專利名稱：利用底物置換進(jìn)行酶活性篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種目的催化劑文庫，其中所述的催化劑由可交換的一對連接子，X和Y，偶聯(lián)至底物；本發(fā)明還涉及利用多次催化轉(zhuǎn)化過程在所述的文庫中分離活性更高的催化劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
在過去，已經(jīng)通過不同的方式創(chuàng)造出以新型生物多聚物(即DNA、RNA或多肽)為基礎(chǔ)的催化劑。下述段落對這些篩選方案中的一些進(jìn)行了描述。
(1)結(jié)合過渡態(tài)類似物通過該方法已經(jīng)分離出催化性RNA、DNA和蛋白(特別是抗體)。其主要用于通過用過渡態(tài)類似物(TSA)免疫小鼠進(jìn)行對催化性抗體的分離，并用TSA對展示于噬菌體以及RNA和DNA文庫上的抗體進(jìn)行篩查。其思路為結(jié)合一給定TSA的分子(蛋白、RNA或DNA)可能結(jié)合底物并穩(wěn)定過渡態(tài)的幾何結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。這可能產(chǎn)生催化作用。
該方法本身與其說是篩選催化活性，不如說是篩選對過渡態(tài)類似物(TSA)的結(jié)合。然而，該方法也包括在本文中，因?yàn)樗悄壳胺蛛x新型催化劑最常用的方法之一。該方法所面臨的問題包括ⅰ)需要對靶反應(yīng)有詳細(xì)的力學(xué)知識(為了設(shè)計(jì)一種適宜的TSA)；ⅱ)在很多情況下，充分模擬過渡態(tài)的TSA是無法獲得或不穩(wěn)定的；ⅲ)不可能模擬反應(yīng)坐標(biāo)的結(jié)構(gòu)和電子動(dòng)力學(xué)。
因此，通過該方法只成功地解決了相當(dāng)有限系列的反應(yīng)類型。在大多數(shù)情況下，分離的催化劑具有較差的轉(zhuǎn)化數(shù)。
(2)活性催化劑的功能標(biāo)記該篩選方案已經(jīng)用于蛋白和核酸。對底物進(jìn)行設(shè)計(jì)以便在反應(yīng)過程中形成一種反應(yīng)性產(chǎn)物(將底物稱為“自殺底物”或“抑制物類似物”)。反應(yīng)性產(chǎn)物可能與產(chǎn)生它的催化劑進(jìn)行反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。結(jié)果，通過所附的標(biāo)記物可以將有活性的催化劑與無活性的催化劑分離。通過該方法已經(jīng)分離了在噬菌體上展示的催化性抗體，而且在一模型系統(tǒng)中顯示，利用該方法可以將有催化活性和無活性的蛋白分離。該方法使得可以進(jìn)行罕見催化劑的分離。
該方法的重要局限性包括ⅰ)對很多反應(yīng)設(shè)計(jì)一種適宜的自殺底物是不可能的。ⅱ)成功的催化劑在篩選過程/周期中僅僅需要進(jìn)行一次循環(huán)，其通常大約為數(shù)分鐘。因此，對于有效的催化劑沒有篩選優(yōu)勢。
(3)連續(xù)進(jìn)化(RNA)設(shè)計(jì)在同一分子中含有底物和潛在催化性結(jié)構(gòu)域的RNA文庫。能夠進(jìn)行預(yù)期反應(yīng)(通常為連接反應(yīng))的RNA將“激活”它們本身進(jìn)行擴(kuò)增(反轉(zhuǎn)錄隨后進(jìn)行RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄)。經(jīng)過充分的稀釋和添加核苷酸前體，可以將這種連續(xù)篩選維持?jǐn)?shù)小時(shí)，然后進(jìn)行分析。
該方法具有2個(gè)重要的局限性ⅰ)底物和催化劑都必須為核酸；ⅱ)由于所催化的反應(yīng)和成功酶的擴(kuò)增并未分離，所以篩選步驟的時(shí)間是靶反應(yīng)的循環(huán)時(shí)間和“激活”分子的擴(kuò)增時(shí)間的總和。因此，由于擴(kuò)增大約為數(shù)秒鐘，對于有效的催化劑無篩選優(yōu)勢。
(4)底物-酶-連接的篩選(SELS)最近，已經(jīng)對此類方法進(jìn)行了描述，其涉及將靶反應(yīng)的底物附于對所附底物具有潛在催化活性的蛋白上(Pedersen等，美國國家科學(xué)院院刊，1998,95卷，10523-10528頁；Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.,38卷，1124-1127頁；Demartis等，1999,JMB,286卷，617-633頁；Neri等，1997,WO 97/40141)。經(jīng)過底物的分子內(nèi)轉(zhuǎn)換后，利用所附的產(chǎn)物可以對有活性的催化劑進(jìn)行分離。
該方案很常用。然而，由于成功的催化劑在篩選過程/周期中只需要進(jìn)行一次循環(huán)，該過程通常大約為數(shù)分鐘，因此對于有效的催化劑沒有篩選優(yōu)勢。由于相同的原因，推測用該篩選方案不可能區(qū)分具有細(xì)微不同特異性活性的酶。
發(fā)明簡述通過本發(fā)明所要解決的問題是提供一種方法，其用于從催化劑分子文庫中體外篩選與該文庫內(nèi)其余催化劑分子相比具有相對更有效的特異性目的催化活性的目的催化劑分子，而且本文中所述的體外篩選方法以其令目的催化劑分子在最終收集前可以進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化(即底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化)為特征。
解決方案是基于在所述的體外篩選方法中利用包括許多獨(dú)立單元的新型樣品。
緊接著下面給出了對所述新型樣品特征的總結(jié)。
所述的新型樣品包括以獨(dú)立單元形式提供的催化劑分子的文庫，其中獨(dú)立單元包括具有下述一般結(jié)構(gòu)的第一種類型的獨(dú)立單元C-XY-S，其中C指催化劑分子，XY指XY交換對，而S指能夠由在所述催化劑分子的文庫中所含的至少一種催化劑分子催化成產(chǎn)物的底物，由此提供了獲得第二種類型獨(dú)立單元的可能性，所述的第二種類型的獨(dú)立單元包括如下一般結(jié)構(gòu)C-XY-P，其中C和XY具有上面所定義的意義，而P為由第一種類型獨(dú)立單元中底物S的催化性轉(zhuǎn)換所產(chǎn)生的產(chǎn)物分子。對此種獨(dú)立單元適當(dāng)實(shí)例的圖解說明見

圖1。
然后，所述的新型樣品以其包括下述功能上定義的特點(diǎn)為特征。
特點(diǎn)1將底物S附于催化劑上，在結(jié)構(gòu)上使得在所述獨(dú)立單元內(nèi)催化劑和底物間能夠進(jìn)行催化反應(yīng)；而且所述的底物和催化劑結(jié)合的性質(zhì)提供了借助于產(chǎn)物的一個(gè)特征分離一種實(shí)體的可能性，所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑分子能夠催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)。
例證參見圖1，其顯示了包括上述特點(diǎn)1的這樣一種獨(dú)立單元的適當(dāng)實(shí)例。
特點(diǎn)2所述的包括許多獨(dú)立單元而且包括上述特點(diǎn)1的樣品進(jìn)一步以所述的XY交換對使得Y部分可以與另一個(gè)Y部分進(jìn)行不對稱交換(即Y與Y交換，而不是與X交換)為特征；借此，然后所述的XY交換對使得在單元結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-產(chǎn)物和“Y-底物”成分之間可以進(jìn)行交換反應(yīng)，而且由此產(chǎn)生單元結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物。
例證參見圖2，其顯示了包括上述特點(diǎn)2的這樣一種獨(dú)立單元的適當(dāng)實(shí)例。
然后，在如本文所述的體外篩選方法(見下頁)中，利用此類新型樣品為基本上只根據(jù)目的催化劑分子所產(chǎn)生的產(chǎn)物分子的特征來對目的催化劑分子進(jìn)行篩選提供了可能(特點(diǎn)1使之可以進(jìn)行；例證見圖1)；而且，其進(jìn)一步為篩選與該文庫內(nèi)其他催化劑分子相比具有相對更加有效的特異性目的催化活性的目的催化劑分子提供了可能，其中所述的篩選以對所述的目的催化劑分子在使其能夠進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化(即，底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化)后首先進(jìn)行最終收集為特征(特點(diǎn)2使之可以進(jìn)行；例證見圖2)。
相應(yīng)地，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及包括許多適于在體外篩選系統(tǒng)中使用的獨(dú)立單元的樣品，其中所述的體外篩選系統(tǒng)的目的是從催化劑分子的文庫中篩選與該文庫內(nèi)其他催化劑分子相比具有相對更有效的特異性目的催化活性的目的催化劑分子，而且其中所述的體外篩選系統(tǒng)以其使得目的催化劑分子在最終收集前可以進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化(即，底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化)為特征，同時(shí)，其中所述的樣品包括(ⅰ)以獨(dú)立單元形式提供的催化劑分子的文庫，其中獨(dú)立單元包括具有下述一般結(jié)構(gòu)的第一種類型的獨(dú)立單元C-XY-S，其中C指催化劑分子，XY指XY交換對，而S指能夠由在所述催化劑分子的文庫中所含的至少一種催化劑分子催化成產(chǎn)物的底物，由此提供了獲得第二種類型獨(dú)立單元的可能性，所述的第二種類型的獨(dú)立單元包括如下一般結(jié)構(gòu)C-XY-P，其中C和XY具有上面所定義的意義，而P為由第一種類型獨(dú)立單元中底物S的催化性轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的產(chǎn)物分子；而且(a)將底物S附于催化劑上，在結(jié)構(gòu)上使得在所述獨(dú)立單元內(nèi)催化劑和底物間能夠進(jìn)行催化反應(yīng)；并且(b)所述的底物和催化劑結(jié)合的性質(zhì)提供了借助于產(chǎn)物的一個(gè)特征分離一種實(shí)體的可能性，所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑分子能夠催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)；而且(c)所述的包括許多獨(dú)立單元的樣品進(jìn)一步以所述的XY交換對允許Y部分與另一個(gè)Y部分進(jìn)行不對稱交換(即Y與Y交換，而不是與X交換)為特征；借此，然后所述的XY交換對使得在單元結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-產(chǎn)物和“Y-底物”成分之間可以進(jìn)行交換反應(yīng)，而且由此產(chǎn)生單元結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物。
在根據(jù)上述第一個(gè)方面的樣品中所包括的術(shù)語“一個(gè)獨(dú)立單元”指包括本發(fā)明的第一個(gè)方面中(ⅰ)所規(guī)定的一般結(jié)構(gòu)；本發(fā)明的第一個(gè)方面中(a)和(b)所規(guī)定的附于催化劑分子的底物分子；以及本發(fā)明的第一個(gè)方面中(c)所規(guī)定的XY交換對的一個(gè)獨(dú)立單元。對于此類獨(dú)立單元的適當(dāng)實(shí)例見圖1和2。
術(shù)語“包括一般結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物或催化劑-XY交換對-產(chǎn)物的獨(dú)立單元結(jié)構(gòu)”指該獨(dú)立單元包括所述的每個(gè)實(shí)體的至少一個(gè)分子，即，至少一種催化劑分子、至少一種XY交換對分子以及至少一種底物分子或至少一種產(chǎn)物分子。從而，所述的獨(dú)立單元例如可能包括一個(gè)拷貝以上的相同催化劑分子或可能包括數(shù)種不同的催化劑分子。
此外，在所述的獨(dú)立單元內(nèi)置于單個(gè)實(shí)體之間的術(shù)語“-”指在所述的獨(dú)立單元內(nèi)所述的單個(gè)實(shí)體之間存在一種物理連接，即在催化劑-XY交換對-底物或催化劑-XY交換對-產(chǎn)物之間存在物理連接。
另外，本文中所述的“一種獨(dú)立單元”指一種獨(dú)立單元，其中為了能夠分離獨(dú)立的獨(dú)立單元在所述的樣品中能夠?qū)⑺龅莫?dú)立單元與其他不同的獨(dú)立單元進(jìn)行物理分離。
術(shù)語“不同的獨(dú)立單元”指每個(gè)均獨(dú)立包括不同的催化劑分子的不同的獨(dú)立單元，即，兩個(gè)不同的獨(dú)立單元的實(shí)例可以是(1)催化劑分子1-XY交換對-底物；以及(2)催化劑分子2-XY交換對-底物；其中催化劑分子1和催化劑分子2指兩種不同的催化劑分子。
術(shù)語“一種包括許多不同獨(dú)立單元的樣品”指包括至少兩種不同獨(dú)立單元的一種樣品，優(yōu)選至少100種不同的獨(dú)立單元，更優(yōu)選至少10,000種不同的獨(dú)立單元，更優(yōu)選至少106種不同的獨(dú)立單元，更優(yōu)選至少108種不同的獨(dú)立單元，更優(yōu)選至少1010種不同的獨(dú)立單元，甚至更優(yōu)選至少1012種不同的獨(dú)立單元，而且最優(yōu)選至少1014種不同的獨(dú)立單元。不同獨(dú)立單元的實(shí)際數(shù)量基本上與催化劑分子文庫的實(shí)際大小相對應(yīng)。
術(shù)語“包括許多獨(dú)立單元的樣品”和術(shù)語“包括許多不同獨(dú)立單元的樣品”在本文中可以交換使用。
術(shù)語“催化劑分子文庫”指一種文庫，其包括至少兩種不同的催化劑分子，優(yōu)選至少100種不同的催化劑分子，更優(yōu)選至少10,000種不同的催化劑分子，更優(yōu)選至少106種不同的催化劑分子，更優(yōu)選至少108種不同的催化劑分子，更優(yōu)選至少1010種不同的催化劑分子，甚至更優(yōu)選至少1012種不同的催化劑分子，而且最優(yōu)選至少1014種不同的催化劑分子。
術(shù)語“一種能夠由所述的催化劑分子文庫中所包括的至少一種催化劑分子催化成產(chǎn)物分子的底物”基本上指任何適當(dāng)?shù)牡孜锓肿?。基本上根?jù)預(yù)期要篩選的特異性催化活性對所述的底物分子進(jìn)行選擇。例如，如果預(yù)期的催化活性為一種蛋白酶活性，那么適宜的底物應(yīng)該為一種肽分子，產(chǎn)物將為降解的肽。術(shù)語“底物”和“底物分子”可以交換使用。
術(shù)語“產(chǎn)物”指通過由如本文所確定的目的催化劑分子催化底物到產(chǎn)物的反應(yīng)而獲得的產(chǎn)物。術(shù)語“產(chǎn)物”和“產(chǎn)物分子”可以交換使用。
術(shù)語“催化劑”指任何具有目的催化活性的催化劑分子，例如有機(jī)和無機(jī)的分子、蛋白質(zhì)、酶、肽、核酸、生物多聚物以及非生物學(xué)多聚物、小的有機(jī)或無機(jī)分子。術(shù)語“催化劑”和“催化劑分子”可以交換使用。
術(shù)語“將底物附于催化劑上，在結(jié)構(gòu)上使得在所述獨(dú)立單元內(nèi)催化劑和底物間能夠進(jìn)行催化反應(yīng)”指在每個(gè)獨(dú)立單元內(nèi)底物和催化劑之間的直接或間接物理連接。這種連接應(yīng)該優(yōu)選使在獨(dú)立單元內(nèi)催化劑和底物之間的生產(chǎn)性相互作用最大化，而使不同獨(dú)立單元上的催化劑和底物間的相互作用最小化。
根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的(b)，術(shù)語“所述的底物和催化劑結(jié)合的性質(zhì)提供了借助于產(chǎn)物的一個(gè)特征分離一種實(shí)體的可能性，所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑能夠多次催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)”指利用產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)特征對所述的實(shí)體進(jìn)行分離。
產(chǎn)物適當(dāng)特征的實(shí)例可以是所述的產(chǎn)物不與基質(zhì)結(jié)合而底物結(jié)合于基質(zhì)。在這種情況下，適當(dāng)?shù)暮Y選方法可以是將獨(dú)立單元以催化劑-XY交換對-底物-基質(zhì)的形式結(jié)合于固相支持物，當(dāng)為催化劑-XY交換對-產(chǎn)物的形式時(shí)將其釋放。對這種系統(tǒng)的實(shí)例的具體描述，參考本文的工作實(shí)施例(見下)。
產(chǎn)物適當(dāng)特征的另一個(gè)實(shí)例可以是如在圖1中所示，所述的產(chǎn)物結(jié)合于一種受體。
根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的(b)，術(shù)語“所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑能夠多次催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)”指一種實(shí)體，或者其中催化劑分子本身中載有所述的信息，或者其包括為明確鑒定催化劑提供可能的其他種類的信息。例如當(dāng)目的催化劑分子為一種肽或多肽時(shí)，這些其他種類的信息可以是包括一段編碼所述的肽或多肽的DNA序列的實(shí)體。舉例如當(dāng)分離的實(shí)體為包括編碼一種目的多肽的DNA序列的絲狀噬菌體時(shí)。見圖12及下述。
如上面所定義的，在一獨(dú)立單元內(nèi)所包括的術(shù)語“XY交換對”指將催化劑通過XY交換部分結(jié)合于底物，即獨(dú)立單元具有下面的一般結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物，而所述的XY交換對滿足根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的(c)的標(biāo)準(zhǔn)。
優(yōu)選XY部分在缺少游離的Y時(shí)穩(wěn)定，但允許游離Y與結(jié)合于X的Y進(jìn)行快速而特異的交換(而并非游離Y與X的交換)。如果獨(dú)立單元催化劑-XY交換對-產(chǎn)物與Y-底物化合物相接觸，這種交換反應(yīng)能夠以底物置換產(chǎn)物。
例如，XY交換對可以具有下述特征ⅰ)X和Y可以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合；以及ⅱ)XY交換對可以由任何種類的分子組成，包括小的有機(jī)(例如，EDTA)和無機(jī)(例如，金屬、磷酸鹽)分子，以及大分子(例如，核酸、肽)。
進(jìn)一步的具體描述見下面，圖示說明見圖2、3和4。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于從催化劑文庫中體外篩選與該文庫內(nèi)其余催化劑分子相比具有相對更有效的特異性目的催化活性的目的催化劑分子的方法，其中所述的體外篩選方法以其令目的催化劑分子在最終收集前可以進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化(即底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化)為特征，而且其中所述的方法包括下述步驟，(ⅰ)將根據(jù)本發(fā)明包括許多獨(dú)立單元的樣品置于目的催化劑分子發(fā)揮其目的催化活性的適當(dāng)?shù)臈l件下，繼而將樣品置于令所述的獨(dú)立單元與一種Y-底物化合物相接觸的條件下。
(ⅱ)通過對一個(gè)或多個(gè)包括產(chǎn)物分子的獨(dú)立單元進(jìn)行篩選來對目的催化劑進(jìn)行篩選；并且(ⅲ)借助于產(chǎn)物的一個(gè)特征，對一種實(shí)體進(jìn)行分離，所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑能夠多次催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)；還可任選(ⅳ)通過利用在步驟(ⅲ)所述實(shí)體中所包括的信息產(chǎn)生目的催化劑分子并構(gòu)建包括所產(chǎn)生的目的催化劑分子的一個(gè)獨(dú)立單元，然后通過利用該獨(dú)立單元作為啟始材料，將步驟(ⅰ)至(ⅲ)重復(fù)一次或多次。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的步驟(ⅰ)，術(shù)語“在目的催化劑分子發(fā)揮其目的催化活性的適當(dāng)條件下”指目的催化劑分子發(fā)揮其目的催化活性的任何適當(dāng)?shù)臈l件。
如果篩選的目的是鑒定在堿性pH下有活性的目的催化劑分子，那么這種適當(dāng)?shù)臈l件應(yīng)該是堿性pH。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的步驟(ⅰ)，術(shù)語“將所述的獨(dú)立單元與一種Y-底物化合物相接觸”指獨(dú)立單元和Y-底物化合物適當(dāng)?shù)乜拷员憧赡馨l(fā)生在本發(fā)明第一個(gè)方面的(c)所定義的交換反應(yīng)。所述的接觸例如可以在緩沖液中，其中獨(dú)立單元和Y-底物化合物可以擴(kuò)散到一起并由此而彼此相互接觸。圖示見圖2。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的步驟(ⅲ)，術(shù)語“能夠催化多次底物到產(chǎn)物反應(yīng)的目的催化劑分子”指所述的目的催化劑分子進(jìn)行底物到產(chǎn)物的催化反應(yīng)至少2次，更優(yōu)選至少100次，更優(yōu)選至少10,000次，甚至更優(yōu)選至少106次，而且最優(yōu)選至少1010次。
術(shù)語“包括允許對目的催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息的實(shí)體”指一種實(shí)體，或者其中催化劑分子本身中載有所述的信息，或者其包括為明確鑒定催化劑提供可能的其他種類的信息。例如當(dāng)目的催化劑分子為一種肽或多肽時(shí)，這些其他種類的信息可以是包括一段DNA序列的實(shí)體。該定義與上述對與本發(fā)明第一個(gè)方面的(b)相關(guān)的相同術(shù)語相同(見上)。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的(ⅳ)，術(shù)語“通過利用在步驟(ⅲ)所述實(shí)體中所包括的信息來產(chǎn)生目的催化劑分子并構(gòu)建包括所產(chǎn)生的目的催化劑分子的一個(gè)獨(dú)立單元，然后通過利用該獨(dú)立單元作為啟始材料，將步驟(ⅰ)至(ⅲ)重復(fù)一次或多次”指所述的重復(fù)可以為一次，更優(yōu)選2次，更優(yōu)選5次以上，甚至更優(yōu)選10次以上，而且最優(yōu)選25次以上。
