專利名稱：檢索和確定表達(dá)信使RNAs的相對(duì)濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不同表達(dá)的mRNAs的同步鑒定的方法和它們相對(duì)濃度的測(cè)量方法。
組成有機(jī)體的蛋白質(zhì)分子的完整的特性，對(duì)于例如改進(jìn)藥物設(shè)計(jì)、個(gè)體患者優(yōu)化治療的選擇、及更多合適的生物物質(zhì)的研究開發(fā)是有用的。表達(dá)蛋白的這樣的一個(gè)特性將包括它們的識(shí)別、順序確定、它們表達(dá)的解剖學(xué)位點(diǎn)的證明，它們生物活性的闡明以及對(duì)這些活性如何決定有機(jī)體生理的理解。對(duì)于醫(yī)藥的應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)包括每種蛋白質(zhì)濃度的改變?nèi)绾螌?duì)藥用或毒性的藥劑做出反應(yīng)的信息。
需要我們考慮的關(guān)于這個(gè)問題的范圍包括共有多少基因？在哺乳動(dòng)物中有多少基因被表達(dá)的問題，在研究至少20年后仍沒有解決。很少有致力于在不同組織中基因表達(dá)模式的直接研究。突變負(fù)荷研究(J.O.Bishop，“基因數(shù)量策略”，細(xì)胞281-86(1974)；T.Ohta.&.M.Kimura，“作為分子進(jìn)化的一個(gè)產(chǎn)物的基因物質(zhì)的功能組織，”自然，223118-119(1971))已表明有3×104至105之間的必需基因。
在cDNA克隆技術(shù)以前，基因表達(dá)的信息來源于RNA復(fù)雜性的研究其基于對(duì)豐富的具有不同特異性的RNA分子的混合庫的觀察基礎(chǔ)上的相似性測(cè)量(成批測(cè)量)。對(duì)于意料外的范圍，早期相似復(fù)雜性研究被事實(shí)上隱藏的復(fù)雜性所歪曲，這個(gè)事實(shí)就是在每個(gè)組織中組成它們mRNA質(zhì)量的大多數(shù)的分子僅占其總復(fù)雜度的一小部分。后來，cDNA克隆允許數(shù)字測(cè)量的應(yīng)用(例如，基于個(gè)體物種的特異的序列測(cè)量)；因此，更現(xiàn)代的關(guān)于mRNA表達(dá)的概念是基于對(duì)個(gè)體的RNA物種的實(shí)際觀察的基礎(chǔ)上的。
大腦、肝、腎通過相似RNA復(fù)雜性測(cè)量曾被極其廣泛研究的哺乳動(dòng)物的組織。復(fù)雜性的最低估測(cè)是Hastie and Bishop(N.D.Hastie&J.B.Bishop，“三類豐富信使RNA在鼠的組織中的表達(dá)，”細(xì)胞9761-774(1976))，他們指出3×109堿基對(duì)嚙齒目的基因組中有26×106核苷酸在大腦中被表達(dá)，23×106在肝中被表達(dá)，22×106在腎中被表達(dá)，同時(shí)在RNA sets中幾乎完全重疊。這表明了有一個(gè)非常小數(shù)量的組織特異性的mRNAs。然而，實(shí)驗(yàn)表明這些數(shù)目很顯然被低估了，因?yàn)槟切┯锌赡茉谶@個(gè)早期研究的檢測(cè)限下豐富的許多mRNA分子已被證明在大腦中表達(dá)，但在肝及腎中不能被檢測(cè)。許多其它的研究人員(J.A.Bantle和W.E.Hahn，“在鼠的大腦中多聚腺苷酸RNA的復(fù)雜性和特性”細(xì)胞.8139-150(1976)；D.M.Chikaraishi，“細(xì)胞質(zhì)多聚腺苷酸和無腺苷酸鼠腦中核糖核酸的復(fù)雜性”生物化學(xué)183249-3256(1979))已測(cè)量了在大腦中100-200×106的核苷酸的相似復(fù)雜性，其比在肝和腎估測(cè)的數(shù)值低2-3倍。對(duì)于大腦的mRNAs，50-65％在肝和腎中是不可檢測(cè)到的。這些數(shù)值得到數(shù)字克隆研究的支持(R.J.Milner和J.G.Sutsliffe，“在鼠腦中基因的表達(dá)”核酸研究，115497-5520(1983))。
大量mRNA的相似性測(cè)量表明平均mRNA長(zhǎng)度在1400-1900核苷酸之間。在通過諾慎印跡雜交(Milner和Sutcliffe，supra)用200個(gè)隨機(jī)選擇的腦cDNAs測(cè)量RNA長(zhǎng)度的一個(gè)系統(tǒng)數(shù)字分析中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)mRNA長(zhǎng)度數(shù)據(jù)以RNA的優(yōu)勢(shì)衡量時(shí)，平均長(zhǎng)度是1790個(gè)核苷酸，這同相似測(cè)量所確定的數(shù)值是一樣的。然而，組成大腦mRNA復(fù)雜度的大多數(shù)mRNAs有一個(gè)5000個(gè)核苷酸的平均長(zhǎng)度。不僅大腦RNAs越長(zhǎng)越稀少，而且它也傾向大腦特異性，同時(shí)越有優(yōu)勢(shì)的大腦mRNAs越普遍表達(dá)且在平均長(zhǎng)度上越短。
這些關(guān)于mRNA長(zhǎng)度的概念已被最近的來源于序列已被確定的大腦mRNA的長(zhǎng)度而進(jìn)一步確認(rèn)(J.G Sutcliffe，“在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的mRNA”神經(jīng)科學(xué)的年度回顧11157-198(1988))。因此，1-2×108核苷酸復(fù)雜度及5000個(gè)核苷酸平均mRNA長(zhǎng)度和估計(jì)的在大腦中表達(dá)的30,000mRNAs是相適應(yīng)的，這些在大腦中表達(dá)的mRNA約2/3在肝和腎中檢測(cè)不到。很明顯大腦占據(jù)了哺乳動(dòng)物組織特異性基因一個(gè)相當(dāng)大的部分。大多數(shù)大腦mRNAs是以低濃度表達(dá)的。沒有總的哺乳動(dòng)物mRNA復(fù)雜性的測(cè)量，是否5000個(gè)核苷酸對(duì)于非神經(jīng)組織是一個(gè)合適的mRNA長(zhǎng)度的估測(cè)也是不知道的。對(duì)于總的基因數(shù)量的合理的估測(cè)值可能在50,000到100,000之間。
通過生理學(xué)功能上的一個(gè)化學(xué)理解，最需要去推進(jìn)發(fā)展的是通過基因組加上的在各種細(xì)胞類型中每個(gè)基因組被表達(dá)的細(xì)胞類型所編碼的一系列蛋白質(zhì)序列。因?yàn)樵诨蚪M序列中有干擾序列存在(內(nèi)含子)，所以目前僅從cDNA而不從基因就很容易推測(cè)蛋白質(zhì)序列。即使一個(gè)哺乳動(dòng)物基因組完整的核苷酸序列也不能代表它的表達(dá)序列的特征。因此，需要一個(gè)收集轉(zhuǎn)錄序列及證明它們表達(dá)位點(diǎn)的系統(tǒng)的策略方法。這樣的策略方法在確定大腦中序列差異表達(dá)中是特別有用的。這樣的研究取得結(jié)果是一個(gè)必然的最終的目的，也就是，去識(shí)別確認(rèn)所有的mRNAs。因?yàn)楦鞣NmRNAs和大量的被許多獨(dú)特組織表達(dá)的獨(dú)特的mRNA具有不同的優(yōu)勢(shì)，所以去得到這樣的結(jié)果可能是困難的。為獲得這樣的結(jié)果所作的努力使得人們?nèi)〉昧艘粋€(gè)進(jìn)步的更可靠的基因空間三維的描述。
在Craig Venter實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的研究(M.D，Adams等，“互補(bǔ)DNA測(cè)序表達(dá)序列標(biāo)簽和人類基因組計(jì)劃，”科學(xué)2521651-1656(1991))；M.D.Adamse等?！?,375人類大腦基因的序列鑒定”自然355632-634(1992))已引起了人的大腦mRNAs的隨機(jī)選擇的cDNA克隆的分離、它們的3’-末端的短的大約為300個(gè)堿基對(duì)的單通道(single-pass)序列的確定、以及這些中2500個(gè)匯輯做為一個(gè)“表達(dá)序列的標(biāo)簽(EST)”數(shù)據(jù)庫。這些數(shù)據(jù)庫盡管是有用的，卻不能提供差異表達(dá)的任何信息。因此，基于在大腦區(qū)域和其它組織中它們的全面表達(dá)模式，及基于對(duì)例如各種生理學(xué)上或病理學(xué)上的狀態(tài)或藥物治療的影響的各種示例作出反應(yīng)，去識(shí)別這些基因是重要的，而不是在一個(gè)單一組織中它們的表達(dá)，其它的工作主要集中在利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)建立一個(gè)數(shù)據(jù)庫。Williams等(J.G.K.William等，“通過隨機(jī)引物DNA多態(tài)性擴(kuò)增做為遺傳標(biāo)記是有用的”核酸研究.186531-6535(1990)和Welsh&McClelland(J.Welsh和McCelland，“用隨機(jī)引物PCR和引物的一個(gè)Matrix of Pairwise聯(lián)合的基因組印跡法”核酸研究.187213-7218(1990))表明隨機(jī)選擇序列單一的10-聚體(mer)的引物，例如任何10-mer的shelf引物，當(dāng)用在與如人、植物、酵母或細(xì)菌基因組DNA的復(fù)雜DNA模板進(jìn)行PCR時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)PCR產(chǎn)物的排列。這樣引物事實(shí)被證明涉及到在引物和模板DNA之間不完全互補(bǔ)?？梢约僭O(shè)，部分錯(cuò)配引物結(jié)合位點(diǎn)，在基因組中是隨機(jī)分布的。偶爾，這兩個(gè)位點(diǎn)是在相反的方向，彼此距離足夠近，以至于能夠產(chǎn)生PCR產(chǎn)物帶。平均共有8-10個(gè)產(chǎn)物，其大小在約O.4-4kb之間變化，而且對(duì)每個(gè)引物有一個(gè)不同的變動(dòng)性。PCR產(chǎn)物排列在同一物種的個(gè)體中顯示了差異。這些作者提出將單一任意引物能夠產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFCP)樣的信息用于基因組研究。其它人也應(yīng)用了此技術(shù)(S.R.Woodward等，“隨機(jī)序列寡聚核苷酸引物檢測(cè)在近親繁殖的鼠系中隔離的多態(tài)性DNA產(chǎn)物”，哺乳動(dòng)物遺傳373-78(1992)；J.H.Nadeau等，“對(duì)鼠基因組分析的多位點(diǎn)標(biāo)記基于任意核苷酸序列的單引物基礎(chǔ)上的PCR擴(kuò)增”，哺乳動(dòng)物遺傳355-64(1992))。
兩個(gè)研究組(J.Welsh等，“RNA的任意引物的PCR印跡”，核酸研究，204965-4970(1992)；P.Liang和A.B.Pardee，“通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法差異顯示真核生物的信使RNA”，科學(xué)257967-971(1992))修改了那種方法以比較mRNA庫。在Liang和Pardee的研究中，這種方法被稱作mRNA差異顯示，其被用于通過兩個(gè)相關(guān)的細(xì)胞類型，正常的和癌基因鼠A31細(xì)胞，以比較表達(dá)的mRNAs庫。對(duì)于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)，他們用一個(gè)任意10-mer作為5’一引物和一個(gè)與一亞套poly A(多聚A)的尾巴互補(bǔ)的寡聚核苷酸作為3’-錨定引物，在從兩個(gè)細(xì)胞類型制備的cDNA上，及35S-dNTPs存在的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物在測(cè)序凝膠上被分析，范圍在100-500個(gè)核苷酸的50-100個(gè)條帶被觀察到。這些條帶推測(cè)來源于cDNAs擴(kuò)增，它們和含有3’一錨定引物互補(bǔ)的mRNAs的3’-末端和一個(gè)部分錯(cuò)配5’-引物位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，這如同在基因組DNA模板中被觀察到的一樣。對(duì)于每個(gè)引物對(duì)，從兩個(gè)cDNAs擴(kuò)增的條帶的模式是相似的，條帶中有大約80％的分布密度是不可區(qū)分的。在一個(gè)或其它的PCR樣品的模板上，有一些條帶是更密集的；兩個(gè)樣品僅有一個(gè)中，有很少的幾條條帶是可檢測(cè)的。
進(jìn)一步的研究(P.Liang等，“通過差異顯示方法真核mRNAs的分布和克隆提純和優(yōu)化，”核酸研究.213269-3275(1993))已證明程序?qū)Φ蜐舛容斎隦NA的起作用(盡管對(duì)比較希有物種它不是定量的)，而且特異性的殘基主要存在于3’一錨定引物的最后的核苷酸中，至少被確認(rèn)識(shí)別的差異檢測(cè)PCR產(chǎn)物中的1/3和差異表達(dá)RNAs相對(duì)應(yīng)，同時(shí)有至少25％的假陽性率。
如果所有的哺乳動(dòng)物的50,000-100,000mRNAs都適用于這種任意引物PCR的方法，那么需要大約80-95個(gè)5’任意引物和12個(gè)3’錨定引物在大約1000 PCR小組和凝膠中以得出一個(gè)可能性，通過泊松分布計(jì)算，這些mRNAs中有大約2/3將被鑒定。
因?yàn)橄旅娴脑颍械膍RNAs都適合采用這種方法進(jìn)行檢測(cè)是不可能的。在這樣的一個(gè)檢測(cè)中要求一個(gè)mRNA呈現(xiàn)在表面，它必須有足夠的優(yōu)勢(shì)在放射自顯影上產(chǎn)生信號(hào)，而且包含有一個(gè)在它的3’-末端作為一個(gè)錯(cuò)配引物結(jié)合和引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)起作用的500個(gè)核苷酸的序列。一個(gè)單獨(dú)的mRNAs越占有優(yōu)勢(shì)，它越有可能產(chǎn)生一個(gè)產(chǎn)物。因此，用大量不同任意引物優(yōu)勢(shì)物種可能產(chǎn)生帶。因?yàn)榛谌我庖镞x擇的基礎(chǔ)上后者的屬性含有一個(gè)不可預(yù)測(cè)的機(jī)會(huì)要素，通過任意引物方法取得結(jié)果可能是困難的。而且，因?yàn)樾畔⒖梢詮囊粋€(gè)實(shí)驗(yàn)室傳到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，可靠的錯(cuò)配引物在不同的實(shí)驗(yàn)條件和用不同的PCR儀的條件下必須要有高度可重復(fù)性，同時(shí)在反應(yīng)條件下，結(jié)果有稍微的變動(dòng)。作為錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)是很少被理解的，這是通過Liang&Pardee差異顯示方法獲得數(shù)據(jù)建立一個(gè)數(shù)據(jù)庫的弊端。
美國(guó)專利號(hào)5,459,037(’037)和5,807,680(’680)描述了一個(gè)改進(jìn)的mRNA物種差異顯示的方法，這個(gè)方法減少了5’-末端產(chǎn)生的不確定方面，而且允許數(shù)據(jù)在不同的組中完全可重復(fù)的。該方法不依靠于潛在的不可重復(fù)的錯(cuò)配引物，減少了進(jìn)行完整檢查所需的PCR組和凝膠的數(shù)量，而且使得雙鏈序列數(shù)據(jù)迅速地被積累。而且，該改進(jìn)的方法也減少了從同一物種mRNA獲得的同時(shí)出現(xiàn)的信號(hào)的數(shù)量?！?37和’680專利在此文中被引作參考而作為公開的一部分。
在’037專利中公開的方法仍存在進(jìn)一步改進(jìn)的需要。例如，通過減少在互補(bǔ)DNA分子合成和PCR反應(yīng)期間的錯(cuò)誤引物設(shè)計(jì)，這個(gè)方法的特異性有可能被提高。而且，該技術(shù)能被進(jìn)一步優(yōu)化，以便于它更具有重復(fù)性、更敏感、更容易應(yīng)用。更優(yōu)越之處在于，該技術(shù)將提供利用從形成數(shù)據(jù)庫獲得的序列、瀏覽例如GenBank的核苷酸數(shù)據(jù)堿基、用例如BLASTN和BLASTX這樣的計(jì)算機(jī)軟件來識(shí)別序列身份及相似性的能力。
我們已開發(fā)研制出一種在一個(gè)mRNA庫中進(jìn)行mRNAs的同步的序列特異的識(shí)別鑒定的改進(jìn)方法。該改進(jìn)的方法在通過1)一個(gè)a＋b長(zhǎng)的部分核苷酸的序列，其中a是在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基的長(zhǎng)度，b是簡(jiǎn)并堿基的數(shù)，在這里6≥b≥3，和2)部分序列距poly(A)尾巴的距離，來確定的身份和地址的基礎(chǔ)上對(duì)mRNAs進(jìn)行分類。具有代表性的身份和地址是被一個(gè)部分序列決定的，該部分序列包含限制性內(nèi)切酶的一個(gè)四堿基識(shí)別位點(diǎn)和四個(gè)簡(jiǎn)并堿基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是MspI，而且部分序列是C-C-G-G-N1-N2-N3-N4。因?yàn)檫@個(gè)方法取決于一個(gè)mRNA的核苷酸序列，而不是它在一個(gè)特定的組織中的優(yōu)勢(shì)，所以這個(gè)方法可以用于解釋所有的在檢測(cè)閾值以上濃度出現(xiàn)的mRNAs。同差異顯示和RAP-PCR方法相比，對(duì)于5’-末端的產(chǎn)生沒有不確定的方面。
根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例(

圖1)，從每個(gè)mRNA樣品中產(chǎn)生的cDNA文庫中含有，在起始的RNA樣品中幾乎所有的poly(A)+mRNAs的從最遠(yuǎn)側(cè)的MspI位點(diǎn)到poly(A)尾巴開始處的3’-最遠(yuǎn)末端的拷貝，其和起始的mRNAs的相對(duì)濃度幾乎是相對(duì)應(yīng)的。因?yàn)槊總€(gè)物種插入序列兩個(gè)末端都是被mRNAs自身的序列所精確的限定的，所以對(duì)于每一個(gè)物種來說，片段的長(zhǎng)度是一致的，這使得它們?cè)谀z上有一個(gè)具體的可見的條帶。不管mRNA的組織來源如何，這些長(zhǎng)度都是不變的，這是這個(gè)方法的一個(gè)重要的基本概念。缺乏MspI識(shí)別序列的信使RNAs沒被描述，它們相對(duì)來說是稀有的。這些mRNAs通過應(yīng)用可以識(shí)別一個(gè)不同四堿基識(shí)別序列的不同限制性內(nèi)切酶的方法而被捕獲。
本發(fā)明的這樣的一個(gè)實(shí)施例的另一個(gè)方面是應(yīng)用和3’-限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)臨近的序列，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一個(gè)MspI位點(diǎn)，在至少兩個(gè)連續(xù)的PCR步驟中對(duì)cDNAs進(jìn)行分類。第一個(gè)PCR步驟是利用一個(gè)引物和來源于例如載體pBC SK+的序列退火，但通過不再生MspI位點(diǎn)的CGG去包括插入序列的第一個(gè)鄰接核苷酸(N1)進(jìn)行延伸。這一步將開始的mRNAs庫分離成為4個(gè)亞庫。在第二個(gè)PCR步驟中，通過第一個(gè)PCR步驟產(chǎn)生的4個(gè)亞庫中的每一個(gè)進(jìn)一步被分成64份，通過用更多的可侵入的插入引物(N1N2N3N4)分成256個(gè)亞亞庫。在最后的PCR步驟中通過用熒光標(biāo)記3’PCR引物，通過激光器誘導(dǎo)熒光，使一個(gè)熒光標(biāo)簽結(jié)合進(jìn)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，例如電泳這樣的分離技術(shù)被用于分析標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分子成為有可測(cè)量強(qiáng)度及和可測(cè)量的長(zhǎng)度相對(duì)應(yīng)的可以區(qū)分的條帶。合適的分離技術(shù)包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳，HPLC、MALDI質(zhì)譜分析和這一領(lǐng)域所共知的其它的合適的分離技術(shù)，這些技術(shù)在50-500堿基范圍內(nèi)具有單個(gè)堿基分辨率的能力是本發(fā)明所包括的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，每一個(gè)最后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物因此被指定一個(gè)身份和地址，這是基于含有四堿基限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和四個(gè)簡(jiǎn)約堿基(例如C-C-G-G-N1-N2-N3-N4)的一個(gè)8-核苷酸序列及在信使末端與在mRNA的3’末端的polyA尾巴的第一個(gè)A之間從結(jié)合處開始那個(gè)序列的距離的基礎(chǔ)上的。當(dāng)實(shí)驗(yàn)確定的，或通過一個(gè)數(shù)據(jù)庫序列確定的PCR產(chǎn)物片段的核苷酸序列是已知時(shí)，這個(gè)片段被參考作為一個(gè)數(shù)字序列標(biāo)簽(DST)也就是說，通過本發(fā)明方法衍生而來一個(gè)3’-末端EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)。用一個(gè)合適的方法檢測(cè)被分離的標(biāo)記PCR產(chǎn)物片段的條帶的強(qiáng)度，優(yōu)選的是激光誘導(dǎo)的熒光(但放射性或磁性標(biāo)記和檢測(cè)可能被用到)被定量，而且用為PCR產(chǎn)物片段指定的地址在一個(gè)數(shù)據(jù)庫中儲(chǔ)存每個(gè)PCR產(chǎn)物片段。被分離的標(biāo)記PCR產(chǎn)物片段的強(qiáng)度和同PCR產(chǎn)物片段相對(duì)應(yīng)的起始的mRNA的量成比例。
總的說來，本發(fā)明的方法包括(a)用一個(gè)混合的錨定引物從一個(gè)mRNA庫中制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，每一個(gè)錨定引物含有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，而且包括(i)7-40 T殘基的一段序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該位點(diǎn)朝向5’末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，第一個(gè)填充片段被定位朝向于被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入用于識(shí)別6個(gè)以上堿基的被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和T殘基序列之間；和(v)從由-V，-V-N，和-V-N-N組成的小組中選擇的每個(gè)錨定引物的相變殘基被定位在3’-末端，其中V是從由A、C和G組成小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，N是從由A，C，G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，該混合物包括含有所有的V和N的可能的錨定引物。
(b)用第一個(gè)限制性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，該第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，形成了一個(gè)分別有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫。
