專利名稱：脂蛋白中膽固醇的分別定量法和定量用試劑的制作方法
技術(shù)范圍本發(fā)明涉及對臨床診斷很重要的低密度脂蛋白(以下稱為LDL)中膽固醇(以下稱為LDL膽固醇)的定量方法及其所用的定量試劑。此外，本發(fā)明還涉及對臨床診斷很重要的高密度脂蛋白(以下稱為HDL)中膽固醇(以下稱為HDL膽固醇)和LDL膽固醇連續(xù)分別定量法及其所用的試劑盒。此外，本發(fā)明還涉及臨床診斷中很重要的HDL膽固醇和總膽固醇〔HDL、LDL、極低密度脂蛋白(以下稱為VLDL)和乳糜微粒(以下稱為CM)中的所有膽固醇〕的連續(xù)分別定量法及其所用的定量試劑盒。
對于這些膽固醇濃度，可用對各膽固醇具有特異性的專用試劑分別定量，也可以將自動分析儀設(shè)定為分別定量，但人們希望對各膽固醇有更高的特異性。此外，還未知有在同一檢測系統(tǒng)中對HDL膽固醇、LDL膽固醇、總膽固醇等進(jìn)行連續(xù)分別定量的簡單自動分析方法。
此外，本發(fā)明的目的還在于提供同一檢品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的連續(xù)分別定量方法及其所用的定量試劑盒。此外，本發(fā)明的目的還在于提供同一檢品中HDL膽固醇和總膽固醇的連續(xù)分別定量方法及其所用的定量試劑盒。
本發(fā)明涉及以下的(1)～(27)。(1)機體樣品中LDL膽固醇的定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶(以下稱為CH酶類)和c)在使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行膽固醇的反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。(2)根據(jù)(1)記載的定量方法，只作用于LDL膽固醇的CH酶類的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(3)根據(jù)(2)記載的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳香醚。(4)根據(jù)(2)或(3)記載的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)〕所示的表面活性劑。(5)機體樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)加入使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。(6)機體樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的分別定量方法，其特征在于在
a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著加入d)CH酶類和e)加入使d)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。(7)根據(jù)(5)或(6)記載的定量方法，其中使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(8)根據(jù)(7)記載的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳基醚。(9)根據(jù)(7)或(8)記載的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)〕所示的表面活性劑。(10)機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)加入使b)記載CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。(11)機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著加入d)CH酶類和e)使d)記載的CH酶類作用于全部脂蛋白的膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。(12)根據(jù)(5)～(11)任一項記載的定量方法，其中使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑，為使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑。(13)根據(jù)(12)記載的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑還含有不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑。(14)根據(jù)(12)或(13)記載的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環(huán)糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物、與2價金屬鹽構(gòu)成的試劑。(15)根據(jù)(6)或(11)記載的定量方法，第1次膽固醇反應(yīng)所用的CH酶類為化學(xué)修飾的酶，第2次膽固醇反應(yīng)所用的CH酶類為未經(jīng)化學(xué)修飾的酶。(16)根據(jù)(10)～(15)任一項記載的定量方法，使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑含有溶解脂蛋白的表面活性劑。(17)由CH酶類和使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑構(gòu)成的LDL膽固醇定量用試劑。(18)根據(jù)(17)記載的LDL膽固醇定量用試劑，其中使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(19)根據(jù)(18)記載的定量試劑，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基芳基醚。(20)根據(jù)(18)或(19)記載的LDL膽固醇定量用試劑，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)〕所示的表面活性劑。