上述用于體外篩選的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其使得催化劑分子在一輪篩選過程中可以進(jìn)行多次底物到產(chǎn)物的循環(huán)(即在最終收集目的催化劑分子之前)。
這從根本上與本領(lǐng)域中前面所描述的篩選方法不同，前述方法也包括結(jié)合靶反應(yīng)的過渡態(tài)類似物，其中不存在底物的循環(huán)(見上面“背景”中的#1)，或者底物的單次轉(zhuǎn)化(上面“背景”中的#2和3)。
這可以提供2個(gè)優(yōu)點(diǎn)，這可以通過按照可能的篩選方案利用本發(fā)明的方法來說明a)根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的方法中的(ⅰ)，將包括許多獨(dú)立單元的樣品置于目的催化劑分子發(fā)揮其目的催化活性的適當(dāng)?shù)臈l件下，繼而將樣品置于所述的獨(dú)立單元與一種Y-底物分子在產(chǎn)物結(jié)合柱的一端(啟始端)相接觸的條件下，在所述的產(chǎn)物結(jié)合柱中，特異性結(jié)合產(chǎn)物的受體偶聯(lián)至產(chǎn)物結(jié)合柱的基質(zhì)上，而且在產(chǎn)物柱緩沖液中含有適量的Y-底物；b)根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的方法中的(ⅱ)，通過收集最后到達(dá)產(chǎn)物柱另一端(收集端)的獨(dú)立單元對一個(gè)或多個(gè)包括產(chǎn)物分子的獨(dú)立單元進(jìn)行篩選來對目的催化劑分子進(jìn)行篩選。
在該篩選方案中，下述作用發(fā)生在產(chǎn)物柱內(nèi)1)包括一個(gè)潛在目的催化劑分子的獨(dú)立單元將所附的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物；2)所述的獨(dú)立單元現(xiàn)在包括產(chǎn)物，其擴(kuò)散并與靠近產(chǎn)物柱啟始端放置的受體結(jié)合；3)產(chǎn)物柱緩沖液內(nèi)的Y-底物分子介導(dǎo)催化劑分子-XY交換對-產(chǎn)物和Y-底物分子間的交換反應(yīng)，而且由此產(chǎn)生單元結(jié)構(gòu)催化劑分子-XY交換對-底物，然后由此介導(dǎo)將上面步驟(2)中所述的被結(jié)合的獨(dú)立單元釋放；4)上面步驟(3)中所述的釋放的獨(dú)立單元目前含有一種底物和一種潛在的目的催化劑分子，其已經(jīng)進(jìn)行了一次底物到產(chǎn)物的催化轉(zhuǎn)換，而且目前被再生成(1)中獨(dú)立單元的原始形式。于是，所述的單元因此可以再次進(jìn)行反應(yīng)(1)；結(jié)合相對更靠近產(chǎn)物柱收集端的受體等。
具有最有效特異性目的催化活性的目的催化劑分子在一給定的時(shí)間間隔內(nèi)將進(jìn)行最多的底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換，由此將在固定于產(chǎn)物結(jié)合受體上花更多的時(shí)間。因此，包括所述最有效的催化劑分子的獨(dú)立單元將最后到達(dá)所述產(chǎn)物柱的收集端。
利用本發(fā)明第二個(gè)方面方法中的這個(gè)實(shí)例，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)可以是ⅰ)可能的“可篩選”催化活性可以比現(xiàn)有技術(shù)的篩選方法高得多。篩選步驟包括進(jìn)行靶反應(yīng)，擴(kuò)散并將產(chǎn)物結(jié)合至產(chǎn)物結(jié)合柱上，最后通過XY-交換反應(yīng)將產(chǎn)物和底物交換。由于擴(kuò)散通常是一個(gè)快速的過程，所以簡單地通過柱上的產(chǎn)物結(jié)合受體的數(shù)量或者在產(chǎn)物柱緩沖液總Y-S成分的數(shù)量可以控制篩選的嚴(yán)謹(jǐn)度；此外，如果例如將電泳用作分離更有活性催化劑的方式，那么向受體的擴(kuò)散可能不是一個(gè)限制性因素，因此該系統(tǒng)的篩選嚴(yán)謹(jǐn)度甚至可能更高。
ⅱ)可以區(qū)分活性上的微小差別；由于在催化劑流過柱子時(shí)篩選步驟被重復(fù)很多次，所以即使在催化劑活性上的微小差別將導(dǎo)致在柱子上的不同滯留時(shí)間，以及因此而不同的富集。
本發(fā)明的最后一個(gè)方面涉及一種用于生產(chǎn)目的催化劑分子的方法，其包括進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明用于體外篩選的方法并進(jìn)而進(jìn)行下列步驟，(a)通過適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ㄒ赃m當(dāng)?shù)南Ｍ恐苽渌龇蛛x的目的催化劑分子。
附圖簡述圖1對第一種類型獨(dú)立單元適當(dāng)實(shí)例的圖示說明，所述的獨(dú)立單元具有下述一般結(jié)構(gòu)C-XY-S，其中C指催化劑分子，XY指XY交換對，而S指底物。將底物S附于催化劑上，在結(jié)構(gòu)上使得在所述獨(dú)立單元內(nèi)催化劑和底物間能夠進(jìn)行催化反應(yīng)。催化反應(yīng)導(dǎo)致形成第二種類型的獨(dú)立單元C-XY-P，其中C指催化劑分子，XY指XY交換對，而P指產(chǎn)物分子。所述的底物和催化劑結(jié)合的性質(zhì)提供了借助于產(chǎn)物的一個(gè)特征(例如對一種基質(zhì)的結(jié)合親和力)分離一種實(shí)體(例如催化劑本身或?qū)⑵湔故镜囊环N噬菌體)的可能性，所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑能夠催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)。
圖2對第一種類型獨(dú)立單元的圖示說明，其中XY交換對允許Y部分與另一個(gè)Y部分進(jìn)行不對稱交換(即Y與Y交換，而不是與X交換)。在靶反應(yīng)(圖1)發(fā)生后，所述的XY交換對允許在第二種類型單元結(jié)構(gòu)C-XY-P與未結(jié)合的Y-S成分間進(jìn)行交換反應(yīng)，由此產(chǎn)生新的第一種類型單元結(jié)構(gòu)C-XY-S和未結(jié)合的Y-P成分，此后，該單元的催化劑還可以在新結(jié)合的底物上進(jìn)行另一個(gè)催化反應(yīng)。
結(jié)合產(chǎn)物P的基質(zhì)可以有效地保持對Y-P成分以及C-XY-P類型獨(dú)立單元的結(jié)合，直至發(fā)生如就在上面所述的交換反應(yīng)，所述的交換反應(yīng)以一種新產(chǎn)生的第一種類型單元C-XY-S的形式從基質(zhì)中有效地釋放催化劑而留下Y-P成分與基質(zhì)結(jié)合。
圖3對根據(jù)本發(fā)明的獨(dú)立單元的適當(dāng)XY交換對的圖示說明。催化反應(yīng)促進(jìn)X和Y的解離(例如，X為一條DNA鏈，Y為一種互補(bǔ)DNA/RNA/DNA雜交體或者一種DNA/RNA/基質(zhì)雜交體，C為一種RNA酶)。
其他實(shí)例有在X和Y之間的非共價(jià)鍵(His4-Fe-IDA和NTA-Fe-IDA)，以及在X和Y之間的共價(jià)鍵(二硫鍵)。注意，對稱交換單元(XX)與二硫鍵相似，可以用作交換單元。
圖4對一種獨(dú)立單元的圖示說明，其中XY交換單元為另一種酶-底物對。
圖5對在下面實(shí)施例2中所述的Y-底物分子的圖示說明。
圖6對在下面實(shí)施例4中所述的篩選方案的圖示說明。對催化羥醛形成的酶的優(yōu)化。
圖7-8對按照本發(fā)明第二個(gè)方面的體外篩選方法進(jìn)行的適當(dāng)篩選方案的圖示說明。
圖9-11圖示證明在本文實(shí)施例1(見下頁)中的描述。
圖9．堿基-連接子-底物偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)和合成。
圖10．底物與噬菌體上pⅢ蛋白的共價(jià)結(jié)合。(a)將編碼酸性肽序列和C-末端半胱氨酸的DNA融合于基因pⅢ的N-末端形成酸性輔助噬菌體。噬菌粒編碼與pⅢ蛋白融合的蛋白文庫；(b)噬菌體的制備產(chǎn)生展示噬菌粒編碼蛋白的噬菌體顆粒；pⅢ蛋白具有酸性肽延伸部分；(c)酸性和堿性肽之間螺旋-螺旋的形成將底物非共價(jià)結(jié)合至噬菌體pⅢ蛋白；(d)去除還原劑導(dǎo)致酸性和堿性肽通過它們C末端的半胱氨酸交聯(lián)；(e)在本研究中，將展示葡萄球菌核酸酶的噬菌體通過5’-生物素化的單鏈寡聚脫氧核苷酸結(jié)合于鏈親和素磁珠上。通過在一種分子內(nèi)反應(yīng)中裂解寡聚脫氧核苷酸將展示活性酶的噬菌體釋放。
圖11噬菌體的固定以及從固相支持物上的裂解。將非堿基-連接子、堿基-連接子-pTp或者堿基連接子-寡聚脫氧核苷酸偶聯(lián)物交聯(lián)于(a)噬菌體展示的SNase或者(b)對照蛋白Fab 39-A11。1-4列顯示在鏈親和素磁珠上的固定。通過直接對磁珠進(jìn)行噬菌體滴度測定(1-3列)或在用DNA酶Ⅰ對磁珠處理后進(jìn)行滴度測定(4列)對固定進(jìn)行檢測；5-7列顯示滲漏(在缺少Ca2+的情況下釋放)；8-10列顯示Ca2+誘導(dǎo)的釋放(裂解)?；厥章曙@示于各列上面的括號中。
圖12圖示證明在本文實(shí)施例5(見下)中的描述。
圖13圖示證明在本文實(shí)施例6(見下)中的描述。
圖14圖示證明在本文實(shí)施例7(見下)中的描述。對產(chǎn)生更有活性蛋白酶的細(xì)胞的富集。
圖15圖示證明在本文實(shí)施例8(見下)中的描述。對錘頭型核酶的分離。
圖16數(shù)據(jù)證明本文實(shí)施例10(見下)。在低活性變體的背景中對野生型脂酶的富集。
圖17圖示證明在本文實(shí)施例10(見下)中的描述。Y-底物-生物素偶聯(lián)物的合成。
圖18數(shù)據(jù)證明在本文實(shí)施例11(見下)中的描述。在低活性纖維素酶變體的背景中對野生型纖維素酶C6B的富集。
圖19圖示證明在本文實(shí)施例11(見下)中的描述。在噬菌體展示的纖維素酶情況下再加載底物的原則。
圖20圖示證明在本文實(shí)施例12(見下)中的描述。在低活性RNA酶A變體的背景中對野生型RNA酶A的富集。
圖21數(shù)據(jù)證明在本文實(shí)施例14(見下)中的描述。通過熒光偏振光譜法進(jìn)行交換率的測定。
本發(fā)明實(shí)施方案如下述，僅為舉例。
發(fā)明詳述
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面包括許多不同獨(dú)立單元的樣品XY交換對如上所述，在一個(gè)獨(dú)立單元內(nèi)，催化劑與底物通過一個(gè)XY交換對物理相連。因此，獨(dú)立單元具有催化劑-XY交換對-底物的-般結(jié)構(gòu)。
此外，如上所述，在上面定義的獨(dú)立單元內(nèi)所包括的“XY交換對”指將催化劑通過XY交換部分附于底物，即獨(dú)立單元具有下述一般結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物而且所述的XY交換對滿足根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的(c)的標(biāo)準(zhǔn)。
另外，在缺乏另外的Y-底物成分時(shí)催化劑-XY交換對-底物單元仍保持連接這個(gè)意義上，優(yōu)選所述的交換對是穩(wěn)定的，這意味著在測試條件下X部分在任何給定的時(shí)間都應(yīng)該載有底物。如果Y-底物成分顯著高于在所選條件下XY相互作用的解離常數(shù)Kd，這可能是事實(shí)。在大多數(shù)情況下，最大的Y-底物濃度為大約1mM或更少。因此，解離常數(shù)Kd應(yīng)該優(yōu)選小于10-4M。解離常數(shù)Kd=Koff/Kon。在結(jié)合的二級速率常數(shù)約106-109M-1sec-1時(shí)，啟始速率Kon通常受擴(kuò)散制約。因此，為了獲得良好的交換速率(每秒交換一次以上)，結(jié)束速率Koff優(yōu)選應(yīng)該至少為1sec-1，由此在這種情況下Kd應(yīng)不低于10-9M。因此，在大多數(shù)需要交換率大于1sec-1的情況下，解離常數(shù)應(yīng)在10-4-10-9M范圍內(nèi)。
這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了一個(gè)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中在C-XY-S或C-XY-P單元如果不與Y-S化合物相接觸便是穩(wěn)定的這個(gè)意義上，XY交換反應(yīng)可以被稱為是一種聯(lián)合的置換反應(yīng)。
一個(gè)XY交換對包括至少一個(gè)X-部分和至少一個(gè)Y-部分。然而其還可以包括一個(gè)以上拷貝和/或類型的X-和Y-部分。
此外，X和Y部分可以是相同的分子。在本文中此類交換對可以被稱為一種“XX交換對”。
優(yōu)選X和Y部分為不同的分子。
為了作為一個(gè)非限制性的實(shí)例進(jìn)行說明，優(yōu)選XY部分在缺乏游離的Y時(shí)穩(wěn)定，但可以使游離Y與結(jié)合于X的Y進(jìn)行快速而特異的交換(而不是游離Y與X的交換)。如果如上所述獨(dú)立單元與Y-底物化合物相接觸，這種交換反應(yīng)能夠以底物置換產(chǎn)物。
XY交換對可以具有下述特征
ⅰ)X和Y可以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合。
XY交換對可以由任何種類的分子組成，包括小的有機(jī)(例如，EDTA)和無機(jī)(例如，金屬、磷酸鹽)分子，以及大分子(例如，核酸、肽)。
ⅱ)優(yōu)選將XY交換反應(yīng)描述為一種活躍的置換反應(yīng)。
ⅲ)優(yōu)選XY單元在缺乏另一個(gè)Y時(shí)穩(wěn)定。
ⅳ)優(yōu)選XY單元不對稱，即Y只置換Y，而不是X。
ⅴ)優(yōu)選Y對Y的交換非?？?。
ⅵ)優(yōu)選X和Y的結(jié)合為一個(gè)非常快的過程。
ⅶ)交換單元可以是對稱的(即，一個(gè)XX交換單元。)下面給出了XY交換對的適當(dāng)實(shí)例。此外，在圖3和4中給出了所述實(shí)例圖示說明。
ⅰ)金屬配體。優(yōu)選X部分由一個(gè)配體和一個(gè)金屬離子以解離速率很慢的強(qiáng)相互作用組成通常形成一種非常穩(wěn)定的配體-金屬單元。另一方面，Y部分為一種與相同的金屬離子相配具有高親和力，但具有快速的解離和結(jié)合速率的配體。此外，一個(gè)Y部分與另一個(gè)Y部分的交換優(yōu)選為一種置換反應(yīng)，例如因?yàn)閅部分為多配位體。具體實(shí)例a)X:EDDA’-Ca++(EDDA，乙二胺二乙酸，相當(dāng)于EDTA，其中去除了偶聯(lián)至其中一個(gè)氮上的兩個(gè)乙酸。因此，EDDA與Ca++形成4倍的配位體)。
Y:R-N(CH2COO-)2，一種雙配位體配體，或者Y:R-N(CH2COO-)(CH2)2N(CH2COO-)2，一種三配位體配體(Ca++可以與某些配體形成9倍的配位體)。
b)X:His6-Ni++，可能為4倍的配位。將組氨酸標(biāo)簽用于重組蛋白的純化，而且可以將6個(gè)組氨酸插入到蛋白的N-或C-末端，或者在蛋白表面上暴露的環(huán)中。Cu、Ni、Zn、Fe、Cd、Co、Mg和其他金屬，優(yōu)選具有快速交換動(dòng)力學(xué)的，它們可以與基于肽的螯合物一起使用。因此可以利用與金屬配位的其他肽，例如含有2個(gè)或多個(gè)組氨酸的肽(Schmidt等，1996，當(dāng)代生物學(xué)(Current Biology)，第3卷，645-653頁；Kotrba等，1999，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)(Applied and Environmental Microbiology)，第65卷，1092-1098頁)，或者Cu結(jié)合肽二甘氨酰-L-組氨酸(Lau等，1974，生物化學(xué)雜志(TheJournal of Biological Chemistry)，第249卷，5878-5884頁)。
Y:R-N(CH2COO-)2，一種雙配位體配體。
c)X:His6-Ca++(Ca++具有與大部分配體快速交換的特征)Y:R-N(CH2COO-)2，一種雙配位體配體，或者Y:R-N(CH2COO-)(CH2)2N(CH2COO-)2，一種三配位體配體。
ⅱ)大分子交換部分(核酸)。Y部分可以由結(jié)合X部分上重疊位點(diǎn)的兩種多核苷酸Y1和Y2組成，所述的X部分也是一種多核苷酸。優(yōu)選對寡聚體的長度和序列進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便X與Y1的相互作用在缺乏Y2的情況下穩(wěn)定，但Y2可以活躍地置換Y1，而且反之亦然。
相互作用的重疊區(qū)的原則通常應(yīng)該適于交換其他化學(xué)物質(zhì)的單元，例如蛋白質(zhì)、多聚體、有機(jī)或無機(jī)分子。對于多核苷酸的原則說明如下a)X:DNA多核苷酸5’-GGGGTTGTTCCCC-3’Y:DNA多核苷酸Y1:3’-CCCCAACAA-5’和Y2:3’-AACAAGGGG-5’的等摩爾混合物。
b)X:DNA多核苷酸5’-GGAAGGGATGGTCAC-3’Y多核苷酸Y1:3’-CCTACTACCA-5’和Y2:3’-TCCCTAAGTG-5’的等摩爾混合物。
ⅲ)共價(jià)鍵。共價(jià)鍵的形成和斷裂可以是一個(gè)相當(dāng)快的過程。在某些情況下這是所述鍵的內(nèi)在特征。在其他情況下，催化劑可以加速該鍵形成和斷裂的速率(例如，下面的酶促酯基轉(zhuǎn)移作用)。下面為具體的實(shí)例；“R”代表獨(dú)立單元(催化劑)或底物的結(jié)合位點(diǎn)a)X硼酸，R-B(OH)2Y一種糖，或其他鄰位二元醇相互作用的“雙配位體”特性(兩個(gè)鍵的協(xié)調(diào)形成和斷裂)應(yīng)該引起一個(gè)糖分子被另一個(gè)糖分子活躍地置換。
b)X:R1-COOR2(一種酯)Y:HO-R2(相應(yīng)的醇)因此，在這種情況下XY等同于X。為了加快交換速率，可以向緩沖液中加入酯酶。類似地，對于X和Y的交換可以利用氨基轉(zhuǎn)移酶、淀粉轉(zhuǎn)移酶和其他轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。對于這些反應(yīng)中的很多反應(yīng)，利用相關(guān)的轉(zhuǎn)移酶來加速交換反應(yīng)是可能的。
c)X:R1-SH
Y包括兩種類型的分子，Y1:R2-SH(一種游離的硫醇)和Y2:R2-SS-R2(一種二硫化物)。
在其底物附著形式中，通過一個(gè)二硫鍵將催化劑同底物偶聯(lián)?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)-二硫化物異構(gòu)酶加入到緩沖液中來加快交換的速率。
d)X鄰二硫醇，或成對的硫醇(例如，在i和i+1位點(diǎn)上為半胱氨酸的α-螺旋肽)Y含有三價(jià)砷的化合物這種類型的鄰二硫醇-三價(jià)砷相互作用已經(jīng)用于含硫醇蛋白的層析純化(Gitler等，1997，分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)，第252卷，48-55頁)，或者用于聯(lián)砷配體與在i、i+1、i+4和i+5位點(diǎn)上含有半胱氨酸的α-螺旋肽的強(qiáng)親和力相互作用(Griffin等，1998，科學(xué)(Science)，第281卷，269-271頁)。通過加入如DTT或2-巰基乙醇等還原劑可以加速交換反應(yīng)。
ⅳ)催化劑-底物對。催化劑(例如一種酶)和底物間的相互作用通常由兩個(gè)常數(shù)描述，Kcat(轉(zhuǎn)化數(shù))和Km。Kcat可以用來概括地定義生產(chǎn)性催化劑/底物復(fù)合物的壽命。因此，例如通過利用對一給定底物具有不同Kcat的酶的不同變體可以獲得具有不同交換速率(穩(wěn)定性)的XY單元(其中酶代表X，底物代表Y)，圖3和4。同時(shí)與一種以上底物相互作用的催化劑作為XY交換單元可能特別有用。
ⅴ)XY相互作用由底物到產(chǎn)物的反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在某些情況下，可以對XY-底物部分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便通過獨(dú)立單元催化劑的活性加速再加載過程。例如，如果X或Y均為一個(gè)裂解反應(yīng)的交換單元和底物，那么裂解可能導(dǎo)致XY的解離，由此再加載過程可能發(fā)生的更快。在下面的實(shí)施例8中，X和Y均為核酸結(jié)構(gòu)。Y為目的反應(yīng)(核糖二核苷酸的裂解)的交換單元和底物。Y裂解后XY單元解離，這將加速X與另一個(gè)Y-底物單元的結(jié)合。
該原則可以被更廣泛地應(yīng)用。例如，實(shí)施例8中Y的中央部分(裂解靶點(diǎn))可以與另一個(gè)目的反應(yīng)的底物進(jìn)行交換(見圖3A)。此外，可以對條件進(jìn)行選擇以便X和Y左-底物-Y右的結(jié)合很牢固，但X和Y左-產(chǎn)物1、或X和產(chǎn)物2-Y右的相互作用很弱。因此，底物裂解后X和Y立即分離，這加速了底物的再加載過程。
為了發(fā)生該反應(yīng)，底物不必是X或Y的部分。例如，如果底物到產(chǎn)物的反應(yīng)所誘導(dǎo)的構(gòu)象改變由產(chǎn)物傳遞至Y，而且該構(gòu)象改變導(dǎo)致XY的解離，那么這也將加速再加載過程。在圖3B中給出了一個(gè)實(shí)例。
ⅵ)在柱緩沖液中的酶和其他底物可以以其他方式加速交換反應(yīng)。例如，底物到產(chǎn)物的反應(yīng)可以啟動(dòng)另一個(gè)使X和Y解離的反應(yīng)(由在柱緩沖液中的底物催化)。例如，如果獨(dú)立單元的催化劑裂解一種核酸，那么其可能暴露游離的3’-或5’-末端，其可以被核酸外切酶接近。如果核酸同時(shí)代表靶底物和Y單元，那么Y單元可以被核酸酶降解，因此XY復(fù)合物解離?；蛘撸琗Y復(fù)合物(而不是未復(fù)合的X或Y)可以是柱緩沖液中一種物質(zhì)的靶標(biāo)；如果該物質(zhì)修飾XY復(fù)合物中的X或Y以便其解離得更快，那么該物質(zhì)的存在降加速交換速率。例如，如果X和Y為互補(bǔ)DNA和RNA寡聚體，那么在緩沖液中可以包括RNA酶H。RNA酶H裂解在雙螺旋復(fù)合物中的RNA；因此RNA(Y)將不被裂解，直到其與DNA(X)結(jié)合形成雙螺旋。RNA酶H將裂解RNA而使DNA保持完整。因此，RNA酶H加速XY的解離但使獨(dú)立單元-連接子-X單元保持完整，便于與另一個(gè)Y相互作用。
在本文的實(shí)施例(見下)中進(jìn)一步描述了適當(dāng)XY交換對的具體實(shí)例。
包括許多不同獨(dú)立單元的樣品如上面所確定的，所述的樣品可以包括至少兩種不同的獨(dú)立單元而且高達(dá)多種不同的獨(dú)立單元。
不同獨(dú)立單元的實(shí)際數(shù)量通常與催化劑分子文庫的實(shí)際大小相應(yīng)。
除了所述確定的不同獨(dú)立單元外，所述的樣品原則上還可以包括任何其他適當(dāng)?shù)牟牧稀?br> 此外，包括在所述樣品中的所述不同獨(dú)立單元可以溶于任何適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如水。