(c)來源于步驟(b)，每個(gè)雙鏈cDNA分子被插入進(jìn)一個(gè)載體，在方向上對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是反意義的，在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義的鏈5’-末端和有意義鏈3’-末端的5’和3’側(cè)翼載體的序列，而且所說的有一個(gè)3’側(cè)翼序列的構(gòu)建至少在所說的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述的啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
(d)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生含有克隆插入的載體。
(e)用至少一種或不能識(shí)別插入的cDNA分子，或不能識(shí)別噬菌體特異的啟動(dòng)子序列，但能識(shí)別載體上序列的限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷，這樣產(chǎn)生的線性片段有一個(gè)至少在載體5’端到雙鏈cDNA分子第二個(gè)末端的15個(gè)核苷酸。
(f)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從噬菌體特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的噬菌體特異的RNA聚合酶，產(chǎn)生了反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備。
(g)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且由和5’側(cè)翼體序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的5’反轉(zhuǎn)錄引物(RT)，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA。
(h)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物。第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’PCR引物是15-30核苷酸長(zhǎng)，它和在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定有-N1組成的3’末端，其中“N”是四種脫氧核糖核苷酸A、C、G或T中一個(gè)，第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼的載體序列互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用在四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)。
(i)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物。在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它與在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”如在步驟(h)中一樣，x是從1到5的整數(shù)，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”+1插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且對(duì)于第一套亞庫中每一個(gè)亞庫在第二系列中有4x個(gè)亞庫。
(j)分析第二套PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一個(gè)生物素部分被共軛接合到錨定引物上，優(yōu)選的是接合到錨定引物的5’-末端。在這樣一個(gè)實(shí)施例中，通過第一個(gè)限定的cDNA和一個(gè)鏈霉抗生物素蛋白包被的底物接觸，第一個(gè)限定cDNA被從步驟(b)中的cDNA的剩余物中分離出來。合適的鏈霉抗生物素蛋白包被的底物包括微量滴定板、PCR管、聚苯乙烯球、順磁聚合物珠和順磁多孔玻璃微粒。一個(gè)優(yōu)用的鏈霉抗生物素蛋白包被的底物是順磁聚合物珠的懸浮液(Dynal，Inc.，Lake Success，NY)。
在一個(gè)實(shí)施例中，第一個(gè)5’PCR引物在3’末端的3個(gè)核苷酸通過抗性磷酸二酯酶鍵合連接，優(yōu)選的是硫代磷酸酯鍵合連接。在另外的一個(gè)實(shí)施例中，第二個(gè)5’PCR引物在3’末端的3個(gè)核苷酸通過抗性磷酸二酯酶鍵合連接，優(yōu)選的是第一個(gè)和第二個(gè)兩個(gè)5’PCR引物的3’末端的3個(gè)核苷酸通過硫代磷酸酯連接。
有代表性地，第二個(gè)PCR反應(yīng)引物中的一個(gè)是被共軛接合上一個(gè)熒光標(biāo)簽。一個(gè)合適的熒光標(biāo)簽是從由下面物質(zhì)組成的小組中選擇的，螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸(xanthen)-3-一，6-羧酸，3’，6’-二羥基-6-羧基熒光素(6-FAM，ABI)；螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，5-羧酸，3’，6’-二羥基-5-羧基熒光素(5-FAM，分子探針)；
螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，3’，6’-二羥基熒光素(FAM，分子探針)；9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-二(二甲氨基)-呫噸鎓(xanthylium)(6-羧基四甲基若丹明(6-TAMRA)，分子探針)；3，6一二氨基-9-(2-羧基苯基)-呫噸鎓(若丹明綠TM，分子探針)；螺旋[異苯并呋喃-1(3H)，9’-呫噸]-6-羧酸，5’-二氯-3’，6’-二羥基-2’，7’-二甲氧基-3-氧代-(JOE，分子探針)；1H，5H，11H，15H-呫噸并(xantheno)[2，3，4-ij5，6，7-i’j’]二喹嗪-8-鎓，-(2，4-二硫苯基)-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫一，內(nèi)鹽(TexasRed，分子探針)；6-((4-4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙?；?氨基)己酸(BODIPY FL-X，分子探針)；6-((4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲基苯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙?；?氨基)己酸(BODIPY TMR-X，分子探針)；6-(((4-(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)-己酸(BODIPY TR-X，分子探針)；4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-戊酸(BODIPY FL-C5，分子探針)；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY FL，分子探針)；4，4-二氟-5-苯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY581/591，分子探針)；4，4-二氟-5(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY 564/570，分子探針)；
4，4-二氟-5-苯乙烯基(styryl)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；6-(((4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧(styryloxy))乙?；?氨基己酸(BODIPY 630/650，分子探針)；6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙?；?氨基己酸(BODIPY 650/665，分子探針)；9-(2，4(或2、5)-二羧基苯基)-3，6-二(二甲氨基)-呫噸鎓，內(nèi)鹽(TAMRA，分子探針)。
其它可適用的熒光標(biāo)記，包括4，7，2’，4’，5’，7’六氯-6-羧基熒光素(“HEX”，ABI)，“NED”(ABI)和4，7，2’，7’四氯-6-羧基熒光素(“TET”，ABI)是這個(gè)領(lǐng)域公知的。
具有代表性的是，在步驟(a)中的相變殘基有一個(gè)-V-N-N的3’末端，在另一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(a)中的相變殘基有一個(gè)-V或-V-N的3’末端。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在步驟(i)中“x”是3，更可取的是，在步驟(a)中的相變殘基是-V-N-N，在步驟(i)中“x”是3。
具有代表性的是，每個(gè)錨定引物在T殘基序列中有8-18個(gè)T殘基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，每個(gè)錨定引物在T殘基序列中有18個(gè)T殘基。在其它的實(shí)施例中，在T殘基序列中，每個(gè)錨定引物有8-18個(gè)T殘基，優(yōu)選8-16個(gè)T殘基，更優(yōu)選8-14個(gè)T殘基，最優(yōu)選8-12個(gè)T殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在T殘基序列中，每個(gè)錨定引物有12個(gè)T殘基。
具有代表性的是，第一個(gè)錨定引物填充片段是14個(gè)殘基長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中，第一個(gè)填充片段具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C(SEQ IDNO1)核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，第一個(gè)填充片段具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A(SEQ ID NO2)核苷酸序列。
具有代表性的是，噬菌體特異的啟動(dòng)子是從由T3啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、和SP6啟動(dòng)子組成的小組中篩選的。優(yōu)選的是，噬菌體特異的啟動(dòng)子是T3啟動(dòng)子。
在一個(gè)實(shí)施例中，從cRNA的cDNA的轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)的引物序列是A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G(SEQ ID NO14)。在另一個(gè)實(shí)施例中，從cRNA的cDNA的轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)的引物序列是A-G-C-T-C-T-G-T-G-G-T-G-A-G-G-A-T-C(SEQ ID NO28)。在又一實(shí)施例中，從cRNA的cDNA的轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)的引物序列是T-C-G-A-C-T-G-T-G-G-T-G-A-G-C-A-T-G(SEQ ID NO35)。
在一個(gè)實(shí)施例中，載體是用ClaI和NotI切割的質(zhì)粒pBC SK+，在步驟(h)和(i)中的3’PCR引物是G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-T(SEQID NO47)。在另一個(gè)實(shí)施例中，載體是用ClaI和NotI切割的質(zhì)粒pBCSK+，在步驟(h)和(i)中的3’PCR引物是G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-C-A-G(SEQ ID NO48)。
具有代表性的是，識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是從由AscI，BaeI，F(xiàn)seI，NotI，PacI，PmeI，PpuMI，RsrII，SapI，SexAI，SfiI，SgfI，SgrAI，SrfI，Sse8387I和SwaI所組成的小組中篩選的。識(shí)別6個(gè)以上堿基的一個(gè)優(yōu)選的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是NotI。
具有代表性的是，識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是從由MboI，DpnII，Sau3AI，Tsp509I，HpaII，BfaI，Csp6I，MseI，HhaI，NlaIII，TaqI，MspI，MaeII和HinP1I所組成的小組中篩選的。識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列的一個(gè)優(yōu)選的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI，Sau3AI和NlaIII。
具有代表性的是，用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶具有一個(gè)含有用在步驟(b)中的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶的4-核苷酸序列的一個(gè)核苷酸序列的識(shí)別。在一個(gè)實(shí)施例中，該第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI，用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是SmalI。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是TaqI，用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是XhoI。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MaeII，用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是AatII。
具有代表性的是，步驟(c)的載體是一個(gè)環(huán)形DNA分子形式，其具有在載體填充序列側(cè)翼的第一和第二載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，而且其進(jìn)一步包括在第一和第二載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用內(nèi)切酶切割載體的消化載體的步驟。優(yōu)選的是，該載體的填充序列包含有在第一和第二載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間的一個(gè)內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
一個(gè)合適的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
具有代表性的是，步驟(e)包括用一個(gè)限制性內(nèi)切酶在內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)切割載體的載體消化。
具有代表性的是，用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶也切割在內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的載體。
對(duì)于其它的限制性內(nèi)切酶，在不具備含有一個(gè)內(nèi)部四堿基識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)六堿基識(shí)別位點(diǎn)的合適的限制性內(nèi)切酶的情況下，線性化一個(gè)pSK載體采用的總的策略包括如下步驟(i)分開含有插入片段的質(zhì)粒成兩部分，第一部分用限制性內(nèi)切酶XhoI切割，第二部分用限制性內(nèi)切酶SalI切割；(ii)在切割后重組第一和第二部分；(iii)分開重組的部分成三份，用限制性內(nèi)切酶HindIII切割三份中的第一份，用限制性內(nèi)切酶BamHI切割三份中第二份，第三份用限制性內(nèi)切酶EcoRI切割；(iv)消化后重組該三份，以便產(chǎn)生一個(gè)線性化片段的庫，在這個(gè)庫中大約有總數(shù)1/6同用每一種可能組合酶切割的產(chǎn)物是相對(duì)應(yīng)的。
具有代表性的是，對(duì)于多聚腺苷mRNA物種的mRNA庫被豐富了。
具有代表性的是，在步驟(j)中擴(kuò)增片段的分離分析是通過電泳顯示產(chǎn)物進(jìn)行的。優(yōu)選的是，在電泳后顯示的產(chǎn)物的強(qiáng)度幾乎和在初始混合物中產(chǎn)物相應(yīng)的mRNAs的豐度呈比例的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本方法進(jìn)一步包括在電泳后，從產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)于mRNA的強(qiáng)度確定在初始混合物中每個(gè)mRNA相對(duì)豐度的一個(gè)步驟。
具有代表性的是，用電泳分離分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的步驟，包括在多個(gè)凝膠上的片段的電泳。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本方法進(jìn)一步包括如下步驟(k)洗脫至少一個(gè)與來源于電泳圖譜中的mRNA相對(duì)應(yīng)的cDNA，其中在樣品中出現(xiàn)的代表mRNAs的3’-末端的條帶被顯示；(l)在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增分離的PCR產(chǎn)物；(m)克隆擴(kuò)增分離的PCR產(chǎn)物進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒中；(n)生產(chǎn)來源于質(zhì)粒同克隆分離的PCR產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的DNA；(o)測(cè)序克隆分離的PCR產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例包含如下步驟(a)分離一個(gè)mRNA庫；(b)用一個(gè)混合的錨定引物，從mRNA庫制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，每個(gè)錨定引物具有一個(gè)5’-末端和一個(gè)3’-末端且包括(i)從7-40T的殘基序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，該第一個(gè)填充片段被定位朝向于被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制酶內(nèi)切切割位點(diǎn)和T殘基的序列之間；和(V)相變殘基-V-N-N被定位在每個(gè)錨定引物的3’-末端，其中V是從由A、C和G組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能。
(c)用第一個(gè)限性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，形成了一個(gè)分別有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫。
(d)來源于步驟(b)每個(gè)雙鏈cDNA分子被從一個(gè)方向插入進(jìn)一個(gè)載體，對(duì)于一個(gè)T3啟動(dòng)子是有意義的，其在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義鏈5’-末端和有意義鏈3’-末端的5’、3’側(cè)翼載體的序列，而且所說的有一個(gè)5’側(cè)翼序列的構(gòu)建至少在所說的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
(e)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生含有克隆插入的載體。
(f)用不能識(shí)別或在插入的cDNA分子、或在T3啟動(dòng)子中的序列的至少一種限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷。
(g)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從T3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的T3RNA聚合酶，產(chǎn)生了有意義的cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備。
(h)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且由和3’側(cè)翼體序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的3’反轉(zhuǎn)錄引物(RT)，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA。
(i)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物。第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’-PCR引物是15-30核苷酸長(zhǎng)，它和靠近第一個(gè)限制性內(nèi)的切酶位點(diǎn)3’的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定有-N1組成的3’末端，其中“N”是四種脫氧核糖核酸A、C、G或T中一個(gè)，第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼的載體序互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’-PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用在四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)中。
(j)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物。在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它和靠近第一個(gè)限制性內(nèi)的切酶位點(diǎn)3’的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(i)中一樣，x是從由3和4組成的小組中選擇的，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸進(jìn)入以核苷酸數(shù)量為“x”＝1的cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且在第二系列亞庫中有4x亞庫。
(k)分析第二套PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示。
典型地，48個(gè)錨定引物的混合物具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO5)的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，48個(gè)錨定引物的混合物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO8)的序列。