(21)分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑構(gòu)成，第1試劑為含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類的試劑，第2試劑為含有使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑的試劑。(22)根據(jù)(21)記載的試劑盒，使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。(23)根據(jù)(21)記載的試劑盒，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基芳基醚。(24)根據(jù)(21)或(22)記載的試劑盒，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)〕所示的表面活性劑。(25)分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑構(gòu)成，第1試劑為含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類的試劑，第2試劑為含有使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑的試劑。(26)根據(jù)(25)記載的試劑盒，其中使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑含有溶解脂蛋白的表面活性劑。(27)根據(jù)(21)～(26)任一項記載的試劑盒，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環(huán)糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物、與2價金屬鹽構(gòu)成的試劑。
下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
本發(fā)明涉及往含上述各種脂蛋白的機體樣品中加入使CH酶類只作用于LDL膽固醇的特定試劑(以下稱為試劑A)而定量LDL膽固醇的方法及其所用的試劑。
此外，本發(fā)明還涉及往含上述各種脂蛋白的機體樣品中加入使CH酶類只作用于HDL膽固醇的特定試劑(以下稱為試劑B)而定量HDL膽固醇，接著加入試劑A定量LDL膽固醇的分別定量方法及其所用的試劑盒。
此外，本發(fā)明還涉及往含上述各種脂蛋白的機體樣品中加入試劑B定量HDL膽固醇，接著加入使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑(以下稱為試劑C)而定量總膽固醇的分別定量方法及其所用的試劑盒。
適用于本發(fā)明的機體樣品沒有特殊的限定，具體地說可以使用血液自身或血漿、血清等血液成分。
本發(fā)明中定量膽固醇的反應(yīng)在水性介質(zhì)、特別是緩沖液中進(jìn)行。
作為緩沖液中所用的緩沖劑，例如有三(羥甲基)氨基甲烷、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑和Good緩沖劑等。作為Good緩沖劑，例如有N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(ADA)、N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-〔N,N-雙(2-羥乙基)氨基〕-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(以下稱為MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(以下稱為MOPS)、3-(N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸)(以下稱為PIPES)、哌嗪-N,N’-雙(2-羥基丙-3-磺酸)(POPSO)等。
緩沖液的pH為5～10，優(yōu)選6～9。緩沖劑的濃度為5～500mM，優(yōu)選20～200mM。
使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑A是不使CH酶類作用于HDL、VLDL和CM中的膽固醇的試劑。試劑A即使在使后述HDL以外脂蛋白凝聚的試劑存在下也能夠使CH酶類只作用于LDL膽固醇。
作為該試劑A，例如有至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的試劑。
作為聚氧乙烯衍生物，例如有聚氧乙烯烷基芳基醚和聚氧乙烯烷基醚等；作為該烷基，為碳數(shù)8以上、例如辛基、壬基等；作為該芳基，例如有苯基等。
作為具體的聚氧乙烯衍生物，例如有Nonion HS-210、Nonion HS-215、Nonion NS-208.5、Nonion HS-208(以上為日本油脂公司制造)、Emulgen L-40、Emulgen 911、Emulgen 810(以上花王公司制造)等市售品。聚氧乙烯衍生物的親水親油平衡值(以下稱為HLB)優(yōu)選9～20。
作為聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可以是聚氧乙烯和聚氧丙烯的無規(guī)共聚物、也可以是嵌段共聚物，例如通式(Ⅰ)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)〕所示的化合物。
作為通式(Ⅰ)所示的化合物，例如有Pluronic L-121、PluronicL-122、Pluronic L-101、Pluronic P-103、Pluronic F-108等市售品(均為旭電化公司制造)。此外，作為通式(Ⅰ)所示化合物中聚丙二醇基團的分子量，優(yōu)選2050以上，更優(yōu)選2750以上，特別優(yōu)選3250以上。聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的HLB優(yōu)選1～6。
聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的使用濃度沒有特殊的限定，優(yōu)選分別各自為0.001～10％，更優(yōu)選0.1～5％，特別優(yōu)選0.05～1％。