另外，所述的樣品還可以包括Y-底物化合物，根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的方法中步驟(ⅰ)其與不同的獨(dú)立單元相接觸。
不同的獨(dú)立單元如上所述，一個(gè)獨(dú)立單元包括一般結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物；或者如果底物已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，那么一般結(jié)構(gòu)為催化劑-XY交換對-產(chǎn)物。
另外，術(shù)語“不同的獨(dú)立單元”指每個(gè)均獨(dú)立包括不同催化劑分子的不同獨(dú)立單元，即兩個(gè)不同獨(dú)立單元的實(shí)例可以為(1)催化劑分子1-XY交換對-底物；和(2)催化劑分子2-Xy交換對-底物；其中催化劑分子1和催化劑分子2指兩種不同的催化劑分子。
此外，本文所述的“獨(dú)立單元”指一種獨(dú)立單元，其中為了能夠分離獨(dú)立的獨(dú)立單元，在所述的樣品內(nèi)將所述的獨(dú)立單元與其他不同的獨(dú)立單元物理分離是可能的。
生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種根據(jù)本發(fā)明包括許多獨(dú)立單元的樣品，其中根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的(ⅰ)的獨(dú)立單元為一種生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種根據(jù)本發(fā)明包括許多獨(dú)立單元的樣品，其中根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的(ⅰ)的獨(dú)立單元為一種生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元而且所述的底物和所述的催化劑分子都結(jié)合在所述生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元的表面。
術(shù)語“生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元”指在所述的獨(dú)立單元內(nèi)；(ⅰ)目的催化劑分子是一種生物學(xué)上可擴(kuò)增的分子；或者(ⅱ)目的催化劑分子由在允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的實(shí)體內(nèi)所包括的信息進(jìn)行生物學(xué)編碼；這提供了為獲得多個(gè)拷貝的所述催化劑分子而擴(kuò)增所述目的催化劑分子的可能性。
在上面(ⅱ)中的術(shù)語“生物學(xué)編碼”指信息以遺傳密碼的形式包括在DNA或RNA分子內(nèi)。
與上面(ⅰ)相關(guān)的生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元的一個(gè)實(shí)例為一種獨(dú)立單元，其中目的催化劑分子為DNA或RNA分子，因?yàn)樵诒绢I(lǐng)域中眾所周知DNA或RNA分子可以很容易地?cái)U(kuò)增。
與上面(ⅱ)相關(guān)的生物學(xué)上可擴(kuò)增的獨(dú)立單元的一個(gè)實(shí)例為一種獨(dú)立單元，其中目的催化劑分子為肽或多肽，而且其中所述的包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定信息的實(shí)體為編碼所述肽或多肽的DNA分子。
與上面的第二個(gè)實(shí)例相關(guān)，為了分離帶有其編碼的肽的DNA，在肽和編碼它的DNA之間必須存在一種物理連接。連接可以是直接連接，在這種情況下肽直接附于編碼它的核酸上，或者間接連接，此時(shí)肽可以附于例如一種細(xì)胞的表面或者由一種細(xì)胞分泌，因此在緊鄰分泌細(xì)胞處比其他任何地方均豐富得多。此類細(xì)胞在本文中被稱為“載體系統(tǒng)”，下面將對其進(jìn)行進(jìn)一步討論。
彈性連接子本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中(ⅰ)中所述的獨(dú)立單元包括下述結(jié)構(gòu)催化劑分子-彈性(XY交換對)連接子-底物。
優(yōu)選彈性連接子包括XY交換對。
術(shù)語“彈性連接子”在本文中指作為一個(gè)整體連接催化劑和底物的分子。例如，如果底物通過一種彈性分子結(jié)合于磁珠，而催化劑也通過一種彈性分子結(jié)合于磁珠，那么“彈性連接子”指“彈性分子-磁珠-彈性分子”，而且彈性連接子的特征將反映兩個(gè)彈性分子和連接二者的磁珠部分的各自特征。例如，彈性連接子可以由彈性多肽、聚乙二醇(PEG)以及其他具有適當(dāng)彈性的多聚體組成。
此外，彈性連接子還可以連接催化劑分子和載體系統(tǒng)(見下面)。
載體系統(tǒng)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中在本發(fā)明第一個(gè)方面的(ⅰ)中所述的獨(dú)立單元包括下述結(jié)構(gòu)催化劑分子-載體系統(tǒng)-XY交換對-底物，或者更優(yōu)選包括下述結(jié)構(gòu)催化劑分子-載體系統(tǒng)-彈性(XY交換對)連接子-底物。
術(shù)語“載體系統(tǒng)”指一種系統(tǒng)/實(shí)體，其物理連接催化劑分子和底物，或者攜帶有允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，而且其中所述的載體系統(tǒng)并不直接參與由催化劑分子催化的底物到產(chǎn)物的催化反應(yīng)。
本文中將此類載體系統(tǒng)進(jìn)一步分成生物學(xué)上可擴(kuò)增的載體系統(tǒng)和生物學(xué)上非可擴(kuò)增載體系統(tǒng)。
生物學(xué)上可擴(kuò)增載體系統(tǒng)的實(shí)例包括(載體系統(tǒng)-催化劑分子)噬菌體-多肽(Boublik等，1995，生物技術(shù)(Biotechnol)(NY)，第13卷，1079-1084頁)、絲狀噬菌體-肽(Kay,Winter和McCafferty,1996，“肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示，實(shí)驗(yàn)室手冊(Phage Display of Peptides and Proteins,A LaboratoryManual)”,Academic Press)、逆轉(zhuǎn)錄病毒-多肽(Buchholz等，1998，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，第16卷，951-954頁)、質(zhì)粒-肽(Schatz等，1996，酶學(xué)方法(Meth.Enzym.)，第267卷，171-191頁)、多核糖體-肽(Mattheakis等，1994，美國國家科學(xué)院院刊，第91卷，9022-9026頁；He和Taussig,1997，核酸研究(Nucleic Acids Research)，第25卷，5132-5134頁)、細(xì)菌-肽(Brown,1997，自然生物技術(shù)，第15卷，269-272頁)以及mRNA-肽(Roberts和Szostak,1997，美國國家科學(xué)院院刊，第94卷，12297-12302頁)、cDNA-肽(除了蛋白附于編碼它的mRNA的cDNA而不是mRNA本身外，類似于mRNA-蛋白質(zhì)融合展示，)、肽-分泌性細(xì)胞-肽(Kinsella和Cantwell,1991，酵母(Yeast)，第7卷，445-454頁)、肽-分泌性人造微球-肽(人造微球含有由微球內(nèi)所含基因編碼的蛋白質(zhì)，見Tawfik和Griffiths,1998，自然生物技術(shù)，第16卷，652-656頁)。
生物學(xué)上非可擴(kuò)增載體系統(tǒng)的實(shí)例包括(載體系統(tǒng)-催化劑分子)磁珠-有機(jī)分子或磁珠-肽(Brenner和Lerner,1992，美國國家科學(xué)院院刊，第89卷，5381-5383頁)、釘-無機(jī)分子和磁珠-DNA序列(Geysen等，1996，化學(xué)和生物學(xué)(Chemistry and Biology)，第3卷，679-688頁)。
應(yīng)該注明的是，在本文中包括磁珠-DNA序列結(jié)構(gòu)的獨(dú)立單元是一種生物學(xué)上可擴(kuò)增的單元(見上面)，然而載體系統(tǒng)本身(磁珠)為一種生物學(xué)上非可擴(kuò)增的載體系統(tǒng)。
催化劑和催化劑分子庫如上所述，術(shù)語“催化劑”指任何具有預(yù)期催化活性的催化劑分子，例如有機(jī)和無機(jī)分子、蛋白質(zhì)、酶、肽、核酸、生物多聚體和非生物學(xué)多聚體、小的有機(jī)或無機(jī)分子。此外術(shù)語“催化劑”和“催化劑分子”可以相互交換使用。
因而，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的催化劑分子庫為天然或非天然的肽或多肽的文庫，優(yōu)選為酶的文庫；(ⅱ)根據(jù)上面實(shí)施方案(ⅰ)包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的文庫為包括具有許多不同酶活性的多肽的文庫；或者(ⅲ)根據(jù)上面實(shí)施方案(ⅰ)包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的文庫為包括衍生自一個(gè)或多個(gè)前體多肽的多肽的文庫，其中所述的前體多肽表現(xiàn)出密切相關(guān)的酶活性。
優(yōu)選術(shù)語“包括具有許多不同酶活性的多肽的文庫”指一種文庫，其中所述的不同酶活性為實(shí)質(zhì)上不同的活性，例如蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶活性。此類文庫的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)可以是依所需特異性活性變換底物，所述文庫可用來鑒定多種目的肽。例如，如果例如一種肽作為底物用本文所述體外篩選法首先分離了一種目的蛋白酶，那么隨后通過將底物變換為例如一種淀粉分子可以分離一種淀粉酶。
術(shù)語“天然或非天然的肽或多肽”指肽或多肽可以由二十種天然氨基酸構(gòu)建塊(building blocks)中任何氨基酸，或者任何具有其他側(cè)鏈的非天然氨基酸，或者能夠?qū)蓚€(gè)肽連接起來的任何非氨基酸構(gòu)建塊組成。根據(jù)大量已知用于制備此類文庫的標(biāo)準(zhǔn)方法中的任意方法可以制備所述的文庫。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及根據(jù)上面剛剛提到的本發(fā)明的實(shí)施方案包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的文庫為包括改組/重組/摻雜的多肽的一種文庫。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及，(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的催化劑分子的文庫為天然或非天然核酸的文庫；(ⅱ)根據(jù)上面實(shí)施方案(ⅰ)包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的文庫為包括具有許多不同催化活性的核酸的文庫；或者(ⅲ)根據(jù)上面實(shí)施方案(ⅰ)包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的文庫為包括衍生自一個(gè)或多個(gè)前體核酸的核酸的文庫，其中所述的前體核酸表現(xiàn)出密切相關(guān)的催化活性。
優(yōu)選術(shù)語“包括具有許多不同催化活性的核酸的文庫”指一種文庫，其中所述的不同催化活性為實(shí)質(zhì)上不同的活性，例如核酸酶、連接酶、異構(gòu)酶、磷酸化酶。此類文庫的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)可以根據(jù)目的特異性活性變換底物，所述的文庫可用來鑒定多種目的核酸。例如，如果利用例如兩種DNA寡核苷酸作為底物經(jīng)本文所述體外篩選法首先分離了一種目的DNA連接酶，那么隨后通過將底物變換為例如一種RNA寡核苷酸可以分離一種核糖核酸酶。
根據(jù)大量已知用于制備此類文庫的標(biāo)準(zhǔn)方法中的任意方法可以制備所述的文庫。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及根據(jù)上面剛剛提到的本發(fā)明的實(shí)施方案包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的核酸文庫為包括改組/重組/摻雜的核酸的一種文庫。
術(shù)語“天然或非天然的核酸”指核酸可以包含五種天然堿基(A、T、G、C、U)中的任何堿基、或任何非天然堿基或骨架結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述的催化劑分子的文庫為包括天然多聚體分子、或非天然多聚體分子、或有機(jī)小分子、或無機(jī)小分子或者所述分子的混合物的文庫；或者(ⅱ)根據(jù)上面剛剛提到的實(shí)施方案包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中通過組合化學(xué)制備所述的文庫。
優(yōu)選樣品可以含有一個(gè)實(shí)質(zhì)上的組合文庫(美國國家科學(xué)院院刊，1997，第94卷，2106-2110頁)，每個(gè)潛在的催化劑由一個(gè)以上的亞單位組成，在這個(gè)意義上，所述的亞單位通過可逆的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵相互作用結(jié)合起來，在多次轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中亞單位結(jié)合并解離數(shù)次。
在實(shí)質(zhì)上的組合文庫情況下，可以用對回收的實(shí)體而不必是單個(gè)催化劑組合的明確鑒定來理解本文通篇使用的術(shù)語“明確的鑒定”。此類由實(shí)質(zhì)上的組合文庫分離的催化劑可以為由數(shù)條多肽鏈組成的催化劑，所述的多肽鏈通過弱的相互作用(例如蛋白質(zhì)亞單位的結(jié)合，以低的亞單位-亞單位親和力為特征)結(jié)合起來，或者通過可逆的共價(jià)二硫鍵結(jié)合起來，加入氧化還原緩沖劑(例如氧化型和還原型谷胱甘肽)可加速其交換速率，因此連續(xù)地結(jié)合和解離。
術(shù)語“天然多聚體分子或非天然多聚體分子”指多聚體可以是天然的，或人工制備的。
或者，文庫成員可以是通過二硫鍵結(jié)合起來的小的有機(jī)分子的集合；此外，通過包含氧化還原緩沖劑可以加速實(shí)質(zhì)上的組合文庫的動(dòng)力學(xué)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明包括許多不同獨(dú)立單元的樣品，其中催化劑分子和能夠被催化成產(chǎn)物的底物(在第一個(gè)方面的(ⅰ)中)為不同的化學(xué)物質(zhì)。
術(shù)語“催化劑分子和能夠被催化成產(chǎn)物的底物(在第一個(gè)方面的(ⅰ)中)為不同的化學(xué)物質(zhì)”指所述的催化劑分子和底物分子為實(shí)質(zhì)上不同的化學(xué)物質(zhì)。
因此，在該優(yōu)選的實(shí)施方案中，催化劑分子和底物分子為DNA或RNA分子的情況在本文中被稱為是催化劑分子和底物分子并非不同化學(xué)物質(zhì)的情況。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，用于體外篩選中多次催化活性轉(zhuǎn)化的方法根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面中的步驟(ⅱ)，術(shù)語“篩選”指對包括在樣品內(nèi)的1個(gè)以上，優(yōu)選100個(gè)以上，或者優(yōu)選10,000個(gè)以上，更優(yōu)選1,000,000個(gè)以上，甚至更優(yōu)選108個(gè)以上，而且最優(yōu)選1010個(gè)以上的獨(dú)立單元進(jìn)行篩選，優(yōu)選沒有技術(shù)人員的干預(yù)。
術(shù)語“柱”在本文中指所有種類的固相支持物。實(shí)例為柱、包括BiacoreTM設(shè)備的表面。在某些情況下無需固相支持物，如果分離是基于在電場中的遷移便是如此。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的方法的Y-底物化合物和目的催化劑的分離如上所述，根據(jù)部分們第二個(gè)方面中的(ⅰ)，術(shù)語“所述的獨(dú)立單元與Y-底物化合物相接觸”指將獨(dú)立單元和Y-底物化合物適當(dāng)?shù)乜拷员隳軌蜻M(jìn)行交換反應(yīng)。所述的接觸例如可以在一種緩沖液中，其中獨(dú)立單元和Y-底物化合物可以擴(kuò)散到一起，由此而彼此相互接觸。
根據(jù)本發(fā)明，在按照用于多次催化活性轉(zhuǎn)化的體外篩選方法進(jìn)行的篩選循環(huán)中，進(jìn)行第一輪篩選的嚴(yán)謹(jǐn)度低于后幾輪篩選是有利的。例如，通過利用低濃度的Y-底物，和/或低濃度的產(chǎn)物結(jié)合受體可以很容易做到這一點(diǎn)，在某些情況下在第一輪循環(huán)中可以不使用Y-底物。另外，可以使用低效的Y-底物化合物。然后在后面的篩選循環(huán)中增加濃度。對于某些實(shí)驗(yàn)設(shè)置，這可能是不可行的。例如，如果使用由非常活躍的酶組成的文庫，而且分離催化劑的方法是以在產(chǎn)物結(jié)合柱上的固定為基礎(chǔ)，那么高啟始濃度的Y-底物可以產(chǎn)生高濃度的Y-產(chǎn)物。根據(jù)產(chǎn)物結(jié)合柱的容量，這可能以產(chǎn)物飽和產(chǎn)物結(jié)合受體，因此導(dǎo)致篩選嚴(yán)謹(jǐn)度降低。然而，例如通過(在裂解反應(yīng)情況下)經(jīng)含有底物的連接子將催化劑連接于柱(見圖8)可以解決該問題。為了進(jìn)一步增加篩選的嚴(yán)謹(jǐn)度，可以向柱緩沖液中加入過量的底物S(未連接于Y)(其將起“競爭性底物”的作用)。調(diào)節(jié)反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)度的其他方法包括改變連接酶和底物的連接子的長度，向柱緩沖液中加入對底物或酶有親和力的因子，或者加入影響底物-酶相互作用的因子(例如，結(jié)合酶活性位點(diǎn)的受體/抗體、酶抑制劑、對底物有親和力的受體/抗體)。
為了限制催化劑轉(zhuǎn)化底物的有效時(shí)間，例如在篩選過程中可以施加電壓或光線的脈沖。適當(dāng)間隔的脈沖能夠產(chǎn)生例如瞬時(shí)的pH或離子梯度，其可以啟動(dòng)由催化劑進(jìn)行的底物到產(chǎn)物的反應(yīng)。脈沖在時(shí)間上應(yīng)該有足夠的間隔，以便在脈沖開始下一個(gè)反應(yīng)前，使溶液中的催化劑可以有充足的時(shí)間固定于受體上。這樣，在柱中進(jìn)行的篩選的空載時(shí)間(即催化劑從一個(gè)受體擴(kuò)散到下一個(gè)上所花的時(shí)間)可以大大降低，并獲得非常高的嚴(yán)謹(jǐn)度。
一般說來，優(yōu)化具體實(shí)驗(yàn)設(shè)置是在技術(shù)人員一般知識范圍內(nèi)的。
在本發(fā)明第二個(gè)方面的步驟(ⅰ)之前進(jìn)行富集的步驟某些蛋白難以展示到絲狀噬菌體上。特別是大的蛋白或?qū)Υ竽c桿菌具有毒性或生長抑制作用的蛋白通常展示效率較低，即產(chǎn)生的噬菌體顆粒大部分在表面上不攜帶展示的蛋白。已經(jīng)報(bào)道過低至一千個(gè)有一個(gè)展示目的蛋白的噬菌體的展示效率(Jestin等，1999,Angew.Chemi.Int.Ed.第38卷，1124-1127頁；Demartis等，1999，分子生物學(xué)雜志(JMB)，第286卷，617-633頁)。在這種情況下，由于攜帶編碼目的蛋白DNA卻未在表面上展示所述蛋白的噬菌體顆粒大量過剩，所以估計(jì)會(huì)有高度非特異的背景。為了克服這個(gè)潛在的問題，可以在目的蛋白的C-末端偶聯(lián)一個(gè)親和性標(biāo)簽，使得可以通過柱層析對展示全長帶標(biāo)簽的蛋白的噬菌體進(jìn)行純化。
在該方式中可以使用的非限制性的多種親和性標(biāo)簽為組氨酸標(biāo)簽(見實(shí)施例9)、intein-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合體(Chong等，1997，基因(Gene)，第192卷，271-281頁)、FLAG肽(Slootstra等，1997，分子多樣性(MolecularDiversity)，第2卷，156-164頁)以及麥芽糖結(jié)合蛋白(Pryor和Leiting,1997，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Protein Expression and Purification)，第10卷，309-319頁)。
因而，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中目的催化劑分子為偶聯(lián)了一個(gè)親和性標(biāo)簽的酶或蛋白質(zhì)，而且其中在步驟(ⅰ)前進(jìn)行一個(gè)任選步驟，該任選步驟包括通過純化對展示(全長)酶或蛋白的獨(dú)立單元進(jìn)行富集，在所述的純化步驟中利用親和性標(biāo)簽對展示酶或蛋白的單元進(jìn)行分離。
(ⅱ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中利用抗親和性標(biāo)簽抗體柱對展示(全長)酶或蛋白質(zhì)的獨(dú)立單元進(jìn)行純化，在所述的抗體柱中利用標(biāo)簽對展示帶標(biāo)簽的酶或蛋白質(zhì)的單元進(jìn)行分離。
(ⅲ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中親和性標(biāo)簽包括偶聯(lián)至目的酶或蛋白C-末端的六個(gè)組氨酸殘基，而且在Ni-NTA柱上或者在抗組氨酸抗體柱上對展示(全長)酶或蛋白的獨(dú)立單元進(jìn)行純化，在所述的柱中利用標(biāo)簽對展示帶標(biāo)簽的酶或蛋白質(zhì)的單元進(jìn)行分離。
根據(jù)本發(fā)明的方法分離有活性目的催化劑的方法對有活性或低活性催化劑的分離優(yōu)選包括一個(gè)篩選步驟，在該步驟中催化的反應(yīng)引起催化劑通過其附著的連接子-底物而釋放或附著。
當(dāng)利用柱裝置時(shí)，存在至少四種將有活性催化劑與無活性催化劑分開的方法。ⅰ)通過將產(chǎn)物固定于產(chǎn)物結(jié)合柱上可以分離有活性催化劑(或者更常用，通過附著的產(chǎn)物)。ⅱ)無活性催化劑可以通過固定于底物結(jié)合柱上而被去除。ⅲ)在靶反應(yīng)之前可以將催化劑附著于支持物上；在裂解反應(yīng)發(fā)生時(shí)，將催化劑從支持物上釋放，并可以收集起來。ⅳ)經(jīng)過底物1(附于催化劑)和底物2(附于支持物)的反應(yīng)后，有活性的催化劑本身可以附于固相支持物上。圖示說明見圖7和8。