具有代表性的是，12個(gè)錨定引物的混合物具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO4)的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，12個(gè)錨定引物的混合物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID No7)的序列。
具有代表性的是，3個(gè)錨定引物的混合物具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ IDNO3)的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，3個(gè)錨定引物的混合物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO6)的序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是NotI。
具有代表性的是，第一個(gè)5’PCR-引物是G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO22)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，3’PCR引物在第二個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中是SEQ ID NO47的核苷酸序列共軛連接一個(gè)熒光標(biāo)簽，更優(yōu)選的是SEQ IDNO47的核苷酸序列和6-FAM共軛相連。
在步驟(i)中合適的值是從1-5的整數(shù)，更優(yōu)選的是，在步驟(i)中“x”是3。
具有代表性的是，檢測(cè)在一個(gè)組織中mRNA表達(dá)模式的變化和生理學(xué)或病理學(xué)上變化的聯(lián)系的方法包括以下幾步(a)獲得一個(gè)沒有生理學(xué)或病理學(xué)改變的正常的或瘤形成的第一個(gè)樣品；(b)從第一個(gè)樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(c)通過進(jìn)行總方法中的(a)-(j)步驟確定在組織的第一個(gè)樣品中mRNA表達(dá)的模式，產(chǎn)生代表在第一個(gè)樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第一個(gè)特異序列產(chǎn)物的顯示；(d)獲得有生理學(xué)或病理學(xué)變化組織的第二個(gè)樣品；(e)從第二個(gè)樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(f)通過進(jìn)行總方法中的(a)-(j)步驟確定在組織的第二個(gè)樣品中mRNA表達(dá)的模式，產(chǎn)生代表在第二個(gè)樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第一個(gè)特異序列產(chǎn)物的顯示；(g)比較多個(gè)顯示以確定生理學(xué)或病理學(xué)變化對(duì)在組織中mRNA表達(dá)模式的影響；比較具有代表性的兩個(gè)以上的樣品，優(yōu)選的具體樣品是3個(gè)，更優(yōu)選的至少是4個(gè)樣品，樣品多次被提取和比較。
具有代表性的是，生理學(xué)或病理學(xué)上的變化是從由老年性癡呆癥、帕金森神經(jīng)功能障礙、局部缺血、嗜酒、吸毒成癮、精神分裂癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、多重硬化、抑郁癥、雙極躁狂抑郁障礙所組成的小組中篩選的。
具有代表性的是，生理學(xué)或病理學(xué)上的變化與學(xué)習(xí)或記憶、情緒、谷氨酸脫氫酶神經(jīng)中毒，進(jìn)食行為、嗅覺、視覺、活動(dòng)障礙、病毒感染、電休克療法、藥物的配給或藥物的毒副作用有關(guān)。
具有代表性的是，生理學(xué)或病理學(xué)上的變化是從由生理節(jié)奏變化、老化、及長(zhǎng)期強(qiáng)化所組成的小組中選擇的?？偟膩碚f，生理學(xué)或病理學(xué)上的變化是從通過轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)第二信使、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子和神經(jīng)調(diào)質(zhì)所介導(dǎo)的過程中篩選的?？晒┻x擇的是，生理學(xué)的或病理學(xué)的變化是從通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸、細(xì)胞-底物接觸、細(xì)胞-胞外基礎(chǔ)接觸、及在細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間接觸介導(dǎo)的過程篩選的。
優(yōu)選的是，由細(xì)胞組成的正常的或瘤形成的組織是從由心血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、體被(包括皮膚、頭發(fā)和指甲)，骨骼系統(tǒng)(包括骨骼和肌肉)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)組成的小組中的篩選的一個(gè)器官或器官組織提取或衍生的。
在優(yōu)選實(shí)施例中，由細(xì)胞組成的正常的或瘤形成的組織是從由上皮、內(nèi)皮、粘膜、腺體、血液、淋巴、連接組織、軟骨、骨、平滑肌、骨骼肌、心肌、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脾、胸腺、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、松果體、皮膚、頭發(fā)、指甲、牙齒、肝、胰腺、肺、腎、膀胱、輸尿管、乳腺、卵巢、子宮、陰道、睪丸、前列腺、陰莖、眼和耳朵組成的小組中篩選的一個(gè)器官或器官組織提取或衍生的。
具有代表性的，正?；蛄鲂纬傻慕M織是從由視網(wǎng)膜、小腦皮層、嗅覺泡、丘腦、下丘腦、前垂體、后垂體、海馬、伏隔核、扁桃體、紋狀體、小腦、腦干、交叉上核和脊柱索組成的小組中篩選的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)結(jié)構(gòu)衍生而來的。
具有代表性的，檢測(cè)一個(gè)篩選的藥物和一個(gè)已知化合物作用的不同的方法由以下步驟組成(a)從用已知生理學(xué)功能的化合物處理的有機(jī)體獲得組織的第一份樣品；(b)從第一份樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(c)通過進(jìn)行總方法中的(a)-(j)步驟產(chǎn)生代表在第一份樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第一個(gè)序列特異的產(chǎn)物的顯示，確定在第一個(gè)樣品組織中mRNA表達(dá)的模式。
(d)從用被篩選的藥物處理的有機(jī)體中獲得第二份樣品，確定篩選的藥物和一個(gè)已知化合物作用的不同；(e)從第一份樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(f)通過進(jìn)行總方法中的(a)-(j)步驟產(chǎn)生代表在第二份樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第二個(gè)序列特異的產(chǎn)物的顯示，確定在第二個(gè)樣品組織中mRNA表達(dá)的模式；(g)比較第一個(gè)和第二個(gè)的顯示，以便于在mRNA物種出現(xiàn)的情況下，mRNA的表達(dá)不受已知化合物的影響，而是受被篩選的藥物的影響，因此，可以表明篩選的藥物和已知化合物作用的差異。
具有代表性的是，被篩選的藥物是從由抗抑郁藥、精神抑制藥、安定藥、抗驚厥藥、單胺氧化酶抑制劑、興奮劑、抗帕金森劑、骨骼肌弛緩藥、止痛藥、局部麻醉藥、膽堿能藥、抗病毒劑、抗痙攣藥、類固醇和非類固醇類抗發(fā)炎藥物組成的小組中篩選的。
更普通的是，專業(yè)術(shù)語“被篩選的藥物”和“被檢測(cè)的藥物”在此是指有用的化學(xué)和治療劑的一個(gè)廣泛范圍，其包括生理活性的類固醇、抗生素、抗真菌劑、抗細(xì)菌劑、抗瘤劑、止痛藥和止痛化合物、減食欲劑、驅(qū)腸蟲藥、抗關(guān)節(jié)炎藥、antiasthia劑、抗驚厥藥、抗抑郁藥、抗糖尿病藥、止瀉藥、抗組胺藥、抗發(fā)炎劑、抗偏頭痛制劑、抗多動(dòng)病制劑(animotion sickness preparation)、防暈藥、抗帕金森藥、止癢藥、精神抑制藥、解熱藥、鎮(zhèn)痙藥，包括腸胃的和泌尿的；抗膽堿能藥、擬交感神經(jīng)藥、黃嘌呤衍生物，心血管的制劑包括鈣通道阻滯劑、-受體阻滯藥、抗心律失常藥、抗高血壓利尿藥、血管輸張藥包括全身的、冠狀的末梢和腦的；中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑、咳嗽和感冒劑、減充血?jiǎng)⒓に?、安眠藥、免疫抑制劑、肌肉馳緩藥、抗副交感神經(jīng)藥、抗擬交感神經(jīng)藥、精神興奮劑、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、過敏原、抗組胺藥、抗發(fā)炎藥、生理活性的肽和蛋白蛋、紫外篩選的藥劑、香料、昆蟲驅(qū)除藥、染發(fā)劑等等諸如此類。描述那些可考慮的試劑在這里用專業(yè)技術(shù)“生理活性”應(yīng)從廣泛意義上理解，不僅指對(duì)宿生有一個(gè)直接藥理學(xué)作用的藥劑，也指那些在醫(yī)藥領(lǐng)域有用的對(duì)間接或可觀察到作用的藥劑，例如，為診斷目的著色或不透光組織及從組織中紫外放射性的篩選等等。
例如，典型的抑真菌和殺真菌劑包括噻苯達(dá)唑、二氯羥喹、兩性霉素、殺念菌素、真菌霉素、制霉菌素、氯登妥因、克霉唑、硝酸依托南、咪康唑硝酸鹽、吡咯尼群、水楊酸、苯噻硫酮、氟苯異噻酮、托奈酯、三酯汀、鋅、和巰氧吡啶和巰氧吡啶鈉。
類固醇包括可的松、去氧可的松、氟丙酮化合物、氟氫可的松、二乙酸二氟松、氟氫縮松丙酮化合物、甲羥松、安西法爾、安西非特、倍他米松及其酯、氯潑尼松龍、clorcortelone、21-去氧去炎松、地標(biāo)德、地塞米松、二氯松、二氟潑尼酯、氟氯奈德、氟米松、氟尼縮松、氟輕松醋酸酯、氟可龍、氟米龍、氟培龍、氟潑尼龍、甲潑尼松、甲基甲潑尼松、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松。
抗細(xì)菌的試劑包括磺胺、青霉素、先鋒霉素、青霉素酶、紅霉素、林可霉素、萬古霉素、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素等等?？咕奶貙?dǎo)的例子包括紅霉素、碳酸乙基紅霉素、丙酸酯十二烷基紅霉素、葡庚糖酸鹽紅霉素、乙基丁二酸紅霉素、乳糖醛酸紅霉素、林可霉素、克林霉素、四環(huán)霉素、氯四環(huán)素、地美環(huán)素、強(qiáng)力霉素、美他環(huán)素、氧化四環(huán)素、米諾環(huán)素等等。
肽和蛋白質(zhì)包括，尤其指比平均長(zhǎng)度小的肽，例如胰島素、加壓素、催產(chǎn)素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞素，還有一些大的蛋白質(zhì)，例如人生長(zhǎng)激素。
其它試劑，包括各種治療劑，例如黃嘌，氨苯蝶啶，茶堿，抗腫瘤劑，5-氟尿嘧啶核苷脫氧核糖，6-巰基嘌呤脫氧核糖，阿糖腺苷，麻醉止痛藥，氫嗎啡酮，環(huán)吖嗪，鎮(zhèn)痛辛，bupomorphine，含有有機(jī)陰離子、肝素、前列腺素、前列腺素類似化合物的化合物，色苷酸鈉，甘珀酸，多聚羥基化合物，多巴胺，多馬酚丁胺，1-多馬，a-甲基多巴，血管緊張素拮抗藥，例如緩激肽、胰島素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，腦啡吠、內(nèi)啡肽、生長(zhǎng)抑素、分泌物這樣的多肽和例如四環(huán)素、溴麥角環(huán)肽、利多卡因、西咪替丁或任何相關(guān)化合物的各種混合化合物。
其它試劑包括碘化脫氧尿嘧啶、鬼臼樹脂、茶堿、異丙腎上腺素、曲安奈德磷酸、氫化可的松，吲哚美辛、二苯丁唑酮、對(duì)氨苯甲酸和青霉胺。
前述所列絕未囊括所用，而且任何生理活性試劑均可用本發(fā)明方法檢測(cè)。
典型地，構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫由通過序列特異PCR產(chǎn)物的顯示的定量產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組成的。典型地，這個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步含有涉及到序列相關(guān)性、基因圖譜和細(xì)胞分配的數(shù)據(jù)。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了識(shí)別在一個(gè)樣品中出現(xiàn)的mRNA分子3’-末端和序列數(shù)據(jù)庫中的序列的身份和相似性的方法。其包括如下步驟(a)用一個(gè)錨定引物的混合物從一個(gè)mRNA庫中制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，每一個(gè)錨定引物含有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，而且包括(i)7-40T殘基的一段序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，第一個(gè)填充片段被定位朝向于被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)和T殘基的序列之間；和(v)從由-V、-V-N和-V-N-N組成的小組中選擇的每個(gè)錨定引物相變殘基被定位在3’-末端，其中V是從由A、C和G組成小組中篩選的脫氧核糖核苷酸；N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能；(b)用第一個(gè)限性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，形成了一個(gè)分別具有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫；(c)來源于步驟(b)的每個(gè)雙鏈cDNA分子在一個(gè)方向上被插入進(jìn)一個(gè)載體，其對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是反意義的，在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義鏈5’-末端和有意義鏈3’-末端的5’、3’側(cè)翼載體的序列，而且所說的有一個(gè)3’側(cè)翼序列的構(gòu)建至少在所說的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述的啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度；(d)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生含有克隆插入的載體；(e)用至少一種或不能識(shí)別插入的cDNA分子，或不能識(shí)別噬菌體特異的啟動(dòng)子序列，但能識(shí)別載體上序列的限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷，這樣產(chǎn)生的線性片段具有一個(gè)在載體5’端到雙鏈cDNA分子第二個(gè)末端的至少15個(gè)核苷酸的5’側(cè)翼載體；(f)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從噬菌體特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的噬菌體特異的RNA聚合酶，產(chǎn)生了反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備；(g)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且由和5’側(cè)翼體序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的5’反轉(zhuǎn)錄引物(RT)，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA；(h)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物。第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’-PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它和在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定具有-N1組成的3’末端，其中“N”是四種脫氧核糖核酸A、C、G或T中的一個(gè)，第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼載體序互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’-PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用于四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)中；(i)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物。在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它與在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(h)中一樣，x是從1到5的整數(shù)，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”+1插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且對(duì)于第一套亞庫中每一個(gè)亞庫在第二系列中有4x亞庫；(j)分析第二套PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示；(k)洗脫與來源于電泳圖譜中的mRNA相對(duì)應(yīng)的至少一個(gè)cDNA，其中在樣品中出現(xiàn)的代表mRNAs的3’-末端的條帶被顯示；(l)在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增洗脫的PCR產(chǎn)物；(m)克隆擴(kuò)增分離的PCR產(chǎn)物進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒中；(n)生產(chǎn)同來源于質(zhì)?？寺〉腄NA相對(duì)應(yīng)的DNA；(o)確定克隆的cDNA的序列；(p)從一個(gè)核苷酸數(shù)據(jù)庫確定相應(yīng)的核苷酸序列，這里所說的相應(yīng)的核苷酸序列是被第二個(gè)限制性的內(nèi)切酶最末端的識(shí)別位點(diǎn)和Poly(A)尾巴開始處所界定的序列；以及(q)比較克隆cDNA序列和相應(yīng)的核苷酸序列，因此可以識(shí)別出現(xiàn)在一個(gè)樣品中的mRNA的3’-末端序列和一個(gè)數(shù)據(jù)庫序列的身份及相似性。
典型地，這個(gè)方法進(jìn)一步包括如下步驟(r)在一個(gè)二維圖譜顯示中比較PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和數(shù)量；總地說來，本方法也包括如下幾步(s)確定相應(yīng)的核苷酸的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度(其和從數(shù)據(jù)庫中確定的相應(yīng)核苷酸序列的長(zhǎng)度的總和相等)、可以和載體序列雜交的5’PCR序列的長(zhǎng)度、剩余的錨定引物序列的長(zhǎng)度、載體序列介入部分的長(zhǎng)度以及與載體序列可雜交的3’PCR序列的長(zhǎng)度；和(t)比較PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度和已確定的預(yù)測(cè)的相應(yīng)核苷酸序列的長(zhǎng)度，在此相應(yīng)的核苷酸序列的預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度是通過一個(gè)圖解標(biāo)記或文字符在一個(gè)二維圖譜的顯示中被證明了的。合適的圖解標(biāo)記包括垂直和水平線、例如十字形或“X”形的交叉短線部分、和包括圓形和多邊形的幾何圖形。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了識(shí)別在一個(gè)樣品出現(xiàn)的一個(gè)mRNA分子相對(duì)應(yīng)的一個(gè)cDNA片段序列與一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫間身份和相似性的方法，其包括如下步驟洗脫與在一個(gè)樣品中出現(xiàn)的一個(gè)mRNA分子相對(duì)應(yīng)的一個(gè)cDNA片段；在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增洗脫的cDNA片段產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增的cDNA片段；克隆擴(kuò)增的cDNA片段進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒；產(chǎn)生一個(gè)和cDNA片段對(duì)應(yīng)的一個(gè)DNA分子；測(cè)序產(chǎn)生的DNA分子，因此確定了洗脫的cDNA片段的序列；以及，比較洗脫的cDNA片段的序列和數(shù)據(jù)庫中序列，因此可以識(shí)別序列的身份和相似性。
典型地，比較洗脫的cDNA片段的序列和數(shù)據(jù)庫中序列的步驟是用計(jì)算機(jī)進(jìn)行的，典型地，本方法也包括用圖解顯示比較結(jié)果的附加步驟。
總而言之，在一個(gè)樣品中出現(xiàn)一個(gè)mRNA分子對(duì)應(yīng)的cDNA片段的序列與一個(gè)數(shù)據(jù)庫序列之間的序列身份和相似性是通過一個(gè)包括如下步驟的方法進(jìn)行的洗脫與在一個(gè)樣品中出現(xiàn)的一個(gè)mRNA相對(duì)應(yīng)的cDNA片段，這里cDNA片段有一個(gè)由一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與該mRNA分子的一個(gè)Poly(A)尾巴的位置確定的長(zhǎng)度；用和該限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的一個(gè)5’PCR引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確定cDNA片段的部分序列；以及，比較洗脫cDNA片段的確定的部分序列和在數(shù)據(jù)庫中的序列的cDNA片段的長(zhǎng)度，來識(shí)別序列的身份和相似性。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)化多核苷酸序列數(shù)據(jù)庫登記的一個(gè)方法，其包括以下步驟從一個(gè)多核苷酸序列數(shù)據(jù)庫登記中選擇一個(gè)源序列；在該源序列中定位一個(gè)poly(A)尾巴序列；在源序列中定位一個(gè)和第一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)最靠近的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列；確定和上述限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)鄰接的大約由2-6個(gè)核苷酸組成的一個(gè)索引序列；在源序列中，確定一個(gè)相關(guān)的序列，所說的相關(guān)序列包括被poly(A)尾巴和限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)所界定的序列，且包括限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的至少一部分；確定相關(guān)序列的長(zhǎng)度；和存儲(chǔ)關(guān)于poly(A)尾巴位置和序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)位置和序列、和源序列相關(guān)的相關(guān)序列的長(zhǎng)度的信息，因此可以產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)庫登記。典型地，本方法包括圖示顯示和索引序列相關(guān)的相關(guān)序列的長(zhǎng)度?？蓛?yōu)選的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)是從由MspI，TaqI和HinP1I組成的小組中選擇的。