作為使CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑B，有使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑和HDL以外的脂蛋白的抗體等。
使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑，使用含有該脂蛋白的凝聚劑和/或2價金屬鹽的試劑。作為凝聚劑，有肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環(huán)糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物等；作為環(huán)糊精，有α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精等；作為寡糖，有甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖、甘露七糖等；作為鹽，有鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鎂鹽等。作為2價的金屬鹽，有鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鎳鹽等。
作為凝聚劑，使用0.02～10mM分子量5000～20000的肝素或其鹽、0.1～10mM分子量4000～8000的磷鎢酸或其鹽、0.01～5mM分子量10000～500000的硫酸右旋糖酐或其鹽、0.1～20mM分子量1000～10000的硫酸右旋糖酐或其鹽、0.3～100mM分子量4000～25000的聚乙二醇(PEG)、0.1～50mM分子量1000～3000的硫酸環(huán)糊精或其鹽、0.1～50mM分子量400～3000的硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物。優(yōu)選使用0.03～1mM分子量14000～16000的肝素或其鹽、0.1～3mM分子量5000～7000的磷鎢酸或其鹽、0.01～5mM分子量150000～250000的硫酸右旋糖酐或其鹽、0.1～10mM分子量1000～5000的硫酸右旋糖酐或其鹽、1.0～50mM分子量5000～22000的PEG、0.1～10mM分子量1000～2000的硫酸環(huán)糊精或其鹽、0.1～10mM分子量400～2000的硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物等。
作為2價金屬，有0.1～50mM的鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鎳鹽、鈷鹽等，優(yōu)選0.1～50mM的鎂鹽。
使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑優(yōu)選含有不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑。
作為不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑，有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基苯磺酸鹽等。其中，作為聚氧乙烯烷基醚，優(yōu)選聚氧乙烯醚〔Emulgen 220(花王公司制造)〕；作為聚氧乙烯烷基芳基醚，優(yōu)選市售品Emulgen B66等；作為聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物，優(yōu)選市售品Plurconic F88(旭電化公司制造)等；優(yōu)選聚氧乙烯烷基醚硫酸鈉〔作為市售品，有Emal 20C(花王公司制造)等〕；作為烷基苯磺酸鹽，優(yōu)選十二烷基苯磺酸鈉。
不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑，只要不使CH酶類不能作用于LDL膽固醇，可以組合使用，優(yōu)選單獨使用。所用濃度沒有特殊的限定，優(yōu)選0.01～10％，特別優(yōu)選0.1～5％。
HDL以外脂蛋白的抗體，有抗阿樸脂蛋白B抗體、抗阿樸脂蛋白C抗體、抗阿樸脂蛋白E抗體、抗β脂蛋白抗體等，單獨或組合使用。作為抗體，可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。此外這些抗體可以是用酶或化學(xué)分解、修飾的。
作為使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑C，例如有溶解全部脂蛋白的表面活性劑。
作為該表面活性劑，使用溶解HDL、LDL、VLDL和CM的脂蛋白的非離子性表面活性劑。具體地說，有作為市售品的Triton X-100等非離子表面活性劑、Emulgen 106、Emulgen 108、Emulgen 709等聚氧乙烯烷基醚等。這些表面活性劑可以單獨或組合使用。所用濃度沒有特殊的限定，優(yōu)選0.01～10％，特別優(yōu)選0.1～5％。
作為本發(fā)明所用的具有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶活性的酶，例如有具水解膽固醇酯能力的微生物或動物來源的膽固醇酯酶和脂蛋白脂肪酶、氧化膽固醇生成過氧化氫的微生物來源膽固醇氧化酶、微生物或動物來源的膽固醇脫氫酶等。
這些酶根據(jù)特異的基質(zhì)而使用。例如定量HDL膽固醇時優(yōu)選使用對該膽固醇特異的酶，定量LDL膽固醇時優(yōu)選使用對該膽固醇特異性的酶。為了進(jìn)一步賦予這些酶特異性、穩(wěn)定性，用聚乙二醇為主要成分的基團、水溶性寡糖殘基、磺丙基等對這些酶進(jìn)行化學(xué)修飾。此外，也可使用基因工程所得的酶。