產(chǎn)物和底物特異性柱可以通過結(jié)合分別對產(chǎn)物和底物有特異性的受體分子來固定產(chǎn)物和底物?；蛘?，通過在柱子上功能基團(tuán)和附于催化劑的產(chǎn)物或底物之間的產(chǎn)物或底物特異性反應(yīng)可以介導(dǎo)固定作用。
分離產(chǎn)物或底物(以及分別與它們在一起的有活性或無活性的催化劑)的其他方法包括在不同相之間的分層、質(zhì)譜、沉淀、電或電磁分離等。特別是可以進(jìn)行各種類型的電泳，尤其是在產(chǎn)物的形成導(dǎo)致獨(dú)立單元的電荷顯著改變的情況下。電荷的顯著改變可以導(dǎo)致例如，如果反應(yīng)為連接兩個(gè)底物的連接反應(yīng)，那么其中之一帶電荷并且在反應(yīng)之前在溶液中游離。
因而，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中通過特異性固定作用進(jìn)行步驟(ⅱ)中對產(chǎn)生所述產(chǎn)物分子的目的催化劑分子的篩選；(ⅱ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中通過下述策略進(jìn)行步驟(ⅱ)中對目的催化劑分子的篩選，(a)構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)，其中將第二個(gè)方面的步驟(ⅰ)中包括底物分子和催化性分子的獨(dú)立單元每個(gè)都結(jié)合到基質(zhì)上，而且其中在將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物時(shí)將單元從所述的基質(zhì)上釋放；并且
(b)對從所述的基質(zhì)上釋放的單元進(jìn)行篩選；(ⅲ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中通過下述策略之一對目的催化劑分子進(jìn)行篩選(步驟(ⅱ))，(a)構(gòu)建一個(gè)產(chǎn)物柱，其中沿著產(chǎn)物柱的基質(zhì)上放置特異性結(jié)合產(chǎn)物的受體；并且(b)在產(chǎn)物柱的一端加入獨(dú)立單元的樣品并通過分離最后到達(dá)柱子另一端的獨(dú)立單元對目的催化劑分子進(jìn)行篩選；(ⅳ)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面用于體外篩選的方法，其中通過物理或化學(xué)方法對一種實(shí)體進(jìn)行分離(步驟(ⅲ))，所述的實(shí)體包括允許對目的催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息；(ⅴ)根據(jù)就在上面的方面用于體外篩選的方法，其中的物理方法為電泳。
根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的(ⅳ)，重復(fù)步驟(ⅰ)至(ⅲ)一次或多次如上所述，根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的(ⅳ)，術(shù)語“通過利用在步驟(ⅲ)所述的實(shí)體中所包括的信息來產(chǎn)生目的催化劑分子，并構(gòu)建包括所產(chǎn)生的該目的催化劑分子的一個(gè)獨(dú)立單元，然后通過在所述的重復(fù)步驟中利用該獨(dú)立單元作為啟始材料，將步驟(ⅰ)至(ⅲ)重復(fù)一次或多次”指所述的重復(fù)可以為一次，更優(yōu)選2次，更優(yōu)選5次以上，甚至更優(yōu)選10次以上，而且最優(yōu)選25次以上。
根據(jù)本發(fā)明的最后一個(gè)方面用于制備目的催化劑分子的方法如上所述，在最后一個(gè)方面中本發(fā)明涉及用于制備目的催化劑分子的方法，所述的方法包括根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行用于體外篩選的方法而且進(jìn)一步包括下述步驟，(a)通過適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ㄖ苽溥m當(dāng)量的所述分離的目的催化劑分子。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面在用于體外篩選的方法中，步驟(ⅲ)寫到(ⅲ)“借助于產(chǎn)物的一個(gè)特征，對一種實(shí)體進(jìn)行分離，所述的實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述的催化劑能夠多次催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)”因而，在所述的實(shí)體內(nèi)所包括的信息為通過技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)制備策略制備所述目的催化劑分子提供了可能性。
例如，若所述的催化劑分子為一種目的多肽，那么所述的標(biāo)準(zhǔn)制備策略可以是用于重組制備所述目的多肽的標(biāo)準(zhǔn)方法，或者例如，若所述的催化劑分子為一種目的有機(jī)分子，那么所述的標(biāo)準(zhǔn)制備策略可以是用于制備此類有機(jī)分子的標(biāo)準(zhǔn)方法。
實(shí)施例實(shí)施例1包括本發(fā)明第一個(gè)方面中除XY交換對外的特征的獨(dú)立單元的實(shí)例。
在該實(shí)施例1中，目的催化劑是葡萄球菌DNA酶(SNase)；底物是單鏈寡核苷酸(ssDNA)；產(chǎn)物是被目的SNase裂解的ssDNA。
而且，用一種絲狀噬菌體作為載體系統(tǒng)，用酸/堿連接子作為彈性連接子。
因此，這個(gè)實(shí)施例中的獨(dú)立單元有如下的一般結(jié)構(gòu)SNase-絲狀噬菌體-酸/堿連接子-ssDNA催化劑-載體系統(tǒng)-彈性連接子-底物。
圖示見圖10。
在這個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)物(即，被裂解的ssDNA)的“篩選特性”為該產(chǎn)物不與基質(zhì)結(jié)合，而底物(ssDNA)與基質(zhì)結(jié)合。
因此，在這個(gè)實(shí)施例中，通過篩選從所述的基質(zhì)中釋放的獨(dú)立單元對目的SNase分子進(jìn)行分離。圖示見圖10。
材料和方法化合物的合成Fmoc-S-(2-硝基-4,5-二甲氧苯甲基)-L-半胱氨酸1是用Merrifield(6)方法的改良法合成的。簡言之，將605mg L-半胱氨酸(5mmol)懸浮于脫氣的乙醇/水(2∶1)100ml中，加入1.39mL三乙胺(10mmol)和1.39g1-(溴甲基)-2-硝基-4,5-二甲氧苯(5mmol)。在氮?dú)庵?3℃避光攪拌該混合物10小時(shí)并過濾。用乙醇清洗過濾塊，并從乙醇/水中重結(jié)晶產(chǎn)生0.95g S-(2-硝基-4,5-二甲氧苯甲基)-L-半胱氨酸(3mmol)。將重結(jié)晶產(chǎn)物(0.8g)懸浮于20mL水中；加入0.53mL三乙胺(3.8mmol)，隨后加入12mL溶解有0.9g 9-芴基甲氧基羰基琥珀酸酯(2.7mmol)的乙腈溶液，在氮?dú)庵?5℃條件下攪拌該混合物。用1M HCL將產(chǎn)物酸化至pH2-3，使之沉淀，蒸發(fā)乙腈。收集沉淀于一玻璃容器(frit)，用水和乙酸乙酯洗滌以去除過量的HCl和試劑。將得到的粗產(chǎn)物1(1.13g)在真空中充分干燥，直接用于合成堿性連接子多肽，C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKK-KLAQGGC(堿性序列用下劃線標(biāo)出，光保護(hù)的半胱氨酸用黑體標(biāo)出)。在ABI DNA合成儀上，用3＇生物素基團(tuán)(BiotinTEG CPG,Glen Research)和5＇硫醇(5＇-Thiol-Modifier C6,Glen Research)合成化合物2、3和4各1mmole，并用反向HPLC純化，從樹脂中洗脫(Rainin Microsorb C18柱，流速1mL/min；溶劑A:50mM醋酸三乙胺(TEAA),pH7；溶劑B乙腈，溶劑B在40分鐘內(nèi)的5％到50％線性梯度；按照Glen Research的方法去除硫醇基上的三苯甲基保護(hù)基團(tuán)。凍干產(chǎn)物并溶解于水中(終濃度為1.0mM)?；衔?與堿性連接子肽的偶聯(lián)物的制備方法如下在4℃氮?dú)鈼l件下，2mg(415nmole)堿性連接子肽與20倍摩爾濃度過量的N,N＇-雙(3-丙酰馬來酰亞氨基)-2-羥基-1,3丙二胺(3.2mg)在1mL 50mM pH5.5的磷酸鈉緩沖液中反應(yīng)10小時(shí)?；衔?是用反向HPLC(Vydac RP-18柱，流速2mL/min；溶劑A:0.1％TFA水溶液；溶劑B:0.1％TFA乙腈溶液；35分鐘內(nèi)10％到50％溶劑B的線性梯度)從反應(yīng)混合物中純化，產(chǎn)物級分濃縮至大約0.3mL(OD280=6，化合物5不能被濃縮至干燥)。向100mL(138nmole)這種溶液中加入75μL水，75mL pH7的1M磷酸鈉水溶液，30mL 5M NaCl水溶液和22mL(22nmoles)化合物2，并將反應(yīng)在23℃、氮?dú)庵袦赜?0小時(shí)(為了避免沉淀，試劑應(yīng)以這種順序加入)。用陰離子交換FPLC純化產(chǎn)物(Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia)，流速0.75mL/min；溶劑A:20mM Tris-HCL,pH7；溶劑B:20mM Tris-HCL,pH7,2M NaCl；B的20％到60％線性梯度，7.5分鐘之內(nèi))；在10％變性聚丙烯酰胺凝膠上，產(chǎn)物有一條單一條帶。OD260=0.3-1的級分直接用在光-去保護(hù)步驟中(見下面)?；衔?和4與堿-連接子-肽的偶聯(lián)物以如下方法制備大約200nmoles化合物3或4和20倍過量的二馬來酰亞胺在1mL pH5.5的50mM磷酸緩沖液中，4℃溫育15小時(shí)。在用反向HPLC純化及凍干后，用Maldi-ToF MS驗(yàn)證化合物6和7?；衔?和7(150nmoles)和堿-連接子-肽在100mL 10mM TEAA,pH6.5,100mM NaCl中4℃溫育15小時(shí)。產(chǎn)物用反向HPLC純化(Vydac RP-18柱，條件同前面敘述的條件相同)、凍干并用Maldi-ToF MS分析(7)。三個(gè)偶聯(lián)物的C末端半胱氨酸上的2-硝基-4,5-二甲氧苯甲基保護(hù)基團(tuán)通過光解作用去掉，獲得化合物8、9和10，方法如下化合物8的方法，通氬氣15分鐘，除去含有被保護(hù)的偶聯(lián)物的100mLFPLC純化級分中的氣體，然后置于隔膜封蓋的玻璃小瓶中，汞燈(450W高壓汞燈，Ace-Hanovia；PyrexTM濾器，cutoff2300nm)照射30分鐘(8)。化合物9和10的方法，10nmoles偶聯(lián)物溶解于100mL 10mM DTT中，按上述方法除氣和光分解。照射30分鐘后，沒有剩余的起始原料被MALDI-ToF MS檢測到。用HPLC分離反應(yīng)混合物(Vydac RP-18柱，條件同前面敘述的條件相同)，并將產(chǎn)物級分凍干。偶聯(lián)物冰凍保存，并且為了保證有效地依附于噬菌體，在光去保護(hù)之后1周內(nèi)應(yīng)用。
酸輔助噬菌體的構(gòu)建用K07-NarⅠ-prim引物(5’-ACAACTTTCAACGGCGCCAGTTTCAGCGG-3’)通過Kunkel誘變(9)，在M13K07輔助噬菌體(Promega)的成熟pⅢ蛋白的第三個(gè)和第四個(gè)密碼子之間引入一個(gè)NarⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，得到NarⅠ-輔助噬菌體。兩端均帶有NarⅠ限制性位點(diǎn)的編碼氨基酸GAAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQGGCPAGA(下劃線部分表示酸性肽序列，粗體表示GGC基序)的DNA，是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用質(zhì)粒pCRⅡ(Ellis L.Reinherz,Dana Farber癌癥研究所，波士頓)和引物NarⅠfwd(5’-ACTACAAATTGGCGCCGCTCAGCTCGAAAAAGAGC-3’)和引物NarⅠbck(5’-AATTATAGGCGCCAGCCGGGCAACCGCCCTGAGCCAGTTCCTTTTCC-3’)生成的。用NarⅠ消化PCR產(chǎn)物，并將其引入到NarⅠ消化的NarⅠ-輔助噬菌體中，獲得酸性輔助噬菌體。
編碼葡萄球菌核酸酶-pⅢ融合蛋白和39-All Fab-pⅢ融合蛋白的噬菌粒的構(gòu)建為了制造SNase-pⅢ融合蛋白，用引物5’-CGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCAACTTCAACTAAA-3’(劃線部分為SfiⅠ限制性位點(diǎn))和引物5’-GCGAATTGGTGCGGCCGCTTGACCTGA-ATCAGCGTTG-3’(劃線部分為NotⅠ限制性位點(diǎn))，在質(zhì)粒pONF1上進(jìn)行PCR(10),pONF1上攜帶SNase編碼基因。產(chǎn)物用SfiⅠ和NotⅠ消化，并引入到SfiⅠ-NotⅠ消化的pFAB-5c的衍生物pFAB-5c.His上(11)，獲得噬菌粒pⅡ78-6。用噬菌粒pComb3H.DA作為陰性對照。這個(gè)噬菌粒(12)攜帶融合到pⅢ蛋白上的39-All Fab抗體(13)。SNase和對照蛋白的表達(dá)均受lac啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。
噬菌體顆粒的產(chǎn)生噬菌體顆粒按照φrum等的方法(11)略有修改而制備。簡述之，用pⅡ78-6或pComb3H.DA轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-blue，在含100mg/mL氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)。在OD600為0.5時(shí)，加入終濃度為1.5×108cfu/mL的酸性輔助噬菌體，在37℃溫育20分鐘。將細(xì)胞成團(tuán)，后在2×YT、100mM IPTG、100mg/mL氨芐青霉素、50mg/mL卡那霉素中懸浮，在常溫下振蕩培養(yǎng)14小時(shí)。將細(xì)胞成團(tuán)，上清中的噬菌體顆粒用PEG沉淀，隨后懸浮于TBS(25mM Tris-HCl,pH7.4、140mM NaCl、2.5mM KCl)。用標(biāo)準(zhǔn)的方法以大腸桿菌XL1-blue滴定噬菌體(14)。
堿性連接子-底物偶聯(lián)物和噬菌體的共價(jià)結(jié)合。大約108個(gè)噬菌體顆粒在加有1mM巰基乙胺(MEA)和1nmole堿性-連接子-寡脫氧核苷酸(化合物8)、堿-連接子-pTp(化合物9)或堿-連接子-pTpTp(化合物10)的40mL緩沖液A(TBS,10mM EDTA,0.1％BSA)中37℃溫育60分鐘，然后PEG沉淀兩次，重懸于緩沖液A中。
噬菌體的固定和從固體支持相中釋放大約108個(gè)與堿-連接子-底物偶聯(lián)物共價(jià)結(jié)合的噬菌體顆粒和50mL鏈親和素磁珠(Boehnriger Mannheim，生物素結(jié)合能力1.5nmole/ml)在1mL緩沖液A中23℃溫育15分鐘；用含0.1％吐溫20的緩沖液A洗滌8次，每次1分鐘，隨后用緩沖液A洗滌2次，每次1分鐘。將磁珠懸浮于緩沖液A中，然后用懸浮珠直接感染大腸桿菌XL1-blue并滴定，或者用Dnase 1(1單位/mL DNase 1,10mM MgCl2,20mM Tris-HCl,pH8,23℃15分鐘)處理后再感染，以確定磁珠上所固定的噬菌體數(shù)。將磁珠懸浮于緩沖液B(TBS,10mM CaCl2,0.1％BSA),23℃溫育5分鐘并滴定上清，以檢測其從固體支持相的鈣依賴性釋放(裂解)。將磁珠懸浮于緩沖液A,23℃溫育5分鐘并滴定上清，以檢測其從磁珠的鈣依賴性釋放(裂解)。
從文庫樣集合體中富集活性酶將展示SNase或39-All Fab的噬菌體顆粒以1∶100的比例混合，并共價(jià)結(jié)合堿性-連接子-寡脫氧核苷酸偶聯(lián)物(化合物8)。將噬菌體固定在鏈親和素磁珠上，按上面敘述的方法在緩沖液A中洗滌并在緩沖液B中溫育，用上清感染大腸桿菌XL1-blue，將細(xì)胞鋪于含100mg/mL氨芐青霉素的LA平板上。用PCR或限制性內(nèi)切酶消化的方法，鑒定隨機(jī)挑選的克隆為Snase克隆還是對照克隆。
結(jié)果和討論篩選方案為了檢測上述噬菌體展示形式的定向酶進(jìn)化策略，首先必需發(fā)展一個(gè)常規(guī)方法以便選擇性地將一個(gè)給定的底物附著在噬菌體展示的酶上或其附近。重要的是底物必需被附著，以使其有效的結(jié)合在結(jié)合酶的活性部位。而且，底物應(yīng)該和噬菌體共價(jià)結(jié)合，以確保不存在文庫成員間交叉反應(yīng)的產(chǎn)物。一種可能的策略包括用底物通過二硫化物交換反應(yīng)對酶或附近的噬菌體包膜蛋白(例如pⅢ蛋白)進(jìn)行選擇性的化學(xué)修飾。例如，經(jīng)定點(diǎn)誘變引入到葡萄球菌核酸酶活性部位附近的半胱氨酸殘基已用來通過二硫化物交換反應(yīng)選擇性的引入唯一的化學(xué)功能(15)。為了將這種方法應(yīng)用在表達(dá)于絲狀噬菌體上的蛋白上，首先將包膜蛋白pⅥ、pⅦ、pⅨ上的三個(gè)單獨(dú)的半胱氨酸誘變成丙氨酸。pⅢ蛋白的埋在內(nèi)部的8個(gè)半胱氨酸沒有變化，因?yàn)樗鼈兛赡苄纬山Y(jié)構(gòu)上重要的二硫鍵(16)。不幸的是，通過二硫化物的交換、馬來酰亞胺附加或烷化反應(yīng)等方法對引入到幾種展示于噬菌體上的酶的活性部位附近的半胱氨酸選擇性修飾的反復(fù)努力，均導(dǎo)致對噬菌體包膜蛋白的顯著的非特異性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記含唯一表面半胱氨酸殘基的pⅢ融合蛋白的條件和試劑，還沒有發(fā)現(xiàn)。組成噬菌體包膜的幾千種蛋白使得對化學(xué)反應(yīng)的特異性要求過高，還有由于在蛋白質(zhì)生物合成時(shí)的內(nèi)在錯(cuò)誤率，對這樣一個(gè)大的蛋白集合體，半胱氨酸錯(cuò)誤摻入的可能性變得顯著。另外，pⅢ蛋白的半胱氨酸殘基可能對交聯(lián)試劑敏感。
為了繞開這些問題，發(fā)展了兩步法，即在化學(xué)交聯(lián)之前，于修飾位點(diǎn)上選擇性形成非共價(jià)復(fù)合物(圖9和10)。復(fù)合物是異二聚體化的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)合成的堿性肽B,C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGGC和酸性肽A,GAAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQGGCPAGA，其中堿性肽A在形成異二聚體前與底物共價(jià)偶聯(lián)，酸性肽A作為與絲狀噬菌體pⅢ包膜蛋白融合的N末端融合蛋白被表達(dá)。酸性肽和堿性肽被選為二聚體化結(jié)構(gòu)域是由于它們的序列短(30個(gè)氨基酸)且具有較高的形成穩(wěn)定、平行異二聚體化卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的傾向--酸-酸和堿-堿同型二聚體的形成較異二聚體的形成效率低105倍左右(17)。合成肽(B)和噬菌體編碼肽(A)的異二聚體化將底物帶到展示酶附近，并且引起兩條肽鏈的半胱氨酸自發(fā)形成二硫鍵(圖10)。在酸性肽和堿性肽的C末端加上三肽Gly-Gly-Cys，以促進(jìn)兩個(gè)螺旋間形成二硫鍵(17)。底物通過一個(gè)彈性連接子共價(jià)結(jié)合于堿性肽B，以促進(jìn)底物與酶的生產(chǎn)性結(jié)合(圖9)。酸性肽A與噬菌體的pⅢ蛋白融合，而不是與展示酶本身結(jié)合，原因如下ⅰ)在酶中插入該酸性肽序列可能干擾酶的功能；ⅱ)堿性-連接子-肽這種彈性連接子、pⅢ蛋白的鉸鏈區(qū)、以及位于pⅢ蛋白和展示酶之間的肽連接子，應(yīng)使底物相對于酶活性中心有多種可能的定向；和ⅲ)應(yīng)能利用單個(gè)帶有該酸性肽延伸部分的輔助噬菌體展示多種酶-底物對，而不需要用基因工程為每種酶構(gòu)建一個(gè)功能性偶聯(lián)位點(diǎn)。
酸性輔助噬菌體和堿性-連接子-底物偶聯(lián)物的產(chǎn)生為了將堿性-連接子-底物偶聯(lián)物結(jié)合到噬菌體上，我們在M13K07輔助噬菌體pⅢ蛋白的N末端引入了酸性肽A。酶文庫與pⅢ包膜蛋白的N末端融合，該構(gòu)建體攜帶于噬菌粒中。輔助噬菌體超感染后，產(chǎn)生噬菌體顆粒，它們包含噬菌粒DNA但其包膜組成蛋白是由輔助噬菌體編碼的(有一個(gè)例外)。這一個(gè)例外是pⅢ蛋白，它在噬菌體的一端有4-5個(gè)拷貝。在噬菌體包裝期間，酶-pⅢ融合蛋白和酸性肽A-pⅢ融合蛋白均可產(chǎn)生；從典型制劑中得到的噬菌體顆粒攜帶一個(gè)或零個(gè)酶-pⅢ融合蛋白加上三到五個(gè)拷貝的酸性肽A-pⅢ融合蛋白。
為了生成攜帶酸性肽-pⅢ融合蛋白的噬菌體，將編碼C末端含半胱氨酸殘基的酸性肽A的DNA引入到M13K07輔助噬菌體基因Ⅲ的5’端。得到的酸性輔助噬菌體顆粒在用堿性肽B包被的ELISA-平板上的固定效率比M13K07高100多倍，提示突變的輔助噬菌體在其pⅢ蛋白上攜帶易接近的酸性氨基酸延伸序列。同樣，當(dāng)含有編碼pⅢ融合蛋白的噬菌粒的大腸桿菌被酸性輔助噬菌體超感染時(shí)，得到的噬菌體顆粒，除了展示pⅢ融合蛋白外，還展示被修飾的pⅢ延伸序列(圖10)。酸性肽的插入并不顯著地改變該輔助噬菌體的滴度或挽救效率。
結(jié)合底物的合成性堿性-連接子-肽(B)包含12殘基(GlyGlySer)4連接子，其后為組成堿性序列的30個(gè)氨基酸(圖9)。堿性-連接子-肽在N-末端和C末端還有半胱氨酸，它們分別使肽與底物高效、選擇性地結(jié)合及使肽與噬菌體形成二硫鍵(圖9和圖10)。合成性肽C-末端的半胱氨酸最初是由2-硝基-4,5二甲氧苯甲基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，后者可經(jīng)光化學(xué)反應(yīng)去除。這使底物通過硫醇特異性反應(yīng)(如二硫化物交換、烷化反應(yīng)或Micheal加成反應(yīng))選擇性地結(jié)合于N-末端半胱氨酸的游離硫醇基團(tuán)上。底物結(jié)合之后，C-末端半胱氨酸被光化學(xué)反應(yīng)去保護(hù)，產(chǎn)生大量的游離硫醇基，它們可與噬菌體上的酸性肽延伸序列交聯(lián)。因?yàn)榈孜锱c堿性-連接子肽的化學(xué)偶聯(lián)，及該偶聯(lián)物與噬菌體的交聯(lián)是分別進(jìn)行的，許多不同的化學(xué)物質(zhì)和反應(yīng)條件可以用來使堿性連接子肽和底物結(jié)合。而且偶聯(lián)物的成分在與噬菌體交聯(lián)之前可以純化和定性(例如通過質(zhì)譜分析)。
葡萄球菌核酸酶作為一個(gè)模型系統(tǒng)葡萄球菌核酸酶是一種已知酶，由149個(gè)氨基酸的單鏈多肽組成(18)。它在A、U-或A、T-富集區(qū)域優(yōu)先水解單鏈RNA(ssRNA)、ssDNA和雙鏈DNA的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3’磷酸和5’羥基末端(18)。Ca2+是酶活性所必須的，其提供了一個(gè)調(diào)節(jié)酶作用的機(jī)制。此外SNase被成功地以pⅢ融合蛋白的形式展示于噬菌體上(19)。
因?yàn)闆]有試劑、抗體或受體可用來輕易的區(qū)分單鏈寡脫氧核苷酸底物和它的裂解產(chǎn)物(互補(bǔ)寡核苷酸將降解)，發(fā)展了一個(gè)篩選方案，在這個(gè)方案中ssDNA底物的裂解導(dǎo)致噬菌體從固體支持相中釋放。在這個(gè)方案中一輪的篩選包括如下的步驟ⅰ)通過一個(gè)單鏈寡脫氧核苷酸將展示Snase的噬菌體結(jié)合于固體支持相(為不激活SNase，沒有Ca2+)；ⅱ)洗滌除去未結(jié)合的噬菌體；ⅲ)通過加入Ca2+啟動(dòng)裂解反應(yīng)；ⅳ)對洗脫噬菌體的分離。在篩選的后幾個(gè)循環(huán)中，洗脫可以在嚴(yán)謹(jǐn)度逐漸增加的條件下進(jìn)行，例如縮短反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度及改變pH。噬菌體與固體支持相的結(jié)合，是通過以下幾個(gè)步驟實(shí)驗(yàn)的，即5’-生物素標(biāo)記的寡脫氧核苷酸-肽B偶聯(lián)物和噬菌體上酸性肽A延伸序列之間卷曲螺旋的形成，隨后的兩個(gè)肽的二硫鍵交聯(lián)及其在鏈親和素珠上固定(圖9)。這個(gè)方案中噬菌體通過底物與固體支持相結(jié)合，需要酶或底物在與噬菌體結(jié)合期間保持無活性狀態(tài)，然后通過改變反應(yīng)條件被激活。這些改變包括調(diào)節(jié)pH值，加入輔因子或共同底物，以及底物的光化學(xué)或化學(xué)激活。生物分子縮合反應(yīng)通過形成化學(xué)鍵導(dǎo)致噬菌體固定在固體支持相上時(shí)，無需啟動(dòng)反應(yīng)；如果活性酶是通過產(chǎn)物特異性試劑、抗體或受體而捕獲時(shí)，也是如此。
底物和噬菌體的共價(jià)結(jié)合通過酸性輔助噬菌體超感染制備展示SNase或?qū)φ盏鞍?抗體39-All Fab片段)的噬菌體。為了評估堿性-連接子-底物偶聯(lián)物與噬菌體的結(jié)合效率，用過量的對照偶聯(lián)物“pTp”-肽B(化合物9)與噬菌體共同溫育。堿性-連接子-pTp偶聯(lián)物由生物素部分及其后的脫氧胸苷-3’,5-二磷酸(pTp)、彈性肽連接子和堿性肽序列、C末端半胱氨酸組成。在溶液中堿性-連接子-pTp偶聯(lián)物不是野生型SNase的底物(pTp是強(qiáng)效的SNase抑制劑)(20)。噬菌體和底物-肽B偶聯(lián)物首先用還原性試劑巰基乙胺(MEA)溫育，以還原噬菌體酸性肽或合成肽半胱氨酸之間的二硫鍵。然后通過PEG沉淀除去MEA和游離堿性-連接子-pTp，并加入鏈親和素磁珠。洗滌十次后，通過用磁珠感染大腸桿菌XL1-blue并滴定噬菌體檢測被固定的噬菌體數(shù)量。這種方法檢測時(shí)，展示SNase和抗體39-All Fab的噬菌體的固定效率大約為10％(圖11)。
接下來檢測在無Ca2+時(shí)，與展示Snase的噬菌體結(jié)合的寡脫氧核苷酸底物是否穩(wěn)定。堿性-連接子-寡脫氧核苷酸偶聯(lián)物與展示Snase的噬菌體結(jié)合(在EDTA存在的條件下)，固定效率的檢測同上。固定效率還是大約10％(圖11)，說明無Ca2+時(shí)，結(jié)合的寡脫氧核苷酸底物沒有被SNase裂解。如果一些噬菌體當(dāng)與磁珠結(jié)合時(shí)喪失了感染性，那么真正的固定效率很可能高于檢測到的結(jié)果。通過加入DNaseⅠ可檢測這個(gè)觀點(diǎn)，DNaseⅠ可以裂解結(jié)合的寡脫氧核苷酸底物，并釋放被固定的噬菌體。如圖11所示，大部分被固定的噬菌體是非感染性的，但當(dāng)加入DNaseⅠ后，變?yōu)楦腥拘?，說明真正的固定效率大約為80％(圖11)。如果沒有包括寡脫氧核苷酸-肽B偶聯(lián)物，被固定的噬菌體少于0.01％；如果用野生型M13K07輔助噬菌體超感染，被固定的噬菌體大約為0.3％。因此將底物結(jié)合于噬菌體pⅢ蛋白的兩步法是高效的、且高度位點(diǎn)特異性的方法。
噬菌體的酶依賴性與固體支持相分裂和富集為了檢測噬菌體展示的SNase是否能在分子內(nèi)反應(yīng)中特異性裂解結(jié)合的寡脫氧核苷酸底物，在被固定的噬菌體中加入Ca2+以激活酶。大約有15％的噬菌體被釋放(圖11)，相反僅有0.2％的展示Fab 39-All的對照噬菌體被釋放(圖11)。同預(yù)期結(jié)果一樣，這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SNase從固體支持相上裂解和釋放噬菌體的效率比對照蛋白高得多。然而在檢測時(shí)，有小部分但是明顯的噬菌體從支持相中漏出(在堿性-連接子-寡脫氧核苷酸和堿性-連接子-pTp偶聯(lián)物及兩個(gè)展示蛋白中，在沒有Ca2+的條件下觀察到這個(gè)背景滲漏，圖11)。加入Ca2+導(dǎo)致噬菌體從支持相開始爆發(fā)性釋放；然而噬菌體的釋放水平迅速降至相當(dāng)于沒有Ca2+時(shí)的滲漏水平。這個(gè)結(jié)果證實(shí)，通過分子間裂解反應(yīng)將噬菌體釋放到溶液中時(shí)，并不釋放其它噬菌體，如通過分子內(nèi)裂解作用釋放的那樣。因此即使用象Snase這樣活性很高的酶，也不會(huì)有明顯的交叉反應(yīng)性。
上述分析說明，有可能從展示催化性失活蛋白庫樣集合體的噬菌體中富集展示SNase的噬菌體。為檢測這一點(diǎn)，以1∶100的比例混合展示SNase和Fab 39-All對照蛋白的噬菌體，與寡脫氧核苷酸-肽B交聯(lián)并固定。與Ca2+一起溫育后，回收的噬菌體比例為22∶18，它相當(dāng)于富集系數(shù)稍微高于100。通過五輪的篩選和擴(kuò)增，這個(gè)富集程度足以從含1010個(gè)成員的文庫中分離一個(gè)有活性的催化劑。
通過減少噬菌體從支持物中漏出，很可能提高富集系數(shù)。這種漏出可能由鏈親和素從支持物中的釋放引起，或者由合成肽和噬菌體編碼肽之間的二硫鍵的還原或錯(cuò)誤形成引起。我們目前探討了這些可能性?；蛘?，可通過增加酶-催化的裂解反應(yīng)的程度而提高富集系數(shù)。在噬菌體生成的條件下，由輔助噬菌體表達(dá)的pⅢ與由噬菌粒表達(dá)的pⅢ融合蛋白的比例使大部分的噬菌體僅攜帶野生型pⅢ蛋白，僅一小部分噬菌體攜帶pⅢ融合蛋白。簡單地通過增加展示所述酶的噬菌體的數(shù)量，就可以增加自我裂解的噬菌體的數(shù)量。對在此描述的噬菌粒/輔助噬菌體組合，我們估計(jì)僅約15％的噬菌體為單價(jià)體。通過適當(dāng)?shù)妮d體設(shè)計(jì)和噬菌體制備，有可能將平均展示增加到每個(gè)噬菌體約一個(gè)蛋白。這將使裂解和滲漏的比率增加7倍，因此將活性酶對非活性酶的富集系數(shù)從目前的約100增加到約700。
為了檢測在此描述的篩選方案是否適用于有小分子底物參與的反應(yīng)，一個(gè)pTpTp-肽B偶聯(lián)物(化合物10)被結(jié)合到展示SNase或?qū)φ盏鞍椎氖删w上。通過上述的富集步驟攜帶噬菌體，并再一次富集展示SNase的噬菌體。用MALDT-ToF質(zhì)譜分析顯示pTpTp底物在兩個(gè)胸苷之間的磷酸二酯鍵處被裂解；沒有檢測到副產(chǎn)物。因此表明這個(gè)方法對大分子和小分子底物均適合。我們目前正在探討從酶或抗體文庫中分離新催化劑的可能性。
大部分在噬菌體上展示的酶文庫需要用M13K07等輔助噬菌體超感染。因此在此描述的篩選方案可以直接應(yīng)用于這些文庫--僅需要在用酸性肽輔助噬菌體超感染噬菌粒編碼的文庫后制備噬菌體，并使所選底物與堿性肽B偶聯(lián)。同樣，這種方法可以應(yīng)用于結(jié)構(gòu)上不同的蛋白群體?；蚪M編碼蛋白就是這樣的群體。例如，用這種篩選方案應(yīng)能從基因組蛋白文庫中分離具有指定底物特異性的天然激酶。這類功能性克隆(其中天然酶及其編碼基因根據(jù)其催化活性分離)應(yīng)該能應(yīng)用于天然酶催化的許多反應(yīng)。
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實(shí)施例2用噬菌體展示型脂酶作催化劑，以寡聚DNA(DNA oligo)為XY交換對分離脂酶變體。這是圖8所述篩選方案的實(shí)施例。
噬菌粒構(gòu)建用絨毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂酶基因(SP40)作為模板，以Fwd:GTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTAACCAGTTC,Rev:CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGTGCGGCCGCAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTACC為引物進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物用SfiⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶消化，并插入SfiⅠ和NotⅠ消化的噬菌粒pFab5C(φrum等.,1993,NAR 21:4491-4498)中。得到的噬菌粒pFab-SP400攜帶一個(gè)融合基因，該融合基因包含(從N末端讀)pelB信號序列(劃線部分)、成熟脂酶編碼基因和始于氨基酸殘基198的pⅢ基因(劃線部分)。pFab-SP400脂酶文庫包括大量的這類噬菌粒構(gòu)建體，其脂酶的氨基酸序列有差異。
噬菌體顆粒的產(chǎn)生按φrum等的方法略作修改(見上面)制備噬菌體顆粒。簡言之，用pFab-SP400脂酶文庫感染大腸桿菌Top10F’，在含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)。在OD600為0.5時(shí)，加入酸性輔助噬菌體(一種M13K07衍生物，在pⅢ的N末端上攜帶一段30’聚體酸性肽序列，見Pedersen等，美國國家科學(xué)院院刊(1998)，出版中)，終濃度為1.5×108cfu/mL,37℃溫育20分鐘。細(xì)胞沉淀并重懸于含5μMIPTG,100μg/mL氨芐青霉素，50μg/mL卡那霉素的LB中，37℃振蕩培養(yǎng)6-8個(gè)小時(shí)。沉淀細(xì)胞并用PEG沉淀上清中的噬菌體顆粒，隨后重懸于TBS(25mMTris-HCl,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM KCl)中。重復(fù)沉淀和重懸步驟，最后將噬菌體菌過濾。
堿性-連接子-DNA偶聯(lián)物(“堿性-連接子-X”)的合成合成光保護(hù)和F-moc保護(hù)的化合物F-moc-S-(2-硝基-4,5-二甲氧苯甲基)-L-半胱氨酸1。將得到的粗產(chǎn)物真空充分干燥，直接用于合成堿性-連接子-肽C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKK-LAQGGC(劃線的為堿性序列，黑體為光保護(hù)的半胱氨酸)。用5＇-硫醇(5＇-Thiol-Modifier C6,Glen Research)合成具有近似長度和序列5＇-SH-GGGAAGAACCC-3＇的寡聚DNA，用反向HPLC純化，從樹脂中洗脫。按照Glen Research的實(shí)驗(yàn)方案去除硫醇上三苯甲基保護(hù)的基團(tuán)。凍干產(chǎn)物，溶于水并結(jié)合于堿性-連接子-肽，方法如下堿性連接子多肽和20倍摩爾過量的N,N＇-雙(3-丙酰馬來酰亞氨基)-2-羥基-1,3-丙二胺在pH5.5的磷酸鈉緩沖液中4℃氮?dú)庀路磻?yīng)約10小時(shí)。用反向HPLC從反應(yīng)混合物中純化產(chǎn)物。將緩沖液調(diào)整為磷酸鈉，pH7，加入NaCl以避免沉淀，然后加入上述的寡聚DNA，在室溫下，溶液于氮?dú)庵袦赜s10小時(shí)。產(chǎn)物用陰離子FPLC純化，產(chǎn)物級分直接用于光去保護(hù)步驟。在去保護(hù)步驟中，在C-末端半胱氨酸殘基上2-硝基-4,5二甲氧苯甲基保護(hù)的基團(tuán)通過如下的光解方法去除通過通入氬氣使被保護(hù)的偶聯(lián)物(見上)脫氣，然后在被隔膜蓋上的小瓶中暴露于汞燈30分鐘，產(chǎn)生去保護(hù)的堿性-連接子-DNA偶聯(lián)物。
DNA-pnp丁酸酯-柱基質(zhì)偶聯(lián)物的合成通過例如使硫醇化的DNA與丁酸酯或軟脂酸酯上的馬來酰亞胺反應(yīng)，將具有近似長度和序列5＇-SH-CCCTTCTT-3＇和5＇SH-TTCTTGGG的5＇-硫醇修飾的寡聚DNA與對硝基-苯基-丁酸酯或?qū)ο趸?苯基-軟脂酸酯結(jié)合，而制備該篩選方案中應(yīng)用的Y-底物柱部分。然后通過與基質(zhì)上功能性基團(tuán)的特異性反應(yīng)，將產(chǎn)物結(jié)合到柱基質(zhì)的正位或間位上。
堿性-連接子-DNA偶聯(lián)物與噬菌體的共價(jià)結(jié)合大約1010個(gè)噬菌體顆粒在含10mM EDTA、0.1％BSA、1mM巰基乙胺(MEA)和100nmole堿性-連接子-DNA的4mL TBS中37℃溫育60分鐘，然后PEG沉淀兩次，重懸于脂酶緩沖液(50mM Tris-HCl,pH7.5,0.3mMCaCl,0.1mM MgCl2,0.1％Triton X-100)。
被堿性-連接子-DNA偶聯(lián)物結(jié)合的噬菌體預(yù)分類為去掉未被堿性連接子-DNA偶聯(lián)物結(jié)合的噬菌體，將已如上述實(shí)施了共價(jià)結(jié)合步驟的噬菌體加載在帶寡聚DNA的親和柱上，該DNA是堿性-連接子-DNA-偶聯(lián)物中DNA的互補(bǔ)序列(如GGGAAGAACCC序列)。收集滯留于柱上的DNA。
分離文庫中活性最強(qiáng)的脂酶。
其中“DNA-pnp丁酸酯”已與基質(zhì)結(jié)合的柱在脂酶緩沖液中平衡。然后，結(jié)合了堿性-連接子-DNA偶聯(lián)物(見上面)的噬菌體顆粒被加載在柱上。對每個(gè)收集組分進(jìn)行滴定檢測；含大量噬菌體的遷移最快的組分中應(yīng)該含有攜帶活性更強(qiáng)的脂酶的噬菌體。
實(shí)施例3用可PCR擴(kuò)增的DNA文庫，以寡聚DNA作為XY交換對(Y交換單元由兩個(gè)寡聚DNA,Y1和Y2組成，它們在X寡聚體的結(jié)合部位有重疊)分離RNA裂解性脫氧核酶變體。
DNA文庫構(gòu)建用正義引物5＇-GGAAGGGATGGTCACATGCA-3＇和反義引物5＇-生物素-GTCAGTTGCCAAGCTTACCG-3＇，和模板5＇-ggaagggatggtcacatgcaCTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCCcggtaagcttggcaactgac-3＇(小寫部分為引物位點(diǎn)，斜體部分為脫氧核酶為催化基序，劃線部分為底物結(jié)合序列，黑體為X交換部分)進(jìn)行PCR。通過重復(fù)過鏈親和素親和柱(Genosys,TheWoodlands Texas)，將PCR產(chǎn)物固定，用幾個(gè)柱體積的洗滌緩沖液(1MNaCl,0.1mM EDTA,50mM Tris-HCl pH7.5)洗滌，用100mM NaOH洗脫非生物素標(biāo)記鏈。用乙醇沉淀單鏈DNA分子，用于下述基于柱的篩選方法。上述(“野生型”)序列的ssDNA分子在依賴Mg2+的反應(yīng)中裂解序列為5＇r(GGAAAAAGUAACUAG)-3＇的RNA分子。脫氧-核酶文庫(見下)包括大量的這類ssDNA分子，它們在引發(fā)位點(diǎn)的序列中有差異。
Y-RNA靶-基質(zhì)柱的制備通過重復(fù)過鏈親和素親和柱，將序列為5’-生物素化-d(TACACG)-r(GGAAAAAGUAACUAG)-d(TTAGTGTCTCACCATCATCC)-3’和5’-生物素化-d(TACACG)-r(GGAAAAAGUAACUAG)-d(TTAGTGTCTCGTGAATCCCT)-3’(Oligos Etc.,USA)的兩種DNA/RNA寡聚物混合的等克分子溶液固定，用幾個(gè)柱體積的洗滌緩沖液(1M NaCl,0.1mM EDTA,50mM Tris-HClpH7.5)洗滌。黑體部分為Y交換部分Y1和Y2。
分離ssDNA文庫中活性最強(qiáng)的RNA-裂解性脫氧-核酶將ssDNA文庫(見上面)加載在鏈親和素柱上，在該柱中已將Y1-RNA-生物素和Y2-RNA-生物素靶底物(見上)固定在洗滌緩沖液中。用幾倍柱體積的洗滌液平衡后，用反應(yīng)緩沖液過柱，持續(xù)一段時(shí)間。收集級分，并測定DNA含量(例如用紫外檢測)。包含顯著量DNA的最快遷移級分應(yīng)含有攜帶最強(qiáng)活性、鎂依賴的RNA-裂解性分子的DNA。
實(shí)施例4催化羥醛形成的酶的最優(yōu)化。在這個(gè)實(shí)施例中，X單位包含一個(gè)多組氨酸環(huán)和相關(guān)金屬離子Y單位由雙配位配體(乙二胺)組成。
一種酮底物與乙二胺(EDA)部分結(jié)合，該酶攜帶一個(gè)多組氨酸環(huán)。當(dāng)酮和酶在有適當(dāng)金屬離子(如Fe)存在的條件下混合時(shí)，多組氨酸與金屬離子將形成動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的相互作用。EDA-酮將競爭多組氨酸-結(jié)合金屬的剩余兩個(gè)配位位點(diǎn)。有醛縮酶活性的酶可促進(jìn)酮與帶乙醛的酶在柱緩沖液中的結(jié)合，以形成羥醛產(chǎn)物。通常，該羥醛有一定頻率的脫水現(xiàn)象，從而形成一個(gè)α,β-不飽和酮。這一偶聯(lián)的烯烴能與柱上的游離硫醇基發(fā)生Micheal加成反應(yīng)，從而將酶固定。然而，緩沖液中的EDA-酮偶聯(lián)物將與固定的酶交換，將酶以其原始底物結(jié)合形式釋放。在這個(gè)過程中，His*金屬-EDA代表X-Y，產(chǎn)物結(jié)合部分是親核體，它在水分消失后捕捉產(chǎn)物。因而所述篩選方案將篩選能有效催化羥醛和脫水反應(yīng)的酶。
實(shí)施例5適合于引入實(shí)施例1所述噬菌體展示系統(tǒng)的XY交換對的實(shí)施例。
如實(shí)施例1中所述的噬菌體展示系統(tǒng)中XY的“實(shí)施方案”方案1按照實(shí)施例1的指示合成堿性-連接子-X，不同的是此處X是與堿性連接子肽結(jié)合，不是與底物結(jié)合(見上面實(shí)施例2)。如實(shí)施例1中描述的方法，將堿性-連接子-X偶聯(lián)物與pⅢ(輔助噬菌體上)上酸性伸展區(qū)交聯(lián)(見圖12)。將Y和底物偶聯(lián)，并進(jìn)行篩選(見上面實(shí)施例2)。
方案2將4、5或6個(gè)組氨酸引入輔助噬菌體pⅢ的N末端，或者引入到pⅢ的一個(gè)暴露的環(huán)上(His4和金屬離子組成X部分)。通過一個(gè)彈性連接子(如聚乙二醇)使底物與金屬配體結(jié)合(如雙配位體或三配位體)。在指定金屬離子存在的條件下，混合噬菌體和金屬配位的底物，然后進(jìn)行篩選(見圖12B)。
方案3將酸性肽序列或His4肽序列插入到噬菌體的酶-pⅢ融合蛋白上，優(yōu)選在連接pⅢ和酶的連接子上插入。如上繼續(xù)。
常規(guī)蛋白中的XY“實(shí)施方案”方案1將酸性肽或His4序列引入到酶的一個(gè)暴露的環(huán)上，或其C-或N-末端上。如上繼續(xù)。
方案2在酶上引入一個(gè)唯一的半胱氨酸殘基(在DNA水平上)，通過硫醇特異性反應(yīng)(如，二硫鍵的形成、馬來酰亞胺加成反應(yīng))與X部分結(jié)合，如上繼續(xù)。
實(shí)施例6特別適合于引入噬菌粒-肽、多聚核糖體-肽或mRNA-肽系統(tǒng)中的一個(gè)交換對的實(shí)施例。在下面敘述了交換對-底物如何與噬菌粒系統(tǒng)(Schatz等，.1996，酶學(xué)方法，第267卷，171-191頁)、多聚核糖體-肽系統(tǒng)(Mattheakis等，1994，美國國家科學(xué)院院刊，第91卷，9022-9026頁；He和Taussig,1997，核酸研究，第25卷，5132-5134頁)或mRNA-肽系統(tǒng)(Roberts和Szostak,1997，美國國家科學(xué)院院刊，第94卷，12297-12302頁)中的酶結(jié)合。在這里以mRNA-肽融合系統(tǒng)為例。
設(shè)計(jì)DNA模板，使mRNA-蛋白融合體中mRNA的一部分成為X單位(如，在模板DNA中包括DNA序列5＇-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAACCCG-3＇)，見圖13A。使指定底物與DNA Y單位結(jié)合(例如將底物與Y1 3’-TTACTTCCCGTTGGGC-5’和Y2 3＇-CGGCTTCGCGTTACTT-5＇兩種寡聚體的混合物結(jié)合)。使mRNA-肽融合體沉淀后，將mRNA-肽融合體(攜帶X單位)和底物偶聯(lián)物(攜帶Y單位)混合，例如通過與產(chǎn)物結(jié)合柱混合進(jìn)行底物再加載篩選(見圖2)。
或者，X單位可以是連結(jié)mRNA和編碼肽的連接子的一部分(如在連結(jié)mRNA和肽的連接子中包括序列5＇-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAACCCG-3＇)，見圖13B。然后與底物偶聯(lián)物混合，如上進(jìn)行底物再加載篩選。
實(shí)施例7在產(chǎn)生較低活性蛋白酶變體的細(xì)胞背景中富集產(chǎn)生較高活性蛋白酶的細(xì)胞在這個(gè)實(shí)施例中，獨(dú)立單元包括一個(gè)細(xì)胞、通過XY交換單位結(jié)合到細(xì)胞表面的底物和由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的酶(圖14)。在周圍介質(zhì)中游離的Y-底物持續(xù)取代結(jié)合于細(xì)胞表面的底物。從而因所分泌的酶的局部濃度在結(jié)合酶分泌細(xì)胞的底物附近高于結(jié)合任何其它細(xì)胞的底物附近，故結(jié)合活性酶分泌細(xì)胞的產(chǎn)物比結(jié)合低活性酶分泌細(xì)胞的產(chǎn)物更多。
底物可以通過多種途徑結(jié)合于細(xì)胞表面。例如，磷脂、脂肪酸、固醇、膽固醇酯等可與靶反應(yīng)的底物一起衍化。當(dāng)與細(xì)胞溫育時(shí)，這些分子輕易地定位于膜內(nèi)部，并且在細(xì)胞表面暴露底物?；蛘叩孜锟梢院团c細(xì)胞表面物質(zhì)相互作用的交聯(lián)試劑一起衍化。最后，底物可與結(jié)合于膜組分(如多糖或膜蛋白)的結(jié)構(gòu)(如蛋白、抗體等)一起衍化。
以下述例子舉例說明本原理，其中獨(dú)立單元由細(xì)胞(如芽孢桿菌)、結(jié)合的底物(肽)和分泌的酶(蛋白酶)組成。His6-金屬-IDA或His6-金屬-NTA復(fù)合物作為XY交換單位。篩選是在柱中進(jìn)行。用含蛋白酶靶序列的肽包被柱基質(zhì)，肽的一端與柱基質(zhì)結(jié)合，另一端攜帶一個(gè)多組氨酸(His6)。
實(shí)驗(yàn)按如下步驟進(jìn)行。分泌目的蛋白酶(如地衣芽孢桿菌C組分或市售Savinase蛋白酶)的芽孢桿菌細(xì)胞在指數(shù)生長期收集，重懸于適當(dāng)?shù)木彌_液中，用可以與細(xì)胞表面組分交聯(lián)的雙功能分子共同溫育。雙功能分子可以是與亞胺基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)部分結(jié)合的羥基琥珀酰亞胺(NHS)。NHS與細(xì)胞表面共價(jià)錨定IDA或NTA部分的伯胺反應(yīng)。
用靶向目的蛋白酶的肽(例如靶向C組分時(shí)，肽序列為IELSEPIGNTVCHHHHHH)包被或衍生用于分離細(xì)胞的適當(dāng)柱基質(zhì)(如Sepharose或Sephadex)。該肽的一端攜帶多組氨酸延伸區(qū)，另一端結(jié)合于柱基質(zhì)(例如通過N末端氨與NHS活化的Sepharose(Pharmacia Biotech)的相互作用)。
將適當(dāng)?shù)木彌_液中(例如，加入了Ni++、Zn++、Cu++或Co++的2×TY或LB培養(yǎng)基；溫度為35-50℃)的IDA-或NTA修飾細(xì)胞加載在肽修飾柱上，流速保持在0.5mL/min以下。
形成His6-金屬-IDA(或His6-金屬-NTA)復(fù)合物，并因此使蛋白酶底物結(jié)合于細(xì)胞。如果細(xì)胞分泌活性蛋白酶，這些酶裂解靶位點(diǎn)并從柱基質(zhì)中釋放細(xì)胞；還有，His6-金屬-IDA(或His6-金屬-NTA)復(fù)合物迅速被平衡，導(dǎo)致用新的底物持續(xù)取代底物或產(chǎn)物。因此分泌更有效的酶的細(xì)胞或分泌活性酶更多的細(xì)胞，首先在柱的底部洗脫。
按如下步驟檢測了其原理。用上述方法檢測，分泌大量蛋白酶變體的細(xì)胞或分泌不同量的相同蛋白酶的細(xì)胞，并且按上述方法進(jìn)行底物再加載。分泌更有效酶的細(xì)胞或分泌更多活性酶的細(xì)胞首先洗脫。
該原理如下檢驗(yàn)。分泌多種蛋白酶變體的細(xì)胞，或分泌不同量的同種蛋白酶的細(xì)胞如上述處理，并如上述實(shí)施底物再加載方案。分泌更有效酶的細(xì)胞或分泌最多蛋白酶的細(xì)胞被首先洗脫。
用固定在柱基質(zhì)上和細(xì)胞表面IDA-(或NTA-)偶聯(lián)物上的底物濃度控制篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性。在不同條件如鹽濃度、pH值或溫度下表達(dá)或活性改善了的變體可以用這種方法分離。
實(shí)施例8用DNA/RNA雜合二聚體作為XY交換對，以Y-單位的一部分作為靶底物，分離錘頭型核酶。
錘頭型核酶是天然核酶，其裂解特定磷酸二酯，產(chǎn)生3＇-環(huán)磷酸和5＇羥基末端，速率(Kcat)接近1min-1(Stage-Zimmermann等，1998,RNA第4卷，875-89頁)。其特異性由核酶和靶序列之間簡單的Wason-Crick堿基配對介導(dǎo)，因?yàn)榱呀鈱Π行蛄械奈ㄒ灰笫荱后的堿基為A、U或C，所以事實(shí)上，錘頭型核酶可以被設(shè)計(jì)來裂解任何RNA分子。然而，錘頭型核酶用于治療有一個(gè)主要缺點(diǎn)，當(dāng)為了增加特異性而延長兩個(gè)二聚體時(shí)，結(jié)束速率顯著下降，并且核酶不能轉(zhuǎn)化。為了尋找顯示增加的裂解率的錘頭型核酶變體，其他人在含隨機(jī)序列的RNA庫中進(jìn)行了體外篩選(Vaish等，1997，生物化學(xué)，第36卷，6495-501頁)。然而在所有已報(bào)道的研究方案中的篩選方案都是以單輪裂解為基礎(chǔ)。利用底物再加載策略，核酶必須從待由柱中洗脫的固定基質(zhì)中將其本身釋放多次。為了使核酶裂解后迅速釋放底物，在下述的實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了鹽濃度、溫度和二聚體長度。釋放的核酶迅速結(jié)合于被兩個(gè)由5bp螺旋堆積成的共軸所穩(wěn)定的新靶標(biāo)上。Y被核酶裂解成兩半，因此使XY相互作用不穩(wěn)定，由此完成了快速X-Y交換(見圖3A)。當(dāng)緩沖液持續(xù)流過柱時(shí)，更快裂解的核酶首先洗脫。
為了消除潛在的對RNA分子的篩選，即由于競爭性的內(nèi)部結(jié)構(gòu)或錯(cuò)誤折疊，這些RNA與底物結(jié)合慢(因此被迅速洗脫)，可以選擇進(jìn)行預(yù)篩選(圖15,B)，篩選出與非裂解性DNA-底物寡聚物有效相互作用的分子。
為了證實(shí)其原理，我們在核酶的保守核心區(qū)選擇了7個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)化(見圖15)。這相當(dāng)于16384個(gè)不同的分子，其中一個(gè)相應(yīng)于野生型錘頭型核酶，其裂解速率約為1min-1(Stage-Zimmermann等，1998,RNA，第4卷，875-89頁)。因?yàn)樵谙率龅膶?shí)驗(yàn)中我們的文庫包含1013個(gè)以上的RNA分子，我們預(yù)期能分離到野生型核酶或至少具有野生型核酶速率的核酶。
實(shí)驗(yàn)概述材料1．用傳統(tǒng)技術(shù)(用隨機(jī)合成的DNA寡聚物作為模板，用T7 RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄)制備RNA文庫(約100微克)。文庫用PAGE純化，重新溶解于柱緩沖液中，分成每份10微克，-80℃保存。
2．用于結(jié)合底物寡聚體(通過2-氨基-1-(2-pyrridyldithio)-乙烷)的NHS活化的Sepharose和硅化玻璃柱(0.2cm×10cm)。
3．通過傳統(tǒng)的化學(xué)方法合成底物寡聚RNA(圖15)，并用HPLC純化。在5＇末端連結(jié)一個(gè)5＇-硫代磷酸-HEG-間隔臂(5＇硫代磷酸-HEG間隔臂-AGCUGUCACUCC-3＇)。
4．基于脫氧核苷酸的反向篩選DNA寡聚體(圖15B)是通過傳統(tǒng)的化學(xué)方法合成的(5＇硫代磷酸-HEG-間隔臂-AGCTGTCACTCC-3＇)。
5．柱緩沖液(10mM MgCl2,50mM Tris/HCl pH7.5)實(shí)驗(yàn)步驟；(可任選進(jìn)行DNA反向篩選-步驟2-4)1．100nmol RNA底物寡聚體或100nmol反向篩選DNA寡聚體被加載在1毫升床體積的NHS活化的sepharose上，所述Sepharose用活化的二硫化物衍生化，其在一個(gè)直徑0.2厘米長10厘米的硅化玻璃柱中，并在使用前用5倍柱體積的柱緩沖液新鮮平衡。
2．RNA文庫加載在所述DNA寡聚體柱上，用10倍體積的柱緩沖液洗滌，20℃，流速為1毫升/分鐘。
3．柱溫度調(diào)節(jié)為60℃，用2倍柱體積的水洗脫RNA。
4．緩沖液調(diào)整為0.25M NaOH pH6.0，RNA用2.5倍體積EtOH沉淀并重新溶于20mL柱緩沖液。
5．將該樣品在37℃溫育5分鐘，使RNA復(fù)性，小心地加載在所述RNA柱上。為了隨后篩選的優(yōu)化，應(yīng)該將溫度調(diào)節(jié)在25-50℃范圍之內(nèi)。流速應(yīng)保持在0.5mL/min以下，以便允許所述核酶的底物再加載。
6．從柱底部收集樣品，用標(biāo)準(zhǔn)方法分別檢測核酶活性(Vaish等，1997，生物化學(xué)，第36卷，6495-501頁)。
7．利用3＇端互補(bǔ)引物將在最早收集到的表現(xiàn)出核酶活性的組分池中的核酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用上游和下游配對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在上游引物中包括T7啟動(dòng)子，它可造成隨后轉(zhuǎn)錄。將DNA池克隆在質(zhì)粒中，每個(gè)克隆均測序分析。每個(gè)克隆子的核酶通過T7轉(zhuǎn)錄而制備并檢測。
實(shí)施例9展示His標(biāo)記蛋白的噬菌體的預(yù)富集。
某些蛋白在絲狀噬菌體上展示是困難的。尤其是大分子蛋白或?qū)Υ竽c桿菌有毒性或生長抑制作用的蛋白通常具有較低的展示效率，即制備的大多數(shù)噬菌體顆粒在表面不攜帶pⅢ融合蛋白。僅在千分之一的噬菌體上展示融合蛋白的低展示效率已見報(bào)道(Jestin等，1999,Angew.Chemi.Int.Ed.第38卷，1124-1127頁；Demartis等，1999，分子生物學(xué)雜志，第286卷，617-633頁)。在這些情況中，非特異性背景將會(huì)較高，因?yàn)閿y帶pⅢ融合蛋白之編碼DNA但不在表面展示該融合蛋白的噬菌體嚴(yán)重過量。為了克服這個(gè)潛在的問題，我們在pⅢ包膜蛋白和所述酶之間引入了一個(gè)組氨酸標(biāo)簽，使得可用Ni-NTA柱層析純化展示His-標(biāo)記蛋白的噬菌體。
在下面闡述的與組氨酸標(biāo)簽用法相似的其它標(biāo)簽包括，intein-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域域融合蛋白(Chong等，1997，基因，第192卷，271-281頁)，F(xiàn)LAG肽(Slootstra等，1997，分子多樣性，第2卷，156-164頁)和麥芽糖結(jié)合蛋白(Pryor和Leiting,1997，蛋白表達(dá)和純化，第10卷，309-319頁)。
展示脂酶-His-pⅢ或纖維素酶-His-pⅢ融合蛋白的噬菌體的Ni-NTA柱純化用600μl“50mM pH8.0磷酸鈉緩沖液，300mM NaCl,1mM咪唑，0.05％BSA”平衡Ni-NTA離心柱(Qiagen Spin Kit)(700G離心2分鐘)。400μl噬菌體制劑(見實(shí)施例10和11)(約1012個(gè)噬菌體顆粒)中加入100μl“250mM pH8.0磷酸鈉緩沖液，1.5M NaCl,,0.25％BSA”，和4μl100mM咪唑，將溶液加載在預(yù)平衡過的柱上，200G離心4分鐘。用600μl“50mM pH8.0磷酸鈉緩沖液，300mM NaCl,20mM咪唑，0.05％BSA”洗滌兩次(分別為200G離心4分鐘和700G離心2分鐘)。然后噬菌體用3×333μl“50mM pH8.0磷酸鈉緩沖液，300mM NaCl,250mM咪唑，0.05％BSA”(700G離心2分鐘)洗脫。然后用PEG沉淀999μl洗脫物，重懸于400μl“50mM pH8.0磷酸鈉緩沖液，300mM NaCl,1mM咪唑，0.05％BSA”。將溶液加載在新的離心柱上，重復(fù)上述過程，只是將最后的PEG沉淀物溶于50μl pH8.0 TE緩沖液中。這個(gè)步驟使展示His-標(biāo)記蛋白的噬菌體富集約500倍。
實(shí)施例10在過量的低活性脂酶變體環(huán)境中，用噬菌體展示的脂酶和DNA寡聚體作為XY交換對，富集野生型脂肪酶。
這個(gè)篩選方案的實(shí)施例在圖10B中描述。
噬菌粒構(gòu)建使噬菌粒ph8(野生型脂酶)和ph18(脂酶S146A突變體)DNA寡聚體“Not-His6-正義鏈”(5’-GGCCGCACCAGGAGGAGGATCACATCACCATCACCATCACTC-3’)和“Not-His6-反義鏈”(5’-GGCCGAGTGATGGTGATGGTGATGTGATCCTCCTGGTGC-3’)退火，將該雙鏈產(chǎn)物連接至NotⅠ消化的pFab-SP400(見上述)和pFab-SP400-S146A(除了在146位點(diǎn)攜帶一個(gè)絲氨酸到丙氨酸的突變使其活性降低至少100倍外，與pFab-SP400相同)。得到的噬菌粒ph8(野生型脂酶)和ph18(脂酶S146A突變體)攜帶的氨基酸序列見SEQ ID NO 2(野生型)。得到的融合基因包括(從N末端讀)pelB信號序列(劃線部分)、成熟脂酶編碼基因(wt或S146A突變體)、插入序列(斜體)和6個(gè)組氨酸(黑體)以及始于氨基酸殘基196的pⅢ融合蛋白(劃線)。
噬菌體顆粒的產(chǎn)生根據(jù)φrnm等的方法(稍作修改)制備噬菌體顆粒(見實(shí)施例2)。簡言之，用噬菌粒ph8(野生型脂酶)、噬菌粒ph18(脂酶S146A突變體)或噬菌粒ph13(陰性對照，攜帶組氨酸標(biāo)記的纖維素酶，而不是脂酶，但是其它方面與ph8和ph18結(jié)構(gòu)相同)轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1blue，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含100微克/毫升氨芐青霉素、5微克/毫升四環(huán)素和2％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)。在OD600值為0.5時(shí)，加入酸性噬菌體(一種M13K07衍生物，在pⅢ蛋白的N末端攜帶30＇聚體酸性肽延伸區(qū)，見Pedersen等，美國國家科學(xué)院院刊(1998)，第95卷，10523-10528頁)至終濃度為1.5×108cfu/mL,在37℃溫育20分鐘。離心細(xì)胞并重懸于含5μM IPTG(對ph13為100mMIPTG),100μg/mL氨芐青霉素，50μg/mL卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。離心細(xì)胞，上清中的噬菌體顆粒經(jīng)PEG沉淀3次，重懸于400微升TE緩沖液中(10mM Tris-HCl pH8；1mM EDTA)。
在堿性-連接子-X和噬菌體共價(jià)結(jié)合之前(見下面)，按照實(shí)施例9的方法，富集展示脂酶變體的噬菌體。這種方法一般可獲得最初噬菌體之0.04-0.2％的回收率；我們估計(jì)超過90％的回收噬菌體展示脂酶。
在噬菌體上展示組氨酸標(biāo)記的活性脂酶為了證實(shí)制備的噬菌體展示脂酶-pⅢ融合蛋白，用抗組氨酸標(biāo)記的抗體(五-His抗體，Qiagen)、抗脂酶蛋白抗體或作為陰性對照的抗無關(guān)淀粉酶抗體包被微滴板的各個(gè)孔。每孔加入大約109個(gè)展示非組氨酸標(biāo)記的野生型脂酶(ph13)、組氨酸標(biāo)記的野生型脂酶(ph8)或組氨酸標(biāo)記的脂酶S146A突變體(ph18)的噬菌體。結(jié)果表明同預(yù)期的一樣，ph8和ph18均展示組氨酸標(biāo)簽，非組氨酸標(biāo)記的野生型脂酶沒有明顯地結(jié)合于抗His抗體(見圖16)。同預(yù)期地一樣，突變和野生型脂酶均被固定在抗脂肪酶抗體上。最后，沒有脂肪酶變體被固定在無關(guān)抗體上。因此可以得出結(jié)論，ph8和ph18編碼可在噬菌體表面正確折疊的脂酶-組氨酸標(biāo)簽-pⅢ融合蛋白。組氨酸標(biāo)記的噬菌體(ph8和ph18)按實(shí)施例9中敘述的方法通過Ni-NTA柱純化。富集步驟預(yù)期產(chǎn)生幾乎完全由展示His-標(biāo)簽蛋白的噬菌體組成的噬菌體群體。這個(gè)過程包括兩個(gè)連續(xù)的Ni-NTA柱純化步驟，第一輪可重復(fù)性地回收輸入量的0.2-0.3％，第二輪回收輸入量的10-20％。這些數(shù)目說明得到的主要是展示蛋白的噬菌體，并且最終的噬菌體群體幾乎由均展示蛋白的噬菌體組成。最后，在亮綠平板檢測中，含野生型脂酶-His-pⅢ融合蛋白的細(xì)胞顯示脂酶活性，而含脂酶S146A-pⅢ融合蛋白的細(xì)胞則無活性。因此可以暫時(shí)認(rèn)為ph8展示有活性的正確折疊的野生型脂酶；ph18-噬菌體展示正確折疊的活性降低的脂酶S146A突變體。
堿性-連接子-DNA(“堿性-連接子-X”)偶聯(lián)物的合成。
堿性連接子肽C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGGC與DNA寡聚體“X-26聚體”(HS-5＇-ATTAAATTAGCGCAATGAAGGGCAAC-3＇)的5＇硫醇結(jié)合，并被光去保護(hù)，按Pedersen等(美國國家科學(xué)院院刊(1998),95,10523-10528)描述的方法進(jìn)行。劃線的序列組成X部分。得到的偶聯(lián)物稱為“堿性-X-26聚合體”。
Y-底物-生物素偶聯(lián)物的合成制備異功能性分子(39)(見圖17)，其在一端含馬來酰亞胺部分，在另一端含生物素，在中間有作為脂酶底物的一種酯。ω-氨基十二烷酸首先以其與生物素-NHS偶聯(lián)的甲基酯形式(40)被保護(hù)，隨后水解，釋放生物素-酸(41)。通過馬來酰亞胺與6-羥基己胺的反應(yīng)，制備馬來酰亞胺醇。在(41)和(42)之間酯化，產(chǎn)生靶底物(39)。最后，化合物(39)與Y1 DNA寡聚體(5＇-SH-AATAAATAAACGGGTTGCCCTTCATT-3＇)或Y2 DNA寡聚體(5＇-TTCATTGCGCTTCGGCAAATAAATAA-SH-3＇)結(jié)合。劃線序列組成Y1和Y2交換部分。
堿性-連接子-DNA偶聯(lián)物與噬菌體的共價(jià)結(jié)合X-26聚體偶聯(lián)物(見上面)與Ni-NTA純化的噬菌體(見上面)共價(jià)結(jié)合，例如可通過上面實(shí)施例1的方法。為了確保偶聯(lián)度較高，從偶聯(lián)反應(yīng)中得到的噬菌體可選擇再次純化。這包括噬菌體與鏈親和素包被的磁珠退火，所述磁珠上固定了與X-26聚體互補(bǔ)的生物素化寡聚體。洗滌幾次除去沒有與X-26聚體結(jié)合的噬菌體，增加溫度，使DNA二聚體解鏈并釋放結(jié)合的噬菌體。
分離活性更高的脂酶Y1-底物-生物素和Y2-底物-生物素偶聯(lián)物與用鏈親和素衍生的基質(zhì)(例如固定在4％瓊脂糖上的鏈親和素，Sigma)混合，濃度為1-10μM，在室溫下溫育1-2小時(shí)。洗滌柱子，在緩沖液中加入與26聚體偶聯(lián)物結(jié)合的噬菌體，在20-35℃溫度下，這種緩沖液允許脂酶有活性以及有效的退火(其含有MgCl2和CaCl2)?；蛘咧苯釉谥线M(jìn)行結(jié)合步驟。與噬菌體結(jié)合的X-26聚體DNA與Y1-或Y2-底物一生物素分子退火，通過底物固定在基質(zhì)上。展示有催化活性的脂酶的噬菌體將裂解底物，并在柱子中持續(xù)遷移，依靠與另一個(gè)Y1-或Y2-底物的相互作用，交換反應(yīng)可以發(fā)生，并將再一次固定噬菌體。催化活性低的脂酶與給定底物的結(jié)合時(shí)間長，因此催化活性高的噬菌體比活性低的噬菌體遷移速度更快，因此可以先在柱底部收集。
實(shí)施例11用纖維素酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)作為X單位，用Avicel(纖維素)基質(zhì)作為底物和Y-單位，在低活性突變纖維素酶的環(huán)境中富集在絲狀噬菌體上展示的野生型纖維素酶C6B。
噬菌粒的構(gòu)建噬菌粒ph7(克隆載體)DNA寡聚物“Not-His-正義鏈”(見上面)與“Not-His6-反義鏈”(見上面)退火，將雙鏈產(chǎn)物連接至用NotⅠ消化的pFab5c.His(φrum等，1993，核酸研究，第21卷，4491-4498頁)，生成噬菌粒ph7?；旧?，這可導(dǎo)致在pⅢ包膜蛋白的N末端上加入氨基酸序列APGGSHHHHHHS(劃線部分為組氨酸標(biāo)簽)。
噬菌體ph13(野生型纖維素酶)在編碼Humicola insolens的野生型纖維素酶C6B的合成DNA構(gòu)建體上進(jìn)行PCR，引物為NcoⅠ-纖維素酶-fwd:5’-CGACATGCCATGGCGCAGTCCGGCAATCCGTTCTCNotⅠ-纖維素酶-bck:5’-CCTTTAGAGCCTGCGGCCGCGCCTCCTGGGAGGCACTGGCTGTACCAC產(chǎn)物用NcoⅠ和NotⅠ消化，并引入NcoⅠ和NotⅠ消化的ph7(見上面)，得到ph13。
噬菌粒ph14(纖維素酶D316A)構(gòu)建方法與ph13一樣，只是用帶有D316A突變的DNA分子作為模板。
噬菌粒ph16(纖維素酶D139A,D136A)首先進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)，其中一個(gè)PCR的模板含D316A突變(見上面)，引物為D139A-fwd:5’-GCTGTGATTCTGGAACCCGCGGCCATC-GGCAACATGGTGACNotⅠ-纖維素酶-bck:5’-CCTTTAGAGCCTGCGGCCGCGCCTCCTGGGAGGCACTGGCTGTACCAC。
另一個(gè)PCR用相同的模板，但引物為NcoⅠ-纖維素酶-fwd(見上)D139A-bck:5’-GTCACCATGTTGCCGAT-GGCCGCGGGTTCCAGAATCACAGC這兩個(gè)PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，并作為模板，以“NcoⅠ-纖維素-fwd”和“NcoⅠ-纖維素-bck”(見上面)為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。得到的PCR產(chǎn)物用NcoⅠ和NotⅠ消化，并引入NcoⅠ和NotⅠ消化的ph7(見上面)。得到的融合基因序列見SEQ ID NO 3(給出野生型序列；以pelB的第一個(gè)密碼子開始，以pⅢ蛋白的終止密碼子結(jié)束)這對應(yīng)于下面的融合蛋白(從N端開始讀)pelB肽，纖維素C6B，組氨酸連接子，pⅢ包膜蛋白。
噬菌體ph17(纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CBD)用編碼Humicola insolens的野生型纖維素酶C6B的合成DNA(見上面)和引物“NcoⅠ-CBD-fwd”(5＇-CGACATGCCATGGCGGCGAGAGGCGCTGCCGGTTC-3＇)和“NotⅠ-纖維素酶-bck”(見上面)進(jìn)行PCR。得到的PCR產(chǎn)物用NcoⅠ和NotⅠ消化，并引入NcoⅠ和NotⅠ消化的ph7(見上面)，得到ph17。得到的融合基因序列見SEQ ID NO 4。這對應(yīng)于下面的融合蛋白(從N末端開始讀)pelB引導(dǎo)肽，CBD結(jié)構(gòu)域，組氨酸標(biāo)簽，pⅢ包膜蛋白。
噬菌體顆粒的制備按實(shí)施例10中描述的方法制備噬菌體，不同的是在用輔助噬菌體超感染之后加入100μM IPTG。
組氨酸標(biāo)記的活性纖維素酶在噬菌體上被展示為了證實(shí)制備的噬菌體展示纖維素-pⅢ或CBD-pⅢ融合蛋白，用抗組氨酸標(biāo)記的抗體、抗纖維素酶C6B蛋白抗體或作為陰性對照的抗無關(guān)脂酶(SP400，見實(shí)施例2)的抗體包被微量滴定板的各個(gè)孔。將大約108個(gè)展示野生型纖維素酶(ph13)、纖維素酶D316A(ph14)、纖維素酶D316A,D319A(ph16)、CBD(ph17)或無關(guān)脂肪酶(ph3)的噬菌體，加入到各個(gè)孔中。結(jié)果表明ph13、ph14、ph16和ph17均展示His標(biāo)簽，見圖18。全長纖維素酶(ph13、ph14、ph16)與抗纖維素酶抗體結(jié)合，而CBD結(jié)構(gòu)域不與這個(gè)抗體結(jié)合。與預(yù)期的一樣，陰性對照(ph13)不與抗-His或抗纖維素酶抗體結(jié)合。同樣，纖維素酶和CBD展示噬菌體不與抗脂酶抗體結(jié)合，而展示脂酶的噬菌體(ph13)則可結(jié)合。因此，可得出結(jié)論，ph13、ph14和ph16噬菌粒編碼纖維素酶-組氨酸標(biāo)簽-pⅢ融合蛋白，并很可能在噬菌體表面正確折疊。His-標(biāo)記的噬菌體(ph13、ph14、ph16和ph17)用實(shí)施例9中的方法經(jīng)過Ni-NTA柱純化。富集步驟預(yù)期可以產(chǎn)生一個(gè)噬菌體群體，該群體幾乎完全由展示His標(biāo)記的蛋白的噬菌體組成。過程包括兩步連續(xù)的Ni-NTA柱純化，第一輪可重復(fù)地回收輸入量的不到0.1％，第二輪回收輸入量的近20％。這些數(shù)目說明得到的主要是展示蛋白的噬菌體，并且最終的噬菌體群體幾乎均由展示蛋白的噬菌體組成。最后，在液體CMC-剛果紅纖維素酶活性檢測中，進(jìn)一步證實(shí)攜帶表達(dá)野生型纖維素酶的噬菌粒的XL1 blue細(xì)胞提取物，顯示纖維素酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)，而表達(dá)突變的D316A纖維素酶的細(xì)胞提取物不顯示該活性。因此認(rèn)為ph13展示有活性的正確折疊的野生型纖維素酶；ph14和ph16-噬菌體展示正確折疊的纖維素酶活性降低的纖維素酶突變體。
在噬菌體展示的纖維素酶環(huán)境中底物再加載的原則Humicola insolens中的纖維素酶C6B由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，具有催化活性的核心結(jié)構(gòu)域和通過一個(gè)約25個(gè)氨基酸殘基的連接子與該核心連接的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CBD。因此我們推測當(dāng)CBD對纖維素的親和力適當(dāng)減弱時(shí)，有可能造成CBD對纖維素上不同位點(diǎn)的合理交換，并且有可能建立一個(gè)基于這種交換的以柱為基礎(chǔ)的篩選方法。在這樣的條件下，CBD將結(jié)合纖維素上的一個(gè)位點(diǎn)，并因此將核心酶固定于這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)附近(圖19)?；钚悦缚梢粤呀馀c其CBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合的纖維素束，因而使其本身釋放。而活性較低的酶才被固定在纖維素上直到相應(yīng)CBD脫離其結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)極端情況中，如果CBD與纖維素的結(jié)合非常牢固，纖維素酶將通過裂解使其本身從柱中釋放，并以CBD-纖維素束復(fù)合物的形式從柱中洗脫。在這種情況下，只需要一次底物的轉(zhuǎn)化，因此對更好的纖維素酶的選擇壓力小。在另一個(gè)極端情況中，CBD-纖維素相互作用非常弱，以至于在柱上的固定時(shí)間是由CBD-纖維素復(fù)合物的半衰期決定的，而不是酶的轉(zhuǎn)化率決定的。在這種情況下，對活性更高的酶幾乎不存在選擇壓力。
在中性pH值條件下，纖維素酶C6B的CBD與酸處理的AvicelTM(微結(jié)晶纖維素，Merck)有高度的親和力，在高pH值時(shí)，親和力低。在pH值11.6以上時(shí)，纖維素酶能夠從AvicelTM中洗脫。因此我們開始定義條件，在這個(gè)條件中，纖維素酶是有活性的，并且為了獲得多次轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，CBD的結(jié)合性適當(dāng)降低，這將區(qū)別不同比活性的纖維素酶。
展示的纖維素酶的CBD結(jié)構(gòu)域與AvicelTM柱材料結(jié)合我們希望用CBD-纖維素相互作用作為一個(gè)XY交換單位的簡單模型。因此，檢測了CBD結(jié)構(gòu)域與磷酸膨脹的AvicelTM可逆結(jié)合的能力。約1mg酸膨脹的AvicelTM和Sephacryl混合，得到約2mL的柱床體積。Ni-NTA純化的ph17噬菌體(見上)在pH7.5磷酸鈉(Naphosphate)緩沖液中再加載于凝膠上，并在pH值逐漸增高的條件下(同下面的條件一樣)，用幾倍柱體積的緩沖液洗滌。展示無關(guān)脂酶的對照噬菌體在第一個(gè)洗脫級分中收集，直到幾倍柱體積的pH值11.6的磷酸鈉洗脫之后，ph17噬菌體才被洗脫(數(shù)據(jù)未顯示)。因此在中性pH下，在噬菌體上展示的CBD結(jié)構(gòu)域與酸膨脹的Avicel結(jié)合，在pH值11.6的條件下，親和力將下降，CBD被洗脫下來。
活性纖維素酶的富集超過低活性纖維素酶接下來，我們在AvicelTM/SephacrylTM柱上加載了約1∶1混合的Ni-NTA純化的展示野生型纖維素酶(ph13)或D139A,D316A突變的纖維素酶的噬菌體(ph16)，制備方法同前。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中溫度為50℃。上樣緩沖液為pH7.520mM磷酸鈉緩沖液，0.05％BSA,0.05％吐溫。用1倍柱體積的pH7.520mM磷酸鈉緩沖液，0.05％BSA,0.05％吐溫，500mM NaCl和1倍柱體積的pH8.5 20mM Tris-HCl,0.05％BSA,0.05％吐溫，200mM NaCl洗滌之后，在接下來的6個(gè)柱體積中將pH值增加到10.6。最后pH值增加到11.6。收集級分，檢測每個(gè)級分中噬菌體的效價(jià)。通過PCR反應(yīng)，然后用PstⅠ消化并在瓊脂糖凝膠上分析，檢測ph13∶ph16的比率。D136A突變引入了一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)，因而用PstⅠ消化將產(chǎn)生兩個(gè)較小的片段。在瓊脂糖凝膠上，上面和中間條帶的強(qiáng)度比因此相當(dāng)于指定級分中野生型纖維素酶(ph13)對突變型纖維素酶(pH16)的噬菌體相對數(shù)量。在輸入物中ph13∶ph16的比率約為0.7。在凝膠上估計(jì)，級分1-2(相當(dāng)于pH值7.5)和級分4-11(相當(dāng)于pH值10.6/11.6)中的ph16噬菌體過量1-10倍，級分3中ph13∶ph16的比率約為1.5。因而在一個(gè)低活性纖維素酶(雙突變，ph16)的環(huán)境中，獲得了高活性酶(野生型，ph13)的近兩倍富集。應(yīng)該指出的是，所得噬菌體的52％在級分2-4中回收，在級分1和7-11中為17％，在pH值11.6的條件下，30倍柱體積洗滌后，仍然有31％的噬菌體固定在柱上。
在相似的實(shí)驗(yàn)中，我們沒有從ph14單突變體環(huán)境中富集到野生型纖維素酶。我們重復(fù)觀察到篩選的兩個(gè)階段(即，在第一個(gè)級分中ph16過量回收，然后在一個(gè)或兩個(gè)級分中ph13組分過量回收，在剩下的級分中ph16過量回收)。這兩個(gè)階段的存在，證實(shí)了這樣的推論，即當(dāng)展示纖維素酶的噬菌體通過柱時(shí)，至少發(fā)生兩個(gè)反應(yīng)CBD結(jié)構(gòu)域與纖維素結(jié)合，裂解纖維素。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，CBD-Avicel相互作用代表一個(gè)XY交換單位。這個(gè)簡單的XY單位可能沒有達(dá)到最佳首先，大部分大分子的相互作用是用慢動(dòng)力學(xué)描述的，在這個(gè)實(shí)施例中這導(dǎo)致慢速底物再加載。第二，就啟始速率和結(jié)束速率而言，CBD和纖維素的結(jié)合是通過適當(dāng)?shù)膒H值選擇進(jìn)行最優(yōu)化的，因?yàn)閜H值也影響纖維素酶的催化活性，所以這種方法不理想。這種結(jié)合可能可以用不顯著影響纖維素酶活性的其它方式調(diào)節(jié)，例如鹽濃度或高濃度去污劑的存在。如果CBD-纖維素相互作用的親和力和/或動(dòng)力學(xué)可通過這種方式進(jìn)一步優(yōu)化，這應(yīng)該可以增加篩選的嚴(yán)謹(jǐn)度，并可以分離活性水平僅有輕微差異的酶(在上述實(shí)驗(yàn)中用野生型和單突變纖維素酶代表)。
或者可以將實(shí)施例10的方法應(yīng)用于噬菌體展示的纖維素酶ⅰ)用酸性輔助噬菌體挽救噬菌體(ph13、ph14、ph16、ph17等)，ⅱ)Ni-NTA純化展示纖維素酶變體的噬菌體，ⅲ)將堿性-X-26聚體與噬菌體結(jié)合，ⅳ)在柱上固定Y-底物偶聯(lián)物(在這里底物指纖維素，例如通過β1-4鍵連接的2或6個(gè)葡萄糖單位，ⅴ)進(jìn)行底物再加載方案。這可能增加底物再加載的效率，并可分離活性有稍許差異的纖維素酶。
我們斷定即使用這種簡單CBD-纖維素交換單位，也有可能從低活性纖維素酶(ph13)背景中富集高活性纖維素酶(ph16)。
實(shí)施例12用多組氨酸標(biāo)簽作為X單位，用亞氨基二乙酸作為Y單位，在過量、低活性的RNase A肽變體背景中在珠上富集野生型RNase A肽。
為了在合成性組合文庫領(lǐng)域中檢測底物再加載原理，我們設(shè)計(jì)了一個(gè)涉及RNase A肽的簡單實(shí)驗(yàn)。合成了兩個(gè)C末端生物素化的肽，肽1和肽2，如在(Gutte等，1971，生物化學(xué)雜志，第246卷，1922-1941頁)中概述。除了N末端加入了六個(gè)組氨酸，肽1攜帶野生型RNase A序列。除了引入突變使肽的RNA酶活性完全或部分消除(如用丙氨酸替換活性位點(diǎn)組氨酸，H12和H119中的一個(gè)或兩個(gè))以外，肽2的序列與肽1相同。所述肽去保護(hù)之后，從支持相中裂解，如(Gutte等，1971，生物化學(xué)雜志，第246卷，1922-1941頁)所述再折疊，通過C末端的生物素部分固定于直徑約10-100nm的鏈親和素包被珠上。通過將鏈親和素固定于N-羥基-琥珀酰亞胺活化的膠乳珠(Polysciences Inc.)上，制備這種包被珠。制備一個(gè)柱子(如Sepharose或Sephadex)，其柱基質(zhì)一端攜帶被固定的RNA分子，另一端與亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)結(jié)合。這可通過下面的方法制備，即合成RNA寡聚體(如20個(gè)核苷酸長)，在一個(gè)末端加上硫醇基，另一個(gè)末端加上生物素(Oligos Etc.,Inc)，使其具有功能。然后通過標(biāo)準(zhǔn)的方法，用硫醇基將RNA和亞氨基二乙酸(或次氮基三乙酸)特異性偶聯(lián)。
按如下的方法進(jìn)行底物再加載實(shí)驗(yàn)(圖20)。在緩沖液中混合攜帶肽1或肽2的珠，這種含有金屬離子(Zn++或Ni++)的緩沖液可使RNase A具有活性(例如Tris-HCl pH7或8)，然后按上述方法加載在柱上。柱用相同的緩沖液洗滌，收集級分。在柱中遷移期間，肽珠通過六個(gè)N末端組氨酸、Zn++或Ni++與結(jié)合了RNA分子的IDA之間的相互作用，被固定在基質(zhì)上。因而，形成His6-金屬-IDA復(fù)合物，它有效的將攜帶肽的肽珠與RNase A的底物RNA結(jié)合?；钚訰nase A(肽1)將裂解結(jié)合的RNA，并使其本身釋放，從而繼續(xù)其在柱中的遷移。然而肽2的催化活性低于肽1，被固定的時(shí)間較長，因此多次轉(zhuǎn)化之后，肽1珠與肽2珠將因它們對RNA底物的不同催化活性而被分離。因此在柱底部，帶活性較高的RNase A變體的肽珠首先被收集。
利用非天然氨基酸，可以檢測RNase A的催化機(jī)制，并且應(yīng)用上述的底物再加載篩選，很可能開發(fā)出新的改良型RNase A變體(Jackson等，1994，科學(xué)，第266卷，243-247頁)。或者，可在隨機(jī)肽總庫中尋找新的催化劑。在所回收的磁珠上的肽序列可以用Edamn降解或質(zhì)譜分析測定。
實(shí)施例13在低活性葡萄球菌核酸酶(SNase)變體環(huán)境中，富集較高活性的Snase變體。這個(gè)篩選中應(yīng)用電泳分離高活性酶。
將His6-標(biāo)簽引入到噬菌粒pⅡ78-6中連接SNase和pⅢ包膜蛋白的連接子中(Pedersen等，1998，美國國家科學(xué)院院刊，第95卷，10523-10528頁)，或者將His6-標(biāo)簽克隆在M13K07輔助噬菌體的gpⅢ基因的N末端(按照將酸性延伸區(qū)克隆到M13K07的克隆方法，Pedersen等，1998，美國國家科學(xué)院院刊，第95卷，10523-10528頁)。用正常M13K07輔助噬菌體和His6標(biāo)記的SNase噬菌粒，或者用pⅡ78-6噬菌粒和His標(biāo)記的輔助噬菌體，制備噬菌體顆粒。這兩種方法均產(chǎn)生在其表面展示SNase和His標(biāo)簽的噬菌體。
用標(biāo)準(zhǔn)的方法，用亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)在5’末端衍生含約20個(gè)核苷酸的DNA寡聚體。例如，合成的寡聚體帶有5’硫醇基，它可以與雙功能IDA-馬來酰亞胺部分形成衍生物。衍生的寡聚體與另一個(gè)引物及可以產(chǎn)生100-1000堿基對產(chǎn)物的模板一起進(jìn)行PCR。
在其末端與IDA或NTA形成衍生物的DNA片段，與上面制備的噬菌體共同溫育，并上樣在電泳凝膠上，例如在適合的緩沖液中的0.5％-0.7％的瓊脂糖凝膠上。緩沖液(Tris-HCl pH5-8)中包含Ca++(SNase活性所需)和Zn++、Ni++、Co++或Cu++(為協(xié)調(diào)His6和IDA或NTA部分)，和高濃度的上述IDA-或NTA-衍生的DNA片段。
在噬菌體上展示的His6標(biāo)簽，通過形成復(fù)合物His6-金屬-DNA(His6-金屬-NTA)與DNA結(jié)合。如果在同一個(gè)噬菌體上展示的SNase是有活性的，它將裂解相連的DNA。同時(shí)，不同DNA片段之間的迅速交換導(dǎo)致噬菌體上全長片段的持續(xù)加載。因此，展示較高活性SNase的噬菌體通常與較短DNA片段相連，并因此與展示無活性SNase的噬菌體的遷移不同。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是通過混合展示大量不同的SNase變體的噬菌體，并如上所述通過電泳分離較高活性變體而進(jìn)行的。
實(shí)施例14DNA寡聚體作為XY交換體用熒光極化光譜檢測交換速率間接底物再加載方案的基本特征是連接底物和酶的XY交換單位。理想的XY單位應(yīng)該提供一個(gè)底物在酶上動(dòng)態(tài)地、快速地和有效地再加載的方法。我們希望設(shè)計(jì)一些核酸，可以滿足(至少部分滿足)理想的XY單位的需要快速交換且XY復(fù)合物內(nèi)部仍然穩(wěn)定。因此，設(shè)計(jì)了兩套寡聚體，#1和#2。這兩套XY復(fù)合物的預(yù)期解鏈溫度分別約為60℃和40℃。為了提供活躍的交換，設(shè)計(jì)了兩個(gè)DNA寡聚體，Y1和Y2，使它們與X上不相同的但有重疊的靶區(qū)域結(jié)合(見材料和方法)。預(yù)計(jì)重疊區(qū)可以提供X-Y1和X-Y2復(fù)合物間的快速交換。
在各種溫度下，用熒光極性光譜法分析兩套寡聚體的交換速率。動(dòng)力學(xué)范圍(寡聚體交換相對較快而X仍然是保持復(fù)合物狀態(tài)的溫度范圍)比XY二聚體的預(yù)期解鏈溫度稍微低一些。得到游離Y與復(fù)合物結(jié)合Y的90％交換所需要的時(shí)間(t交換)在30到500秒之間變動(dòng)。用其它的寡聚體設(shè)計(jì)或優(yōu)化條件(尤其Mg++濃度和溫度)，有可能獲得高于每秒1次的核酸交換率，很可能每秒10-100次。
材料和方法DNA寡聚體序列。Set#Ⅰ:X#1: 3＇-TGCTAGCATGGCCCAACGGGAAGTAACGCGAAGCCGATGCTAGCATGC-5＇Y1-F1#1: 5＇-Fam-CGGGTTGCCCTTCATT-3＇Y1#1:5＇-CGGGTTGCCCTTCATT-3＇Y2#1:5＇-TTCATTGCGCTTCGGC-3＇Set#Ⅱ:X#2: 3＇-ACGGGAAGTAACGCGA-5＇Y1-F1#2: 5＇-Fam-TGCCCTTCATT-3＇Y1#2:5＇-TGCCCTTCATT-3＇Y2#2:5＇-TTCATTGCGCT-3＇黑體部分為在X和Y中互補(bǔ)的序列；劃線部分為Y1和Y2的重疊區(qū)；FAM指熒光部分。
熒光極化光譜在Perkin Elmer LS50分光光度計(jì)上檢測。激發(fā)光為485nm，放射光在525nm處記錄。所有的檢測在緩沖液A(除非指明，否則為10mM Tris-HCl pH9,100mM NaCl,1mM MgCl2)中進(jìn)行。一個(gè)薄管與樣品試管相連，因此在加額外材料時(shí)不需要開蓋。用這套裝置不可能測量到在30秒內(nèi)完成的反應(yīng)的速率。
結(jié)果根據(jù)核酸設(shè)計(jì)XY交換單位為了最終的應(yīng)用，在酶-連接子XY連接子-底物結(jié)構(gòu)中的XY交換單位，應(yīng)該在緩沖液中迅速用過量的Y-底物分子平衡，這樣通過在緩沖液中Y產(chǎn)物(或Y底物)與Y底物的交換，促進(jìn)與酶“結(jié)合”產(chǎn)物(或底物)的迅速交換。
為了完成這個(gè)快速平衡，我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)寡聚體，Y1和Y2，它們在X寡聚體上有重疊的結(jié)合位點(diǎn)(見材料和方法)。因此通過不與Y1退火的X部分，Y2將能短暫地與X∶Y1復(fù)合物上的X相互作用，反之亦然。當(dāng)與X上完全互補(bǔ)序列退火時(shí)，Y1和Y2形成相同數(shù)量的AT和GC堿基配對，因此預(yù)計(jì)對X具有非常相近的親和力，及大概相似的啟始或結(jié)束速率。因此Y1從X∶Y2復(fù)合物中替換Y2的速度與Y2替換Y1的速度一樣快。
我們設(shè)計(jì)了兩套寡聚物，它們的退火位點(diǎn)長度不同，退火區(qū)和重疊區(qū)域的相對長度也不同。選擇重疊區(qū)序列(5’-TTCATT-3’)以避免三聚體的形成，而且在實(shí)驗(yàn)中(和實(shí)施例10中)應(yīng)用的X和Y的濃度非常低。因此，幾乎不可能形成三聚體。
Y2與X-Y1復(fù)合物的Y1的交換用熒光極化法分別分析了兩套寡聚體的交換率。溶液中熒光標(biāo)記分子的熒光極化與分子的旋轉(zhuǎn)放松(relaxation)時(shí)間成比例。如果粘性和溫度保持恒定，熒光極化值直接與分子的體積成比例。兩個(gè)分子的結(jié)合或分離可以導(dǎo)致改變分子的體積，如同本實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
首先分析了#1套寡聚體，在5nM濃度和46℃條件下，熒光素標(biāo)記的Y1寡聚體(Y1-F1#1，見材料和方法)的熒光極化值為0.028(見圖21，上圖)。在t=660秒時(shí)加入200倍過量的寡聚體#1(1μM)，極化迅速增加到約0.037的高水平，提示X∶Y1-F1#1復(fù)合物的形成。在t=2400條件下，當(dāng)加入20倍過量的Y2#1(20μM)至X時(shí)，極化迅速下降，提示Y1-F1#1從X∶Y1-F1#1復(fù)合物中釋放。最可能的情況是，形成X∶Y2-#1復(fù)合物，從X#1中替換Y1-F1#1。
從X#1中用Y2#1替換Y1-F1#1是相對較快的過程；在30秒內(nèi)，觀察到90％的平衡。X#1∶Y1-F1#1復(fù)合物的形成是一個(gè)較慢的過程(得到90％的平衡大約需要600秒)。然而，這可以被過量寡聚體的濃度低20倍的事實(shí)解釋。
接著在50℃分析了同樣的結(jié)合反應(yīng)。形成X∶Y1復(fù)合物所需要的時(shí)間縮短(300秒)；另一方面，交換完成90％的時(shí)間稍慢(40秒，見表1)。
我們想驗(yàn)證重疊靶區(qū)域可以提高交換速率的觀點(diǎn)。因此在相同的條件下(46℃)，形成X#1∶Y-F1#1復(fù)合物，但在此向X#1中加入20倍過量的Y1#1(而不是Y2#1)。從圖21的下圖和表1中可以看到，非標(biāo)記Y1#1取代Y1-F1#1是緩慢進(jìn)行的。得到90％平衡需要約500秒。我們推斷在這種情況下，X上Y1和Y2的重疊靶機(jī)制將交換加速大約17倍。
用同樣的方法分析了#2套寡聚體(見表1)。在24℃和1mM MgCl2參考條件下，在200秒內(nèi)，交換反應(yīng)完成90％。溫度增加到30℃，交換速度增加4倍；同樣，增加Mg++濃度到10mM，可增加交換4倍。目前的裝置有-個(gè)大約30秒的應(yīng)答時(shí)間，因此我們沒有檢測10mM Mg++和30℃時(shí)的交換速率。
最后，重疊靶區(qū)域機(jī)制再一次被驗(yàn)證。在亞優(yōu)化條件下(24℃,1mMMgCl2),Y1對與X形成復(fù)合物的Y1-F1的交換在500秒內(nèi)完成90％，這比Y2對Y1的交換慢2.5倍。因此即使在這些條件下交換速度僅增加2.5倍，包含兩個(gè)而不是一個(gè)Y單位也是有利的。
在圖21的下圖中，熒光極化信號沒有下降到基線(游離Y1-F1的信號水平)。在針對#1套和#2套寡聚體、Y1交換Y1和Y2交換Y1以及用不同的MgCl2濃度的多次實(shí)驗(yàn)中，幾次觀察到這個(gè)結(jié)果。我們對此現(xiàn)象無法解釋，然而，這似乎并不影響測定的交換速率。在無X的條件下，向游離Y1-F1中加入大量過量的Y2對熒光極化信號沒有影響。
討論兩套寡聚體的交換速率表明強(qiáng)烈依賴于溫度；為了交換的高效進(jìn)行，篩選實(shí)驗(yàn)的執(zhí)行溫度應(yīng)該保持在一個(gè)相對窄的范圍內(nèi)，大約為最佳溫度的+/-5℃范圍內(nèi)。
MgCl2濃度強(qiáng)烈的影響交換速率。在一個(gè)所謂的“以DNA為臂的錘頭型核酶”中，(Shimayama等，(1995),FEBS Letters 368,304-306)也觀察到了相似的影響。他們發(fā)現(xiàn)錘頭型核酶的催化活性，其中雜交臂已用脫氧核糖核苷酸取代，強(qiáng)烈的依賴于Mg++濃度，即使是在確信活性部位已經(jīng)用Mg++飽和的高鎂離子濃度條件下也是如此。因此他們的結(jié)果可解釋為，高M(jìn)g++濃度可增加RNA靶上核酸臂的交換。
基于核酸的XY交換單位的設(shè)計(jì)應(yīng)該是一種非常普通的產(chǎn)生快速有效的交換單位的方法。適當(dāng)選擇退火位點(diǎn)的長度和組成以及進(jìn)行篩選的條件，可使DNA寡聚體在不同的pH值、鹽濃度、溫度和壓力等條件中作為XY交換單位。本研究中表明Mg++濃度和溫度的最優(yōu)化可使交換率下降到儀器的檢測極限(每秒10次)。這些條件的結(jié)合，可能還包括其它條件的優(yōu)化，可使交換率下降到大約每秒1次。最后，調(diào)節(jié)退火位點(diǎn)的相對長度與組成和Y1與Y2寡聚體的重疊區(qū)域，可以進(jìn)一步改善交換率。
在X寡聚體上具有重疊結(jié)合位點(diǎn)的Y1和Y2寡聚體的設(shè)計(jì)可以提高交換率。推測重疊靶區(qū)域介導(dǎo)一個(gè)寡聚體被另一個(gè)寡聚體活躍替換。根據(jù)這種觀點(diǎn)以及反義RNA的結(jié)構(gòu)和機(jī)制特點(diǎn)，XY交換單位的更復(fù)雜設(shè)計(jì)，應(yīng)該能更進(jìn)一步改善這個(gè)系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)。


表1．在各種溫度和MgCl2條件下90％復(fù)合物的形成和90％交換的時(shí)間。
將第一個(gè)寡聚體(Y1-F1)加至5nM；第二個(gè)寡聚體(X)加至1μM；第三個(gè)寡聚體(Y2或Y1)加至20μM。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>利用底物置換進(jìn)行酶活性篩選<130>用底物篩選酶活性<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>379<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述噬菌粒，pFab-SP400<400>1Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Ser Gln Asp leu Phe Asn Gln Phe20 25 30Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn35 40 45Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro50 55 60Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser65 70 75 80Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys85 90 95Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile100 105 110Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly115 120 125Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp130 135 140Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr145 150 155 160Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val165 170 175Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser180 185 190Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr195 200 205Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile210 215 220Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro225 230 235 240Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp245 250 255Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro260 265 270Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly275 280 285Thr Cys Leu Ala Ala Ala Gly Ser Lys Asp Ile Arg Pro phe Val Cys290 295 300Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala305 310 315 320Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly325 330 335Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser340 345 350Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn355 360 365Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala370 375<210>2<211>391<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述噬菌粒，ph8<400>2Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe20 25 30Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn35 40 45Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro50 55 60Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser65 70 75 80Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys85 90 95Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile100 105 110Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly115 120 125Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp130 135 140Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr145 150 155 160Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val165 170 175Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser180 185 190Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr195 200 205Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile210 215 220Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro225 230 235 240Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp245 250 255Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro260 265 270Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly275 280 285Thr Cys Leu Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ser His His His His His His290 295 300Ser Ala Ala Gly Ser Lys Asp Ile Arg Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln305 310 315 320Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly325 330 335Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly340 345 350Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly355 360 365Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys370 375 380Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala385 390<210>3<211>2031<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述噬菌粒，ph7<400>3atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcgcagt ccggcaatcc gttctctgga cgtaccttgc tcgttaacag cgactacagt 120tccaagttgg accagactcg acaggctttc ctgagccgag gtgatcagac caacgctgcc 180aaggtgaagt acgttcagga gaaggtcggt accttctact ggattagcaa catcttcctc 240ttgcgtgata tcgacgttgc tatccagaac gcacgtgctg ccaaggcccg tggagagaat 300cccattgttg gtttggtcct gtacaacttg cctgatcgag attgcagcgc tggtgagagc 360agtggcgagc tgaagctgag ccagaacggt ctcaaccggt acaagaacga gtacgtgaat 420cccttcgctc agaagcttaa ggctgcatcc gacgtgcagt tcgctgtgat tctggaaccc 480gatgccatcg gcaacatggt gaccggcacc agtgctttct gccgaaatgc acggggccct 540cagcaagagg ctatcggcta cgcgatcagc cagttgcagg cctcccacat tcacctgtac 600ctggacgtgg ccaacggcgg ttggctcggt tgggctgaca agctcgagcc cactgctcag 660gaggtggcta ctatcctgca gaaggctggt aacaatgcga agatccgcgg cttcagttcg 720aacgtgagca actacaatcc ctacagcacc tccaaccctc cgccctacac tagcggttct 780ccgtctcctg acgagtcccg ctacgctacc aatatcgcta acgccatgcg ccagcgaggc 840ttgcccactc agttcattat cgatcagagc cgcgtcgctc tgtccggagc ccgtagcgaa 900tggggacagt ggtgcaacgt gaacccggct ggtttcggtc agccgttcac taccaacacg 960aacaatccta acgtggacgc gatcgtctgg gtcaagcctg gaggcgaatc tgacggtcaa 1020tgcggtatgg gcggtgctcc cgctgccggc atgtggttcg acgcgtatgc ccaaatgctc 1080actcagaatg ctcacgacga gatcgcgaga ggcgctgccg gttccggtgg aggcaacaat 1140ggcggaggta acaatccgaa tcctactccc accaatccca cgaatcccgg tcctacttct 1200aaccctggag gcggtaactg cgcatccaag tggggtcagt gcggaggcca aggatgggca 1260ggacccacct gttgcgaagc tggaagcact tgcacccgtc agaacgagtg gtacagccag 1320tgcctcccag gaggcgcggc cgcaccagga ggatcacatc accatcacca tcactcggcc 1380gcaggctcta aagatatcag accattcgtt tgtgaatatc aaggccaatc gtctgacctg 1440cctcaacctc ctgttaatgc tggcggcggc tctggtggtg gttctggtgg cggctctgag 1500ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggct ctgagggtgg cggttccggt 1560ggtggctctg gttccggtga ttttgattat gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct 1620atgaccgaaa atgccgatga aaacgcgcta cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct 1680gtcgctactg attacggtgc tgctatcgac ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct 1740aatggtaatg gtgctactgg tgattttgct ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt 1800gacggtgata attcaccttt aatgaataat ttccgtcaat atttaccttc 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1．一種樣品，其包含適于在體外篩選系統(tǒng)中使用的多個(gè)獨(dú)立單元，其中所述體外篩選系統(tǒng)旨在從催化劑分子庫中篩選與該文庫內(nèi)其他催化劑分子相比具有相對更有效的所需特異性催化活性的目的催化劑分子，而且其中所述體外篩選系統(tǒng)以其使得目的催化劑分子在最終收集前可以進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化，即底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化，為特征，此外，所述樣品包括(ⅰ)以獨(dú)立單元形式提供的催化劑分子庫，其中所述獨(dú)立單元包括具有下述一般結(jié)構(gòu)的第一種類型的獨(dú)立單元C-XY-S，其中C指催化劑分子，XY指XY交換對，而S指能夠由所述催化劑分子庫中所至少一種催化劑分子催化成產(chǎn)物的底物，從而有可能獲得具有如下一般結(jié)構(gòu)的第二種類型的獨(dú)立單元C-XY-P，其中C和XY具有上面所定義的意義，而P為由第一種類型獨(dú)立單元中底物S經(jīng)催化性轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的產(chǎn)物分子；而且(a)使底物S附于催化劑上，該構(gòu)型使所述獨(dú)立單元內(nèi)催化劑和底物間能夠進(jìn)行催化反應(yīng)；并且(b)所述底物和催化劑之附著的性質(zhì)使得有可能利用所述產(chǎn)物的一個(gè)特征分離一種實(shí)體，該實(shí)體包括允許對催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述催化劑分子能催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)；而且(c)所述含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品其特征在于，所述XY交換對允許Y部分與另一個(gè)Y部分進(jìn)行不對稱交換，即Y與Y交換，而不是與X交換；從而所述XY交換對使得在單元結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-產(chǎn)物與“Y-底物”組分之間可以進(jìn)行交換反應(yīng)，并由此產(chǎn)生單元結(jié)構(gòu)催化劑-XY交換對-底物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中權(quán)利要求1之(ⅰ)中的獨(dú)立單元是生物學(xué)可擴(kuò)增的獨(dú)立單元。
3．根據(jù)權(quán)利要求1包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中權(quán)利要求1之(ⅰ)中的獨(dú)立單元是生物學(xué)可擴(kuò)增的獨(dú)立單元，且所述底物和所述催化劑分子均附于該生物學(xué)可擴(kuò)增的獨(dú)立單元表面。
4．根據(jù)在先權(quán)利要求之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中(ⅰ)所述的獨(dú)立單元包括如下的結(jié)構(gòu)催化劑分子-彈性(XY交換對)連接子-底物。
5．根據(jù)在先權(quán)利要求之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中權(quán)利要求1之(ⅰ)所述的獨(dú)立單元包括如下結(jié)構(gòu)催化劑分子-載體系統(tǒng)-XY交換對-底物，或更優(yōu)選包括如下結(jié)構(gòu)催化劑分子-載體系統(tǒng)-彈性(XY交換對)連接子-底物。
6．根據(jù)權(quán)利要求3和5的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中在權(quán)利要求3所述的生物學(xué)可擴(kuò)增的獨(dú)立單元內(nèi)，權(quán)利要求5的載體系統(tǒng)是噬菌體。
7．根據(jù)權(quán)利要求5的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述載體系統(tǒng)是磁珠。
8．根據(jù)權(quán)利要求1到7之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述催化劑分子文庫是天然或非天然肽或多肽的文庫，更優(yōu)選酶的文庫。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述的文庫是一個(gè)包括各具有多個(gè)不同酶活性的多肽文庫。
10．根據(jù)權(quán)利要求8的包含多個(gè)不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述文庫是包括衍生自一或多種前體多肽的多肽變體的文庫，其中所述前體多肽顯示密切相關(guān)的酶活性。
11．根據(jù)權(quán)利要求8至10之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述文庫包括改組/重組/摻雜的多肽。
12．根據(jù)權(quán)利要求1至7的包含多個(gè)不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述催化劑分子庫是天然或非天然核酸庫。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的包含多個(gè)不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述文庫是包含具有多個(gè)不同催化活性的核酸文庫。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的包含多個(gè)不同獨(dú)立單元的樣品，其中所述文庫是包含衍生自一或多種前體核酸的核酸變體的文庫，其中所述前體核酸顯示密切相關(guān)的催化活性。
15．根據(jù)權(quán)利要求12至14之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述核酸文庫包括改組/重組/摻雜的核酸。
16．根據(jù)權(quán)利要求1至7之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述催化劑分子庫包括天然多聚體分子、或非天然多聚體分子、或有機(jī)小分子、或無機(jī)小分子或所述分子的混合物。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中所述文庫通過組合化學(xué)制備。
18．根據(jù)在先權(quán)利要求之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品，其中權(quán)利要求1之(ⅰ)所述的催化劑分子和能被催化成產(chǎn)物的底物是不同的化學(xué)物質(zhì)。
19．一種體外篩選方法，其用于從催化劑文庫中體外篩選與該文庫內(nèi)其余催化劑分子相比具有相對更有效的所需特異性催化活性的目的催化劑分子，其中所述體外篩選方法的特征在于，其使目的催化劑分子在最終收集前可以進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化，即底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化，且所述方法包括下述步驟，(ⅰ)使權(quán)利要求1至18之任一項(xiàng)的包含多個(gè)獨(dú)立單元的樣品處在使目的催化劑分子發(fā)揮其目的催化活性的適當(dāng)?shù)臈l件下，以及使所述獨(dú)立單元與一種Y-底物化合物相接觸的條件下；(ⅱ)通過篩選含有所述產(chǎn)物分子的一或多個(gè)獨(dú)立單元而篩選目的催化劑；和(ⅲ)利用產(chǎn)物的一個(gè)特征分離一種實(shí)體，所述實(shí)體包含能對目的催化劑分子進(jìn)行明確鑒定的信息，所述催化劑能多次催化底物分子到產(chǎn)物分子的反應(yīng)；并任選地(ⅳ)通過利用步驟(ⅲ)所述實(shí)體中所包含的信息產(chǎn)生目的催化劑分子，并構(gòu)建包含所產(chǎn)生的目的催化劑分子的一個(gè)獨(dú)立單元，然后通過利用該獨(dú)立單元作為啟始材料，將步驟(ⅰ)至(ⅲ)重復(fù)一次或多次。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的體外篩選方法，其中目的催化劑分子是與親和性標(biāo)簽偶聯(lián)的酶或蛋白質(zhì)，且其中在權(quán)利要求19步驟(ⅰ)之前進(jìn)行一個(gè)任選步驟，該任選步驟包括對展示(全長)酶或蛋白質(zhì)的獨(dú)立單元進(jìn)行純化以便富集，在所述純化步驟中利用所述親和性標(biāo)簽對展示酶或蛋白質(zhì)的單元進(jìn)行分離。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的體外篩選的方法，其中利用抗親和性標(biāo)簽的抗體柱對展示(全長)酶或蛋白質(zhì)的獨(dú)立單元進(jìn)行純化，在所述抗體柱中利用所述標(biāo)簽對展示帶標(biāo)簽的酶或蛋白質(zhì)的單元進(jìn)行分離。
22．根據(jù)權(quán)利要求20的體外篩選方法，其中所述親和性標(biāo)簽包含偶聯(lián)至目的酶或蛋白質(zhì)C-末端的六個(gè)組氨酸殘基，而且展示(全長)酶或蛋白質(zhì)的獨(dú)立單元在Ni-NTA柱或抗組氨酸抗體柱上純化，在所述的柱中利用所述標(biāo)簽對展示帶標(biāo)簽的酶或蛋白質(zhì)的單元進(jìn)行分離。
23．根據(jù)權(quán)利要求19的體外篩選方法，其中在權(quán)利要求19步驟(ⅱ)中對目的催化劑分子的篩選是通過對所述產(chǎn)物分子的特異性固定來進(jìn)行的。
24．根據(jù)權(quán)利要求19的體外篩選方法，其中在權(quán)利要求19步驟(ⅱ)中對目的催化劑分子的篩選通過下述策略進(jìn)行(ⅰ)構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)，其中實(shí)質(zhì)上權(quán)利要求19步驟(ⅰ)所述含底物分子和催化性分子的獨(dú)立單元每個(gè)都結(jié)合到基質(zhì)上，且當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化成產(chǎn)物時(shí)該單元從所述基質(zhì)上釋放；和(ⅱ)選擇所述基質(zhì)中釋放的單元。
25．根據(jù)權(quán)利要求19的體外篩選方法，其中在權(quán)利要求19步驟(ⅱ)中對目的催化劑分子的篩選通過下述策略進(jìn)行(a)構(gòu)建一個(gè)產(chǎn)物柱，其中沿產(chǎn)物柱基質(zhì)放置特異性結(jié)合所述產(chǎn)物的受體；和(b)在產(chǎn)物柱一端加入獨(dú)立單元的樣品，并通過分離最后到達(dá)柱子另一端的獨(dú)立單元而篩選目的催化劑分子。
26．根據(jù)權(quán)利要求19的體外篩選方法，其中通過物理或化學(xué)方法分離根據(jù)權(quán)利要求19步驟(ⅲ)的一種實(shí)體，所述實(shí)體含有能明確鑒定目的催化劑分子的信息。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的體外篩選方法，其中所述物理方法是電泳。
28．根據(jù)權(quán)利要求19到27之任一項(xiàng)的體外篩選方法，還包括下述步驟，(a)通過適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ㄖ苽渌枇康纳鲜龇蛛x的目的催化劑分子。
全文摘要
一種方法,其用于從催化劑文庫中體外篩選與該文庫內(nèi)其余催化劑分子相比具有相對更有效的特異性目的催化活性的目的催化劑分子,而且本文中所述的體外篩選方法以其令目的催化劑分子在最終收集前可以進(jìn)行多次催化活性轉(zhuǎn)化(即底物到產(chǎn)物的催化活性轉(zhuǎn)化)為特征。
文檔編號G01N33/15GK1319141SQ99811159
公開日2001年10月24日 申請日期1999年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月19日
發(fā)明者亨里克·佩德森, 斯文·霍爾德, 于爾根·杰姆斯, 梅特·K·倫德 申請人:諾維信公司