本發(fā)明也提供了通過減小由于非靶cDNAs擴(kuò)增的背景而改進(jìn)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和數(shù)量的分辨率的一種方法，其包括如下的步驟篩選一個(gè)cDNAs庫的一個(gè)樣品，在這里每一個(gè)cDNA分子包含有插入序列和來源于載體的序列；用一個(gè)可以和來源于載體的序列雜交的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，延伸大約5-6個(gè)核苷酸進(jìn)入插入序列，以產(chǎn)生一個(gè)cDNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物；再一次分離cDNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物；用一個(gè)可以和來源于載體的序列雜交的一個(gè)3’引物和一個(gè)5’引物與再一次分離cDNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行至少一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，延伸大約7-9個(gè)核苷酸進(jìn)入插入序列產(chǎn)生一個(gè)PCR產(chǎn)物，因此減小由于非靶cDNAs擴(kuò)增的背景。
典型的有16個(gè)庫的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和16個(gè)不同的反轉(zhuǎn)錄引物。總共有4x亞庫的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在這里，5’PCR引物延伸進(jìn)入插入序列的核苷酸的數(shù)量同反轉(zhuǎn)錄引物延伸進(jìn)入插入序列的核苷酸的數(shù)量是不同的。
本發(fā)明的這些和其它的特征、方面及優(yōu)點(diǎn)參考下面的描述、所附權(quán)利要求及同時(shí)提供的附圖將會(huì)變得更容易理解圖1是本發(fā)明改進(jìn)方法的一個(gè)圖解描述，其表明引物設(shè)計(jì)、切割、克隆、反意RNA轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的各個(gè)階段，而且也圖示地表明了錨定和其它引物的序列——完整的序列參看文字部分；圖2是用帶有包被抗生蛋白鏈霉素的底物的生物素?；腻^定引物的改進(jìn)方法的一個(gè)實(shí)施例的一個(gè)圖解描述，而且顯示了引物設(shè)計(jì)、切割、克隆、反意RNA轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的各個(gè)階段，而且也圖示地表明了錨定和其它引物的序列——完整的序列參看文字部分；圖3是用一個(gè)熒光檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)記PCR產(chǎn)物的相對(duì)豐度對(duì)在堿基對(duì)中產(chǎn)物長(zhǎng)度的關(guān)系的圖表，其表明了對(duì)用一個(gè)5’PCR引物C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T-G(SEQ ID NO42)獲得的PCR產(chǎn)物的分析，從饑餓血清(serun-starved)(A)和添加血清(serun-added)(B)的人MG63細(xì)胞中的mRNA的樣品開始，用軟件比較在兩個(gè)樣品之間的相對(duì)的表達(dá)水平，從(A)和(B)得到的數(shù)據(jù)在序列的末端是重疊的圖4是對(duì)于用兩個(gè)PCR步驟的方法和僅用一個(gè)PCR步驟的方法，使用一個(gè)熒光檢測(cè)系統(tǒng)比較標(biāo)記PCR產(chǎn)物的相對(duì)的豐度對(duì)產(chǎn)物在堿基對(duì)中長(zhǎng)度的一個(gè)圖表，其表明用或一個(gè)PCR步驟(A-D)或兩個(gè)PCR步驟(E-H)對(duì)從饑餓血清(serun-starved)(A)和添加血清(serun-added)(B)的MG63骨肉瘤細(xì)胞中提取的mRNA分析獲得的結(jié)果，顯示了來源于5’PCR引物109T(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-T-G-C-A，SEO ID NO43)和45A(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-G-C-A，SEO ID NO44)的數(shù)據(jù)，其僅在N1位置(用黑體表示)不同，對(duì)饑餓血清(serun-starved)(os-)和添加血清(serun-added)(os+)的樣品，表明用109T和45A產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物看起來幾乎和從用一個(gè)PCR步驟方法(A-D)產(chǎn)生的模板是一樣的，而來源于用兩個(gè)PCR步驟的方法產(chǎn)生的模板進(jìn)行下一步的PCR所檢測(cè)的產(chǎn)物是完全不同的(E-H)；圖5是為了比較用在圖1中所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法和在圖2中所描述的磁珠實(shí)施例所獲得的結(jié)果，使用一個(gè)熒光檢測(cè)系統(tǒng)比較標(biāo)記PCR產(chǎn)物的相對(duì)的豐度對(duì)產(chǎn)物在堿基對(duì)中長(zhǎng)度的一個(gè)圖表，其表明來源于磁珠的實(shí)施例的數(shù)據(jù)和來源于標(biāo)準(zhǔn)的方法的實(shí)施例的數(shù)據(jù)比較，在所有樣品的復(fù)制性方面有一個(gè)顯著的增加(產(chǎn)生片段的相似性和強(qiáng)度數(shù)值的一致性)；圖6是表示對(duì)于幾個(gè)不同組織產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的峰度和cDNA濃度之間的線形關(guān)系的圖；圖7表明了核苷酸序列和多克隆位點(diǎn)質(zhì)粒pBC SK+/DGT1、pBC SK+/DGT2、pBC SK+/DGT3、pBC SK+/DGT4和pBC SK+/DGT5的限制性的圖譜；圖8是用帶有包被抗生蛋白鏈霉素的底物的生物素?；腻^定引物的改進(jìn)方法的一個(gè)實(shí)施例的圖解描述，其表明了引物設(shè)計(jì)、切割、克隆、反意RNA轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的各個(gè)階段，而且也圖示地表明了錨定和其它引物的序列——完整的序列參看文字部分。
我們已研究開發(fā)了對(duì)于在一個(gè)mRNA庫中同步的序列特異mRNAs的鑒定和顯示的改進(jìn)方法，該方法在確定藥物作用的機(jī)制、藥物的篩選、及生理學(xué)和病理學(xué)情況的研究、基因圖譜方面有大量的應(yīng)用。如下是對(duì)該改進(jìn)的方法及其應(yīng)用的討論。
I.mRNAs同步序列特異的鑒定基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的方法提供了被正常或瘤形成的真核細(xì)胞或組織表達(dá)的幾乎每個(gè)mRNA在凝膠上都有一個(gè)明顯條帶的可見的方法，且條帶的強(qiáng)度和mRNA的濃度大致相對(duì)應(yīng)。本方法是基于對(duì)含有3’poly(A)尾巴，但不依賴于結(jié)合尾巴的引物的特異性的幾乎所有的mRNAs的觀察的基礎(chǔ)上的。
改進(jìn)的方法如在圖1、圖2及圖8三個(gè)實(shí)施例中被圖示證明了?？偟恼f來，改進(jìn)的方法包括如下幾步a)用一個(gè)錨定引物的混合物從一個(gè)mRNA庫中制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，每一個(gè)錨定引物含有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，而且包括(i)7-40T殘基的一段序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，該第一個(gè)填充片段被定位朝向于被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制酶內(nèi)切切割位點(diǎn)和T殘基的序列之間；和(v)從由-V、-V-N和-V-N-N組成的小組中選擇的每個(gè)錨定引物相變殘基被定位在3’-末端，優(yōu)選-V-N-N，其中V是從由A、C和G組成小組中篩選的脫氧核糖核苷酸；N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能；(b)用第一個(gè)限性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，該第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，以形成一個(gè)分別具有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫；(c)來源于步驟(b)的每個(gè)雙鏈cDNA分子被插入進(jìn)一個(gè)載體，在方向上對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是反意義的，在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義鏈5’-末端和有意義鏈3’-末端的5’、3’側(cè)翼載體的序列，而且所說的有一個(gè)3’側(cè)翼序列的構(gòu)建至少在所說的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述的啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度；(d)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生含有克隆插入的載體；(e)用至少一種或不能識(shí)別插入的cDNA分子，或不能識(shí)別噬菌體特異的啟動(dòng)子序列，但能識(shí)別載體上序列的限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷，這樣產(chǎn)生的線性片段具有一個(gè)在載體5’端到雙鏈cDNA分子第二個(gè)末端的至少15個(gè)核苷酸的5’側(cè)翼載體序列；(f)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從噬菌體特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的噬菌體特異的RNA聚合酶，產(chǎn)生了反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備；(g)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且由和5’側(cè)翼體序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的5’反轉(zhuǎn)錄引物(RT)，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA
(h)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物，該第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’-PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它和在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定有-N1組成的3’末端，其中“N”是四種脫氧核糖核酸A、C、G或T中一個(gè)，第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼的載體序互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’-PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用在四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)；(i)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物。在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它與在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(h)中一樣，x是從1到5的整數(shù)，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”+1插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且對(duì)于第一套亞庫中每一個(gè)亞庫在第二系列中有4x亞庫；(j)分析第二套PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示。
在一個(gè)可選的實(shí)施例中，上述步驟(c)包括插入來源于步驟(b)的每一個(gè)雙鏈cDNA分子進(jìn)入載體，且它的插入的方向?qū)d體中噬菌體特異的啟動(dòng)子來說是有意義的，這樣就形成了一個(gè)含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫(圖8)。
A.雙鏈cDNA的制備在本方法中的第一步要求一個(gè)mRNA庫。提取mRNA的方法對(duì)于這個(gè)領(lǐng)域是公知和被描述的。例如，在J.Samrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，NewYork，1989)，vol.1，ch.7，“從真核細(xì)胞中提取、純化和分析信使RNA”，在此被引作參考。其它的分離和提取方法也是公知的。普遍地，分離是在象氯化胍或硫氰酸胍離液劑存在的情況下進(jìn)行的，盡管其它的去污劑和提取劑也是可選用的。
通常，mRNA是通過寡聚dT-纖維素色譜或其它的有能力結(jié)合mRNA分子的多聚腺苷酸化的3’-部分的色譜介質(zhì)從總的提取RNA中分離出來的?？梢赃x擇的是，總的RNA是可用的，但不是最優(yōu)選的。但是，總的來說提取poly(A)+RNA是更可取的。
用一個(gè)錨定引物的混合物起始引發(fā)從mRNA庫的反轉(zhuǎn)錄，這樣就制備出了雙鏈cDNAs。每一個(gè)錨定引物含有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，而且包括(i)7-40T殘基的一段序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，該第一個(gè)填充片段被定位朝向于被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和T殘基的序列之間；和(v)從由-V、-V-N和-V-N-N組成的小組中選擇的每個(gè)錨定引物相變殘基被定位在3’-末端，其中V是從由A、C和G組成小組中篩選的脫氧核糖核苷酸；N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能。在這里混合物中的相變殘基被-V、-V-N或-V-N-N中的一個(gè)所限定。錨定引物在這里有一個(gè)-V的相變殘基，混合物包括3個(gè)錨定引物的混合。錨定引物在這里有一個(gè)-V-N的相變殘基，混合物包括12個(gè)錨定引物的混合。錨定引物在這里有一個(gè)-V-N-N的相變殘基，混合物包括48個(gè)錨定引物的混合。
典型的是，每個(gè)錨定引物在T殘基序列區(qū)域有18個(gè)T殘基，在-V-N-N末端有14個(gè)殘基長(zhǎng)的第一個(gè)填充片段，第一個(gè)填充片段的優(yōu)選序列是從由A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C(SEQ ID NO1)和G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A(SEQ IDNO2)組成的小組中篩選的。具有代表性的是，識(shí)別6個(gè)以上堿基的限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)是NotI切割位點(diǎn)。
3個(gè)可優(yōu)選的一套錨定引物是具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ IDNO3)序列的。12個(gè)可優(yōu)選的一套錨定引物是具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(S EQ ID NO4)序列的。48個(gè)可優(yōu)選的一套錨定引物是具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(S EQ ID NO5)序列的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，那套3個(gè)錨定引物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO6)的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，那套12個(gè)錨定引物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO7)的序列。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，那套48個(gè)錨定引物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO8)的序列。
所述錨定引物混合物的一個(gè)成員起始引發(fā)在樣品中每個(gè)mRNA物種的所有拷貝的在3’末端的一個(gè)固定位置的合成，因此限定了每個(gè)物種的一個(gè)3’末端點(diǎn)。
這個(gè)反應(yīng)是在從mRNA進(jìn)行雙鏈cDNA制備的條件下進(jìn)行的，這對(duì)于本領(lǐng)域的人是公知的。例如這樣的技術(shù)在J.Samrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”第2卷中，標(biāo)題“cDNA文庫的構(gòu)建和分析”中被描述了。合適的反轉(zhuǎn)錄酶包括來源于禽類成髓細(xì)胞血癥病毒(AMV)和莫洛尼鼠的白血病病毒(MMLV)的反轉(zhuǎn)錄酶。一個(gè)可優(yōu)選的反轉(zhuǎn)錄酶是MMLV反轉(zhuǎn)錄酶。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，磁珠用于改進(jìn)cDNA庫的制備(圖2和圖8)。具有代表性的是，生物素的一部分是共軛連接到錨定引物的5’末端，而且通過用包被抗生蛋白鏈霉素的底物接觸第一個(gè)限制性的cDNA，第一個(gè)限制性的cDNA被從其余的cDNA中分離出來，如同包被抗生蛋白鏈霉素磁珠的數(shù)量。
B.用限制性內(nèi)切酶切割cDNA樣品cDNA樣品用兩種限制性內(nèi)切酶切割。第一個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別具有6個(gè)以上堿基的位點(diǎn)，同時(shí)在錨定引物混合物的每一個(gè)成員中單一位點(diǎn)處切割。第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是一個(gè)可以識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列的內(nèi)切酶。這樣的內(nèi)切酶普遍在大多數(shù)的cDNAs的多位點(diǎn)切割。具有代表性的是，第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是NotI，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI。在大多數(shù)cDNAs中NotI不能切割。這正是我們所希望的，其減少了由于在除了在錨定位置外位置的cDNAs的切割引起的克隆插入的損失。
第二個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可在TaqI，MaeII，或HinP1I中選擇。用上述的三個(gè)限制性內(nèi)切酶能檢測(cè)不能被MspI切割的稀有mRNAs。第二個(gè)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生一個(gè)5’-突出，就象下面所描述的一樣，它同克隆的期望載體是相配的。這個(gè)克隆，對(duì)于載體是從由pBC SK+、pBS SK+、pBCSK+/DGT1、pBS SK+/DGT2和pBS SK+/DGT3組成的小組中篩選的，克隆進(jìn)入ClaI位點(diǎn)，就象如下所討論的。
第二個(gè)限制性內(nèi)切酶可以選擇Sau3AI。用這個(gè)個(gè)限制性內(nèi)切酶能檢測(cè)不能被MspI切割的稀有mRNAs。第二個(gè)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生一個(gè)5’-突出，就象下面所討論的一樣，它同克隆的期望載體是相配的。這個(gè)克隆載體是pBS SK+/DGT4，克隆進(jìn)入BamHI位點(diǎn)，就象下面所討論的一樣。
第二個(gè)限制性內(nèi)切酶可以選擇NlaIII。用這個(gè)個(gè)限制性內(nèi)切酶能檢測(cè)不能被MspI切割的稀有mRNAs。第二個(gè)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生一個(gè)5’-突出，就象下面所討論的一樣，它同克隆的期望載體是相配的。這個(gè)克隆載體是pBS SK+/DGT5，克隆進(jìn)入SphI位點(diǎn)，就象下面所討論的一樣。
能被用于檢測(cè)不能被上述的限制性內(nèi)切酶切割的cDNAs的其它的適合的限制性內(nèi)切酶是可以選擇的。適合可以識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶是MboI、DpnII、Sau3AI、Tsp509I、HpaII、BfaI、Csp6I、MseI、HhaI、NlaIII、TaqI、MspI、MaeII和HinP1I。
識(shí)別6個(gè)以上堿基的適合的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是AscI、BaeI、FseI、NotI、PacI、PmeI、PpuMI、RsrII、SapI、SexAI、SfiI、SgfI、SgrAI、SrgfI、Sse8387I和SwaI。
消化cDNA的條件，在這個(gè)領(lǐng)域是公知的，例如在J.Samrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”第1卷第5章中，“用在分子克隆中的酶”中被描述了。
