專利名稱：篩查巨大后代綜合征的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩查動物胚胎或胚胎衍生的多能細(xì)胞系異常發(fā)育的方法，并涉及在結(jié)合該篩查方法的體外培養(yǎng)中操作動物胚胎或細(xì)胞的方法。本發(fā)明也涉及該篩查方法在確定細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境或操作方法是否誘導(dǎo)動物胚胎異常發(fā)育中的應(yīng)用。
在胚泡期之前暴露于不同異常環(huán)境的牛及綿羊胚胎導(dǎo)致異常巨大后代的發(fā)育(Young等人，生殖綜述(Reviews of Reproduction)待出版(1998))，其也可能顯示多種器官缺陷，包括骨骼和面部畸形(Walker等人，動物生殖學(xué)(Theriogenology)45111-120(1996))、過度肌肉化(over-muscling)和肌纖維成份的改變(Maxfield等人，生理學(xué)雜志(J.Physiol.)274E1121-E1123(1998))、小腦發(fā)育不全(Schmidt等人，動物生殖學(xué)46527-539(1996))、肝及心血管缺陷(van Soom等人，動物生殖學(xué)41855-867(1994)；Wilmut等人，自然(Nature)385810-813(1997)；Campbell等人，自然380383(1996)；Cibelli等人，科學(xué)(Science)2801256-1258(1998))、泌尿生殖道缺陷(Campbell等人，自然380383(1996))、肺缺陷(Cibelli等人，科學(xué)2801256-1258(1998))和胎盤缺陷，包括羊水過多、水尿囊和胎盤瘤增大(Cibelli等人，科學(xué)2801256-1258(1998))。曾報道了幾種器官的增大(Farin,P.W.和Farin,C.E.,生殖生物學(xué)(Biology of Reproduction)52676-682(1995)；Cibelli等人，科學(xué)2801256-1258(1998))，相關(guān)特征包括妊娠延長、難產(chǎn)(Kruip,T.A.M.和den Haas,J.H.G.，動物生殖學(xué)4743-52(1997))和尤其與體溫調(diào)節(jié)、能量平衡、呼吸及代謝pH調(diào)節(jié)有關(guān)的生理缺陷(Garry等人，動物生殖學(xué)45141-152(1996))。圍生期死亡率是一個特殊問題，產(chǎn)前死亡率較高(Walker等人，動物生殖學(xué)45111-120(1996))。這組癥狀現(xiàn)已通稱為巨大后代綜合征(Large Offpring Syndrome,LOS)，但有時被稱為巨牛綜合征(Willadsen等人，動物生殖學(xué)35161-170(1991))。不是在每例LOS中都能觀察到所有這些特征，有時，在沒有明顯體積增大時可觀察到這些特征。
當(dāng)對母體施用高尿素飲食時(McEvoy等人，動物生殖科學(xué)(AnimalReproduction Science)4771-90(1997))，核移植中植入前胚胎的操作、胚胎的體外培養(yǎng)、異步胚胎移植或排卵后不久母體的孕酮處理現(xiàn)在都與這些問題有關(guān)(Walker等人，動物生殖學(xué)45111-120(1996)綜述)。雖然體內(nèi)胚胎環(huán)境的改變是實驗性的，但與LOS有關(guān)的問題在商業(yè)上是特別重要的，這與核移植和體外生產(chǎn)中植入前胚的體外處理有關(guān)。體外產(chǎn)生可包括任一或全部下列三個階段(1)卵母細(xì)胞的體外成熟(IVM)；(2)卵母細(xì)胞的體外受精(IVF)；和/或(3)受精卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)(IVC)，通常至胚泡期。核移植也可包括操作過程之前、期間和之后的卵母細(xì)胞或重建的胚胎的體外培養(yǎng)階段。核移植-重建胚胎的培養(yǎng)能在體外或在生殖道內(nèi)體內(nèi)進(jìn)行，哺乳動物(通常是綿羊或兔)輸卵管通常結(jié)扎。這兩者都可提供異常的胚胎環(huán)境，并與LOS的癥狀有關(guān)。
也曾描述了人和小鼠的胎兒生長綜合征。但是它們與植入前胚胎操作無關(guān)，而分別是染色體及其他遺傳異?；?qū)嶒炦z傳操作的結(jié)果。胚胎操作或培養(yǎng)后人及小鼠中不發(fā)生胎兒過度生長可能是由于牛與綿羊固有的物種差異，或由于所用方法的不同。例如，家畜胚胎通常作為胚泡被移植到受體中，而歷史上也曾將四細(xì)胞期的人胚胎移回母體中，因此人胚在關(guān)鍵時期能不接觸干擾因素。小鼠胚胎常規(guī)培養(yǎng)至胚泡期，但常用的所有培養(yǎng)基都不含血清。與體外胚胎培養(yǎng)有關(guān)的大多數(shù)牛和綿羊LOS病例都包括接觸共培養(yǎng)細(xì)胞和/或血清(例如，見Walker等人，動物生殖學(xué)45111-120(1996))，它們可能產(chǎn)生和/或含有干擾因素。因此，如果培養(yǎng)條件明顯改變，則影響牛和綿羊胚胎的相同因素也能以類似的方式影響其他物種的胚胎。
就分娩和后代的存活而言，受干擾的胎兒生長具有重要的臨床意義。在商業(yè)上，通過包括體外成熟(IVM)或體外受精(IVF)的體外產(chǎn)生(IVP)與牛和綿羊胚胎的產(chǎn)生是十分相關(guān)的。該技術(shù)可能與該技術(shù)在其他物種中的廣泛應(yīng)用越來越相關(guān)，如有價值的個體如馬(Hinrichs動物生殖學(xué)4913-21(1998))以及瀕臨滅絕的物種如大熊貓(Saegusa自然394409(1998))。LOS也可能在利用核移植技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物中有更大的重要性。LOS的征兆可能與人IVF有關(guān)，假定植入前期間的事件能影響后代的前景。例如，常規(guī)人IVF能產(chǎn)生具有相對較低出生體重的嬰兒。由于該技術(shù)越來越具侵入性(例如，胞質(zhì)內(nèi)精子注射、胞質(zhì)減少、體外培養(yǎng)至胚泡期、胚胎活組織檢查、植入前診斷)，后代的健康越來越危險(Walker等人，動物生殖學(xué)45111-120(1996)；Handyside等人，遺傳學(xué)趨勢(Trends in Genetics)13270-275(1997))。
培養(yǎng)的胚胎衍生的胚胎干(ES)細(xì)胞和胚胎生殖(EG)細(xì)胞也能用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因小鼠或其他動物(Nagy等人，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908424-8428(1993),Dean等人，發(fā)育(Development)1252273-2282(1998))或這些生物的細(xì)胞和組織。胚胎干(ES)細(xì)胞是從胚泡期胚胎(Evans,M.J.和Kaufman,M.H.，自然292154-156(1981))、桑椹胚(Eistetter,H.R.發(fā)育、生長與分化(Dev.Growth Differ.)31275-282(1989))的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞中分離的多能細(xì)胞系或分離的上胚層細(xì)胞(Brook F.A.和Gardner,R.L.美國國家科學(xué)院院刊945709-5712(1997))。來源于小鼠原始生殖細(xì)胞的這些細(xì)胞系及多能胚胎生殖(EG)細(xì)胞系的建立使得能在培養(yǎng)中遺傳修飾這些細(xì)胞系，并能產(chǎn)生特定基因已被改變、導(dǎo)入或置換的轉(zhuǎn)基因小鼠(McWhir,J.,Roslin研究所年報(Roslin Institute Annual Report)1995-1996 80-83(1996)；L.M.Houdebine(編)《轉(zhuǎn)基因動物生殖與應(yīng)用》，OverseasPublishers Association,Amsterdam(1997))。盡管迄今為止只有小鼠的ES和EG細(xì)胞能建成種系，從而提供轉(zhuǎn)基因動物的途徑，但目前對由其他物種的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞產(chǎn)生多能細(xì)胞系有很大興趣。最近，已有用來源于胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的ES細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生嵌合豬(Golueke等人，動物生殖學(xué)49 238(1998))和牛(Cibelli等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)16 642-646(1998))的報道。由于體外培養(yǎng)(在血清和共培養(yǎng)細(xì)胞的存在下)和核移植技術(shù)都可用于牛ES細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生，這些技術(shù)有可導(dǎo)致巨大后代綜合征的畸形特征的高風(fēng)險。這也適用于將來從也是胚胎衍生的原始生殖細(xì)胞分離EG細(xì)胞。在小鼠中，衍生或培養(yǎng)期ES細(xì)胞系的改變可能足以誘發(fā)與LOS有一定相似性的畸形(Nagy等人，美國國家科學(xué)院院刊908424-8428(1993)),Dean等人，發(fā)育1252273-2282(1998))，而不需體外培養(yǎng)產(chǎn)生的胚胎(因為未報道在這些及其他小鼠研究中使用的胚胎培養(yǎng)技術(shù)可誘發(fā)與LOS相似的表型)。由于最近提出遺傳修飾的牛ES細(xì)胞可為異種移植提供組織治療來源以治療人類疾病(Cibelli等人，自然生物技術(shù)16642-646(1998))，所以確保正常發(fā)育的篩查技術(shù)可能是相當(dāng)有價值的。正在積極探索多能人EG細(xì)胞和ES細(xì)胞，已提出它們能提供“非限定性體外衍生分化細(xì)胞來源，以通過移植治療特定疾病”(First,N.L.和Thomson,J.自然生物技術(shù)16620-621(1998))。此外，也已提出人或其他卵母細(xì)胞能以類似于最近在牛(Cibelli等人，科學(xué)2801256-1258)、綿羊(Campbell等人，自然38064-66(1996)；Wilmut等人，自然385810-813(1997)；和Schnieke等人，科學(xué)2782130-2133(1997))和小鼠(Wakayama等人，自然394369-373(1998))中所證明的方式重編來自分化人細(xì)胞核的發(fā)育進(jìn)程，這種可能性具有重要治療用途(First,N.L.和Thomson,J.自然生物技術(shù)16620-621(1998))。
已提出了可用于產(chǎn)生胚胎、細(xì)胞或組織的其他類型的干細(xì)胞，它們可以或可以不是轉(zhuǎn)基因的。其包括胚和胎衍生的干細(xì)胞以及成年動物中固有的干細(xì)胞。實例包括性腺干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞和神經(jīng)元干細(xì)胞(WO94/24274)。由于這些干細(xì)胞通過如胚胎聚集、胚泡注射或核移植等方法在產(chǎn)生胚胎、細(xì)胞或組織中的應(yīng)用都包括體外胚胎和/或細(xì)胞培養(yǎng)，所以這些細(xì)胞也可被強(qiáng)烈干擾而誘發(fā)類似于LOS的表型。
人及小鼠的胎兒過度生長起因于幾種基因表達(dá)的改變。在貝-維綜合征中發(fā)現(xiàn)的胎兒過度生長歸因于H19和/或Igf2基因(Reik等人，人類分子遺傳學(xué)(Human Molecular Genetics)42379-2385(1995)；Eggenschwiler等人，基因與發(fā)育(Gene and Development)113128-3142(1997)；Sun等人，自然389809-815(1997))，在Simpson-Golabi-Behmel綜合征中歸因于GPC3基因(Pilia等人，自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)12241-247(1996))。另外，對于H19、Igf2和Igf2r而言為無效突變體的小鼠均具有顯著的生長表型。例如，相比各自的野生型對應(yīng)體，H19無效突變體重了27％(Leighton等人，自然37534-39(1995)),Igf2無效突變體輕了40％(De Chiara等人，細(xì)胞64849-859(1991))。小鼠中母體Igf2r等位基因的實驗性缺失也導(dǎo)致平均出生體重增長30％，及胚胎促分裂原-胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)血漿濃度的提高(Lau等人，基因與發(fā)育82953-2963(1994))。除GPC3之外，所有這些基因都顯示將被印記，至少在小鼠中如此。親本(基因組)印記是籍此在哺乳動物胚胎和細(xì)胞中在某些基因座處發(fā)生母體和親本等位基因的差異表達(dá)的方法(Moore,T.和Reik,W.，生殖綜述(Rev.Reprod.)173-77(1996))。印記基因的異常表達(dá)與許多胚胎和胎兒畸形有關(guān)。盡管相當(dāng)比例的印記基因所編碼的產(chǎn)物的近似功能大部分未知，但認(rèn)為迄今鑒定的至少7種印記基因可影響生長。Igf2、Mas和Ins2都是親本表達(dá)的并可提高生長率。以此類推，預(yù)計Ins1也是一種生長增強(qiáng)劑。Igf2r、H19、p57KIP2和Mash2均由來源于母體的基因組表達(dá)，并可降低生長率(Hurst等人，自然遺傳學(xué)12234-237(1996))。另外，經(jīng)過印記的幾種DNA結(jié)合蛋白基因如WT1、ZNF127和Mash2已確定在其他基因組基因座處具有可能的作用，提示另一層調(diào)節(jié)(Moore,T.和Reik,W.，生殖綜述173-77(1996))因此可能的反調(diào)節(jié)。印記法的一個組成步驟是CpG二核苷酸處的DNA甲基化(Moore,T.和Reik,W.，生殖綜述173-77(1996))。除了已知的對胎兒生長的作用外，提示印記基因(或確定在其他物種中印記的基因)可作為參與牛及綿羊巨大后代綜合征的候選物，因為當(dāng)印記建立或保持時，許多印記基因在早期胚胎發(fā)生期間具有顯著、等位基因特異的DNA甲基化改變(Szabo P.E.和Mann J.R.，基因與發(fā)育93097-3108(1995))。在小鼠中，印記基因DNA甲基化的這些改變發(fā)生于正常植入前胚胎發(fā)育期間，此時實際上基因組中的所有其他DNA完全脫甲基化(Li,E.《基因組印記》,1-20頁，Riek,W.和Surani,A.編，IRL出版社，牛津(1997)；Kafri等人，美國國家科學(xué)院院刊9010558-10562(1993))。然而，迄今尚未確定牛或綿羊的特定基因(無論印記與否)表達(dá)與巨大后代綜合征之間有明確的因果關(guān)系。
在體外成熟期間，在含有多種血清和共培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，即在與早期胚胎暴露期間LOS誘導(dǎo)有關(guān)的相同條件下(Thompson等人，生殖生物學(xué)(Biology of Reproduction)531385-1391(1995)；Sinclair等人，動物生殖學(xué)47380(1997))，體外培養(yǎng)多個牛和綿羊卵母細(xì)胞(Trounson等人，動物生殖學(xué)4157-66(1994)；Marquant-Leguienne,B.和Humbolt,P.動物生殖學(xué)493-11(1998)；Sirard,M.A.和Blondin,P.,動物生殖科學(xué)(Animal Reproduction Science)42417-426(1996)；Thompson J.G.，生殖與受精進(jìn)展(Reprod.Fertil.Dev.)9341-354(1997))。尚不清楚體外成熟期是否能以誘發(fā)LOS的方式干擾卵母細(xì)胞，因為很少有研究涉及該問題。然而，Holm等人(生殖與受精雜志(Journalof Reproduction and Fertility)107175-181(1996))的研究提供了一些證據(jù)，表明該綜合征可能是由于體外成熟并受精，然后置入受體母羊中經(jīng)過胚胎培養(yǎng)期和妊娠其余階段的卵母細(xì)胞引起的。對于多種印記基因，印記和DNA甲基化的有關(guān)改變在配子發(fā)生期間建立，卵母細(xì)胞暴露至體外成熟誘導(dǎo)的該階段的任何外遺傳改變也可導(dǎo)致LOS的典型表型，其機(jī)制類似于為胚胎培養(yǎng)所提出的機(jī)制。類似地，當(dāng)在卵母細(xì)胞成熟前在卵泡內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)時，卵母細(xì)胞中可發(fā)生外遺傳改變。卵泡培養(yǎng)最近已作為一種提高體外成熟的牛卵母細(xì)胞之后發(fā)育能力的方法(FouladiNashta等人，生殖生物學(xué)59255-262(1998))。至少在某些情況中，也可能是卵母細(xì)胞固有的印記基因異常負(fù)責(zé)引發(fā)LOS。與動情周期中正常體內(nèi)成熟相比，利用如體外成熟或超數(shù)排卵的方法可從單個卵巢中獲得更多的卵母細(xì)胞。通過這些方法成熟的大多數(shù)卵母細(xì)胞將在體內(nèi)排卵之前死亡。這些方法通常用于提高卵母細(xì)胞對于體外產(chǎn)生或核移植的可利用性，并可“拯救”在體內(nèi)無法正常存活的具有印記缺陷的卵母細(xì)胞。這種“拯救”也可在胚胎培養(yǎng)期間發(fā)生，盡管已知只經(jīng)歷胚胎培養(yǎng)期足以誘發(fā)LOS(Thompson等人，生殖生物學(xué)531385-1391(1995)；Sinclair等人，動物生殖學(xué)47380(1997))。
也極不了解核移植后LOS的誘發(fā)。例如，尚未證明干擾是由于核移植本身還是相關(guān)的卵母細(xì)胞或胚胎培養(yǎng)期。大多數(shù)核移植胚胎或利用與受干擾的生長和發(fā)育有關(guān)的方法隨后在體外培養(yǎng)(例如，見Yazawa等人，動物生殖學(xué)48641-650(1997))，或在綿羊輸卵管中結(jié)扎，而不考慮受體動物與重建胚胎的發(fā)育階段的同步性(例如，見Willadsen等人，動物生殖學(xué)35161-170(1991))。以前已證明綿羊胚胎暴露于異步生殖道環(huán)境可導(dǎo)致胎兒過大(Wilmut,I.和Sales,D.I.，生殖與受精雜志61179-184(1981)；Young等人，動物生殖學(xué)45231(1996))。除可能的異步性外，輸卵管結(jié)扎本身是一種異常環(huán)境。在發(fā)育至胚泡期的過程中(通常用于向牛和綿羊的妊娠受體的胚胎移植)，胚胎在子宮中自然保持3-4天，并接觸子宮分泌物。因此輸卵管的結(jié)扎可使胚胎與引起干擾環(huán)境的異常分泌物接觸，引起LOS。在經(jīng)原核注射遺傳修飾的牛和綿羊胚胎中，隨后的發(fā)育通常也發(fā)生于結(jié)扎的輸卵管中或體外胚胎培養(yǎng)中。
另外，有人提出(Jaenish R.遺傳學(xué)趨勢13323-329(1997))，核移植中核對供體的成功應(yīng)用在胎兒死亡的效率及頻率方面可能部分依賴于在供體細(xì)胞的印記基因中發(fā)現(xiàn)的甲基化錯誤的發(fā)生率?？梢哉J(rèn)為，這些錯誤的發(fā)生率與產(chǎn)生供體細(xì)胞的動物年齡有關(guān)，較老的細(xì)胞具有較多的錯誤。這有待于直接實驗證明，但尤其在印記基因中的這些錯誤不能在核重編程序期間被早期胚胎發(fā)生中發(fā)生的脫甲基化和從頭DNA甲基化事件消除(Kafri等人，基因與發(fā)育6705-714(1992))。有時，這些錯誤可提供誘發(fā)巨大后代綜合征的另一種可能的方法。
據(jù)信，理論上可改變這些細(xì)胞的環(huán)境或這些細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(包括DNA和RNA)用來產(chǎn)生胚胎的胚胎或細(xì)胞的任何操作，都可誘導(dǎo)脆弱基因的外遺傳改變。包括透明帶的鉆孔或穿透的方法，例如去核、胞質(zhì)內(nèi)精子注射(Barnes等人，人類生殖103243-3247(1995))或植入前診斷(Handyside,A.H.和Delhanty,J.D.,遺傳學(xué)趨勢13270-275(1997))，可使遺傳物質(zhì)與透明帶通常不合的因子接觸。如胞質(zhì)轉(zhuǎn)移或胞質(zhì)減少的方法(Cohen等人，分子人類生殖學(xué)(Mol.Hum.Reprod.)4269-280(1998)；Cohen等人，柳葉刀(Lancet)350186-187(1997)；Eviskov等人，發(fā)育109323-328(1990)；Eviskov等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.203199-204(1994))可改變影響DNA(Moore,T.和Riek,W.,生殖綜述173-77(1996))或RNA的胞質(zhì)因子的濃度。另外，如胞質(zhì)內(nèi)精子注射或核移植的方去，其包括向受體卵母細(xì)胞或細(xì)胞中導(dǎo)入外源物質(zhì)，可將這些因子無意地導(dǎo)入可能受干擾的受體中。
因此存在幾種引發(fā)牛和綿羊LOS的可能途徑，它們都可通過印記基因的外遺傳改變起作用。其包括卵母細(xì)胞或胚胎的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的外遺傳改變、卵母細(xì)胞或胚胎暴露于異常環(huán)境(包括結(jié)扎的輸卵管)、經(jīng)超數(shù)排卵體外或體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞的固有缺陷、用于核移植的供體細(xì)胞的固有缺陷和核移植后印記的不恰當(dāng)?shù)闹鼐幊绦颉?br> 哺乳動物胎兒生長調(diào)節(jié)的關(guān)鍵是胰島素樣生長因子Ⅱ(IGFⅡ)。IGFⅡ調(diào)節(jié)以動態(tài)或梯級的方式發(fā)生，在轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)結(jié)合或受體相互作用水平上具有控制作用(Zarrilli等人，分子細(xì)胞內(nèi)分泌學(xué)(Mol.Cell.Endocrinol)101R1-R4(1994))。Igf2基因在小鼠(DeChiara等人，細(xì)胞64849-859(1991))、人(Giannoukakis等人，自然遺傳學(xué)494(1993))和綿羊(Feil等人，《哺乳動物基因組》，待出版(1998)；Hagemann等人，分子生殖進(jìn)展(Mol.Reprod.Dev.)50154-162(1998))中被印記，印記機(jī)制功能喪失引起的印記丟失導(dǎo)致雙等位基因表達(dá)，因此導(dǎo)致Igf2基因的過量表達(dá)?？蓪?dǎo)致人和小鼠胎兒過度生長的該基因印記的丟失被認(rèn)為是由濃度提高的胰島素樣生長因子Ⅱ(IGFⅡ)蛋白引起的(Eggenschwiler等人，基因與發(fā)育113128-3142(1997)；Sun等人，自然389809-815(1997))。在小鼠中，刪除似乎與Igf2印記機(jī)制有關(guān)的相鄰H19基因可誘導(dǎo)Igf2印記的丟失(Leighton等人，自然37534-39(1995)；Ohlsson等人，發(fā)育120361-368(1994))。小鼠Igf2基因的轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)導(dǎo)致出生前過度生長和類似于牛和綿羊巨大后代綜合征和人貝-維綜合征的其他后果。所述后果包括羊水過多、胎兒及新生兒死亡、器官及骨骼畸形(Sun等人，自然389809-815(1997))。
在人貝-維綜合征的某些病例中，胎兒過度生長是由于H19/Igf2區(qū)的二體、三體或其他染色體重排引起的。但是，在該綜合征的某些偶發(fā)病例中，觀察到的印記的丟失和引起的Igf2基因的雙等位基因過量表達(dá)與染色體異常無關(guān)。而是認(rèn)為這些病例起因于種系或早期胚胎中H19/Igf2區(qū)域的“外遺傳事件”(Reik等人，人類分子遺傳學(xué)42379-2385(1995))，盡管尚未確定或描述，并且尚不知它們是如何發(fā)生的。環(huán)境誘導(dǎo)的印記基因外遺傳改變，如DNA甲基化改變，被認(rèn)為是由體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞衍生的小鼠胎兒中觀察到的出生前及圍生期死亡和較大體積的可能原因(Nagy等人，美國國家科學(xué)院院刊908424-8428(1993))。雖然還不知哪種(些)基因負(fù)責(zé)這一作用，但最近已顯示，由小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞的衍生或培養(yǎng)引起的DNA甲基化和印記基因表達(dá)的外遺傳改變在植入后發(fā)育期間不能被更正，并且與ES細(xì)胞衍生的胎兒中的異?；虮磉_(dá)有關(guān)(Dean等人，發(fā)育1252273-2282(1998))。該研究發(fā)現(xiàn)了所檢測的全部4種印記基因改變的證據(jù)，雖然這在所檢測的(4種)不同ES細(xì)胞系之間和之中是不一致的。特別是，通常檢測到母體U2af1-rs1等位基因甲基化的喪失，這導(dǎo)致該基因(其編碼一種具有未知生物功能的剪接因子)的雙等位基因表達(dá)。H19的雙等位基因甲基化也是常見的，這導(dǎo)致強(qiáng)烈抑制的H19在ES細(xì)胞胚胎中表達(dá)。在所研究的全部ES細(xì)胞系中，除親本等位基因外，母體Igf2等位基因無法顯著甲基化。在幾種胚胎中，這導(dǎo)致兩種等位基因特別是母體等位基因的Igf2的表達(dá)。最后，在所有ES細(xì)胞系和大多數(shù)ES細(xì)胞胚胎中Igf2r基因母體甲基化。在所有ES細(xì)胞系中，Igf2r表達(dá)模式是雙等位基因的，而在大多數(shù)ES細(xì)胞胚胎中只來源于母體等位基因。這與在正常小鼠胚泡期胚胎(ES細(xì)胞由其產(chǎn)生)和胎兒中發(fā)現(xiàn)的Igf2r甲基化和表達(dá)模式一致。這些發(fā)現(xiàn)證實了以前關(guān)于小鼠ES細(xì)胞系中Igf2r印記穩(wěn)定性的報道(Labosky等人，發(fā)育1203197-3204(1994))。然而，由兩種ES細(xì)胞系衍生的某些ES胚胎顯示Igf2r的部分雙等位基因表達(dá)(小于正常沉默、親本等位基因的表達(dá)的35％)。另外，在(24種之中的)一種ES胚胎中，觀察到雙等位基因Igf2r表達(dá)，在該情況中親本等位基因的甲基化是明顯的。
印記在Igf2r表達(dá)中的作用和小鼠中表達(dá)缺乏導(dǎo)致胎兒過度生長的事實已被用來假定Igf2r印記的相應(yīng)丟失(即雙等位基因表達(dá))與Igf2具有相反的作用，并將導(dǎo)致胎兒生長的減緩(Moore,T.和Reik,W.，生殖綜述173-77(1996))。在ES細(xì)胞胚胎中未報道有這種表型，也無任何培養(yǎng)誘導(dǎo)的Igf2r改變，這與胎兒過度生長或巨大后代綜合征的其他癥狀一致(Dean等人，發(fā)育1252273-2282(1998))。此外，對ES細(xì)胞衍生的胚胎描述的不同發(fā)育異常，包括羊水過多、顎畸形和間質(zhì)出血，迄今尚未與特異印記基因關(guān)聯(lián)，并且當(dāng)然與所報道的研究中未檢測的基因相關(guān)。這些關(guān)于培養(yǎng)的、胚衍生的ES細(xì)胞中異常印記基因表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，與印記基因的已知發(fā)育作用和(在某些情況中)對胎兒生長的已知表型作用一起，確定了印記基因及其外遺傳改變是異常環(huán)境中胚胎培養(yǎng)和/或核移植后牛和綿羊巨大后代綜合征的基礎(chǔ)這一假說的可信性(Moore,T.和Reik,W.，生殖綜述173-77(1996)；Walker等人，動物生殖學(xué)45111-120(1996)；Dean等人，發(fā)育1252273-2282(1998))。然而，它們未能清楚地顯示哪種基因直接有關(guān)。
診斷誘發(fā)的LOS的篩查方法在鑒定和改進(jìn)胚胎培養(yǎng)、核移植及其他與異常發(fā)育有關(guān)的胚胎操作方法中具有商業(yè)利益。因此迫切需要能有效地篩查體外培養(yǎng)動物胚胎中異常發(fā)育的存在，以便能適當(dāng)?shù)馗深A(yù)或改變培養(yǎng)條件。
現(xiàn)在有證據(jù)表明，編碼胰島素樣生長因子Ⅱ受體(IGFⅡR)的Igf2r基因的改變的表達(dá)預(yù)示動物胚胎的異常發(fā)育，其具有一般與巨大后代綜合征(LOS)有關(guān)的癥狀。具有LOS危險的胚胎包括在體外或在異常體內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)的胚胎，以及通過核移植制備的重建胚胎。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種為巨大后代綜合征篩查動物胚胎的方法，其包括分析動物胚胎中或來源于胚胎的生物樣品中胰島素樣生長因子-2受體(Igf2r)基因表達(dá)的步驟。
通過根據(jù)本發(fā)明的方法對動物胚胎的篩查能避免在體外培養(yǎng)的動物胚胎受巨大后代綜合征癥狀影響時遇到的問題，在所述綜合征中胚胎能生長為較大體積，或具有相關(guān)的器官缺陷或發(fā)育異常。該方法也適用于在改變的或異常環(huán)境中體內(nèi)培養(yǎng)的動物胚胎。該篩查方法的應(yīng)用將允許干預(yù)胚胎發(fā)育，以抑制或防止異常發(fā)育?？赡軐?dǎo)致產(chǎn)生異常后代的多能細(xì)胞和由其衍生的胚胎或細(xì)胞的檢測可為嵌合體或細(xì)胞衍生的胚胎的產(chǎn)生選擇適當(dāng)?shù)闹晗?。根?jù)本發(fā)明的方法也允許鑒定不引起導(dǎo)致巨大后代綜合征的缺陷的培養(yǎng)條件。這些方法在農(nóng)業(yè)物種中可能有相當(dāng)大的商業(yè)利益，并可能在包括人類在內(nèi)的其他幾個物種中具有未來的用途。這可能與干細(xì)胞或用于基于人細(xì)胞的治療的其他細(xì)胞在醫(yī)學(xué)中的任何未來用途特別相關(guān)(Solter,D.，自然394315-316(1998))。
本方法的篩查方法通常適用于任何動物胚胎，包括鳥類，如家禽、魚、真獸亞綱動物和有袋類哺乳動物，包括胚胎是核移植或體外生產(chǎn)(IVP)(包括卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)(IVC)和/或體外受精(IVF)和/或體外成熟(IVM))的產(chǎn)物，進(jìn)一步包括在任何環(huán)境下的培養(yǎng)，其中胚胎在正常妊娠期間不能使自己位于或暴露于(例如，在臨時受體動物的結(jié)扎的)輸卵管中的培養(yǎng)。然而，該方法可在篩查哺乳動物胚胎特別是反芻動物、人或靈長類動物胚胎中具有主要用途。該方法適用的其他哺乳動物種包括但不限于非人類哺乳動物，例如，有蹄動物種，如牛、綿羊、豬、山羊、馬、駱駝或野牛(包括水牛)，以及如狗、貓、馬、羊駝(llamas)、羊駝(alpaca)和嚙齒類動物，包括大鼠、小鼠或兔或豚鼠的物種，和多種動物(野生動物或未馴化的)物種，包括大熊貓、虎和鯨類物種，包括鯨和海豚。
該方法也可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因或遺傳修飾的動物胚胎，包括經(jīng)核移植法制備的嵌合體和胚胎，或者該胚胎是改變其遺傳內(nèi)容物的操作的對象。這些方法也可應(yīng)用于利用核移植用培養(yǎng)的ES細(xì)胞或其他細(xì)胞進(jìn)行的基于細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。例如，在胚胎或胚胎衍生的細(xì)胞的篩查中，特別是ES或EG細(xì)胞(Dinsmore等人，動物生殖學(xué)49145-151(1998))參與動物基因組的修飾，其中用胚胎細(xì)胞為醫(yī)學(xué)治療用途制備特異細(xì)胞型，包括這些細(xì)胞的體外分化。
應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”與動物有關(guān)時，不應(yīng)只限于指在基因組或種系中含有另一物種的一種或多種基因的動物，雖然許多轉(zhuǎn)基因動物含有這些基因。相反，該術(shù)語更廣泛地指其種系或基因組是重組DNA方法技術(shù)干預(yù)的對象的任何動物。因此，例如，在其種系中一種內(nèi)源基因缺失、復(fù)制、激活或修飾的動物是用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，其基因組或種系中加入一種外源DNA序列的動物也是轉(zhuǎn)基因動物。在動物是轉(zhuǎn)基因動物的本發(fā)明的實施方案中，可用物理技術(shù)如向合子的雄性或雌性原核中或者向卵母細(xì)胞或胚胎的細(xì)胞質(zhì)或核中微注射進(jìn)行遺傳修飾。另外，遺傳修飾也能包括使用大量轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，如電穿孔、病毒轉(zhuǎn)染(包括腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨方法或合成反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、微粒細(xì)胞轟擊、反義技術(shù)、載體如YAC和BAC，或利用其他工具如精子。而且，這種修飾也能得益于同源重組、DNA修復(fù)機(jī)制的干預(yù)，包括限制酶的應(yīng)用。細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移能使用多種細(xì)胞，包括ES細(xì)胞、EG細(xì)胞和其他干細(xì)胞或來源于任何哺乳動物種的適當(dāng)細(xì)胞。
利用未遺傳修飾的動物的核移植可發(fā)現(xiàn)其他用途。例如，未修飾的克隆可用于倍增遺傳上優(yōu)良或有用的個體用于農(nóng)業(yè)用途，包括提高牛奶和牛肉產(chǎn)量或質(zhì)量，和提高生殖能力。其也可用于克隆瀕危物種以保留品種、群體或物種(例如，虎、犀牛、大熊貓、鯨或海豚)。另外，為了LOS相關(guān)異常的可能發(fā)展篩查胚胎，也可能在用于基于細(xì)胞的治療的植入前人胚胎或用于移植的其他胚胎的可能發(fā)育及應(yīng)用中具有極大的利益。
根據(jù)本發(fā)明的方法用于篩查動物胚胎。胚胎的體外培養(yǎng)現(xiàn)在已是一種體外產(chǎn)生動物的完善成熟的技術(shù)，包括卵母細(xì)胞的體外成熟。其應(yīng)用于解決人類不育問題和通常利用體外受精控制繁殖農(nóng)畜，其中使卵母細(xì)胞和精子在受控及可觀察的體外環(huán)境中聚集在一起。動物胚胎的體外培養(yǎng)也包括經(jīng)核移植法制備的動物胚胎或是改變其遺傳內(nèi)容物的操作對象的動物胚胎。也常應(yīng)用胚胎的體內(nèi)培養(yǎng)，特別是在經(jīng)核移植重建胚胎或經(jīng)原核注射遺傳修飾后。這通常包括受體動物輸卵管中胚胎的手術(shù)結(jié)扎，其中胚胎可包埋于保護(hù)性、可滲透的但是惰性的培養(yǎng)基中，例如瓊脂或相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)中(Campbell等人，生殖生物學(xué)501385-1393(1994))。受體動物不總是與體內(nèi)培養(yǎng)的動物胚胎相同的物種(Wilson等人，動物生殖協(xié)會(Anim.Reprod.Soc.)3873-83(1995))。該方法也適用于篩查在可導(dǎo)致發(fā)生巨大后代綜合征(LOS)的改變的或異常環(huán)境中培養(yǎng)的任何動物胚胎，包括在正常妊娠中胚胎無法使自己位于或暴露于其中的任何環(huán)境。這可包括胚胎從一種動物的生殖道向另一種動物或向同一動物生殖道的另一部分的移植。其也可包括生殖道環(huán)境的直接或間接改變。直接改變的實例包括但不限于，用適當(dāng)液體沖洗生殖道或加入任何移植物、外源物質(zhì)或?qū)ο?。間接改變可包括但不限于飲食、內(nèi)分泌或?qū)κ荏w動物施用藥物。
術(shù)語“胚胎”用于描述受孕及合子第一次分裂后直到新生動物出生時發(fā)育的動物。因此該術(shù)語包括更專業(yè)化的描述性術(shù)語“囊胚”、“原腸胚”和“胎”。胎能用于描述植入后在軟骨中出現(xiàn)第一個骨細(xì)胞時的胚胎。該術(shù)語也包括“胚泡”，其描述人的一個發(fā)育階段，此時在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)作為平盤擴(kuò)散到囊胚腔中時在正常妊娠中發(fā)生向子宮壁中的植入。在其他動物種如綿羊和牛中，可能直到胚泡期之后才發(fā)生植入，因此可以認(rèn)為該定義擴(kuò)展到包括中央囊胚腔周圍內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的發(fā)育階段。
本發(fā)明的方法涉及對巨大后代綜合征(LOS)的篩查。該綜合征最常見于通過核移植法、體外遺傳操作和/或包括利用體外成熟、體外受精和/或體外胚胎培養(yǎng)在內(nèi)的體外生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)生的農(nóng)畜中。巨大后代綜合征的征狀通常難以表征，因為它不僅表現(xiàn)于出生體重方面。也存在其他相關(guān)的異常，包括流產(chǎn)率提高和身體畸形、妊娠期延長和死亡率和發(fā)病率水平的提高(Walker等人，動物生殖學(xué)45 111-120(1996))。異常發(fā)育是相對于正常動物胚胎在相當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段時的發(fā)育而言。
在分析動物胚胎中編碼胰島素樣生長因子-2受體(IGF2R)的基因表達(dá)后，利用根據(jù)本發(fā)明的方法篩查診斷巨大后代綜合征(LOS)在胚胎中的出現(xiàn)。IGF2R有時也被稱為甘露糖6-磷酸受體、Ⅱ型IGF受體和不依賴陽離子的甘露糖6-磷酸受體。因此應(yīng)認(rèn)為IGF2R蛋白和Igf2r基因包括這些定義。改變的或干擾的Igf2r基因表達(dá)是與正常水平的基因表達(dá)相比動物胚胎的異常發(fā)育的指示。改變的基因表達(dá)可看作降低水平的編碼IGF2R的DNA轉(zhuǎn)錄。在受影響的胚胎中編碼IGF2R的基因中DNA甲基化模式的改變也可證明這一改變。DNA的其他改變，包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或組蛋白乙酰化的改變，可能也與改變的Igf2r表達(dá)有關(guān)。這一改變也可表示為與同一孕齡的正常胚胎相比，IGF2R蛋白水平的降低。動物中Igf2r表達(dá)降低時，預(yù)示胚胎具有發(fā)展為巨大后代綜合征(LOS)的危險。不希望為理論所束縛，可以認(rèn)為Igf2r基因表達(dá)的降低不伴隨著Igf2基因表達(dá)中存在變異。也可以理解，本發(fā)明的方法也可應(yīng)用于在LOS的某些特點不是很明顯時篩查新生動物，可能存在出生后不久該階段的篩查是有用的情況。
對來源于胚胎的生物樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析。樣品可包括取自胚胎或胎盤的羊膜或尿膜液的組織活檢、細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)或生物液體如血液。組織或細(xì)胞樣品可采自器官、肌肉、軟骨、骨或皮膚。然而，在早期胚胎中，樣品可方便地采自發(fā)育中的胚胎的細(xì)胞。有時，可篩查整個胚胎。樣品也可以是處于從初級卵母細(xì)胞期到次級卵母細(xì)胞期的卵母細(xì)胞，或在卵原細(xì)胞的任何發(fā)育階段引入卵母細(xì)胞的卵泡，和成熟卵子。
Igf2r基因表達(dá)的分析可以用任何標(biāo)準(zhǔn)方法包括基于PCR的方法如RT-PCR來完成。能由Genbank牛序列如序列J03527(5’-核苷酸530-551,3’-核苷酸769-750；Lobel等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)263(5)2563-2570(1988))設(shè)計Igf2r引物。
有時，為了對照，能用本發(fā)明的方法進(jìn)行Igf2和Igf2r表達(dá)水平的對比。Igf2外顯子特異性轉(zhuǎn)錄物的引物能如Ohlsen等人，DNA細(xì)胞生物學(xué)(DNA Cell Biol.)13(4)377-388(1994)所述獲得，IGFBP2、IGFBPE如Winger等人，生殖生物學(xué)56 1415-1423(1997)所述，IGFBP4如Armstrong等人，內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)139(4)2146-2154(1998)所述。Igf2以組織特異的和發(fā)育階段特異的方式表達(dá)為一系列選擇剪接的、外顯子特異的轉(zhuǎn)錄物(Ohlsen等人，DNA細(xì)胞生物學(xué)13(4)377-388(1994))。
因此可認(rèn)為本發(fā)明的方法包括編碼IGF2R的核酸序列或其片段或與之互補(bǔ)或同源的序列在制備用于診斷動物胚胎或來自胚胎的樣品中巨大后代綜合征(LOS)的藥劑中的應(yīng)用。編碼IGF2R的基因Igf2r的序列在人類(Oshima等人，生物化學(xué)雜志263(5)2553-2562(1988)；Morgan等人，自然329301-307(1987))、牛(Lobel等人，生物化學(xué)雜志263(5)2563-2570(1988))和小鼠(Ludwig等人，基因142(2)311-312(1994))中已知，技術(shù)人員能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)選擇適當(dāng)?shù)囊镄蛄?Sambrook等人《分子克??；實驗室指南》，第二版(1989))。這些核酸序列可直接應(yīng)用，或者更常用的是為基于PCR的分析用其設(shè)計適當(dāng)引物。
與可用于本發(fā)明的方法中的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列是在嚴(yán)格條件下可與這種序列雜交的序列，或在由于遺傳密碼簡并性與這種序列同源或在嚴(yán)格條件下可與之雜交的核酸序列，或?qū)θ我辉撔蛄刑禺惖墓押塑账嵝蛄?。這些核酸序列包括由核苷酸組成的寡核苷酸，也包括由肽核酸組成的寡核苷酸。在核酸序列基于編碼IGF2R的基因片段時，該片段可以是該基因的至少10個連續(xù)核苷酸，或者例如是由20、30、40或50個核苷酸組成的寡核苷酸。
嚴(yán)格雜交條件的特征在于低鹽濃度或高溫度條件。例如，高嚴(yán)格條件可定義為在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中與結(jié)合于固體載體上的DNA雜交，并在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等人編，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》1,2.10.3頁，GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.，紐約(1989))。有時可能需要低嚴(yán)格條件。在本申請書中使用時，中度嚴(yán)格條件可定義為包括在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等人(1989)，同上)。也可通過加入漸增量的甲酰胺使雜合核酸雙螺旋去穩(wěn)定而使雜交更嚴(yán)格。因此可容易地操作特定雜交條件，并且通?？筛鶕?jù)希望的結(jié)果選擇。通常，對于與靶DNA95-100％同源的探針，在50％甲酰胺存在時的常規(guī)雜交溫度為42℃，對于90-95％同源為37℃，對于70-90％同源為32℃。
本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選核酸序列的實例是基于牛Igf2r基因序列的5’-核苷酸530-551、3’-核苷酸769-750的寡核苷酸引物(Lobel等人，生物化學(xué)雜志263(5)2563-2570(1988))。
根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)于以前所述的體外產(chǎn)生(包括體外受精和體外成熟)、遺傳修飾和核移植技術(shù)。篩查異常發(fā)育的能力應(yīng)能通過在胚胎發(fā)育或在出生時或在之后不久的胚胎異常發(fā)育及死亡，減少不成功妊娠的數(shù)量，來提高這些技術(shù)的效率。具有異常發(fā)育危險的胚胎的鑒定也允許進(jìn)行測定以保護(hù)攜帶該胚胎的雌性的健康。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種體外產(chǎn)生動物胚胎的方法，其包括下列步驟向體外培養(yǎng)系統(tǒng)的卵母細(xì)胞中導(dǎo)入一種精細(xì)胞，隨后培養(yǎng)得到的胚胎，并通過分析來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，為巨大后代綜合征(LOS)篩查該胚胎。
通常，待受精的卵母細(xì)胞在靠近精細(xì)胞之前可施以體外成熟步驟。動物胚胎的體外產(chǎn)生一般包括動物卵母細(xì)胞的體外受精，并能根據(jù)動物種用任何適當(dāng)方法完成。這些方法的實例包括但不限于，Trounson等人，動物生殖學(xué)4157-66(1994)；Thompson,J.G.，生殖與受精進(jìn)展(Reprod.Fertil.Dev.)9341-354(1997)；Wilmut等人，《綿羊遺傳學(xué)》,395-412頁，Piper,L.和Ruvinsky,A.編，CAB International，牛津，UK(1997)；Gardner,D.K.和Lane,M，人類生殖信息(Human ReproductionUpdate)3367-382(1997)；Summers等人，生殖生物學(xué)53431-437(1995)；Weston,A.M.和Wolf,D.P.，分子生殖進(jìn)展4488-92(1996)；Liu等人，分子生殖進(jìn)展45157-162(1996)；Li等人，動物生殖學(xué)471103-1113(1997)；Biggers等人，人類生殖信息3125-135(1997)；Trounson,A.和Gardner,D.K.編，《體外受精手冊》，CRC Press Inc.Salem,USA(1993)的方法。本發(fā)明該方面也可包括所得動物胚胎的體外培養(yǎng)。也應(yīng)容易地理解，根據(jù)本發(fā)明該方面的方法也可包括對胚胎生存力及向最終雌性受體移植的適宜性的其他篩查步驟。另外，該方法也擴(kuò)展到是正常受精結(jié)果但隨后從雌性動物中取出并在重新植入受體雌性動物之前體外培養(yǎng)一段時間的胚胎。
適于體外成熟的卵母細(xì)胞通常利用手術(shù)腹腔鏡檢或超聲指導(dǎo)的“卵子挑選”(OPU)取自于新吸出的卵巢，或供體動物或患者(Wilmut等人，《綿羊遺傳學(xué)》，395-412頁，Piper,L.和Ruvinsky,A.編，CABInternational，牛津，UK(1997)；Trounson,A.和Gardner,D.K.編，《體外受精手冊》，CRC Press Inc.Salem,USA(1993))。有時可用激素或其他試劑預(yù)處理供體。體外成熟最常在含有多種添加物包括共培養(yǎng)的支持細(xì)胞、促性腺激素、雌二醇、生長因子、丙酮酸、血清和聚乙烯醇的組織培養(yǎng)基199中進(jìn)行(Thompson,J.G.，生殖與受精進(jìn)展9341-354(1997)；Barnes等人，人類生殖103243-3247(1995))，這可使卵母細(xì)胞發(fā)育至可以受精的階段。
體外受精能在支持精子的運動性和獲能但仍保持待受精的卵母細(xì)胞生存力的任何條件下進(jìn)行。這些條件在物種之間變化極大。例如，不同于反芻動物，人精子不需要獲能的任何特定誘導(dǎo)(Trounson等人，動物生殖學(xué)4157-66(1994))。對于牛卵母細(xì)胞，最常用的受精培養(yǎng)基是通常添加了幾種獲能和運動性刺激劑如肝素、腎上腺素、亞?；撬岷颓嗝拱返牡倭_德白蛋白乳酸丙酮酸培養(yǎng)基(TALP)(Thompson,J,G.，生殖與受精進(jìn)展9341-354(1997))。與母牛不同，綿羊體外受精常規(guī)使用簡單培養(yǎng)基如合成輸卵管液(SOF)?；顒泳佑脦追N方法制備，包括“游動”和利用Percoll梯度(Wilmut等人，《綿羊遺傳學(xué)》，395-412頁，Piper,L.和Ruvinsky,A.編，CAB International，牛津，UK(1997))。
由體外成熟和/或受精方法或超數(shù)排卵法和供體胚胎回收產(chǎn)生的胚胎的體外培養(yǎng)方法在物種之間和之中有極大不同?；居袃煞N培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)(或以前用于細(xì)胞的“條件”培養(yǎng)基)和合成(或半合成)的。牛和綿羊胚胎的共培養(yǎng)通常在一般添加血清的組織培養(yǎng)基199或MenezoB2培養(yǎng)基中進(jìn)行。支持細(xì)胞通常是牛顆粒細(xì)胞、牛輸卵管上皮細(xì)胞或水牛大鼠肝細(xì)胞。沒有體細(xì)胞支持的胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)通常稱為半合成的或合成系統(tǒng)，這取決于是使用血清(或蛋白質(zhì)源如牛血清白蛋白)還是合成大分子(如聚乙烯醇)。廣泛應(yīng)用的已知成份培養(yǎng)基包括合成輸卵管液(SOF)和CR1，其中可加入多種血清及其他添加物(如生長因子、激素、維生素、氨基酸、酶和抗氧化劑)(Thompson,J.G.，生殖與受精進(jìn)展9341-354(1997))。胚胎也可在體液或含有體液如卵泡液和人羊水的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Trounson等人，動物生殖學(xué)4157-66(1994))。除靜態(tài)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)外，也發(fā)展了用于連續(xù)輸送新鮮培養(yǎng)基的灌注系統(tǒng)的應(yīng)用(Thompson,J.G.，動物生殖學(xué)4527-40(1996))。
牛和綿羊胚胎通常在移植到適當(dāng)?shù)氖荏w動物中之前培養(yǎng)至胚泡期(胚胎培養(yǎng)5-7天后)，而人胚胎通常在發(fā)育的第2天或第3天移植到子宮中。然而，培養(yǎng)人胚胎至胚泡期受到更廣泛的關(guān)注(Gardner,D.K.和Lane,M，人類生殖信息3367-382(1997))，或者至少直到原條發(fā)育為止。不算貯存胚胎的任何時間，從配子混合開始，在不晚于14天末時在胚胎中出現(xiàn)原條。需要體外胚胎培養(yǎng)作為許多當(dāng)前及潛在用途的一部分，并用于在人和其他物種中幫助生殖。經(jīng)原核注射產(chǎn)生的許多遺傳操作的胚胎在移植到受體之前培養(yǎng)，通過核移植重建的許多胚胎也如此。體外胚胎培養(yǎng)已用于產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和ES細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生，并且在發(fā)展臨床應(yīng)用的基于細(xì)胞的治療中是重要的。盡管進(jìn)行了相當(dāng)多的研究嘗試并在技術(shù)效率方面取得了極大的進(jìn)步，但仍沒有一種以相當(dāng)于體內(nèi)方法的速度產(chǎn)生胚胎的方法(Wilmut等人，《綿羊遺傳學(xué)》，395-412頁，Piper,L.和Ruvinsky,A.編，CAB International，牛津，UK(1997))。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種重建動物胚胎的方法，其包括下列步驟向適當(dāng)受體細(xì)胞中移植供體細(xì)胞的核，通過分析來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，為巨大后代綜合征(LOS)篩查得到的胚胎。
在以上方面所述的本發(fā)明的方法中，從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移核。該方法的應(yīng)用不限于特定供體細(xì)胞型。供體細(xì)胞可如Wilmut等人，自然385810(1997)；Campbell等人，自然38064-66(1996)；Cibelli等人，科學(xué)2801256-1258(1998)；或Wakayama等人，自然394369-373(1998)所述。正常核型的所有細(xì)胞，包括能在核移植中成功應(yīng)用的胚細(xì)胞、胎細(xì)胞和成人體細(xì)胞，原則上都可在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用。胎成纖維細(xì)胞是特別有用的一類供體細(xì)胞。Campbell等人，動物生殖學(xué)43181(1995)、Collas等人，分子生殖進(jìn)展38264-267(1994)、Keefer等人，生殖生物學(xué)50935-939(1994)、Sims等人，美國國家科學(xué)院院刊906143-6147(1993)、Wakayama等人，自然394369-373(1998)、WO-A-9426884、WO-A-9424274、WO-A-9807841、WO-A-9827214、WO-A-9003432、US-A-4994384和US-A-5057420中描述了普遍適用的核移植方法。因此本發(fā)明涉及至少部分分化的細(xì)胞包括完全分化的細(xì)胞的應(yīng)用。供體細(xì)胞可以但不必培養(yǎng)，并且可以是靜止的。靜止的核供體細(xì)胞是可誘導(dǎo)為靜止或在體內(nèi)以靜止?fàn)顟B(tài)存在的細(xì)胞。WO-A-9707669和WO-A-9707668中描述了培養(yǎng)的牛初級成纖維細(xì)胞、胚衍生的綿羊細(xì)胞系(TNT4)、來源于6歲成羊的綿羊乳腺上皮細(xì)胞衍生的細(xì)胞系(OME)、來源于綿羊胎組織的成纖維細(xì)胞系(BLWF1)和來源于9日齡綿羊胚的上皮樣細(xì)胞系(SEC1)。WO-A-9607732中描述了本發(fā)明中有用的一類胚衍生細(xì)胞系，包括TNT4細(xì)胞系。WO-A-9737009和WO-A-9827214中描述了培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞，WO-A-9807841中描述了胚胎或干細(xì)胞樣細(xì)胞系。Zawada等人(自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)4(5)569-574(1998))和Cibelli等人(科學(xué)2801256-1258(1998))描述了用作核供體的轉(zhuǎn)基因牛成纖維細(xì)胞。
當(dāng)供體細(xì)胞表述為靜止時，這些細(xì)胞不必通過有絲分裂細(xì)胞周期活躍增殖。WO-A-9707669中描述了靜止供體細(xì)胞的應(yīng)用。有絲分裂細(xì)胞周期具有4個不同時期G1、S、G2和M。細(xì)胞周期的開始事件，稱作起點，發(fā)生在G1期，且具有獨特的功能。在起點時選擇或決定經(jīng)歷另一細(xì)胞周期。一旦細(xì)胞通過起點，其通過G1期的剩余部分，該期為DNA合成前期。第二階段，S期，是發(fā)生DNA合成的時期。隨后是G2期，它是DNA合成與有絲分裂之間的時期。有絲分裂本身發(fā)生在M期。通常認(rèn)為靜止細(xì)胞(包括誘導(dǎo)為靜止的細(xì)胞，及自然靜止的細(xì)胞，如某些完全分化的細(xì)胞，如支持細(xì)胞、神經(jīng)元或丘細(xì)胞)不處于周期中這4個階段的任一個；它們通常被描述為處于G0期，以表明它們不能正常地通過該周期，或者不能通過細(xì)胞周期活躍地分裂。靜止G0細(xì)胞的核含有二倍DNA內(nèi)容物。
能用多種方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入靜止期，包括化學(xué)處理、營養(yǎng)剝奪、生長抑制或基因操作或蛋白質(zhì)表達(dá)。目前已成功地利用培養(yǎng)基中血清水平的降低誘導(dǎo)綿羊及牛細(xì)胞系的靜止。在該情況中，細(xì)胞在G1期時退出生長周期，并如上所述停止于所謂的G0期。這些細(xì)胞能保持該狀態(tài)幾天(根據(jù)細(xì)胞可能更長)，直到重新刺激才重新進(jìn)入生長周期。停止于G0期的靜止細(xì)胞是二倍體。G0期是細(xì)胞周期中細(xì)胞能夠分化的時段。已報道了關(guān)于靜止的大量代謝改變，包括一磷酸化組蛋白、纖毛中心粒、所有蛋白質(zhì)合成的減少或完全停止、增強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解、導(dǎo)致總細(xì)胞RNA減少的轉(zhuǎn)錄減少和RNA轉(zhuǎn)換增加、多核糖體的解聚、失活80S核糖體的積累和染色質(zhì)濃縮(Whitfield等人，動物細(xì)胞增殖控制(Controlof Animal Cell Proliferation)1 331-365(1985)綜述)。
這許多特征是向去核卵母細(xì)胞進(jìn)行核移植所需的。G0狀態(tài)與細(xì)胞分化相關(guān)的事實提示，這可產(chǎn)生一種更適于被受體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)改建和/或重編程序的核/染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。這樣，利用呈靜止?fàn)顟B(tài)的核供體細(xì)胞，可在胚胎重組或重建之前修飾供體核的染色質(zhì)，以使核能直接發(fā)育。這不同于以前報道的所有核移植方法，因為其中供體細(xì)胞的染色質(zhì)在用這些細(xì)胞作為核供體之前被修飾。
接受供體細(xì)胞核移植的受體細(xì)胞可以是卵母細(xì)胞或其他適當(dāng)?shù)募?xì)胞。已經(jīng)證明了非卵母細(xì)胞的細(xì)胞的重編程序，包括胚胎干細(xì)胞(Matveeva等人，分子生殖進(jìn)展50128-138(1998))和胚胎生殖細(xì)胞(Tada等人，EMBO J.166510-6520(1997))。
對于合子和二細(xì)胞胚可使用處于不同發(fā)育階段的受體細(xì)胞，如從中期I到中期Ⅱ的卵母細(xì)胞(Cheong等人，日本獸醫(yī)研究雜志(Jpn.J.Vet.Res.)40149-150(1992))。每一種均具有優(yōu)點和缺點。受精卵的應(yīng)用確保有效的活化，而卵母細(xì)胞需要單性生殖活化(見下)。在某些物種中可能更常使用卵裂期胚胎的另一種機(jī)制是需要基因表達(dá)重編程序的情況。小鼠中在第二個細(xì)胞周期中開始轉(zhuǎn)錄，并且直到胚泡期經(jīng)雙向電泳未顯示合成蛋白質(zhì)的性質(zhì)有重要改變(Howlett和Bolton，胚胎學(xué)實驗形態(tài)學(xué)雜志(J.Embryol.Exp.Morphol.)87175-206(1985))。在大多數(shù)情況中，受體細(xì)胞是卵母細(xì)胞。在牛及綿羊胚胎中，轉(zhuǎn)錄開始較晚，在第四個細(xì)胞周期中發(fā)生，這樣晚的卵裂期胚胎在這些物種中是合適的。在大多數(shù)情況中，受體細(xì)胞是卵母細(xì)胞。
優(yōu)選地受體是去核的。雖然通常假定用核移植法對受體卵母細(xì)胞的去核是必需的，但沒有公開的實驗證明這一判斷。最初對有蹄動物所述的方法包括使細(xì)胞對半分裂為兩份，其中之一可能是去核的(Willadsen，自然320(6)63-65(1986))。該方法的缺點是未知的另一半仍有中期細(xì)胞器并且認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)體積的減少促進(jìn)了新胚胎的分化模式(Eviskov等人，發(fā)育109322-328(1990))。
最近，用不同方法試圖除去含有最少細(xì)胞質(zhì)的染色體。發(fā)現(xiàn)吸引第一極體和相鄰細(xì)胞質(zhì)可除去67％的綿羊卵母細(xì)胞中的中期Ⅱ細(xì)胞器(Smith和Wilmut，生殖生物學(xué)401027-1035(1989))。只有利用DNA特異的熒光染料(Hoeschst 33342)才能提供一種保證去核而細(xì)胞質(zhì)體積減少最少的方法(Tsunoda等人，生殖與受精雜志82173(1988))。在家畜物種中，這可能是目前常規(guī)使用的方法(Prather和First，生殖與受精雜志增41125(1990),Westhusin等人，生殖生物學(xué)(增)42176(1990))。
極少有用于哺乳動物去核的非侵入性方法的報道，而在兩棲動物中，用紫外線照射作為常規(guī)方法(Gurdon Q，顯微協(xié)會雜志(J.Microsc.Soc.)101299-311(1960))。沒有在哺乳動物中使用該方法的詳細(xì)報道，但應(yīng)當(dāng)指出，在使用DNA特異的熒光染料中，小鼠卵母細(xì)胞暴露于紫外線超過30秒種可降低細(xì)胞的發(fā)育能力(Tsunoda等人，生殖與受精雜志82173(1988))。
供體細(xì)胞核向受體卵母細(xì)胞的移植可利用本領(lǐng)域公知的任何適當(dāng)方法。這些技術(shù)包括但不限于，融合或注射，即如Wilmut等人，自然385810(1997)；Campbell等人，自然38064-66(1996)；Cibelli等人，科學(xué)2801256-1258(1998)或Wakayama等人，自然394369-373(1998)所述的顯微注射。
重建動物胚胎可在移植到受體動物之前在適當(dāng)條件下體外培養(yǎng)。培養(yǎng)可達(dá)且包括胚胎發(fā)育的任何適當(dāng)階段，例如桑椹胚、原腸胚或胚泡期，或確定數(shù)量的細(xì)胞，例如16個細(xì)胞、32個細(xì)胞或64個細(xì)胞。此外，可培養(yǎng)至原條的發(fā)育。不算貯存胚胎的任何時間，從配子混合開始，在不晚于14天末時在胚胎中出現(xiàn)原條。該方法也可包括體內(nèi)暫時胚胎培養(yǎng)。經(jīng)驗表明，核移植產(chǎn)生的胚胎不同于正常胚胎，有時受益于乃至需要不同于通常培養(yǎng)(至少體內(nèi))胚胎的體內(nèi)培養(yǎng)條件。其原因不清。在牛胚胎的常規(guī)增殖中，例如，重建胚胎(其中許多立即)在綿羊輸卵管中培養(yǎng)5-6天(如Willadsen所述，《哺乳動物卵移植》(Adams,E.E.編)185CRC Press,Boca Raton,Florida(1982))。為保護(hù)由核移植或體外受精方法產(chǎn)生的胚胎，在植入前將胚胎包埋于保護(hù)性培養(yǎng)基如瓊脂中，然后在從臨時受體中回收后從瓊脂中切下是必要的。保護(hù)性瓊脂或其他培養(yǎng)基的功能是雙重的首先，其通過將透明帶維持在一起作為胚胎的結(jié)構(gòu)支持；其次，其作為受體動物免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的屏障。
如果在體外發(fā)生可達(dá)胚泡期的發(fā)育，則在此階段進(jìn)行向最終受體動物中的移植。但是，如果在體內(nèi)進(jìn)行胚泡發(fā)育，雖然原則上胚泡能在胚泡前宿主中發(fā)育，但實際上通常從(臨時)胚泡前受體中取出胚泡，并在從保護(hù)性培養(yǎng)基中切下后移植到(永久)胚泡后受體中，使之發(fā)育。在一個臨時受體中培養(yǎng)大量胚胎降低了所需動物的數(shù)量，但通常將適于在相關(guān)物種中建立成功妊娠的較小量胚胎移植到永久受體中。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種重建動物胚胎的方法，該方法包括向停止于第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞中移植二倍體核而不同時活化該卵母細(xì)胞，使核暴露于受體細(xì)胞質(zhì)中一段時間，使胚胎足以能夠活產(chǎn)，隨后活化重建的胚胎而保持正確的倍性，包括通過分析胚胎或來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，為巨大后代綜合征(LOS)篩查胚胎。根據(jù)本發(fā)明該方面的受體卵母細(xì)胞在WO-A-9707668中有完整描述。其他特征如上所述。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種用以上本發(fā)明第三或第四方面所述的方法制備的重建動物胚胎，或通過如本發(fā)明第二方面所述的體外產(chǎn)生法制備的動物胚胎。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了一種產(chǎn)生動物的方法，該方法包括(a)在體外或體內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)一種動物胚胎，包括經(jīng)體外技術(shù)如成熟、受精和/或培養(yǎng)制備該胚胎，其中對該胚胎進(jìn)行原核注射，或如上所述重建動物胚胎；
(b)通過分析胚胎或來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，為巨大后代綜合征(LOS)篩查胚胎；(c)使該動物從胚胎發(fā)育至足月；和(d)任選地由這樣產(chǎn)生的動物繁殖。
步驟(a)和(b)如上詳述。第三步(c)在本發(fā)明的該方法中是使該動物由胚胎發(fā)育至足月。這可直接或間接進(jìn)行。在直接發(fā)育中，只是使步驟(b)產(chǎn)生的重建胚胎發(fā)育，而不另外進(jìn)行超出發(fā)育所需范圍的干預(yù)。但在間接發(fā)育中，可在發(fā)生完全發(fā)育之前操作胚胎，例如，為了提高產(chǎn)量可分裂胚胎，及克隆擴(kuò)充細(xì)胞。此外，根據(jù)本發(fā)明的任一方面通過克隆擴(kuò)充或連續(xù)核移植實現(xiàn)活胚胎產(chǎn)量的提高也是可能的。如果經(jīng)核移植制備轉(zhuǎn)基因或嵌合動物胚胎，其中欲向動物胚胎DNA內(nèi)容物中插入超過1種的轉(zhuǎn)基因，則連續(xù)核移植是有用的。例如，在從供體細(xì)胞(其本身可以是轉(zhuǎn)基因的)核移植和胚胎重建后，能分裂得到的胚胎，并向細(xì)胞中插入其他轉(zhuǎn)基因，以用作另一核移植中的供體細(xì)胞。在該方法的每一階段，能用根據(jù)本發(fā)明的方法篩查胚胎，以檢查異常發(fā)育。在本發(fā)明該方面的任選步驟(d)中，可由前述步驟制備的動物繁殖動物。這樣，可用一只動物建立一群具有希望的遺傳特征的動物。當(dāng)動物是轉(zhuǎn)基因動物時，可進(jìn)一步進(jìn)行重建胚胎的篩查，以選擇轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合和正確的基因型/表型。
通過圖例和概述，下列方案展示了一種可制備轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因動物的典型方法?？烧J(rèn)為該方法包括4個步驟(a)通過核移植或體外產(chǎn)生對體外培養(yǎng)胚胎的制備；(b)通過分析來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，為巨大后代綜合征(LOS)篩查胚胎；(c)篩選顯示正常Igf2r基因表達(dá)模式的胚胎；(d)將胚胎移植到雌性受體動物中。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了如上所述制備的動物。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了一種為巨大后代綜合征篩查動物細(xì)胞的方法，其包括分析動物細(xì)胞中Igf2r基因表達(dá)的步驟。
當(dāng)在動物胚胎的體外產(chǎn)生或核移植法中使用時，如上所述的篩查方法允許鑒定具有發(fā)展為巨大后代綜合征危險的動物細(xì)胞。該動物細(xì)胞可由體外或體內(nèi)來源獲得。
能根據(jù)本發(fā)明該方面篩查的細(xì)胞包括可在體外培養(yǎng)的任何動物細(xì)胞。其定義包括重建的單細(xì)胞胚或合子。例如，可篩查胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)、精子衍生干細(xì)胞或來源于胚胎、新生、嬰兒、青年或成年動物的其他干細(xì)胞。在本發(fā)明說明書中，動物干細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞、胚胎干(ES)細(xì)胞、胚胎生殖(EG)細(xì)胞(原始生殖細(xì)胞衍生的或PGC衍生的細(xì)胞)、體干/祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞或神經(jīng)元干細(xì)胞。全能細(xì)胞能指導(dǎo)整個動物的發(fā)育(當(dāng)通過從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞如去核卵母細(xì)胞的核移植構(gòu)建胚胎時，供體細(xì)胞核是全能性的)。這包括引導(dǎo)胚外譜系即胎盤的發(fā)育。在該定義中，受精的合子及某些物種中的卵裂球也是全能性的。與之相比，多能細(xì)胞(即胚胎干細(xì)胞)型被定義為在注射到囊胚腔后能形成孕體/后代中所有組織的細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，動物干細(xì)胞可以是胚胎干(ES)細(xì)胞或胚胎生殖(EG)細(xì)胞。在該定義中，術(shù)語胚胎干(ES)細(xì)胞和胚胎生殖(EG)細(xì)胞不限于來源于小鼠的細(xì)胞，而涉及任何相當(dāng)?shù)募?xì)胞，如其他物種中的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。
可用本發(fā)明該方面的方法有效篩查的其他細(xì)胞包括在核移植或利用四倍體聚集、胚泡注射等的胚胎重建中使用或由其制備的任何細(xì)胞，或是連續(xù)核移植產(chǎn)物的細(xì)胞。這些細(xì)胞型一般包括但不限于分化或未分化細(xì)胞，其也可是轉(zhuǎn)基因的適當(dāng)成纖維細(xì)胞。未分化細(xì)胞可進(jìn)一步用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)誘導(dǎo)分化。
應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法的特定用途在于檢測培養(yǎng)環(huán)境，包括培養(yǎng)基和條件、體內(nèi)環(huán)境和胚胎操作方法，以確定在這種系統(tǒng)中培養(yǎng)的動物胚胎是否具有發(fā)展為巨大后代綜合征(LOS)的危險。根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了一種檢測用于在動物胚胎中誘發(fā)巨大后代綜合征的胚胎培養(yǎng)環(huán)境的方法，其包括分析來源于胚胎的生物樣品中Igf2r基因表達(dá)的步驟。
檢測胚胎培養(yǎng)環(huán)境誘發(fā)動物胚胎LOS的能力的方法特別有利于提供一種方法，用于確定該系統(tǒng)的哪一特征負(fù)責(zé)胚胎培養(yǎng)中動物胚胎發(fā)育的干擾。就此而言，它可能在為商業(yè)用途優(yōu)化胚胎培養(yǎng)方案中得到應(yīng)用。因此，本發(fā)明該方面也擴(kuò)展到根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法檢測用于誘發(fā)動物胚胎巨大后代綜合征的胚胎培養(yǎng)環(huán)境的應(yīng)用。
胚胎培養(yǎng)環(huán)境可能包括胚胎操作方法、胚胎培養(yǎng)方法和核移植方法。一般而言，胚胎操作方法包括透明帶的鉆孔或穿透，以助于胚泡孵化，例如精子導(dǎo)入技術(shù)如ICSI(胞質(zhì)內(nèi)精子注射；Barnes等人，人類生殖103243-3247(1995))、細(xì)胞質(zhì)減少或置換(Cohen等人，分子人類生殖(Mol.Hum.Reprod.)4269-280(1998)；Cohen等人，柳葉刀350186-187(1997))、核、原核、線粒體或任何遺傳物質(zhì)的去核、移植或去除，及植入前診斷(Handyside,A.H.和Delhanty,J.D.，遺傳學(xué)趨勢13270-275(1997))。其他胚胎操作技術(shù)包括從一種動物的生殖道向另一種動物的生殖道或向同一生殖道的另一部分移植胚胎。在某些方法中，結(jié)扎輸卵管，而胚胎在或不在瓊脂塊或相當(dāng)物中。也可通過外源物質(zhì)或植入物(如激素、飲食添加物)的沖洗或加入或母體環(huán)境的任何變化來改變胚胎環(huán)境。胚胎培養(yǎng)方法包括制備及保持干細(xì)胞或其他任何細(xì)胞的方法，這些細(xì)胞用于利用如四倍體聚集和胚泡注射的方法的核移植或胚胎重建。培養(yǎng)方法也可包括協(xié)同培養(yǎng)或灌注系統(tǒng)的應(yīng)用及靜止培養(yǎng)。核移植法和DNA的原核或胞質(zhì)內(nèi)注射如上所述。胚胎培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中眾所周知，一般含有養(yǎng)分、血清、生長因子、激素、維生素、抗氧化劑、酶及其他成份。培養(yǎng)基也可包含體液如卵泡液。
根據(jù)本發(fā)明該方面的方法的結(jié)果將使技術(shù)人員能通過加入或去除一種或多種成份，或改變成份的濃度，來改變胚胎培養(yǎng)環(huán)境的條件，以防止LOS的誘發(fā)。例如，溫度、pH或空氣環(huán)境的改變，如甲基化劑或去甲基化劑(如甲基轉(zhuǎn)移酶、5-氮雜胞苷、多胺)等成份水平的改變，遺傳或化學(xué)修飾(如基因轉(zhuǎn)移或利用反義寡核苷酸)引起的Igf2r基因或IGFⅡR蛋白表達(dá)的改變，毒性物質(zhì)的酶或其他清除劑的加入，例如用谷氨酸脫氫酶去除氨(Gardner,D.K.，國際細(xì)胞生物學(xué)(Cell Biol.Int.)181163-1179)。
這種篩查方法的應(yīng)用能鑒定作用于胚、細(xì)胞和遺傳物質(zhì)(包括DNA或RNA)的因素，其通過影響Igf2r基因的表達(dá)干擾動物胚胎的發(fā)育。這使得能設(shè)計新的或改進(jìn)的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、胚胎環(huán)境，包括臨時體內(nèi)系統(tǒng)，和避免該綜合征的核移植法。也能利用這種篩查確定發(fā)生生長干擾的發(fā)育階段，這可提供改變培養(yǎng)方案的另一種方法。
按照本發(fā)明的方法篩查的或者用引入篩查LOS步驟的方法制備的胚胎能用作如上所述其他核供體細(xì)胞的來源。胚胎能進(jìn)一步用作細(xì)胞來源，產(chǎn)生可以是ES細(xì)胞或ES細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞系。來源于這些胚胎的動物細(xì)胞或細(xì)胞系也能在細(xì)胞移植治療中使用。因此，在本發(fā)明的另一方面提供一種治療方法，其包括對患者施用動物細(xì)胞，其中這些細(xì)胞由按照上述方法篩查的胚胎制備，或者按照引入這種篩查步驟的方法制備。本發(fā)明該方面擴(kuò)展到這些細(xì)胞在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，例如細(xì)胞移植治療，也擴(kuò)展到來源于這些胚胎的細(xì)胞在制備用于移植的細(xì)胞或組織移植物中的應(yīng)用。這些細(xì)胞可組成組織，例如心臟、肺、肝、腎、胰、角膜、神經(jīng)(例如腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓)、皮膚，或者這些細(xì)胞可以是血細(xì)胞(例如血細(xì)胞、即紅細(xì)胞、白細(xì)胞)或造血干細(xì)胞或其他干細(xì)胞(例如骨髓)。例如，可制備一種自體移植物，其中在改變之前從患者中取出細(xì)胞，隨后回輸。然而，本發(fā)明的方法也可用于在制備同基因移植物(同種移植物)、異基因移植物和/或異種移植物中篩查胚胎。這些方法包括用于向患者治療性移植的胚細(xì)胞的體外分化，包括遺傳修飾細(xì)胞以改正醫(yī)學(xué)缺陷的情況。這些用途包括如糖尿病、帕金森氏病、運動神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥、AIDS等疾病的治療，或特征在于患病個體細(xì)胞或器官功能喪失的病癥的治療。
因此本發(fā)明也擴(kuò)展到用于診斷動物胚胎中或來自胚胎的樣品中巨大后代綜合征(LOS)的試劑盒的供應(yīng)，其中包含檢測Igf2r基因表達(dá)的試劑。這些試劑盒也可用來實施根據(jù)本發(fā)明第九方面的方法，該方法用于檢測誘發(fā)動物胚胎巨大后代綜合征的胚胎培養(yǎng)環(huán)境。Igf2r表達(dá)的分析或檢測可如上所述進(jìn)行。
本發(fā)明的第二及其后方面的優(yōu)選特征在加以必要修改后適于第一方面。
現(xiàn)參照下列實施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，其只是為了說明，而不應(yīng)看作對本發(fā)明的限制。提到多個附圖，其中

圖1顯示體外培養(yǎng)后妊娠125日胎肝(圖1(a))、心(圖1(b))、腎(圖1(c))的不同的器官生長。對照(CONT)胎以實線(擬合數(shù)據(jù))和虛線(預(yù)測的生長)表示，其用線性異速生長方程式logey=logea+b(loge)x得出，其中y=器官重量，x=胎重量。點(ⅰ)和(ⅱ)分別代表妊娠125日CONT胎的最小和最大重量，點(ⅲ)代表根據(jù)Gompertz方程式預(yù)測的出生體重。異速生長系數(shù)(b±s.e.m)是對于心臟(CONT b=0.91±0.18，培養(yǎng)物b=1.47+0.12)、肝(CONT b=0.89±0.13，培養(yǎng)物b=1.16±0.10)和腎(CONT b=1.10±0.29，培養(yǎng)物b=1.09±0.26)，(●,○)。空心數(shù)據(jù)點(○)代表出見羊水過多的妊娠。
圖2顯示Igf2r PCR測定的確證及IGFⅡr蛋白同一性的結(jié)果。
圖2(a)顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定的典型確證，其用于定量相對于18S核糖體亞單位的基因轉(zhuǎn)錄物水平(在本案中為肝Igf2r)。Igf2r與18S在單管內(nèi)擴(kuò)增，使用適當(dāng)?shù)难h(huán)數(shù)和18S引物與稀釋的CompetimerTM之比，以確保至少10倍稀釋的cDNA的線性擴(kuò)增。數(shù)值為信號強(qiáng)度的主觀單位。
圖2(b)顯示CONT和LO肝樣品中Igf2r和18S的RT-PCR擴(kuò)增。
圖2(c)顯示證實IGFⅡWestern配體印跡上的一條＞200kDa條帶為IGFⅡ受體。用抗IGFⅡr蛋白的多克隆抗體對羊胎血漿的免疫印跡顯示，一條帶(a)與純化和牛IGFⅡr(b)共遷移，并通過胎血漿的Western配體印跡鑒定＞200kDa條帶。
圖2(d)顯示對CONT和LO血漿樣品的IGFⅡ Western配體印跡，鑒定IGFⅡr蛋白和IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)。
材料與方法綿羊LOS模式系統(tǒng)盡管該事件既不可預(yù)測又不能重現(xiàn)，但多種體外胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)與綜合征的程序性進(jìn)展有關(guān)(Lau等人，基因與發(fā)育82953-2963(1994))。本研究中，超排卵的蘇格蘭黑臉母羊的受精卵在4次體外處理中培養(yǎng)5天。這包括兩種培養(yǎng)系統(tǒng)合成輸卵管液(SOF)及TCM199與牛顆粒細(xì)胞單層的共培養(yǎng)物(Cocult)(Lau等人，基因與發(fā)育82953-2963(1994))，其中根據(jù)不同飲食方案(處理SOFA、SOFB、CocultA和CocultB)添加從公牛獲得的兩種血清(A或B)之一。將胚泡期胚胎分別移植入蘇格蘭黑臉母羊受體內(nèi)，并在妊娠125天時回收孕體(11SOFA,13SOFB,11CocultA和13CocultB)?；厥?-6小時后將第六日的對照胚胎(CONT)移植入受體，回收22個孕體。胚胎培養(yǎng)與移植在用Chronogest陰道海綿(Intervet)引起發(fā)情同步后，用400i.u.PMSG(Intervet)和Ovagen(ICP)在成熟蘇格蘭黑臉母羊中誘導(dǎo)超數(shù)排卵。使用釋放孕酮的陰道海綿(30mg乙酸熒光孕酮，Chronogest，Intervet)12天使供體與受體母羊動情周期同步。對于受體母羊同樣的海綿被置于陰道內(nèi)12天，而對于供體母羊則取出海綿并于7日后插入第二塊海綿。受體在取出海綿時施以400i.u.PMSG(Intervet)。從停用孕酮24小時后開始，在以后三天內(nèi)于08:00、12:00、16:00和24:00時對已切除輸精管的公羊進(jìn)行發(fā)情期觀察。在從12天孕酮刺激期的第10天開始的4天中，每日兩次施用等劑量的FSH(Ovagen,ICP Ltd，新西蘭)，總劑量為9mg，以誘導(dǎo)供體的超數(shù)排卵。
在取出海綿44小時后，用從一只Suffolk公羊新鮮獲得的精液進(jìn)行腹腔鏡檢子宮內(nèi)受精，以使遺傳變異降到最低。精液用每ml含有1000i.u.青霉素鈉及1mg硫酸鏈霉素的磷酸鹽緩沖液以3∶1稀釋。稀釋的精液在受精前置于30℃下，并在每一子宮角放置大約100×106個活動精子。
受精36小時后經(jīng)誘導(dǎo)全身麻醉(氟烷；氧氣；氧化亞氮)剖腹取出胚胎。每一輸卵管以20ml HEPES緩沖的合成輸卵管液(HSOF)沖洗，該洗液由Tervit等人(1972)的制劑衍生，包含20.0mM HEPES緩沖液、5.0mM碳酸氫鈉、1.SmM葡萄糖、3.3mM乳酸鈉、0.33mM丙酮酸鈉、1.0mM L-谷氨酰胺和30mg/ml牛血清白蛋白。
然后將胚胎分配于四個培養(yǎng)處理組。處理間的分配旨在保證就允許的卵產(chǎn)量而言每一供體都相同。胚胎培養(yǎng)按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在SOF和卵泡細(xì)胞層共培養(yǎng)物(Cocult)中進(jìn)行。所用的共培養(yǎng)基為培養(yǎng)基199，其中含有Earle’s鹽(Life Technologies，英國)、50i.u./ml青霉素、50μg/ml硫酸鏈霉素、10％熱滅活(56℃,30min)的公牛血清(Globepharm Ltd，英國)。pH值調(diào)節(jié)到7.3，滲透摩爾濃度調(diào)節(jié)為390-310mOsm。SOF由Tervit等人(1972)的最初制劑衍生，不含HEPES緩沖液，包含25.0mM的碳酸氫鈉、9.9mM乳酸鈉、0.99mM丙酮酸鈉、1.5mM葡萄糖、1.0mM L-谷氨酰胺、50i.u./ml青霉素和50μg/ml硫酸鏈霉素。SOF培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為7.4，滲透摩爾濃度調(diào)節(jié)為270-280mOsm或290-310mOsm。
從喂飼分別包含120g和190g粗蛋白/kg干物質(zhì)的食物的公牛中獲得血清A和B。用這些血清(4∶1v/v)添加到SOF和Cocult中，形成四種胚胎培育處理(SOFA、SOFB、CocultA和CocultB)。用于協(xié)同培養(yǎng)的每個60mm直徑組織培養(yǎng)皿(Bibby Sterilin)含有50μl小滴(n=8)的M199，血清上覆蓋礦物油(目錄號M8410,Sigma，英國)。在引入合子時(第1天)，在這些小滴中建立4日齡牛的顆粒細(xì)胞層。在引入合子之前更新培養(yǎng)基(50％置換，以體積計)，之后在38.5℃下在濕潤環(huán)境(5％CO2，95％空氣)中進(jìn)行5天的培養(yǎng)期中以48小時更新培養(yǎng)基(按體積50％置換)。在合子收集當(dāng)天，每個60mm培養(yǎng)皿用8小滴，制備添加有血清的SOF小滴(20μl，在油下)。在38.5℃低氧環(huán)境中(5％CO2,5％O2,95％N2)每滴至多可培養(yǎng)4個合子。之后以48小時的間隔，在更新每滴的培養(yǎng)基后，在相同條件下將合子移到新鮮制備的20μl液滴中。
胚胎培養(yǎng)5天后，通過腹腔鏡檢術(shù)將發(fā)育至桑椹期或胚泡期的胚胎分別移植到發(fā)情同步的母羊子宮內(nèi)。該移植技術(shù)包括子宮角尖端通過腹腔鏡指導(dǎo)的挑取通過腹壁的腹部小切口的短暫暴露。在妊娠125日時通過施用25ml 20％w/v戊巴比妥鈉(Euthatal,Rhone Merieux Ltd，英國)使懷孕母羊安樂死。然后取出妊娠子宮稱重。取出胚胎稱重，切下肝、心臟、腎及個別肌肉并稱重。
該研究中所有母羊均用2.5％尿素處理的干草飼養(yǎng)。各步驟均嚴(yán)格按Home Office規(guī)定進(jìn)行。胚胎重量以ANOVA分析。然后用t檢驗評估平均值與異速生長系數(shù)之間的差異。結(jié)果在妊娠125天時，所有胚胎培養(yǎng)處理的胚胎重量均大于對照組(P＜0.01；平均值±s.e.,CONT 3907±68,SOFA 4594±248,SOFB4856±309,CocultA 4495±291,CocultB 5302±422),并且比最重對照組胚胎更重的胚胎的百分?jǐn)?shù)分別為46％、54％、36％和54％。羊水過多(即胎液重量超過對照組孕體平均值3個標(biāo)準(zhǔn)差)在54％的體外培養(yǎng)胚胎妊娠中明顯，15％顯示嚴(yán)重的胎羊水腫(Hydrops fetalis)。培養(yǎng)處理的三種胚胎兩倍于對照組的平均體重，表明極度的過度生長。此外，在妊娠125日時，由培養(yǎng)的胚產(chǎn)生的胎羊中有13％重于三周后147天時對照胎羊的預(yù)測出生體重。培養(yǎng)處理產(chǎn)生的許多巨胎的外形在整體形態(tài)及皮毛生長范圍方面均類似于足月胎。這表明LOS使發(fā)育大大進(jìn)步。
也發(fā)現(xiàn)過大的胎羊中主要器官的發(fā)育基本上也受到影響。對于全部處理組，用下列線性異速生長方程式將器官重量與胎體重量相關(guān)聯(lián)，來估計第125日的發(fā)育logey=logea+blogex其中y=器官重量，x=胎體重。
圖1所示為對照(CONT)組確定的異速生長系數(shù)(b±s.e.m.)類似于在較早研究中(Sinclair等人，動物生殖學(xué)45 223(1996))由妊娠35-135天時取出的121個相同基因型的正常胎所得到的數(shù)值(心臟b=0.92±0.01，肝b=0.86±0.01，腎b=0.99±0.01)。將體外培養(yǎng)的胚(培養(yǎng)圖1)所產(chǎn)生的胎的相應(yīng)系數(shù)與以前的研究結(jié)果相比較，因為其中觀測到的較大胎重量范圍可更精確地估計異速生長系數(shù)。對于體外培養(yǎng)的胚產(chǎn)生的胎肝(圖1(a),P＜0.05)和心臟(圖1(b),P＜0.0001)，生長系數(shù)明顯較高，表明這些器官的生長速度高于由妊娠125日的正常胚胎或由同等重量的正常發(fā)育的較老胚胎所預(yù)計的。培養(yǎng)胚胎的腎臟重量高度可變(圖1(c))。有幾個腎臟明顯增大，這通常與羊水過多(即胎液重量超過CONT妊娠平均值3個標(biāo)準(zhǔn)差；圖1(c))及嚴(yán)重的胚胎水腫(Hydropsfetalis；數(shù)據(jù)未顯示)有關(guān)。重要器官發(fā)育的這些改變可導(dǎo)致與巨大后代綜合征有關(guān)的出生前及圍生期死亡。實施例1Igf2r基因表達(dá)的分析在單管實驗中定量相對于18S核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄水平。18s引物引導(dǎo)的擴(kuò)增由于可阻斷Taq DNA聚合酶延伸的18S PCR CompetimerTM(Ambion)的競爭而減弱。用RNA IsolatorTM(Genosys)從組織中提取總RNA,2.5μg用pd(N)6隨機(jī)六聚體引物和第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia Biotech)反轉(zhuǎn)錄。在25μl PCR反應(yīng)中，125ng cDNA模板與0.5μM基因特異引物、0.5μM選擇18S引物和18S PCRCompetimerTM(Ambion)、含2.5mM MgCl2的10×緩沖液，1mM dNTPs(InVitrogen)及0.635單位的Taq DNA聚合酶(Boehringer)混合。Igf2外顯子特異性轉(zhuǎn)錄物的引物(Ohlsen等人，DNA細(xì)胞生物學(xué)13(4)377-388(1994)),IGFBP2、IGFBP3(Winger等人，生殖生物學(xué)56 1415-1423(1997))和IGFBP4(Armstrong等人，內(nèi)分泌學(xué)139(4)2146-2154(1998))如前所述，而Igf2r引物由Genbank牛序列J03527(5’-核苷酸530-551,3’-核苷酸769-750；Lobel等人，生物化學(xué)雜志263(5)2563-2570(1998))設(shè)計。為確保該實驗處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)，18S PCR CompetimerTM:18S引物之比對于每一組織和基因特異引物對不同。所有Igf2引物皆跨越內(nèi)含子，以提供污染DNA的對照，而在每一PCR反應(yīng)中也包括不合cDNA的試管。
在所用方案中，cDNA于95℃變性5分鐘，然后PCR(94℃1分鐘，60-65℃ 30s,72℃ 1分鐘)，共進(jìn)行在溴化乙錠染色的1.7％瓊脂糖凝膠上檢測轉(zhuǎn)錄物所需的最低循環(huán)數(shù)(一般為25-27次循環(huán))。用分子成像儀圖像分析系統(tǒng)用Molecular AnalystTM軟件(Bio-Rad)定量條帶密度。結(jié)果表示為轉(zhuǎn)錄物18s之比，并用兩樣本t檢驗(Minitab)確定其統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)測序(序列2.0版，Amersham)證實PCR產(chǎn)物的鑒定。結(jié)果在所有處理組中將超過5.5Kg的胚胎確定為巨大后代(LO)，進(jìn)行基因表達(dá)分析。利用相對RT-PCR(圖2(a))比較CONT與LO后代胚胎的肝、腎和心臟中Igf2及Igf2r的表達(dá)水平，也用前臂橈側(cè)腕伸肌的組織分析骨骼肌中的基因表達(dá)。Igf2以組織特異及發(fā)育階段特異的方式表達(dá)為一系列選擇剪接的、外顯子特異的轉(zhuǎn)錄物(Ohlsen等人，DNA細(xì)胞生物學(xué)13(4)377-388(1994))。用針對每個非編碼外顯子的5’引物和來源于第一編碼外顯子-外顯子8的3’引物檢測所有可能的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。未檢測到在125日綿羊胎中正常表達(dá)的任何外顯子特異轉(zhuǎn)錄物(前導(dǎo)外顯子5、6、7的轉(zhuǎn)錄物)的水平有任何數(shù)量改變，如表1所示。此外，也未觀察到有任何數(shù)量改變表明在妊娠125日檢測的組織中非正常轉(zhuǎn)錄的外顯子特異性轉(zhuǎn)錄物形式的活化(即外顯子1和3-產(chǎn)后轉(zhuǎn)錄物和外顯子4-胎盤轉(zhuǎn)錄物；數(shù)據(jù)未顯示)。因此綿羊巨大后代綜合征的機(jī)理似乎與人類貝-維綜合征中由Igf2過量表達(dá)誘發(fā)的典型胎兒過度生長不同。相反，Igf2r基因的表達(dá)在肝臟和肌肉中明顯降低約50％，在腎和心臟中降低約30％(表1)。
表1顯示125日胎組織的基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。數(shù)值為表示為轉(zhuǎn)錄物18S之比的主觀吸光度單位。所有數(shù)值均為至少21個CONT和10個LO胎的平均值±se。星號*、**、***表示在CONT和LO值之間有顯著性差異的值(斯氏t檢驗，分別P＜0.05、0.01、0.001)?？s寫B(tài)Q表示基因轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增低于本實驗的檢測極限(18S擴(kuò)增不能被競爭劑充分調(diào)控，以確保轉(zhuǎn)錄物與18S的線性擴(kuò)增)。實施例2:Western印跡分析為研究Igf2r基因表達(dá)的降低是否導(dǎo)致IGFⅡr蛋白水平的降低，用125I-IGFⅡ探查組織蛋白提取物和血漿樣品的Western配體印跡。使用125I-IGFⅡ的Western配體印跡法如先前所述進(jìn)行(Armstrong等人，內(nèi)分泌雜志120 373-378(1989))，其中的改變是用于轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的陰極緩沖液含有0.5mg/ml BSA(Bhavsar等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)221 234-242(1994))。如前所述鑒定IGFBP(Delhanty,P.J.D.和Van,V.K.M.，內(nèi)分泌學(xué)132(1)41-52(1993))。使用過氧化物酶檢測體系(Vector Labs，英國)用抗牛IGFⅡ受體抗體進(jìn)行免疫印跡。IGFⅡr抗體及純化的IGFⅡr由Dr PLobel提供，高等生物技術(shù)及醫(yī)藥中心(Centrefor Advanced Biotechnology and Medicine),Piscataway,NJ，美國。
以前的研究推測，配體印跡上顯現(xiàn)的約250kDa的蛋白質(zhì)為IGFⅡr(Butler,J.H.和Gluckman,P.D.，內(nèi)分泌雜志109 333-338(1986)；Delhanty,P.J.D.和Han,V.K.M.，內(nèi)分泌145 545-557(1993))，而且用抗牛IGFⅡr抗體經(jīng)Western印跡證實了這一點(圖2(b))。分別觀察到肌肉和肝IGFⅡr蛋白水平降低61％和81％(P＜0.001，表2)，而循環(huán)形式的降低67％(P＜0.001，表2)。鑒于Igf2r表達(dá)的降低和Igf2r表達(dá)破壞的小鼠中引起的過度生長表型，這些發(fā)現(xiàn)提供了表明IGF2R在綿羊LOS中的直接原因作用的有力證據(jù)。循環(huán)及組織IGFⅡr水平的明顯降低可解釋廣泛的器官效應(yīng)及普遍的過度生長。
表2顯示125日胎血漿和組織中IGFⅡ受體蛋白IGFBP2和IGFBP3的水平。所有數(shù)值均為由至少21個對照和10個LO胎獲得的平均值±s.e.×1000。數(shù)值為IGFⅡ Western配體印跡產(chǎn)生的信號強(qiáng)度的磷成像儀吸收單位。星號(*、**、***)表示在CONT與LO值之間存在顯著性差異的數(shù)值(斯氏t檢驗，分別P＜0.05、0.01、0.001)。實施例3血漿IGFⅡ水平的測定IGFⅡr影響胎兒生長的機(jī)理仍未完全清楚。IGFⅡr的功能之一是將IGFⅡ?qū)蛉苊阁w降解。因而根據(jù)對小鼠的研究，已廣泛假定IGFⅡr的減少可削弱IGFⅡ從循環(huán)中的清除。引起的強(qiáng)胚胎有絲分裂原水平的提高提供了一種通過細(xì)胞增殖和凋亡抑制促進(jìn)胚胎生長的機(jī)理。在用抗人多克隆IGFⅡ抗血清以及人重組IGFⅡ作為標(biāo)準(zhǔn)(GroPep Pty Ltd)進(jìn)行酸性HPLC(Gutierrez等人，內(nèi)分泌學(xué)雜志153 231-240(1997))后測定血漿IGFⅡ。本實驗的檢測極限約為30pg/管。結(jié)果然而，在本研究中令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在CONT和LO綿羊胎之間IGFⅡ血漿水平無顯著差異(6.08±0.57和4.63±0.67ug/ml；p=0.1)。該結(jié)果可能是由于應(yīng)答被抑制的IGFⅡr的物種間特異性差異，因為據(jù)報道處于相同妊娠期(E18.5)的Igf2r無效突變小鼠的血清IGFⅡ水平比野生型高4倍(Ludwig等人，生物學(xué)進(jìn)展177 517-535(1996))。然而，能通過無效去除在突變小鼠中增多的循環(huán)IGF結(jié)合蛋白引入這種差異。另外，本實驗及其他小鼠研究中報道的血清IGFⅡ差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性(Eggenschwiler等人，基因與發(fā)育11 3128-3142(1997)；Lau等人，基因與發(fā)育8 2953-2963(1994))。而在H19無效突變小鼠中，其中增強(qiáng)的Igf2表達(dá)引起胎兒過度生長，盡管組織水平提高，但血清IGFⅡ未增加(Eggenschwiler等人，基因與發(fā)育11 3128-3142(1997))。討論IGFⅡ水平的絕對改變對于該生長因子生物學(xué)活性的改變不是必要的。胰島素樣生長因子的作用是復(fù)雜的，其由一系列結(jié)合蛋白(IGFBP)和蛋白酶介導(dǎo)(Jones,J.I.和Clemmons,D.R.內(nèi)分泌學(xué)綜述16 3-34(1995))。本研究中的Western配體印跡顯示，在LO胎中與IGFⅡ最強(qiáng)結(jié)合的IGFBP2的循環(huán)水平(Delhanty,P.J.D.和Han,V.K.M.內(nèi)分泌學(xué)132(1)41-52(1993))提高102％(表2)，而伴隨有肝基因表達(dá)的86％的提高(表1)。已提出IGFBP2可延長循環(huán)中IGFⅡ的半衰期，在血液與組織液間運送IGFⅡ，以改變局部濃度及與受體的接近。因此LO胎中增加的IGFBP2可在不改變配體濃度的情況下提高IGFⅡ的生物學(xué)活性。以前報道在特大E18/19胎鼠血漿中提高的IGFBP3血漿水平在巨大羊胎中未有改變，除在腎臟中轉(zhuǎn)錄水平降低23％外，在檢測的所有組織中表達(dá)水平均保持不變。在所有檢測的組織中未檢測到IGFBP4表達(dá)的差異。
巨胎中Igf2r表達(dá)的降低也可能通過不依賴于IGFⅡ的機(jī)制加速了胚胎生長。除對IGFⅡ清除的作用外，IGFⅡr還是TGFB1激活所必需的，TGFB1發(fā)揮強(qiáng)烈的生長抑制作用(Wang等人，癌癥研究(Cancer Res.)57 2543-2546(1997))，并可解釋在LOS中觀察到的部分或全部過度生長。IGFⅡr也具有甘露糖6-磷酸結(jié)合域，并可向溶酶體輸送大約50個6-磷酸甘露糖標(biāo)記的溶酶體酶(Sklar等人，生物化學(xué)雜志264 16733-16738(1989))。報道在Igf2r無效突變小鼠中幾種溶酶體酶水平降低(Wang等人，自然372 464-467(1994))，這可能是胚胎發(fā)育中組織重建的結(jié)果(Sklar等人，(1989))。因此，因LOS中IGFⅡr減少引起的溶酶體酶功能的破壞可用來解釋觀察到的某些器官缺陷，也可解釋總體過度生長。最后，當(dāng)然，多功能IGFⅡ/甘露糖6磷酸受體作用的結(jié)合也可導(dǎo)致綿羊LOS中觀察到的復(fù)雜表型。
本研究建立了綿羊巨大后代綜合征的一種模型，該模型也可適用于牛的類似綜合征(Kruip,T.A.M.和den Daas,J.H.G.，動物生殖學(xué)47 43-52(1996))的研究。本研究中胚胎培養(yǎng)處理引起的巨大后代的高發(fā)生率產(chǎn)生綜合表型描述，和對與干擾機(jī)制有關(guān)的基因的第一次報道。對下調(diào)的Igf2r表達(dá)的鑒定使該印記基因成為引發(fā)該綜合征的有力侯選基因，而該綜合征的發(fā)生是由于因培養(yǎng)條件誘導(dǎo)的植入前胚胎的外遺傳改變，這一點目前尚在研究中。對該機(jī)理的進(jìn)一步理解將導(dǎo)致可避免該問題的胚胎操作方案的發(fā)展。這對于家畜克隆技術(shù)及體外胚胎產(chǎn)生的發(fā)展非常重要。此外，由于仍不知在非反芻動物胚胎操作之后為何未有類似干擾，所以巨大后代綜合征對于新的人類輔助生殖方法也是有意義的。
表1第125日胎組織的基因轉(zhuǎn)錄水平
表2第125日胎組織中的IGFⅡR及IGF結(jié)合蛋白
權(quán)利要求
1．一種篩查動物胚胎巨大后代綜合征(LOS)的方法，其包括分析動物胚胎中或來源于胚胎的生物樣品中胰島素樣生長因子-2受體(Igf2r)基因表達(dá)的步驟。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中動物是哺乳動物。
3．如權(quán)利要求2所述的方法，其中哺乳動物是人。
4．如權(quán)利要求2所述的方法，其中哺乳動物是有蹄動物種。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其中有蹄動物種是牛、綿羊、豬、山羊、馬、駱駝或水牛。
6．如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中有蹄哺乳動物是一種轉(zhuǎn)基因動物。
7．如權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中生物樣品包括組織活檢、細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)或生物液體。
8．一種體外產(chǎn)生動物胚胎的方法，其包括下列步驟向體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的卵母細(xì)胞導(dǎo)入精細(xì)胞，隨后培養(yǎng)得到的胚胎，并通過分析動物胚胎中或來源于該胚胎的生物樣品中的Igf2r基因的表達(dá)，篩查該胚胎的巨大后代綜合征(LOS)。
9．如權(quán)利要求8所述的方法，其中該方法包括在受精前使卵母細(xì)胞體外成熟的另外步驟。
10．一種重建動物胚胎的方法，其包括下列步驟向適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中移植供體細(xì)胞核，并通過分析動物胚胎中或來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，篩查得到的胚胎的巨大后代綜合征(LOS)。
11．一種重建動物胚胎的方法，該方法包括向停止于第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞中移植二倍體核而不同時活化該卵母細(xì)胞，使核暴露于受體細(xì)胞質(zhì)中一段時間，使胚胎足以能夠活產(chǎn)，隨后活化重建的胚胎而保持正確的倍性，包括通過分析胚胎或來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，篩查胚胎的巨大后代綜合征(LOS)。
12．一種用如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法制備的重建動物胚胎。
13．一種產(chǎn)生非人類動物的方法，該方法包括(a)體外培養(yǎng)一種動物胚胎，其中該胚胎是通過體外產(chǎn)生或通過重建如權(quán)利要求8-11任一項所述的動物胚胎而制備的；(b)通過分析該胚胎或來源于該胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)，篩查該胚胎的巨大后代綜合征(LOS)；(c)使該動物由胚胎發(fā)育至足月；和(d)任選地由這樣產(chǎn)生的動物繁殖。
14．一種如權(quán)利要求13所述制備的非人類動物。
15．一種篩查動物細(xì)胞巨大后代綜合征的方法，其包括分析動物細(xì)胞中Igf2r基因表達(dá)的步驟。
16．一種檢測在動物胚胎中誘發(fā)巨大后代綜合征的胚胎培養(yǎng)環(huán)境的方法，其包括分析胚胎或來源于胚胎的生物樣品中的Igf2r基因表達(dá)的步驟。
17．一種治療方法，包括對患者施用動物細(xì)胞，其中由用權(quán)利要求1-7任一項所述的方法篩查的胚胎制備該細(xì)胞。
18．編碼胰島素樣生長因子-2受體(IGF2R)的核酸序列或其片段或與之互補(bǔ)或同源的序列在制備用于診斷動物胚胎或胚胎樣品中巨大后代綜合征(LOS)的試劑中的應(yīng)用。
19．用如權(quán)利要求1-7任一項所述的方法篩查的胚胎衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
20．用如權(quán)利要求1-7任一項所述的方法篩查的胚胎衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系在制備用來移植的細(xì)胞移植物中的應(yīng)用。
21．一種診斷動物胚胎或來自胚胎的樣品中巨大后代綜合征(LOS)的試劑盒，其包含檢測Igf2r基因表達(dá)的工具。
全文摘要
提供了一種用于診斷經(jīng)核移植制備的動物或經(jīng)體外受精或培養(yǎng)方法制備的動物中巨大后代綜合征(LOS)的方法,其包括分析動物胚胎或來源于胚胎的生物樣品中的胰島素樣生長因子－2受體(Igf2r)基因表達(dá)。
文檔編號G01N33/50GK1324400SQ9981255
公開日2001年11月28日 申請日期1999年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月25日
發(fā)明者T·G·莫西沃伊, K·D·辛克萊爾, L·E·楊, I·維爾穆特 申請人:羅斯林學(xué)院(愛丁堡)