作為用于修飾酶的試劑(化學(xué)修飾劑)，為聚乙二醇上結(jié)合有可結(jié)合氨基的基團的化合物，例如聚乙二醇上結(jié)合有能夠和N-羥基琥珀酰亞氨基等氨基結(jié)合的基團的サンブライド VFM4101〔日本油脂公司制造〕等、具有聚烷撐二醇結(jié)構(gòu)和酸酐結(jié)構(gòu)的サンブライド AKM系列、同類的ADM系列、同類的ACM系列〔皆為日本油脂公司制造化學(xué)工學(xué)論文集，第20卷，第3號，459頁，1994年〕、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物上結(jié)合有能結(jié)合氨基的化合物、聚乙二醇單甲基丙烯酰單甲基醚和馬來酸酐的共聚物等。此外，可以使用作為聚氨酯化學(xué)修飾劑的活化聚氨酯P4000(Beringer Mannhaim公司制造，酶修飾規(guī)程手冊)、作為右旋糖酐化學(xué)修飾劑的右旋糖酐T40、活化TCT(同)、1,3-丙烷サルトン等。應(yīng)用這些化學(xué)修飾劑，可以修飾酶、以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、具有聚丙二醇和聚乙二醇共聚物的基團、結(jié)構(gòu)中含糖的基團、磺丙基、聚氨酯基團等。
酶和上述化學(xué)修飾劑反應(yīng)的方法應(yīng)用《蛋白質(zhì)的雜交》、稻田佑二著、共立出版社(1987年)等記載的方法。例如使用サンブライド時，將酶溶解于pH8以上的HEPES緩沖液等緩沖液中，在0～50℃下加入0.01～500倍摩爾量的サンブライド，攪拌5～60分鐘。此反應(yīng)液可以保持原樣或根據(jù)需要以超過濾膜除去低分子物后使用。
本發(fā)明中膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶的用量在反應(yīng)液中分別優(yōu)選0.01～200U/毫升，更優(yōu)選0.1～100U/毫升。
在本發(fā)明中，HDL膽固醇定量時使用的CH酶類在LDL膽固醇或HDL以外的膽固醇或總膽固醇定量時也可以就這樣使用，也可以在LDL膽固醇或HDL以外的膽固醇或總膽固醇定量時加入新的相同或底物特異性不同的CH酶類。
HDL膽固醇定量時所用的CH酶類優(yōu)選使用化學(xué)修飾的酶，LDL或HDL以外的脂蛋白中膽固醇或總膽固醇定量時優(yōu)選使用沒有化學(xué)修飾的CH酶類。
在本發(fā)明的膽固醇反應(yīng)中，在對反應(yīng)特異性沒有影響的范圍內(nèi)為了活化CH酶類可以使用常用的表面活性劑或膽酸類；此外，為了溶解球蛋白等可以使用各種鹽類。
作為活化CH酶類的表面活性劑，例如陰離子表面活性劑在0～1％的范圍內(nèi)使用。作為膽酸，膽酸、去氧膽酸、?；悄懰帷ⅨZ去氧膽酸等在0～5％的范圍內(nèi)使用。作為陰離子表面活性劑，有1-戊磺酸鹽、1-己磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽等烷基磺酸鹽在0～5％的范圍內(nèi)使用。
作為鹽類，氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鋰、硫酸鋰、氯化銨、硫酸銨、硝酸鎂、硝酸鈣等在0～100mM的范圍內(nèi)使用。
膽固醇反應(yīng)用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進(jìn)行時，生成過氧化氫。生成的過氧化氫，例如可以在過氧化酶的存在下，用4-氨基安替比林和酚類、4-氨基安替比林和トリ ンダ-試劑或高敏感度的色素源進(jìn)行定量。
作為酚類，例如有苯酚、4-氯苯酚、間甲酚、3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作為トリンダ-試劑(同仁化學(xué)研究所第19版總目錄、1994年)，有N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基-間甲苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-間甲苯胺、N,N-二磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-間甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺等苯胺類或N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙?；叶返取?br> 作為高敏感度的色素源，有特公昭60-33479所示的10-(N-甲基氨基甲酰基)-3,7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、特公平4-27839所示的雙〔3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特開昭62-296所示的化合物等。
作為這些色素源的濃度，優(yōu)選0.01～10毫克/毫升。
膽固醇的反應(yīng)，在底物氧化型輔酶NAD(P)存在下，應(yīng)用膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)時，生成還原型輔酶NAD(P)H。 NAD(P)H可以在300～500nm、優(yōu)選330～400nm、特別優(yōu)選約340nm下通過測定反應(yīng)液的吸光度而定量。還有，NAD(P)H的定量可以通過加入黃遞酶、四唑鎓鹽使甲色素生色，然后對甲色素進(jìn)行比色。
定量LDL膽固醇的反應(yīng)在10～50℃下、優(yōu)選30～40℃下進(jìn)行，通常在37℃下、進(jìn)行1～30分鐘，優(yōu)選2～10分鐘。
分別定量時，定量HDL膽固醇的反應(yīng)(以下稱為第1反應(yīng))在10～50℃下、優(yōu)選30～40℃下進(jìn)行，通常在37℃下、進(jìn)行1～30分鐘，優(yōu)選2～10分鐘；定量LDL膽固醇或總膽固醇的反應(yīng)(以下稱為第2反應(yīng))在10～50℃下、優(yōu)選30～40℃下進(jìn)行，通常在37℃下、進(jìn)行1～30分鐘，優(yōu)選2～10分鐘。第2反應(yīng)的開始可以是第1反應(yīng)實質(zhì)上終止后、第1反應(yīng)進(jìn)行中或完成了HDL定量的任一個時期。第2反應(yīng)在添加了特異作用于LDL膽固醇的CH酶類的試劑A或作用于全部脂蛋白中膽固醇的CH酶類的試劑C和根據(jù)需要的CH酶類后開始。定量第2反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫或還原型輔酶〔NAD(P)H〕的試劑可以是第1反應(yīng)液中使用的，也可根據(jù)需要加入新的。
在本發(fā)明中，HDL膽固醇反應(yīng)后進(jìn)行LDL膽固醇的反應(yīng)，分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇時，如上述的LDL膽固醇反應(yīng)以添加試劑A引發(fā)；第1的HDL膽固醇反應(yīng)，在添加上述不溶解HDL以外凝聚脂蛋白的非離子表面活性劑、即聚氧乙烯衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的任一個引發(fā)時，第2的LDL膽固醇反應(yīng)，可以添加HDL膽固醇反應(yīng)中所用的表面活性劑及試劑A組成的表面活性劑引發(fā)。
各脂蛋白中膽固醇的濃度根據(jù)使用樣品時各反應(yīng)前后吸光度的差(ΔOD)和使用各種脂蛋白中膽固醇濃度已知的樣品時吸光度的差(ΔODstd)按下面的計算方法算出。
LDL膽固醇濃度可從ΔOD÷ΔODstd×(已知的LDL膽固醇濃度)求出。HDL膽固醇濃度例如可以從ΔOD÷ΔODstd×(已知的HDL膽固醇濃度)求出。還有，分別定量時，第1反應(yīng)和第2反應(yīng)生成的化合物相同、檢測方法相同時，總膽固醇濃度用第1反應(yīng)前和第2反應(yīng)后的吸光度差按ΔOD÷ΔODstd×(已知的總膽固醇濃度)算出。
作為本發(fā)明的LDL膽固醇定量試劑，為含有CH酶類、聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的試劑。該LDL定量試劑中可根據(jù)需要含有上述緩沖劑、凝聚HDL以外脂蛋白的試劑、定量膽固醇所用的表面活性劑、膽酸類、各種鹽類、過氧化酶等酶、4-氨基安替比林和トリンダ-試劑等色源等、NAD(P)等氧化型輔酶。
本發(fā)明的分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑的試劑盒構(gòu)成，例如第1試劑由含有HDL以外脂蛋白的凝聚劑和CH酶類的試劑構(gòu)成，第2試劑由含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的試劑構(gòu)成。
此外，本發(fā)明的分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑的試劑盒構(gòu)成，例如第1試劑由含有HDL以外脂蛋白的凝聚劑和CH酶類的試劑構(gòu)成，第2試劑由含有溶解全部脂蛋白(HDL、LDL、VLDL和CM)的非離子性表面活性劑的試劑構(gòu)成。
本發(fā)明試劑盒的第1試劑或第2試劑中，可根據(jù)需要含有上述緩沖劑、定量膽固醇所用的表面活性劑、膽酸類、各種鹽類、過氧化酶等酶、4-氨基安替比林和トリンダ-試劑等色源等、NAD(P)等氧化型輔酶。
第2試劑中，可根據(jù)需要使用和第1試劑相同或不同來源的CH酶類。第1試劑中使用的CH酶類優(yōu)選上述化學(xué)修飾的酶，第2試劑中使用的CH酶類優(yōu)選使用沒有化學(xué)修飾的酶。
圖2表示本發(fā)明方法(圖中以DB LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(L LDL-C方法，圖中以S LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度的相關(guān)性。
圖3表示本發(fā)明方法(圖中以DB-TC表示)所得的總膽固醇濃度和對照方法(Determiner LTC Ⅱ方法，圖中以L TC Ⅱ表示)所得的總膽固醇濃度的相關(guān)性。
圖4表示本發(fā)明方法(圖中以DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度和對照方法(LHDL-C方法，圖中以SHDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度的相關(guān)性。
圖5表示本發(fā)明方法(圖中以本法表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(圖中以對照方法表示)Friedewald的計算式所得的LDL膽固醇濃度的相關(guān)性。
發(fā)明實施的最佳形式實施例1(HDL膽固醇和LDL膽固醇的定量)試劑1(pH=7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM硫酸右旋糖酐(東京化成公司制造)0.23毫克/毫升硫酸鎂(關(guān)東化學(xué)公司制造) 1.5毫克/毫升HDAOS(同仁化學(xué)公司制造) 0.23毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.13毫克/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇酯酶(*1) 0.25U/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇氧化酶(*2)1.65U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 12.5U/毫升*1:50克膽固醇酯酶(天野制藥公司制造)溶于1升0.1M HEPES緩沖液(pH8.5)，在25℃下加入330克サンブライトVFM4101，攪拌2小時調(diào)制而成。
*2:50克膽固醇氧化酶(協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司制造)溶于1升0.1MHEPES緩沖液(pH8.0)，在15℃下加10克サンブライトVFM4101，攪拌2小時調(diào)制而成。試劑2(pH=7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶、東洋紡公司制造)3U/毫升膽固醇氧化酶(協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司制造) 2U/毫升Pluronic L-121(旭電化公司制造) 0.7％Emulgen L-40(花王公司制造) 0.5％氯化鈣(和光純藥公司制造)0.1毫克/毫升作為樣品，使用健康人血清樣30份，按下述操作定量樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇。往2.25毫升試劑1中加入30微升樣品，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E1。接著在37℃下反應(yīng)5分鐘后，測定相同吸收波長的吸光度E2。往其中再加入0.75毫升試劑2，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E3。接著在37℃下反應(yīng)5分鐘后測定相同吸收波長的吸光度E4。另一方面，膽固醇已知濃度的血清進(jìn)行相同的操作，求出各吸光度E1std、E2std、E3std和E4std。
HDL膽固醇濃度從上述吸光度根據(jù)式(E2-E1)÷(E2std-E1std)×(已知HDL膽固醇濃度)求出。同樣地，LDL膽固醇濃度也從上述吸光度根據(jù)式(E4-E3)÷(E4std-E3std)×(已知LDL膽固醇濃度)求出。
此外，使用其它各膽固醇的個別定量用市售試劑盒Determiner LHDL-C(協(xié)和梅迪克斯公司制造)和Determiner L LDL-C(協(xié)和梅迪克斯公司制造)，定量各樣品中HDL膽固醇濃度、LDL膽固醇濃度。計算該市售試劑盒所得定量值和本發(fā)明方法所得定量值的相關(guān)系數(shù)，HDL膽固醇為0.997,LDL膽固醇為0.988。


圖1表示本發(fā)明方法(圖1中以DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度和對照方法(L HDL-C方法，圖1中S HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度的相關(guān)性。此外，圖2表示本發(fā)明方法(圖2中以DB LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(L LDL-C方法，圖2中以S LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度的相關(guān)性。實施例2(HDL膽固醇和LDL膽固醇的定量)試劑1(pH=7)MES(Nakalai Tesque公司制造)20mM磷鎢酸(和光純藥公司制造) 7.5毫克/毫升硫酸鎂(和光純藥公司制造) 1.5毫克/毫升TOOS(同仁化學(xué)公司制造) 0.5毫克/毫升EmulgenB66(花王公司制造)10毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.5毫克/毫升膽固醇酯酶(LPBP、旭化成公司制造)4U/毫升膽固醇氧化酶(rCO、Oriental酵母公司制造) 2U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造)10U/毫升試劑2(pH=7)MES(Nakalai Tesque) 50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶、東洋紡公司制造)3U/毫升膽固醇氧化酶(協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司制造) 2U/毫升Pluronic L-121(旭電化公司制造) 0.7％Emulgen L-40(花王公司制造) 0.5％氯化鈣(和光純藥公司制造)0.1毫克/毫升使用實施例1相同的樣品，除測定波長為555nm外，其它同實施例1一樣進(jìn)行操作，定量HDL膽固醇和LDL膽固醇。計算市售試劑盒(上述Determiner L HDL-C和Determiner L LDL-C)所得定量值和本發(fā)明方法所得定量值的相關(guān)系數(shù)，HDL膽固醇為0.929,LDL膽固醇為0.911。實施例3(HDL膽固醇和總膽固醇的定量)試劑1(pH=7)MES(Nakalai Tesque) 20mM硫酸右旋糖酐(東京化成公司制造) 0.23毫克/毫升硫酸鎂(關(guān)東化學(xué)社制造) 1.5毫克/毫升HDAOS(同仁化學(xué)公司制造) 0.23毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.13毫克/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇酯酶(*1)0.25U/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇氧化酶(*1) 1.65U/毫升過氧化酶12.5U/毫升*1和實施例1的*1一樣調(diào)制*2和實施例1的*2一樣調(diào)制試劑2(pH=6.75)MES(Nakalai Tesque)30mMTriton X-100(Sigma公司制造)1克/升膽固醇酯酶(東洋紡公司制造) 2.4U/毫升膽固醇氧化酶(天野制藥公司制造) 6.25U/毫升作為樣品，準(zhǔn)備實施例1所用的健康人血清檢30份，按下述操作定量HDL膽固醇和LDL膽固醇。
往2.25毫升試劑1中加入樣30微升，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E1。接著在37℃下反應(yīng)5分鐘后，測定相同吸收波長的吸光度E2。往其中再加入0.75毫升試劑2，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E3。接著在37℃下反應(yīng)5分鐘后測定相同吸收波長的吸光度E4。另一方面，膽固醇已知濃度的血清進(jìn)行相同的操作，求出各吸光度E1std、E2std、E3std和E4std。
HDL膽固醇濃度從上述吸光度根據(jù)式(E2-E1)÷(E2std-E1std)×(已知HDL膽固醇濃度)求出。同樣地，總膽固醇濃度也從上述吸光度根據(jù)式(E4-E1)÷(E4std-Elstd)×(已知總膽固醇濃度)求出。
此外，使用其它各膽固醇的個別定量用市售試劑盒Determiner LHDL-C(協(xié)和梅迪克斯公司制造)和Determiner L TC Ⅱ(協(xié)和梅迪克斯公司制造)，定量各樣品中HDL膽固醇濃度、總膽固醇濃度。計算該市售試劑盒所得定量值和本發(fā)明方法所得定量值的相關(guān)系數(shù)，HDL膽固醇為0.992，總膽固醇為0.999。
圖3表示本發(fā)明方法(圖3中DB-TC表示)所得的總膽固醇濃度(毫克/dL)和對照方法(Determiner L TCⅡ方法，圖3中以LTC Ⅱ表示)所得的總膽固醇濃度(毫克/dL)的相關(guān)性。
圖4表示本發(fā)明方法(圖4中以DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度(毫克/dL)和對照方法(LHDL-C方法，圖4中S HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度(毫克/dL)的相關(guān)。
將300微升第1試劑和4微升各樣品混合，在37℃下保溫5分鐘。測定此時的吸光度，接著加入100微升第2試劑進(jìn)行反應(yīng)，測定5分鐘后的吸光度。使用日立7070自動分析裝置，主波長600nm，副波長700nm。
作為樣品，用LDL組分所得反應(yīng)前后的吸光度差為ALDL，用HDL組分所得反應(yīng)前后的吸光度差為AHDL，用VLDL組分所得反應(yīng)前后的吸光度差為AVLDL，用CM組分所得反應(yīng)前后的吸光度差為ACM。
結(jié)果如表1所示。結(jié)果表示為AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。這些值越小就越表示為對LDL特異的定量條件。表1
如表1所示，表面活性劑組合使用與表面活性劑單獨使用相比，膽固醇反應(yīng)變?yōu)長DL膽固醇特異性。
結(jié)果如表2所示。
表2
如表2所示，表面活性劑組合使用與表面活性劑單獨使用相比，膽固醇反應(yīng)變?yōu)長DL膽固醇特異性。
結(jié)果如表3所示。表3
如表3所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
結(jié)果如表4所示。表4
如表4所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
結(jié)果如表5所示。表5
如表5所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
結(jié)果如表6所示。表6
如表6所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
另一方面，用市售的試劑盒Determiner L TC(協(xié)和梅迪克斯公司制造)測定總膽固醇，用デタミナHDL-C(協(xié)和梅迪克斯公司制造)測定HDL膽固醇，用Determiner LTC(協(xié)和梅迪克斯公司制造)測定中性脂肪，從下述的Friedewald公式求出LDL膽固醇濃度。計算本發(fā)明方法所得LDL膽固醇濃度和Friedewald公式求出的LDL膽固醇濃度的相關(guān)系數(shù)，為0.9767。
Friedewald計算式(LDL膽固醇濃度)=(總膽固醇濃度)-(HDL膽固醇濃度)-(中性脂肪濃度)圖5表示本發(fā)明方法(圖5中以本法表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(圖5中以對照方法表示)所得的LDL膽固醇濃度的相關(guān)性。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了定量LDL膽固醇的方法和該方法所用的試劑盒。此外，本發(fā)明還提供了同一樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇或總膽固醇在同一系統(tǒng)內(nèi)連續(xù)分別定量的方法和該方法所用的試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種機體樣品中低密度脂蛋白--LDL--中的膽固醇--LDL膽固醇--的定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶--CH酶類--和c)使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行膽固醇的反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的定量方法，使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳香醚。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3記載的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)所示的表面活性劑HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)。
5.一種機體樣品中高密度脂蛋白--HDL--中膽固醇--HDL膽固醇--和LDL膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)加入使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。
6.一種機體樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著加入d)CH酶類和e)使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6記載的定量方法，其中使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳基醚。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8記載的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)所示的表面活性劑HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)。
10.一種機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)往全部脂蛋白的膽固醇中加入使b)記載的CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。
11.一種機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進(jìn)行第1次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著往d)CH酶類和e)使d)記載的CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑，進(jìn)行第2次膽固醇反應(yīng)，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求5～11任一項記載的定量方法，其中使CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑為使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12記載的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑還含有不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13記載的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環(huán)糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物、與2價金屬鹽構(gòu)成的試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求6或11記載的定量方法，第1次膽固醇反應(yīng)所用的CH酶類為經(jīng)化學(xué)修飾的酶，第2次膽固醇反應(yīng)所用的CH酶類為沒有經(jīng)化學(xué)修飾的酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求10～15任一項記載的定量方法，使CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑含有溶解脂蛋白的表面活性劑。
17.CH酶類和使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑構(gòu)成F的LDL膽固醇定量用試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17記載的LDL膽固醇定量用試劑，其中使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18記載的定量試劑，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基芳基醚。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19記載的LDL膽固醇定量用試劑，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)所示的表面活性劑，HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)。
21.分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑構(gòu)成，第1試劑為含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類的試劑，第2試劑為含有使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑的試劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21記載的試劑盒，使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21記載的試劑盒，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基芳基醚。
24.根據(jù)權(quán)利要求21或22記載的試劑盒，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(Ⅰ)所示的表面活性劑HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(Ⅰ)式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數(shù)。
25.分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑構(gòu)成，第1試劑為含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類的試劑，第2試劑為含有使CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑的試劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25記載的試劑盒，其中使CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑含有溶解脂蛋白的表面活性劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求21～26任一項記載的試劑盒，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環(huán)糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物、與2價金屬鹽構(gòu)成的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法及其所用的定量試劑。此外，本發(fā)明還提供了高密度脂蛋白中膽固醇和低密度脂蛋白中膽固醇的連續(xù)分別定量方法及其所用的試劑盒以及高密度脂蛋白中膽固醇和總膽固醇的連續(xù)分別定量方法及其所用的定量試劑盒。
文檔編號G01N33/92GK1318107SQ99810984
公開日2001年10月17日 申請日期1999年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月18日
發(fā)明者杉內(nèi)博幸 申請人:協(xié)和梅迪克斯株式會社