C.切割的cDNA插進(jìn)一個(gè)載體中接著，第一個(gè)限制性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的cDNA樣品插進(jìn)一個(gè)載體中，概括說，合適的載體含有一個(gè)NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶ClaI和NotI切割的質(zhì)粒pBC SK+是一個(gè)合適的載體。該載體含有噬菌體特異的啟動(dòng)子。具有代表性的是，啟動(dòng)子是一個(gè)T3、SP6或T7啟動(dòng)子。一個(gè)優(yōu)選的啟動(dòng)子是噬菌體T3的啟動(dòng)子。切割的cDNA被插進(jìn)在相對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是反意義的方向上的啟動(dòng)子中(圖1和圖2)。在另一個(gè)實(shí)施例中，切割的cDNA被插進(jìn)在相對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是有意義的方向上的啟動(dòng)子中(圖8)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)的載體有一個(gè)從由SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13組成的小組中篩選的一個(gè)核苷酸序列。
基于質(zhì)粒載體pBluescript(pBS或pBC)SK+(Stratagene)的載體是優(yōu)選的，這個(gè)質(zhì)粒載體在從656到764位置的核苷酸序列部分被刪除，用一個(gè)包含有一個(gè)NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的至少110個(gè)核苷酸序列取代。這個(gè)被指定為多克隆位點(diǎn)(MCS)的區(qū)域跨越了從SacI位點(diǎn)到KpnI位點(diǎn)的核苷酸序列部分。
一個(gè)合適的質(zhì)粒載體，例如pBC SK+或pBS SK+(Stratagene)，用合適的限制性內(nèi)切酶消化以刪除多克隆位點(diǎn)的至少100個(gè)核苷酸。對(duì)于pBS SK+來說，刪除多克隆位點(diǎn)的適合的限制性內(nèi)切酶是SacI和KpnI。由一個(gè)新的多克隆位點(diǎn)組成的、含有在用第一和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后可以和NotI和ClaI匹配的末端的一個(gè)cDNA部分克隆進(jìn)這個(gè)載體形成一個(gè)合適質(zhì)粒載體。由一個(gè)新的多克隆位點(diǎn)組成的可優(yōu)選的cDNA部分含有在SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO11中描述的部分。通過用一個(gè)可以識(shí)別包含第二個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的4-核苷酸序列在內(nèi)的具有6個(gè)堿基以上的一個(gè)序列的單限制性內(nèi)切酶消化，cDNA克隆被線形化。
一個(gè)可優(yōu)選的質(zhì)粒載體，在這里指的是pBC SK+/DGT1，其包括SEQ IDNO9的多克隆位點(diǎn)(MCS)。第二個(gè)限制性內(nèi)切酶和線形化限制性內(nèi)切酶對(duì)(步驟E，下面)分別是MspI和SmaI；HinP1I和NarI；TaqI和XhoI；MaeI1和AatII。
一個(gè)可優(yōu)選的質(zhì)粒載體，在這里指的是pBS SK+/DGT2，其包括SEQ IDNO10的多克隆位點(diǎn)(MCS)。而且如上述的pBC SK+/DGT1一樣制備。這個(gè)多克隆位點(diǎn)不接受用MaeI1產(chǎn)生的cDNA插入。因此，對(duì)于pBSSK+/DGT2，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶和線形化限制性內(nèi)切酶對(duì)(步驟E，下面)分別是MspI和SmaI；HinP1I和NarI；TaqI和XhoI。
另一個(gè)優(yōu)選的質(zhì)粒載體，在這里指的是pBS SK+/DGT3，其包括SEQ IDNO11的多克隆位點(diǎn)(MCS)。第二個(gè)限制性內(nèi)切酶和線形化限制性內(nèi)切酶對(duì)(步驟E，下面)分別是MspI和SmaI；HinP1I和NarI；TaqI和XhoI；MaeI1和AatII。
另一個(gè)可優(yōu)選的質(zhì)粒載體，在這里指的是pBC SK+/DGT4，其包括SEQID NO12的多克隆位點(diǎn)(MCS)。適合用于這個(gè)載體的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶和線形化限制性內(nèi)切酶對(duì)(步驟E，下面)，分別是Sau3AI和BglII。
另一個(gè)可優(yōu)選的質(zhì)粒載體，在這里指的是pBS SK+/DGT5，其包括SEQ IDNO13的多克隆位點(diǎn)(MCS)。適合用于這個(gè)載體的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶和線形化限制性內(nèi)切酶對(duì)(步驟E，下面)，分別NlaIII和NcoI。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，載體含有一個(gè)載體填充序列，這個(gè)載體填充序列包括一個(gè)在第一個(gè)和第二個(gè)載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)間的一個(gè)內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。在這樣的一個(gè)實(shí)施例中，線形化步驟包括用一個(gè)在內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可以切割載體的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體進(jìn)行消化。在另一個(gè)實(shí)施例中，用在線形化步驟中的限制性內(nèi)切酶也可切割在內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的載體。
D.一個(gè)合適的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化切割的DNA已插入的載體接著被用于轉(zhuǎn)化一個(gè)適合的宿主細(xì)胞，這個(gè)宿主細(xì)胞通過含有插入片段的載體被高效轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。對(duì)于克隆合適的宿主細(xì)胞，就象Samrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”，最有代表性的宿主細(xì)胞是原核的。一個(gè)特別適合的宿主細(xì)胞是一個(gè)大腸桿菌的株系。一個(gè)適合的大腸桿菌的株系是MC1061。更優(yōu)選的是，一小等份被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的XL1-Blue株系，以便于通過在X-gal平板上藍(lán)白斑的相對(duì)百分?jǐn)?shù)來確定插入克隆的百分率。只有文庫有超過5x105重組才被普遍接受。
E線形化片段的產(chǎn)生接著從每個(gè)cDNA文庫中制備質(zhì)粒。通過至少一種限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生線形化片段。
在一個(gè)實(shí)施例中，載體是質(zhì)粒pBC SK+，而且NspI既被用于第二個(gè)限制性內(nèi)切酶又被用于線形化限制性內(nèi)切酶。
在另一個(gè)實(shí)施例中，載體是質(zhì)粒pBC SK+，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是從由MspI、MaeII、TaqI和Hin1P組成的小組中篩選的。線形化是通過用SmaI的第一消化，以及隨后的用KpnI及ApaI混合物的第二消化來完成的。
在另一個(gè)實(shí)施例中載體是從由pBC SK+/DGT1、pBS SK+/DGT2、pBSSK+/DGT3、pBC SK+/DGT4和pBS SK+/DGT5組成的小組中選擇的。在這個(gè)實(shí)施例中，提供了一個(gè)適合的酶的組合，在此第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI，用在線形化中的酶是SmaI。另一個(gè)提供的適合的酶的組合是第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是TaqI，用在線形化中的酶是XhoI。進(jìn)一步提供的適合的酶的組合是第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是HinP1I，用在線形化中的酶是NarI。另一個(gè)提供的適合的酶的組合是第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MaeII，用在線形化中的酶是AatII。如果載體是pBC SK+/DGT4，提供的適合的酶的組合是第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是Sau3AI，用在線形化步驟中的限制性內(nèi)切酶是Bg1II。如果載體是pBS SK+/DGT5，提供的適合的酶的組合是第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是NlaIII，用在線形化步驟中的限制性內(nèi)切酶是NcoI。
概括的說，在下面F部分詳細(xì)描述的線形化步驟中，任何缺乏一個(gè)cDNA插入的質(zhì)粒載體都在一個(gè)6-核苷酸的識(shí)別位點(diǎn)處(在圖7A的下劃線處)被切割，對(duì)于SmaI、NarI、XhoI、或AatII發(fā)現(xiàn)是在NotI和ClaI位點(diǎn)之間，而且對(duì)于SmaI、NarI、XhoI或AatII的具有6個(gè)堿基以上識(shí)別位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)3’靠近ClaI位點(diǎn)。相對(duì)照發(fā)現(xiàn)含有插入序列的質(zhì)粒載體對(duì)于SmaI、NarI，XhoI，或AatIII位點(diǎn)有6個(gè)核苷酸序列識(shí)別位點(diǎn)的3’靠近ClaI位點(diǎn)。
F.cRNA的產(chǎn)生下一步是反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA制備的產(chǎn)生，這是通過溫育線性化的片段和一個(gè)具有起始來源于噬菌體特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的一個(gè)RNA聚合酶進(jìn)行的。具有代表性地，就如上面所討論的，啟動(dòng)子是一個(gè)T3啟動(dòng)子，因此聚合酶是T3RNA聚合酶。在適合合成條件下(Ambion，Austin，TX)，聚合酶和線性化片段和4三磷酸核糖核酸溫育。
G.第一鏈cDNA的轉(zhuǎn)錄用莫洛尼鼠的白血病病每(MMLV)所轉(zhuǎn)錄酶(生命技術(shù)，Gaithersburg，MD)轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。這個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶在42℃下退火，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃下進(jìn)行。該反應(yīng)使用一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引物，且這個(gè)引物和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，用一個(gè)熱穩(wěn)定的反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄cRNA，而且引物如下所描述，一個(gè)優(yōu)選的反轉(zhuǎn)錄酶是禽類的重組反轉(zhuǎn)錄酶，其被稱為熱穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄酶(ThermoScript RT)，根據(jù)生命技術(shù)(GaithersburgMD)記述是可適用的。
這提高了在引物和cRNA間之間高度忠實(shí)的互補(bǔ)性。該引物至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，且和噬菌體特異的啟動(dòng)子3’-末端的序列相對(duì)應(yīng)。
另一個(gè)適合的反轉(zhuǎn)錄酶是來源于棲熱菌屬嗜熱菌的重組反轉(zhuǎn)錄酶，其被稱為rTh，根據(jù)Perkin-Elmer(Norwalk，CT)報(bào)道是可用的。
在這里噬菌體特異的啟動(dòng)子是T3啟動(dòng)子，引物典型地有具A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G(SEQ ID NO14)或G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(SEQ ID NO47)的序列。
H.產(chǎn)生第一個(gè)PCR產(chǎn)物下一步是用轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為模板，用如下所描述的第一套引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增的片段。
概括地說，第一鏈cDNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物被用作模板，用一個(gè)第一套的3’PCR引物和5’PCR引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增片段。第一個(gè)3’PCR引物典型地是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且同在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和被噬菌體特異的啟動(dòng)子限定的位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)。第一個(gè)5’PCR引物具有一個(gè)由N1組的一個(gè)3’末端，這里N1是4個(gè)脫氧核糖核苷酸A、C、G或T中的一個(gè)，且這個(gè)引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，其和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，由于引物的互補(bǔ)性，它延伸進(jìn)入cRNA的特異插入的核苷酸中的一個(gè)核苷酸。在4個(gè)不同的亞庫中的每一個(gè)中使用了第一個(gè)5’PCR引物中的一個(gè)不同的引物。
當(dāng)載體是用ClaI和NotI切割的質(zhì)粒pBC SK+時(shí)，一個(gè)適合的3’PCR引物是從由G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(SEQ ID NO47)和G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G(SEQ ID NO48)組成的小組中選擇的。在這里噬菌體特異的啟動(dòng)子是T3啟動(dòng)子，一個(gè)適合的5’-PCR引物具有G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO22)的序列，其中在一個(gè)給定的反應(yīng)中N中是A、G、C或T。
典型地，用一個(gè)PCR程序，PCR是在94℃變性15秒，50℃-65℃退火15秒，72℃合成30秒條件下，在一個(gè)適合的例如PTC-200(MJ Research)或Pekin-Elmer 9600(Pekin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)這樣的熱循環(huán)儀上進(jìn)行的。對(duì)于引物的特異核苷酸序列退火溫度被優(yōu)化了，其所用原理對(duì)這一領(lǐng)域是公知的。高溫退火步驟通過在它的3’末端的第一個(gè)5’-PCR引物能使人為錯(cuò)配最小化，同時(shí)可以促進(jìn)高度忠實(shí)的復(fù)制。
I.產(chǎn)生第二個(gè)PCR產(chǎn)物下一步是用第一個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作模板，用如下所描述的一個(gè)第二套引物進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生第二套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增片段。
概括地說，用第一個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，利用一個(gè)第二個(gè)3’PCR引物和第二個(gè)5’PCR引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段。典型地，該第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它與在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，該第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(h)中一樣，x是從1到5的整數(shù)，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”+1插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且對(duì)于第一套亞庫中每一個(gè)亞庫在第二系列中有4x亞庫。
在另一實(shí)施例中，所用的引物是(a)同在載體中鄰接在載體中的cDNA樣品的插入位點(diǎn)的一個(gè)序列在序列上對(duì)應(yīng)的一個(gè)第二個(gè)3’PCR引物；(b)從由(i)用在第一個(gè)PCR反應(yīng)中進(jìn)行亞庫擴(kuò)增的第一個(gè)5’PCR引物；(ii)來源于第一鏈cDNA被用于通過一個(gè)附加的-N殘基在亞庫的3’末端延伸的第一個(gè)5’PCR引物；(iii)通過兩個(gè)附加的-N-N殘基被用于在亞庫3’-末端延伸的第一個(gè)5’PCR引物；(iv)通過三個(gè)附加的-N-N-N殘基被用于在亞庫3’末端延伸的第一個(gè)5’PCR引物；(v)通過四個(gè)附加的-N-N-N-N殘基被用于在亞庫3’末端延伸的第一個(gè)5’PCR引物，組成的小組中選擇的，在此N可以是A、C、G或T中任一個(gè)。
適合的3’PCR引物是從由G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(SEQ IDNO47)和G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G(SEQ ID NO48)組成的小組中篩選的。
在這里噬菌體特異的啟動(dòng)子是T3啟動(dòng)子，一個(gè)合適的5’-PCR引物是從由下面序列組成的小組中選擇的A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N(SEQ ID NO16)；A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N(SEQ ID NO17)；A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N(SEQ ID NO18)；G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO22)；G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N(SEQ ID NO23)；T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N(SEQ ID NO24)；C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N(SEQ ID NO25)；G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N(SEQ ID NO26)；A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N(SEQ ID NO16)；A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N(SEQ ID NO19)；及A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N(SEQ ID NO20)。
典型地，用一個(gè)PCR程序，PCR是在94℃變性15秒，50℃-65℃退火15秒，72℃合成30秒條件下，在一個(gè)適合的例如PTC-200(MJ Research)或Pekin-Elmer 9600(Pekin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)這樣的熱循環(huán)儀上進(jìn)行的。對(duì)于引物的特異核苷酸序列退火溫度被優(yōu)化了，所用原理對(duì)這一領(lǐng)域是公知的。高溫度退火步驟通過在它的3’末端的第一個(gè)5’-PCR引物能使人為錯(cuò)配最小化，同時(shí)促進(jìn)高度忠實(shí)的復(fù)制。
利用非放射性標(biāo)記的可優(yōu)選的實(shí)施例的檢測(cè)方法是可用的。對(duì)于非放射性檢測(cè)方法，優(yōu)選對(duì)于第二個(gè)PCR反應(yīng)的引物之一被共軛結(jié)合一個(gè)熒光標(biāo)記。一個(gè)合適的熒光標(biāo)記是從由下面組成的小組中選擇的。
螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，6-羧酸，3’，6’-二羥基-6-羧基熒光素(6-FAM，ABI)；螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，5-羧酸，3’，6’-二羥基-5-羧基熒光素(5-FAM，分子探針)；螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，3’，6’-二羥基熒光素(FAM，分子探針)；9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-二(二甲基氨基)-呫噸鎓(6-羧基四甲基若丹明(6-TAMRA)，分子探針)；3，6-二氨基-9-(2-羧基苯基)-呫噸鎓(若丹明綠TM，分子探針)；螺旋[異苯并呋喃-1(3H)，9’-呫噸]-6-羧酸，5’-二氯-3’，6’-二羥基-2’，7’-二甲氧基-3-氧代-(JOE，分子探針)；1H，5H，11H，15H-呫噸o[2，3，4-ij5，6，7-i’j’]二喹嗪-8-鎓，-(2，4-二硫苯)-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫一，內(nèi)鹽(Texas Red，分子探針)；6-((4-4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酰)氨基)己酸(BODIPY FL-X，分子探針)；6-((4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酰)氨基)-己酸(BODIPY TMR-X，分子探針)；6-(((4-(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯氧)乙酰)氨基)-己酸(BODIPY TR-X，分子探針)；4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-戊酸(BODIPY FL-C5，分子探針)；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY FL，分子探針)；4，4-二氟-5-苯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY581/591，分子探針)；4，4-二氟-5(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY 564/570，分子探針)；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；6-(((4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙?；?氨基己酸(BODIPY 630/650，分子探針)；6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙?；?氨基己酸(BODIPY 650/665，分子探針)；9-(2，4(或2，5)-二羧基苯基)-3，6-二(二甲氨基)-呫噸鎓，內(nèi)鹽(TAMRA，分子探針)；其它可適用的熒光標(biāo)記，包括4，7，2’，4’，5’，7’六氯-6-羧基熒光素(“HEX”，ABI)，和4，7，2’，7’四氯-6-羧基熒光素(“TET”，ABI)和“NED”(ABI)，其是這個(gè)領(lǐng)域公知的。
一個(gè)可優(yōu)選的PCR標(biāo)記是螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，6-羧酸，3’，6’-二羥基-6-羧基熒光素(6-FAM)。
在一個(gè)可選的實(shí)施例中，可用反射自顯影的檢測(cè)方法。在一個(gè)實(shí)施例中，PCR是在35S-dATP存在下進(jìn)行的?？蛇x擇地，PCR擴(kuò)增可在一個(gè)放射性核素標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸，例如[32P]dCTP或[33P]dCTP存在下進(jìn)行。然而，為了得到最大的分辨率，放射性自顯影檢測(cè)通常優(yōu)選用一個(gè)35S-標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸。
在一個(gè)可選的實(shí)施例中，用磁粒標(biāo)記的寡聚核苷酸檢測(cè)方法就如同在美國(guó)專利號(hào)5,656,429中所描述的一樣是可被應(yīng)用和檢測(cè)的，這個(gè)方法在此被引作參考。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在第一個(gè)或第二個(gè)5’PCR引物的3’末端的3個(gè)核苷酸通過硫代磷酸酯連接酶連接。參看Mullins，J.I.，de.Noronha，C.M，用3’-末端的硫代磷酸酯連接酶擴(kuò)增引物抗火山口聚合酶的降解，且可減少Taq聚合酶誤引導(dǎo)。PCR方法應(yīng)用1992 2(2)131-136；Ott，J.和Eckstein，F(xiàn)，保護(hù)寡聚核苷酸引物抗DNA聚合酶I降解。生物化學(xué)1987 26(25)8237-8241；Uhlmann，E.，Ryte，A.，和Peyman，A.部分硫代磷酸酯寡聚核苷酸抗核溶解降解的穩(wěn)定性機(jī)制研究。反意義核酸藥物進(jìn)展，1997 7(4)345-350；Schreiber，G.K，Koch，E.M.，和Neubert，W.J.通過硫代磷酸酯類似物的結(jié)合，體外合成的cDNA抗核酸酶的選擇性保護(hù)，核酸研究1985 13(21)7663-7672。
J.電泳聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的片段接著通過例如電泳的分離方法去顯示代表出現(xiàn)在樣品中的mRNAs的3’-末端的條帶，可被分辯出來。
分辨分析PCR擴(kuò)增片段的電泳技術(shù)在這個(gè)領(lǐng)域已被透徹地理解，在這里沒有必要進(jìn)一步詳細(xì)敘述。相對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物在變性DNA測(cè)序凝膠上被分辯分析，且通過誘導(dǎo)熒光的激光器是可見的。可選地，相對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物可用毛細(xì)管電泳分辯分析，且通過誘導(dǎo)熒光的激光器是可見的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，第二個(gè)PCR反應(yīng)的引物中有一個(gè)被共軛連上一個(gè)熒光標(biāo)記。一個(gè)合適的熒光標(biāo)記是從由下面組成小組中選擇的螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，6-羧酸，3’，6’-二羥基-6-羧基熒光素(6-FAM，ABI)；螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，5-羧酸，3’，6’-二羥基-5-羧基熒光素(5-FAM，分子探針)；
螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，3’，6’-二羥基熒光素(FAM，分子探針)；9-(2，5-二羧基苯)-3，6-二(二甲氨基)-呫噸鎓(6-羧基四甲基若丹明(6-TAMRA)，分子探針)；3，6-二氨基-9-(2-羧基苯)-呫噸鎓(若丹明綠TM，分子探針)；螺旋[異苯并呋喃-1(3H)，9’-呫噸]-6-羧酸，5’-二氯-3’，6’-二羥基-2’，7’-二甲氧基-3-氧代-(JOE，分子探針)；1H，5H，11H，15H-呫噸o[2，3，4-ij5，6，7-i’j’]二喹嗪-8-鎓，-(2，4-二硫苯)-2.3，6，7，12，13，16，17-八氫，內(nèi)鹽(Texas Red，分子探針)；6-((4-4-二氟-5，7---甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酰)氨基)己酸(BODIPX FL-X，分子探針)；6-((4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酰)氨基)-己酸(BODIPY TMR-X，分子探針)；6-(((4-(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯氧)乙酰)氨基)-己酸(BODIPY TR-X，分子探針)；4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-戊酸(BODIPY FL-C5，分子探針)；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY FL，分子探針)；4，4-二氟-5-苯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY581/591，分子探針)；4，4-二氟-5(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸(BODIPY 564/570，分子探針)；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；
6-(((4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙?；?氨基己酸(BODIPY 630/650，分子探針)；6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙?；?氨基己酸(BODIPY 650/665，分子探針)；9-(2，4(或2，5)-二羧基苯)-3，6-二(二甲氨基)-呫噸鎓，內(nèi)鹽(TAMRA，分子探針)。
其它可適用的熒光標(biāo)記，包括4，7，2’，4’，5’，7’六氯-6-羧基熒光素(“HEX”，ABI)，“NED”(ABI)和4，7，2’，7’四氯-6-羧基熒光素(“TET”，ABI)，其是這個(gè)領(lǐng)域公知的。
典型地，熒光被用于檢測(cè)可分辨分析的cDNA物種。然而，其它的檢測(cè)方法象磷光體成像或放射自顯影或磁檢測(cè)也是可用的。
根據(jù)方案，從每個(gè)mRNA樣品中產(chǎn)生的cDNA文庫中含有，在起始的RNA樣品中幾乎所有的poly(A)+mRNAs的從最遠(yuǎn)側(cè)的MspI位點(diǎn)到poly(A)尾巴開始的3’-最遠(yuǎn)末端拷貝，它和起始的mRNAs的相對(duì)濃度幾乎是相對(duì)應(yīng)的。因?yàn)槊總€(gè)物種插入序列兩個(gè)末端都是被序列所精確的限定，所以對(duì)于每一個(gè)物種來說，它們的長(zhǎng)度是一致的，這使得它們?cè)谀z上有一個(gè)具體的可見的條帶，而不管mRNA的組織來源如何。
典型地，電泳后顯示的產(chǎn)物強(qiáng)度大約同相對(duì)應(yīng)于原始混合物中的產(chǎn)物的mRNAs的豐度成比例。
典型地，本方法進(jìn)一步包括電泳后通過產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)于mRNA的強(qiáng)度確定在原始混合物中每個(gè)mRNA的相對(duì)豐度的一個(gè)步驟。
II.本方法對(duì)mRNA顯示的應(yīng)用模式上述描述的本方法通過凝膠電泳進(jìn)行組織中mRNA表達(dá)模式的檢測(cè)及這些模式的分析有大量的應(yīng)用。這些應(yīng)用中的一個(gè)是檢測(cè)在組織中mRNA表達(dá)模式的變化和生理學(xué)或病理學(xué)變化的關(guān)系的應(yīng)用。
概括說，本方法包括(1)獲得沒有受到生理學(xué)或病理學(xué)變化一個(gè)第一個(gè)組織的樣品；(2)如上所述，通過進(jìn)行和代表一個(gè)mRNAs庫的3’-末端的一個(gè)反意義cRNA庫的成員相對(duì)應(yīng)的mRMAs的同步序列特異鑒定的方法，確定在組織的第一個(gè)樣品中mRNA表達(dá)模式，產(chǎn)生代表出現(xiàn)在第一個(gè)樣品中mRNA的3’-末端的第一個(gè)條帶的顯示；(3)獲得受到生理學(xué)或病理學(xué)變化的一個(gè)第二個(gè)組織的樣品；(4)如上所述，通過進(jìn)行和代表一個(gè)mRNAs庫的3-末端的一個(gè)反意義cRNA庫的成員相對(duì)應(yīng)的mRMAs的同步序列特異鑒定的方法確定在組織的第二個(gè)樣品中mRNA表達(dá)模式，產(chǎn)生代表出現(xiàn)在第二個(gè)樣品中mRNA的3’-末端的第一個(gè)條帶的顯示；(5)比較第一和第二個(gè)顯示，確定生理學(xué)或病理學(xué)上變化對(duì)組織中mRNA表達(dá)模式的影響。
典型地，比較是在一個(gè)單一凝膠的鄰接的泳道中進(jìn)行的。
典型地，包括通過序列特異產(chǎn)物的顯示的定量產(chǎn)生數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫，用一個(gè)適合的計(jì)算機(jī)軟、硬件構(gòu)建和維持。更優(yōu)選地，這樣的數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步包括關(guān)于序列相關(guān)、基因圖譜和細(xì)胞分布的數(shù)據(jù)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，長(zhǎng)度和至少PCR產(chǎn)物的核苷酸序列的部分同來源于核苷酸序列的一個(gè)數(shù)據(jù)庫確定的預(yù)測(cè)的數(shù)值相比較。
組織可以是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其，它可以來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其是視網(wǎng)膜、小腦皮層、嗅覺泡、丘腦、下丘腦、前垂體、后垂體、海馬(hippocampus)、伏隔核、扁桃體、紋狀體、小腦、腦干、交叉上核或脊柱索。當(dāng)組織來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，生理學(xué)或病理學(xué)的變化可以是下列老年性癡呆、帕金森神經(jīng)功能障礙、局部缺血、嗜酒、吸毒成癮、精神分裂癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、多重硬化、抑郁癥、雙極躁狂抑郁障礙中的任一個(gè)?？蛇x地，本發(fā)明的方法可被用于研究生理節(jié)奏變化、老化及長(zhǎng)期強(qiáng)化，后者影響同海馬?？蛇x地，尤其是與出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定結(jié)構(gòu)有關(guān)的mRNA物種，本方法能被用于研究己知的參與復(fù)雜行為的大腦區(qū)域，例如學(xué)習(xí)、記憶、情緒、吸毒成癮、谷氨酸脫氫酶神經(jīng)中毒，進(jìn)食行為、嗅覺、病毒感染、視覺和活動(dòng)障礙。
本方法通過比較藥物或毒素配給前后一個(gè)組織中mRNA模式可以被用于研究藥物和/或毒素配給的結(jié)果。電休克治療法的結(jié)果也能被研究。
可選擇地，組織來源于一個(gè)組織或器官的系統(tǒng)包括心血管系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎或骨骼肌和生殖系統(tǒng)或來源于身體的任何其它器官或器官系統(tǒng)。例如，mRNA模式能被用于研究來源于肝、心、腎或骨骼肌。此外，對(duì)于任何組織，樣品能在各個(gè)時(shí)間提取以便發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)的生理節(jié)奏的影響。這樣，本方法可歸因于特定的mRNA物種參與了特定的功能或功能障礙模式。
更優(yōu)選地，正?；蛄鲂纬傻慕M織包括從由心血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、體被(包括皮膚、頭發(fā)和指甲)、骨骼系統(tǒng)(包括骨骼和肌肉)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)組成的小組中的篩選的一個(gè)器官或器官組織提取或衍生的細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，由細(xì)胞組成的正常的或瘤形成的組織包括由從上皮、內(nèi)皮、粘膜、腺體、血液、淋巴、連接組織、軟骨、骨、平滑肌、骨骼肌、心肌、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脾、胸腺、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、松果體、皮膚、頭發(fā)、指甲、牙齒、肝、胰腺肺、腎、膀胱、輸尿管、乳腺、卵巢、子宮、陰道、睪丸、前列腺、陰莖、眼和耳朵組成的小組中篩選的一個(gè)器官或器官組織提取或衍生的細(xì)胞。
相似地，本發(fā)明的mRNA分析方法能被用做篩選藥物副作用方法的一部分，總的來說，這樣方法包括(1)從用已知生理學(xué)功能的化合物處理的有機(jī)體獲得組織的第一份樣品；(2)如上所述，通過進(jìn)行和代表一個(gè)mRNAs庫的3’-末端的一個(gè)反意義cRNA庫的成員相對(duì)應(yīng)的mRMAs的同步序列特異鑒定的方法確定在組織的第一個(gè)樣品中mRNA表達(dá)模式，產(chǎn)生代表出現(xiàn)在第一個(gè)樣品中mRNA的3’-末端的第一個(gè)條帶的顯示；(3)從用被篩選副作用的藥物處理的有機(jī)體獲得組織的第二份樣品；(4)如上所述，通過進(jìn)行和代表一個(gè)mRNAs庫3’-末端的一個(gè)反意義cRNA庫的成員相對(duì)應(yīng)的mRMAs的同步序列特異鑒定的方法確定在組織的第二個(gè)樣品中mRNA表達(dá)模式，產(chǎn)生代表出現(xiàn)在第二個(gè)樣品中mRNA的3’-末端的第二個(gè)條帶的顯示；(5)比較第一個(gè)和第二個(gè)顯示，以便檢測(cè)mRNA物種的存在，mRNA的表達(dá)不受已知化合物的影響，而是受被篩選的藥物的影響，因此，表明篩選的藥物和已知化合物的作用的差別，因而有副作用。
尤其是，本方法能被用于影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，例如由抗抑郁藥、精神抑制藥、安定藥、抗驚厥藥、單胺氧化酶抑制劑、興奮劑。然而，這個(gè)方法在實(shí)際中可以被用于影響在一個(gè)特定的組織中mRNA表達(dá)的任一藥物的篩選。例如可以研究抗帕金森劑、骨骼肌弛緩藥、止痛藥、局部麻醉、膽堿能藥、抗痙攣、類固醇和非類固醇類抗發(fā)炎藥物、抗病毒劑、或任何其它具有影響mRNA表達(dá)的藥物對(duì)mRNA表達(dá)的影響，且確定在一個(gè)特定組織或結(jié)構(gòu)中的影響。
本發(fā)明方法的進(jìn)一步應(yīng)用是獲得被顯示的mRNA物種的3’-末端的序列。概括說，獲得序列的方法包括以下步驟(1)從電泳圖譜中洗脫至少一個(gè)和一個(gè)mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA，在該電泳圖譜中代表出現(xiàn)在樣品中的mRNA的3’-末端的條帶被顯示；(2)在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，擴(kuò)增被洗脫的cDNA；(3)克隆擴(kuò)增的cDNA進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒；(4)從質(zhì)粒中產(chǎn)生和克隆的DNA對(duì)應(yīng)的DNA；以及(5)測(cè)序克隆的cDNA。
用前面用在第二個(gè)PCR步驟中的引物擴(kuò)增已被剪切的cDNA。該cDNA接著通過TA克隆和連接進(jìn)入載體而被克隆進(jìn)pCRII(Invitrogen，SanDiego，CA)。接著從亞克隆中用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)小量制備DNA，而且部分被變性和分成兩個(gè)等份，通過Sanger的雙脫氧鏈末端方法進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序?？捎美鏏BI測(cè)序儀這樣已商品化的適用的測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。這將允許長(zhǎng)度范圍在50-500bp的研究的大多數(shù)cDNA互補(bǔ)序列的測(cè)定。接著用合適的計(jì)算機(jī)配置，這些部分序列可被用于掃描例如GenBank的核苷酸數(shù)據(jù)堿基，用例如BLASTN和BLASTX這樣的比較和分析程序識(shí)別序列的身份和相似性。因?yàn)檫@個(gè)方法產(chǎn)生僅來源于mRNA的3’末端的序列，期望開放閱讀框架(ORFs)僅偶而被遇到。例如，腦的3’-未翻譯區(qū)平均長(zhǎng)度長(zhǎng)于1300個(gè)核苷酸(J.G.Sutcliffe，1988，supra)。通過標(biāo)簽蛋白基序(signature protein motif)，潛在的開放閱讀框架(ORFs)能被檢測(cè)到。
獲得的cDNA序列接著被設(shè)計(jì)引物對(duì)進(jìn)行半定量PCR以確認(rèn)組織表達(dá)模式。被選擇的產(chǎn)物能被用于分離全長(zhǎng)cDNA克隆以便進(jìn)行進(jìn)一步分析。引物對(duì)能被用于基因組DNA的SSCP-PCR(單鏈形成多態(tài)性-PCR)擴(kuò)增。例如，通過一組內(nèi)部特異回交的鼠確定每一個(gè)PCR產(chǎn)物和已連接的標(biāo)記的連接。這可以產(chǎn)生新的基因的圖譜及可以作為鑒定已有圖譜的鼠的突變位點(diǎn)和同源的人的疾病基因的資源。SSCP-PCR用合成的寡聚核苷酸引物，通過PCR擴(kuò)增一個(gè)小的片段(100-200bp)(M.Orita等，“通過凝膠電泳作為單鏈形成多樣性的人DNA多態(tài)性的檢測(cè)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766-2770(1989)；(M.Orita等，“用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速和靈敏地進(jìn)行在DNA多態(tài)性點(diǎn)突變的檢測(cè)”，Genomics5874-879(1989))。
被剪切的cDNA片段可以用這個(gè)領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行放射性標(biāo)記，以便于用探針進(jìn)行一個(gè)諾慎(northern)印跡或原位雜交(in situ)來證實(shí)mRNA分布和了解相對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)mRNA的尺寸和優(yōu)勢(shì)。探針能被用于篩選一個(gè)cDNA文庫以分離克隆進(jìn)行更可靠和更完整的序列的確定。被標(biāo)記的探針也能被用于任何其它的目的，例如研究在體外的表達(dá)。
III.專門的小組和簡(jiǎn)并引物混合物本發(fā)明的另一方面是適合本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用的專門小組的引物和簡(jiǎn)并引物混合物，這些包括(1)含有序列A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N(SEQ ID NO16)16個(gè)引物的一專門小組的引物，在此N是4個(gè)脫氧核糖核苷酸A、C、G或T中的一個(gè)；(2)含有序列A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N(SEQ IDNO17)64個(gè)引物的一專門小組的引物；(3)含有序列A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N(SEQ IDNO18)256個(gè)引物的一專門小組的引物；(4)含有序列A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N(SEQID NO19)1024個(gè)引物的一專門小組的引物；(5)含有序列 A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N(SEQ ID NO20)4096個(gè)引物的一專門小組的引物；
(6)含有序列A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO3)3個(gè)引物的一專門小組的引物；(7)含有序列A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO4)12個(gè)引物的一專門小組的引物，在此V是從A、C和G組成的小組中選擇的1個(gè)脫氧核糖核苷酸；(8)含有序列A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO5)48個(gè)引物的一專門小組的引物；(9)含有序列G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO6)3個(gè)引物的一專門小組的引物；(10)含有序列G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO7)12個(gè)引物的一專門小組的引物；(11)含有序列G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ IDNO8)48個(gè)引物的一專門小組的引物；(12)含有4個(gè)不同的寡聚核苷酸，每個(gè)有序列G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO22)的一專門小組的引物；(13)含有16個(gè)不同的寡聚核苷酸，每個(gè)有序列G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N(SEQ ID NO23)的一專門小組的引物；
(14)含有64個(gè)不同的寡聚核苷酸，每個(gè)有序列T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N(SEQ ID NO24)的一專門小組的引物；(15)含有256個(gè)不同的寡聚核苷酸，每個(gè)有序列C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N(SEQ ID NO25)的一專門小組的引物；(16)含有1024個(gè)不同的寡聚核苷酸，每個(gè)有序列G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N(SEQ ID NO26)的一專門小組的引物；(17)含有4096個(gè)不同的寡聚核苷酸，每個(gè)有序列A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N(SEQ ID NO27)的一專門小組的引物；(18)包含具有序列A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G--C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO2)的3個(gè)引物的混合物的一簡(jiǎn)并引物混合物，3個(gè)引物中的每一個(gè)以等摩爾的量出現(xiàn)；(19)包含具有序列A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ IDNO4)的12個(gè)引物的混合物的一簡(jiǎn)并引物混合物，12個(gè)引物中的每一個(gè)以等摩爾的量出現(xiàn)；(20)包含具有序列A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO5)的48個(gè)引物的混合物的一簡(jiǎn)并引物混合物，48個(gè)引物中的每一個(gè)以等摩爾的量出現(xiàn)；(21)包含具有序列G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ IDNO6)的3個(gè)引物的混合物的一簡(jiǎn)并引物混合物，3個(gè)引物中的每一個(gè)以等摩爾的量出現(xiàn)；(22)包含具有序列G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQID NO7)的12個(gè)引物的混合物的一簡(jiǎn)并引物混合物，12個(gè)引物中的每一個(gè)以等摩爾的量出現(xiàn)；(23)包含具有序列G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO8)的48個(gè)引物混合物的一簡(jiǎn)并引物混合物，48個(gè)引物中的每一個(gè)以等摩爾的量出現(xiàn)。
IV.優(yōu)越性具體體現(xiàn)的特定的實(shí)施例子實(shí)施例1改進(jìn)方法的應(yīng)用本發(fā)明的改進(jìn)方法是基于幾乎所有含有poly(A)尾巴的真核生物mRNAs的觀察的基礎(chǔ)上的，但不同于差異顯示(Liang，P和A.B.Pardee(1992)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法真核生物信使RNA的差異顯示，Science 257967-971)，本發(fā)明的方法用引物僅結(jié)合尾巴的特異性在每一個(gè)mRNA上固定一個(gè)位點(diǎn)，不必再把mRNAs分成亞庫。改進(jìn)的方法在圖1、圖2和圖8的三個(gè)實(shí)施例中被證明了。
概括說，雙鏈cDNA是從豐富poly(A)細(xì)胞質(zhì)mRNA中產(chǎn)生的，而mRNA是用一套起始反轉(zhuǎn)錄的所有的48個(gè)5’-生物素的錨定引物一個(gè)等摩爾的混合物，從目的組織的樣品提取的(Gubler，U.和B.Hoffman(1983)一個(gè)簡(jiǎn)單但非常有效的產(chǎn)生cDNA文庫的方法，Gene 25263-269)(Schibler，K.，M.Tosi，A.C.Pittet，L.Fabiani和P.K.Wellauer(1980)鼠的淀粉酶基因的組織特異性的表達(dá)，J.Mol.Biol.14293-116)。這樣適合的一套引物是A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO5)，在這里V是A、C或G，N是A、C、G或T。這48個(gè)錨定引物混合物的一個(gè)成員起始在樣品中每個(gè)mRNA物種所有拷貝的在3’末端一個(gè)固定的位置的合成，因此，界定每一個(gè)物種的3’末端的點(diǎn)，產(chǎn)生了生物素雙鏈cDNA。
用能識(shí)別序列CCGG限制性內(nèi)切酶MspI切割每個(gè)生物素(?；?雙鏈cDNA樣品。接著在抗生蛋白鏈霉素包被的底物上，通過生物素(酰基)cDNA的捕獲來分離cDNA的3’片段。合適的包被抗生蛋白鏈霉素的底物包括微量滴定板、PCR管、聚苯乙烯珠、順磁的聚合物珠和順磁的多孔玻璃顆粒。一個(gè)優(yōu)選的包被抗生蛋白鏈霉素底物是順磁聚合物珠的懸浮液(Dynal，Inc，Lake Success，NY)。
洗滌包被抗生蛋白鏈霉素的底物和捕獲生物素(酰基)的cDNA片段后，通過NotI消化釋放cDNA片段產(chǎn)物，NotI在錨定引物中的一個(gè)8-核苷酸序列處切割，但很少在cDNAs的來源于mRNA部分切割。3’MspI-NotI片段對(duì)于每個(gè)mRNA物種具有一致長(zhǎng)度，以相對(duì)于載體T3啟動(dòng)子反意義方向直接被連接進(jìn)入用ClaI-、NotI-切割的質(zhì)粒pBC SK+(Stratagene，LaJolla，CA)，且產(chǎn)物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)SURE細(xì)胞(Stratagene)。連接反應(yīng)再生NotI位點(diǎn)，但沒有MspI位點(diǎn)。含有超過5×105重組體，確保所有mRNAs的3’末端有0.001％或更多的可能性的每個(gè)文庫，被多次描述。從每個(gè)樣品的cDNA文庫中進(jìn)行質(zhì)粒的制備正在研究中。
用MspI消化每個(gè)文庫的一等份，MspI通過在親本載體內(nèi)幾個(gè)位點(diǎn)切割并同時(shí)留下完整的3’cDNA插入序列和它的側(cè)翼序列，包括T3啟動(dòng)子，來實(shí)現(xiàn)線性化。產(chǎn)物和T3 RNA聚合酶(MEGAscript Kit，Ambion)溫育產(chǎn)生含有公知的載體序列，但刪除了來源于原始cDNAs的MspI和NotI位點(diǎn)的克隆插入片段的反意義cRNA轉(zhuǎn)錄。
這一步避免來源于無插入質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的不同程度的污染，因?yàn)閷?duì)引物的不同競(jìng)爭(zhēng)，無插入質(zhì)粒將導(dǎo)致不同樣品以后的PCRs的效率的變化。然而，親本載體的多連接區(qū)域ClaI和NotI位點(diǎn)間有一個(gè)MspI位點(diǎn)，因此，MspI消化步驟排除了來源于無插入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄cRNAs的5’標(biāo)簽，使得它們?cè)谙率龅漠a(chǎn)物擴(kuò)增步驟中插入。通過和無DNase的RNase溫育，質(zhì)粒DNA從反意cRNA轉(zhuǎn)錄混合物中被除去。
在這個(gè)階段，每一個(gè)cRNA的制備以一個(gè)三步方式進(jìn)行。在第一步，用5’RT引物(在圖1、2和8中的5PPIMER)A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G(SEQ ID NO14)將250ng的cRNA轉(zhuǎn)換成第一鏈cDNA。在第二步400pg的cDNA產(chǎn)物用做PCR模板，用G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO22)形式的4個(gè)5’PCR引物中每一個(gè)和一個(gè)通用的3’PCR引物G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(SEQ ID NO47)配對(duì)，在四個(gè)分離的反應(yīng)中，用如下程序94℃、15秒；65℃、15秒；72℃、60秒20個(gè)循環(huán)。
在第三步中，每個(gè)亞庫的產(chǎn)物進(jìn)一步被分成64個(gè)亞亞庫(20μl中2ng)，用100ng熒光標(biāo)記的“通用”3’PCR引物，寡聚核酸G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(SEQ ID NO47)被共軛連接到6-FAM和合適形式為C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N(SEQ ID NO25)的5’-PCR引物上，進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)。用如下程序94℃、15秒；
X℃、15秒；72℃、30秒30個(gè)循環(huán)。
這包括退火步驟，它的溫度X稍高于每個(gè)5’PCR引物的Tm，使人為錯(cuò)配引物最小化，同時(shí)提高高度忠實(shí)性復(fù)制。每個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟是在TaqStart抗體(Clonetech)存在下進(jìn)行的。
對(duì)于每個(gè)組織樣品中來源于最后聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟的產(chǎn)物，用自動(dòng)ABI Prizm 377測(cè)序儀在一系列變性DNA測(cè)序凝膠上分析。用基因掃描軟件包(ABI)收集數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)化振幅和遷移。對(duì)于N15’PCR引物建立的4個(gè)亞庫中的每一個(gè)進(jìn)行這一系列完整反應(yīng)產(chǎn)生64個(gè)產(chǎn)物亞庫，對(duì)于完全的N45’PCR引物組進(jìn)行這一系列完整反應(yīng)產(chǎn)生總共256個(gè)產(chǎn)物亞庫。
概括說，在這個(gè)改進(jìn)方法的實(shí)施例中(圖2)，用5PRIMER(SEQ ID NO14)形式的非簡(jiǎn)約引物5’RT引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶從cRNA中產(chǎn)生一個(gè)cDNA亞庫，用5’PCR引物5PRIMERN1(SEQ ID NO11)作為5’-PCR引物和3’-PCR引物(SEQ ID NO47)，利用Taq DNA聚合酶在PCR中(20個(gè)循環(huán))產(chǎn)生雙鏈的cDNA亞庫。最后一個(gè)PCR用2ng DNA模板和每個(gè)5PRIMER3N1N2N3N4引物(SEQ ID NO25)和共軛連到6-FAM上的3’PCR引物各100ng進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
分析來源于饑餓血清(Serum-starved)(圖3，專門小組A)和添加血清(圖3，專門小組B)人的MG63骨肉瘤病細(xì)胞的2個(gè)mRNA樣品。用一個(gè)5’-PCR引物(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T-G，SEQ ID NO42)和在5’-末端標(biāo)記有6-羧基熒光素(6FAM，ABI)的“通用”3’引物(SEQID NO47)配對(duì)產(chǎn)生了顯示的數(shù)據(jù)。在4.5％丙烯酰胺凝膠上的凝膠電泳PCR產(chǎn)物被分析分離，而且在ABI377自動(dòng)測(cè)序儀上獲得熒光數(shù)據(jù)。用基因掃描軟件包(Perkin-Elmer)分析數(shù)據(jù)。在上面所顯示的3個(gè)專門小組中，標(biāo)記PCR產(chǎn)物的相對(duì)豐度對(duì)產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度被繪成圖(Y-軸＝相對(duì)熒光素單位)。本方法的高度重復(fù)性被顯示在下面專門小組中，它表明用基因掃描軟件包在樣品之間進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平的比較來源于重疊專門小組(A)和(B)的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的主要應(yīng)用是比較兩個(gè)或多個(gè)組織樣品mRNA表達(dá)輪廓。我們比較了對(duì)于產(chǎn)生產(chǎn)物的專門小組血清饑餓/添加實(shí)驗(yàn)的影響。來源于共移動(dòng)樣品對(duì)的產(chǎn)物大多數(shù)具有可比較的幅度。產(chǎn)物不到10％有通過兩個(gè)或更多個(gè)因子差異的幅度，而且這些在通過添加血清誘導(dǎo)的物種和那些被添加阻遏的物種之間幾乎是同等分布的。
許多產(chǎn)物，它們中一些在兩個(gè)專門小組中被不同地代表，在位置上的移動(dòng)和基于從GenBank中提取的預(yù)測(cè)的DSTs相吻合，這樣就產(chǎn)生了一個(gè)候選的身份。為了檢測(cè)這些候選的身份，合成和5PRIMER3N1N2N3N4(SEQ IDNO25)對(duì)應(yīng)的寡聚核苷酸，用來源于在GenBank序列中鄰接末端MspI位點(diǎn)的序列的14個(gè)附加的核苷酸在3’末端延伸。用N1cDNA作底物，這些和熒光的3PRIMER(SEQ ID NO47)在PCRs中配對(duì)。
實(shí)施例2用一個(gè)PCR步驟或兩個(gè)PCR步驟PCR產(chǎn)物分析，在本方法具體體現(xiàn)中簡(jiǎn)約的特異性包括兩個(gè)PCR步驟的基本方法的具體體現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)利用饑餓血清和添加血清MG63細(xì)胞被證明了。對(duì)于基本方法(圖1，圖2)的兩個(gè)PCR步驟的變異來說，用一個(gè)非簡(jiǎn)約的形式為5PRIMER的引物(SEQ ID NO14)，利用反轉(zhuǎn)錄酶從cRNA中產(chǎn)生一個(gè)cDNA庫；用5PRIMER1(SEQ ID NO22)作為5’-引物和3’引物(SEQ ID NO47)，在PCR中利用Taq DNA聚合酶產(chǎn)生雙鏈cDNA亞庫。在第一個(gè)PCR步驟的修改中，用形式為5PRIMERN1(SEQ ID NO22)的4個(gè)N1引物中的一個(gè)通過起始轉(zhuǎn)錄，利用反轉(zhuǎn)錄酶從cRNA產(chǎn)生4個(gè)cDNA亞庫。在兩個(gè)方法中，最后PCR用2ngDNA模板，5，PCR引物(SEQ ID NO25)和標(biāo)記6-FAM的3’PCR引物(SEQ ID NO47)各100ng進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
標(biāo)記的PCR片段在自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABI377)上通過電泳方法用基因掃描軟件包進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示。來源于引物109T(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-T-G-C-A，SEO ID NO43)和45A(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-A-G-C-A，SEO ID NO44)的數(shù)據(jù)僅在N1位置(粗體)不同，已被饑餓血清(圖4A、4C、4E和4G)和添加血清的樣品(圖4B、4D、4F和4H)所證明。
用109T的和45A產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物看起來幾乎同一個(gè)PCR步驟的修改產(chǎn)生的模板是相同的(比較圖4A和圖4C，圖4B和圖4D)。相對(duì)照，來源于用兩個(gè)PCR步驟方法產(chǎn)生的模板的后繼PCR檢測(cè)的產(chǎn)物是完全不同的(比較圖4E和圖4G，圖4F和圖4H)，因此，本方法體現(xiàn)的兩個(gè)PCR步驟對(duì)于以前適用的方法提供了實(shí)質(zhì)性改進(jìn)。
實(shí)施例3用一個(gè)PCR步驟或兩個(gè)PCR步驟在本方法具體體現(xiàn)中簡(jiǎn)約的特異性克隆和測(cè)序數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的方法用或一個(gè)PCR步驟(表I)或兩個(gè)PCR步驟(表II)的具體體現(xiàn)在饑餓血清和處理血清MG63細(xì)胞上進(jìn)行。在表I所顯示的實(shí)驗(yàn)中，用那套4個(gè)N1 5’PCR引物(SEQ ID NO22)的一個(gè)，通過起始轉(zhuǎn)錄，利用反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生來源于cRNA的4個(gè)cDNA亞庫。對(duì)于表II，用一個(gè)非簡(jiǎn)約性的5’RT引物(SEQ ID NO14)用反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生來源于一個(gè)cRNA亞庫的一個(gè)cDNA。用5’PCR引物(SEQ ID NO22)和3’PCR引物(SEQ ID NO47)，利用Taq DNA聚合酶在PCR(20個(gè)循環(huán))中產(chǎn)生雙鏈cDNA亞庫。最后PCR在表I和表II中，用2ng輸入cDNA模板，全部的256 5’-PCR(SEQ ID NO25)引物系列和6FAM標(biāo)記的3’-PCR引物(SEQ ID NO47)配對(duì)，同樣被進(jìn)行。從PCR反應(yīng)顯示中，不同地被調(diào)節(jié)的分子為了克隆和測(cè)序的目的被鑒定和分離。
在隨后的數(shù)據(jù)搜索中用BLAST算法確定克隆和基因鑒定，獲得DNA序列數(shù)據(jù)。在表中，通過基因名字和GenBank位置身份，列出了發(fā)現(xiàn)和已知的人類基因精確匹配的克隆。通過把在N1位置相對(duì)于GenBank序列克隆匹配的序列制成表評(píng)估在反轉(zhuǎn)錄(表I)或PCR反應(yīng)(表II)中用5PRIMERN1(SEQ ID NO22)簡(jiǎn)約步驟的忠實(shí)性。在兩步方法中，5/22克隆在N1位置(實(shí)際上是隨機(jī)的)上正確匹配，而在三步程序中，所有的克隆被發(fā)現(xiàn)和相對(duì)應(yīng)GenBank序列的數(shù)據(jù)正確匹配。
表I一個(gè)PCR步驟的簡(jiǎn)約特異性(P65)基因名字GenBank位置身份N1位置匹配NmaCDE1結(jié)合蛋白層粘連蛋白受體同系物U1 snRNP-特異的C蛋白泛素MAD-3α-微管蛋白Id1NNMTBFGFSC35核糖體蛋白S14核糖體蛋白L30Na/K ATPase B3核糖體蛋白L37AIRF-2SRp20乙二醛酶IIpim-1癌基因內(nèi)皮素-1金屬硫蛋白IICRP3同系物表II兩個(gè)PCR步驟的簡(jiǎn)約特異性(P66)基因名字GenBank位置身份N1位置匹配MAD-3Id1Na/K ATPase B3pim-1癌基因內(nèi)皮素-1核糖體蛋白S20核糖體蛋白S10GADD45AP-2β-2-微球蛋白R(shí)DC-156K自動(dòng)抗原NFKB1Lon蛋白酶樣蛋白核苷酸結(jié)合蛋白胰島瘤基因組蛋白2A.2注意用黑體突出顯示的5個(gè)基因產(chǎn)物，MAD-3、Idl、Na/KATPase B3、Pim-1癌基因和內(nèi)皮素-1在兩個(gè)實(shí)險(xiǎn)中被分離，而且兩個(gè)PCR步驟方法的每一種情況在N1位置產(chǎn)生了一個(gè)匹配，而一個(gè)PCR步驟方法沒有這樣匹配。因此兩個(gè)PCR步驟對(duì)于以前適用的方法提供了一個(gè)實(shí)質(zhì)性改進(jìn)。
實(shí)施例4用一生物素(?；?錨定引物獲得的改進(jìn)結(jié)果如上面所提到的，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，錨定引物在5’末端(比較圖1和圖2)被生物素(酰基)化。生物素(?；?的cDNA片段可以用一個(gè)包被抗生蛋白鏈霉素底物捕獲，優(yōu)選的是包被抗生蛋白鏈霉素的順磁珠(Dynal)。圖5比較了用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的結(jié)果和用磁珠錨定引物標(biāo)記獲得的方法。
用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(如圖1所示)和磁珠的可選擇的實(shí)施例(見圖2)，在一系列的時(shí)間間隔(0、0.75、7小時(shí)、10和14天)提取來源于氟哌啶醇處理過的鼠，紋狀體的5個(gè)分離樣品的2gmRNA等分部分，構(gòu)建cDNA文庫。結(jié)果如圖5A-E(標(biāo)準(zhǔn))和5F-J(磁珠)所示。來源于5’PCR引物170G(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T，SEQ ID NO45)和標(biāo)記6-FAM的3’PCR引物(SEQ ID NO47)的兩種情況進(jìn)行比較的結(jié)果被顯示。標(biāo)記PCR產(chǎn)物的相對(duì)的豐度對(duì)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度(堿基對(duì))被繪圖(Y軸是任意的熒光單位)。來源于磁珠文庫(圖5F-J)的數(shù)據(jù)和來源于標(biāo)準(zhǔn)文庫(圖5A-E)的數(shù)據(jù)比較，在一系列的時(shí)間間隔下(都有片段的相似性和強(qiáng)度數(shù)值的一致性)及在樣品間，具有更大復(fù)制性和少的明顯的假的短(100-125)片段。
實(shí)施例5在三步方法中線性的證明PCR產(chǎn)物的峰高和輸入的cDNA濃度的相關(guān)性為了確定線性擴(kuò)增的范圍，一個(gè)單一的cRNA物種被分成4個(gè)獨(dú)立的cRNA亞庫，而且用本發(fā)明的如圖2所示方法進(jìn)行處理。結(jié)果如圖6所示。相對(duì)應(yīng)合成的RNA的峰高(以相對(duì)的熒光單位)測(cè)量，同時(shí)對(duì)輸入的4個(gè)樣品的濃度進(jìn)行繪圖。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)樣品3次重復(fù)的平均值。錯(cuò)誤杠表示±一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)平均值的錯(cuò)誤。
一個(gè)SalI-NotI cDNA片段(SEQ ID NO51)被克隆進(jìn)載體pBC SK+，通過從T3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cRNA和線性化、合成的cRNA被構(gòu)建產(chǎn)生一個(gè)在PCR中已知長(zhǎng)度(492bp)的峰。用N0引物(SEQ ID NO14)在反轉(zhuǎn)錄前，改變cRNA的量(0，25，100或250pg)被引入一個(gè)250ng的cDNA庫中。用400pg的cDNA作為模板，分別用5’PCR引物(SEQ ID NO22)和3’PCR引物(SEQ ID NO47)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用5’PCR引物221C(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-C-T-C-A，SEQ ID NO46)和3’PCR引物(SEQ ID NO47)在最后的一個(gè)PCR反應(yīng)中用2ng等份的cDNA。在圖6所描述的結(jié)果證明了對(duì)于一個(gè)給定的組織類型，PCR產(chǎn)物的峰高和是和輸入的RNA濃度成比例的。
前述意在圖解例證本發(fā)明，但不受此限制。在不和本發(fā)明的真正的精神和范圍背離的情況下，本發(fā)明的大量的變化和修改可能是有效的。
序列表<110>Hasel，Karl W.
Hilbush，Brian S.<120>Method For Indexing And DeterminingThe Relative Concentration of Expressed Messenger RNA<130>98，429-A<140><141>1999-10-14<150>US09/186,869<151>1998-11-04<160>51<170>PatentIn Vet. 2.0<210>1<211>14<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencesyntheticprimer<400>1aactggaaga attc 14<210>2<211>14<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencesyntheticprimer<400>2gaattcaact ggaa 14<210>3<211>46<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencesyntheticprimer<400>3aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttv46<210>4<211>47<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencesyntheticprimer<400>4aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttvn 47<210>5<211>48<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Description of Artificial Sequencesyntheticprimer<400>5aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttvnn 48<210>6<211>47<212>DNA<213>Artificial 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1.一種在一個(gè)mRNA庫中進(jìn)行mRNAs的同步序列特異的鑒定的改進(jìn)方法，其包括以下的步驟(a)用一個(gè)混合的錨定引物從一個(gè)mRNA庫中制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，每一個(gè)錨定引物含有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，且其包括(i)7-40T殘基的一段序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，該第一個(gè)填充片段被定位朝向于與被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段，其插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和T殘基的序列之間；和(v)從由-V、-V-N和-V-N-N組成的小組中選擇的每個(gè)錨定引物相變殘基被定位在3’-末端，其中V是從由A、C和G組成小組中篩選的脫氧核糖核苷酸；N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能；(b)用第一個(gè)限性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，該第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，形成了一個(gè)分別有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫；(c)來源于步驟(b)的每個(gè)雙鏈cDNA分子在一個(gè)方向被插入進(jìn)一個(gè)載體，其對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是反意義的，在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義鏈的5’末端和有意義鏈的3’末端的5’、3’側(cè)翼載體的序列，而且所述的有一個(gè)3’側(cè)翼載體序列的構(gòu)建至少在所述的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度；(d)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生含有克隆插入的載體；(e)用至少一種或不能識(shí)別插入的cDNA分子，或不能識(shí)別噬菌體特異的啟動(dòng)子序列，但能識(shí)別載體上序列的限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷，這樣產(chǎn)生的線性片段有一個(gè)至少在載體5’到雙鏈cDNA分子第二個(gè)末端的15個(gè)核苷酸的5’側(cè)翼載體序列；(f)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從噬菌體特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的噬菌體特異的RNA聚合酶，產(chǎn)生了反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備；(g)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶，和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)且包括由和5’側(cè)翼體序列互補(bǔ)的核苷酸序列的5’反轉(zhuǎn)錄引物，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA；(h)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物，第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’PCR引物是15-30核苷酸長(zhǎng)，它和在第一個(gè)限制性內(nèi)的切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定有-N1組成的3’-末端，其中“N”是四種脫氧核糖核苷酸A、C、G或T中的一個(gè)，第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼的載體序互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用在四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)中；(i)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物，在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它與在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(h)中一樣，“x”是從1到5的整數(shù)，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”＋1插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且在第一套亞庫中每一個(gè)亞庫在第二系列中有4x亞庫；(j)分析第二套PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中一個(gè)生物素部分被共軛連到錨定引物上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述生物素部分被共軛連到錨定引物5’末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述第一個(gè)限制性的cDNA是從通過用一個(gè)包被抗生蛋白的底物接觸第一個(gè)限制性的cDNA在權(quán)利要求1中的步驟b中cDNA的剩余部分分離的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在第一個(gè)5’PCR引物的3’末端的3核苷酸通過硫代磷酸酯連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在第二個(gè)5’PCR引物的3’末端的3核苷酸通過硫代磷酸酯連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在第一個(gè)和第二個(gè)5’PCR引物的3’末端的3核苷酸通過硫代磷酸酯連接的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二個(gè)PCR反應(yīng)的引物被共軛連上一個(gè)熒光標(biāo)簽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述熒光標(biāo)簽是從下面小組的組成中選擇的螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，6-羧酸，3’，6’-二羥基-6-羧基熒光素；螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，5-羧酸，3’，6’-二羥基-5-羧基熒光素；螺旋(異苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)-呫噸)-3-一，3’，6’-二羥基熒光素；9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-二(二甲氨苯基)-呫噸鎓-6-羧基四甲基若丹明；3，6-二氨基-9-(2-羧基苯就基)-呫噸鎓；螺旋[異苯并呋喃-1(3H)，9’-呫噸]-6-羧酸，5’-二氯-3’，6’-二羥基-2’，7’-二甲氧基-3-氧代-；1H，5H，11H，15H-呫噸o[2，3，4-ij5，6，7-i’j’]二喹嗪-8-鎓，-(2，4-二硫苯基)-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫，內(nèi)鹽；6-((4-4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酰)氨基)己酸；6-((4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酰)氨基)-己酸；6-(((4-(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯氧)乙酰)氨基)-己酸；4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-戊酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；4，4-二氟-5-苯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；4，4-二氟-5(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸；6-(((4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙酰基)氨基己酸；6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-基)苯乙烯基氧)乙?；?氨基己酸；9-(2，4(或2，5)-二羧基苯基)-3，6-二(二甲氨基)-呫噸鎓，內(nèi)鹽；以及4，7，2’，4’，5’，7’六氯-6-羧基熒光素和4，7，2’，7’四氯-6-羧基熒光素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(a)中的相變殘基是-V-N-N。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(a)中的相變殘基是-V-N。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(a)中的相變殘基是-V。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(i)中的“x”是3。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(i)中的“x”是1。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(a)中的相變殘基是-V-N-N，而且在步驟(i)中的“x”是3。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在步驟(a)中的相變殘基是-V，而且在步驟(i)中的“x”是2。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述每個(gè)錨定引物在T殘基區(qū)有18個(gè)T殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述錨定引物的第一個(gè)填充片段長(zhǎng)度是14個(gè)殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一個(gè)填充片段的序列是G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A(SEQ ID NO2)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述噬菌體特異的啟動(dòng)子是從由T3啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、和SP6啟動(dòng)子組成的小組中篩選的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述噬菌體特異的啟動(dòng)子是T3啟動(dòng)子。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述從cRNA的cDNA的轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)的引物序列是A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G(SEQ ID NO14)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述載體是用ClaI和NotI切割的質(zhì)粒pBC SK+，在步驟(h)和(i)中3’PCR引物是G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-T(SEQ ID NO47)。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述載體是用ClaI和NotI切割的質(zhì)粒粒pBC SK+，在步驟(h)和(i)中3’PCR引物是G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G(SEQ ID NO48)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是從由MboI、DpnII、Sau3AI、Tsp509I、HpaII、BfaI、Csp6I、MseI、HhaI、NlaIII、TaqI、MspI、MaeII、Sau3AI、Bg1II和HinP1I所組成的小組中篩選的。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是從由AscI、BaeI、FseI、NotI、PacI、PmeI、PpuMI、RsrII、SapI、SexAI、SfiI、SgfI、SgrAI、SrfI、Sse8387I和SwaI所組成的小組中篩選的。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是NotI。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶有一個(gè)含有用在步驟(b)中的第二個(gè)限制性內(nèi)切酶的4-核苷酸序列的一個(gè)核苷酸序列的識(shí)別。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI，且用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是SmaI。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是TaqI，且用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是XhoI。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是HinP1I，且用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是NarI。
34.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是MaeII，且用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是AatII。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是Sau3AI，且用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是Bg1II。
36.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是NlaIII，且用在步驟(e)中的限制性內(nèi)切酶是NcoI。
37.合適于權(quán)利要求1所述方法應(yīng)用的一個(gè)載體，其中步驟(c)的載體是一個(gè)環(huán)形DNA分子形式，其具有在載體填充序列側(cè)翼的第一和第二載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，而且進(jìn)一步包括在第一和第二載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用限制性內(nèi)切酶切割載體的消化載體的步驟。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的載體，其中所述填充序列包含有在第一和第二載體限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間的一個(gè)內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的載體，其中所述步驟(e)包括用一個(gè)限制性內(nèi)切酶在內(nèi)部載體填充限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)切割載體的載體消化。
40.一種載體，其是從由質(zhì)粒pBC SK+/DGT1、pBS SK+/DGT2、pBSSK+/DGT3、pBC SK+/DGT4和pBS SK+/DGT5組成的小組中篩選的
41.一種載體，其含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)的從由SEQ ID NO9、SEQ IDNO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13組成的小組中篩選的。
42.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)于多聚腺苷mRNA物種，mRNA庫被豐富了。
43.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增片段在步驟(j)的分離分析是通過電泳顯示產(chǎn)物進(jìn)行的。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述在電泳后顯示的產(chǎn)物的強(qiáng)度幾乎和在原始混合物中產(chǎn)物相應(yīng)的mRNAs的豐度呈比例。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其進(jìn)一步包括在電泳后，從產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)于mRNA的強(qiáng)度確定在原始混合物中每個(gè)mRNA相對(duì)豐度的步驟。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述通過電泳分離分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的步驟，包括在至少兩個(gè)凝膠上的片段的電泳。
47.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(k)洗脫至少一個(gè)與來源于電泳圖譜中的mRNAs相對(duì)應(yīng)的cDNA，其中代表出現(xiàn)在樣品中的3’-末端的mRNAs的條帶被顯示；(l)在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增洗脫的cDNA；(m)克隆擴(kuò)增的cDNA進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒中；(n)生產(chǎn)來源于質(zhì)粒的同克隆的DNA相對(duì)應(yīng)的DNA；(o)測(cè)序克隆cDNA。
48.包括以下步驟的在一個(gè)mRNA庫中進(jìn)行同步序列特異的mRNAs鑒定的改進(jìn)方法(a)分離一個(gè)mRNA庫；(b)用一個(gè)混合的錨定引物從mRNA庫中制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，其中每個(gè)錨定引物有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，以及包括(i)一個(gè)從7至40T殘基的序列；(ii)被識(shí)別8個(gè)堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’-末端定位是和T殘基的序列相關(guān)的；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，該第一個(gè)填充片段被定位朝向于與被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和T殘基的序列之間；和(v)由被定位在每個(gè)錨定引物的3’末端的-V、-V-N或-V-N-N之一限定的相變殘基，其中V是從由A、C和G組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸；N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能；(c)用第一個(gè)限性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，形成了一個(gè)分別具有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫；(d)來源于步驟(b)的每個(gè)雙鏈cDNA分子在一個(gè)方向上被插入進(jìn)一個(gè)載體，其對(duì)于一個(gè)T3啟動(dòng)子是反意義的，在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義鏈的5’末端和有意義鏈的3’末端的5’、3’側(cè)翼載體的序列，而且所述有一個(gè)3’側(cè)翼載體序列的構(gòu)建在所述第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間至少有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度；(e)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌以產(chǎn)生含有克隆插入的載體；(f)用至少一種或不能識(shí)別插入的cDNA分子中的序列，或不能識(shí)別T3啟動(dòng)子中的序列的限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷。(g)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從T3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的T3RNA聚合酶，產(chǎn)生了反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備；(h)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶，和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)且由和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的5’反轉(zhuