭孢菌素C從0.1M pH7.0 Kpi緩沖液中完全除去。2.3．在奶中測定6種抗生素青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林，氯唑西林，頭孢匹林和頭孢噻呋。2.3.1．所用的溶液-溶液1將在100mM pH8 Tris、1mg/ml BSA、50mM EDTA、50um DTT中凍干的700pmol融合蛋白用5ml Milli-Q水重新水化；進行一次測量需要50ul該溶液。-溶液2:2ml實施例1.2中制備在100％異丙醇中的BioMag-頭孢菌素C顆粒；進行一次測量需要20ul。-溶液3凍干的10 mM,pH6二甲胂酸鹽緩沖液和1M NaCl用500mlMilli-Q水重新水化。-溶液4:400ml溶于DMF的10mM nitrocefine用溶液3稀釋至40ml；每次檢測需要400ul。2.3.2．檢測方法向500ml含添加物的奶樣品中加入50ul溶液1,47℃孵育2分鐘。將20ul溶液2懸浮在奶中，47℃再孵育2分鐘。使用順磁磁鐵將顆粒吸附在容器壁上，將管中上清液倒出。用溶液3洗滌顆粒2次，同時用磁鐵進行相同的操作。最后，加入400ul溶液4，與顆粒在47℃孵育3分鐘。然后，測定482nm處殘余溶液相對于nitrocefine溶液的吸光度。
該方法允許檢測低于當局所實行標準濃度的美國法規(guī)給出的6種抗生素，即5ppb青霉素、10ppb氨芐青霉素、10ppb阿莫西林、10ppb氯唑西林、20ppb頭孢匹林和50ppb頭孢噻呋。實施例3．測定奶中3種抗生素(青霉素G、氯唑西林、頭孢噻呋)。
該實施例闡述在奶中檢測衛(wèi)生部門控制的含有β-內酰胺核的3種抗生素。該實施例中所描述的檢驗使用分別與堿性磷酸酶和過氧化物酶融合的兩種融合蛋白形式的受體BlaR-CTD，并使用微量反應板形式的支持物。3.1．BlaR-CTD-堿性磷酸酶融合蛋白。
通過受體BlaR-CTD(B.Joris等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,107-114(1990))和可獲自Boehringer-Mannheim Biochemica的活化堿性磷酸酶(貨號1464752)之間的化學偶聯(lián)，獲得BlaR-CTD-堿性磷酸酶融合蛋白。
偶聯(lián)按如下方式進行3.1.1．偶聯(lián)BlaR-CTD和堿性磷酸酶在100mM pH9.8碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中透析。15nmol BlaR-CTD與100ul活化的堿性磷酸酶(20mg/ml)在25℃孵育2小時。3.1.2．終止反應加入40ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，之后加入50ul 200mM硼氫化鈉溶液。混合物在4℃孵育30分鐘。然后加入25ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，將混合物在4℃再孵育2小時。3.1.3．偶聯(lián)的穩(wěn)定化加入10ul 1M,pH7.0甘氨酸溶液。3.1.4．轉移至儲存緩沖液中將反應混合物(約300ul)在4℃對0.5升50mM,pH7.6三乙醇胺緩沖液，150mM NaCl,1mM MgCl2,0.5mM ZnCl2,10mM甘氨酸透析三次，每次8小時。3.1.5．最終效價偶聯(lián)的最終效價為約每μl溶液50pmol活性BlaR-CTD。3.2．BlaR-CTD)-過氧化物酶融合蛋白通過受體BlaR-CTD(B.Joris等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,107-114(1990))和可獲自Boehringer-Mannheim Biochemica的活化過氧化物酶(貨號1428861)之間的化學偶聯(lián)，獲得BlaR-CTD-過氧化物酶融合蛋白。
偶聯(lián)按如下方式進行3.2.1．偶聯(lián)BlaR-CTD和過氧化物酶在100mM pH9.8碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中透析。40nmol BlaR-CTD與100ul活化的過氧化物酶(16mg/ml)在25℃孵育2小時。3.2.2．終止反應加入40ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，之后加入50ul 200mM硼氫化鈉溶液。混合物在4℃孵育30分鐘。然后加入25ul 2mM,pH8三乙醇胺溶液，將混合物在4℃再孵育2小時。3.2.3．偶聯(lián)的穩(wěn)定化加入10ul 1M,pH7.0甘氨酸溶液。3.2.4．轉移至儲存緩沖液中將反應混合物(約400ul)在4℃對0.5升10mM,pH7.5磷酸鉀緩沖液，200mM NaCl,10mM甘氨酸透析三次，每次8小時。3.2.5．最終效價偶聯(lián)的最終效價為約每μl溶液100pmol活性BlaR-CTD。3.3．固相支持物微量反應板-頭孢菌素C。3.3.1．制備參照抗生素溶液。
在25C將8ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的213mg人丙種球蛋白(G4386,Sigma)和8.6mg鹽酸2-亞氨基硫雜戊環(huán)(Aldrich,33056-6)的溶液孵育1小時。
另外，在25℃將20ml含有溶于碳酸鈉緩沖液(100mM,pH9)的119.8mg頭孢菌素C和54mg磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(sSMCC,22322 Pierce)的溶液孵育1小時。
然后，將上述二溶液混合在一起。加入3ml 500mM NaH2PO4，調節(jié)所獲溶液的pH值至7.1，混合物在25℃孵育2小時。孵育后的混合物對1升磷酸鈉緩沖液(10mM,pH7.5)透析三次。所獲溶液通過0.22um濾器過濾。3.3.2．用參照抗生素包被微量反應板。
采用商品名為NUNK(Immuno Plate:Maxisorp型)或商品名為GREINER(microlon 600，貨號705071)的具有高蛋白吸附能力的聚苯乙烯微量反應板。用150mM,pH7.2 PBS洗滌微量反應板的小室。然后將實施例3.3.1.制備的等份溶液在小室中4℃孵育24小時。孵育后用含有0.1％Tween-20的150mM,pH7.2 PBS緩沖液洗滌三次。然后在20℃用含有5％BSA的150 mM,pH7.2 PBS飽和緩沖液飽和該管2小時。用洗滌緩沖液洗滌三次后，干燥該管并避潮保存于4℃。
對用于BlaR-CTD-堿性磷酸酶識別試劑的小室，所用洗滌緩沖液是1M,pH9.8二乙醇胺，0.5mM MgCl2；對用于BlaR-CTD-過氧化物酶識別試劑的小室，所用洗滌緩沖液是50mM,pH5磷酸鉀。3.4．測定奶中三種抗生素將1.4pmol的標記識別試劑與100ul含添加物的奶在47℃孵育5分鐘。用加樣器轉移該奶至按實施例2.3.所示預處理的小室中。然后該奶在47℃孵育2分鐘。除去奶后，用洗滌緩沖液洗滌兩次(參見實施例2.3.2.)，在小室中加入含有顯色底物的300ul緩沖液，孵育2分鐘(BlaR-CTD-過氧化物酶識別試劑的顯色底物50mM,pH5磷酸鉀，9.1mM ABTS,0.002％H2O2；BlaR-CTD-堿性磷酸酶識別試劑的顯色底物1 M,pH9.8二乙醇胺，0.5mM MgCl2,10mM 4-NPP)。然后將該板置于ELISA板的自動分光光度計中，波長設定為405nm。
該檢驗允許檢測美國當局所要求的控制閾值以下的三種抗生素青霉素G、氯唑西林和頭孢噻呋(青霉素G5ppb、氯唑西林10ppb和頭孢噻呋50ppb)。實施例4．測定奶中6種抗生素青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、氯唑西林、頭孢匹林和頭孢噻呋。
該實施例闡述檢測低至美國當局目前所要求標準的美國當局控制的含有β-內酰胺核的6種抗生素。該實施例所描述的檢驗使用與堿性磷酸酶或過氧化物酶融合的融合蛋白形式的受體BlaR-CTD，并使用包被的管子形式的支持物。4.1．BlaR-CTD-堿性磷酸酶融合蛋白。
見實施例3.1.。4.2．固相支持物用參照抗生素包被的管子在本實施例中使用商品名為NUNK(Maxisorp型)的具有高蛋白吸附能力的聚苯乙烯管，該管按實施例3.3.2.所示用參照抗生素溶液處理。4.3．測定奶中6種抗生素。
在Eppendorf管中將7 pmol的識別試劑與500ul奶于47℃孵育5分鐘。然后用加樣器轉移該奶至按實施例3.2.所示處理的管中。然后該奶在47℃孵育2分鐘。除去奶后，用1ml of 1M pH9.8二乙醇胺緩沖液、0.5mM MgCl2洗滌該管兩次。然后加入500ul含有1M pH9.8二乙醇胺、0.5mM MgCl2、10mM 4-NPP顯色底物的緩沖液，將底物在47℃孵育2分鐘。然后用分光光度計測量上清液的吸光度，分光光度計波長設定為405nm。
該檢驗允許檢測低至美國當局所要求標準的六種抗生素少于5ppb青霉素G；少于10ppb氨芐青霉素；少于10ppb阿莫西林；少于10ppb氯唑西林；少于20ppb頭孢匹林；少于50ppb頭孢噻呋。
權利要求
1．在生物液體中檢測含有β-內酰胺核的抗生素的方法，其包括如下步驟a)用一定量的識別試劑接觸確定體積的所述生物液體，并在允許該識別試劑與所述生物液體中可能存在的抗生素形成復合物的條件下，孵育由此獲得的混合物，b)在允許參照抗生素與步驟a)中沒有反應的識別試劑形成復合物的條件下，用至少一種固定在支持物上的參照抗生素與步驟a)獲得的混合物接觸，和c)測定結合在支持物上的識別試劑的量，其特征在于識別試劑包含獲自地衣芽孢桿菌并對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體。
2．根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于所述對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體是受體BlaR或受體BlaR-CTD。
3．根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于所述對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體與選自金屬膠體顆粒，硒、碳、硫或碲的膠體顆粒，或有色合成乳膠的膠體顆粒的標記試劑偶聯(lián)。
4．根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于所述對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體與選自熒光物質的標記試劑偶聯(lián)。
5．根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于所述對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體與選自酶如堿性磷酸酶、過氧化物酶和β-內酰胺酶的標記試劑偶聯(lián)。
6．根據(jù)根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于對所述抗生素敏感的受體通過化學或遺傳學途徑與酶標記試劑偶聯(lián)。
7．根據(jù)權利要求3-6之任一項的方法，其特征在于所述對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體在步驟a)之前與標記試劑偶聯(lián)。
8．根據(jù)權利要求3-6之任一項的方法，其特征在于所述對含有β-內酰胺核的抗生素敏感的受體在步驟a)過程中或之后與標記試劑偶聯(lián)。
9．根據(jù)權利要求1-8之任一項的方法，其特征在于步驟a)和步驟b)同時發(fā)生。
10．根據(jù)權利要求1-9之任一項的方法，其特征在于步驟b)中所用的支持物選自用參照抗生素包被的管、板或柱。
11．根據(jù)權利要求1-9之任一項的方法，其特征在于步驟b)中所用的支持物是包含具有第一或第二末端的支持物(1)的檢驗裝置，從第一末端開始其上連續(xù)結合了-用于純化被分析液體的膜(2)，-其上固定了一種或數(shù)種捕獲物質的膜(3)，和-吸附性膜(4)。
12．根據(jù)權利要求1-9之任一項的方法，其特征在于步驟b)中所用的支持物由一套磁性或非磁性珠組成。
13．用于通過權利要求1-12之任一項的方法在生物液體中檢測抗生素的檢驗試劑盒，其包括至少一種識別試劑和至少一種固定在支持物上的參照抗生素，其中該識別試劑獲自地衣芽孢桿菌并對含有β-內酰胺核的抗生素敏感。
全文摘要
本發(fā)明涉及在生物液體中檢測具有β－內酰胺核的抗生素的方法,其包括如下步驟:a)用一定量的識別試劑接觸確定體積的所述生物液體,并在該識別試劑與所述液體中可能存在的抗生素形成復合物的條件下孵育獲得的混合物;b)在參照抗生素與步驟a)中沒有反應的鑒定試劑形成復合物的條件下,用至少一種固定在支持物上的參照抗生素與步驟a)獲得的混合物接觸;和c)測定結合在支持物上的識別試劑的量。本發(fā)明的特征在于識別試劑包含獲自地衣芽孢桿菌并對具有β－內酰胺核的抗生素敏感的受體。
文檔編號G01N33/50GK1311857SQ99809405
公開日2001年9月5日 申請日期1999年3月30日 優(yōu)先權日1998年6月25日
發(fā)明者J·迪戈蘭, B·戈蘭尼爾, J－M·福雷爾, B·卓利斯 申請人:Ucb公司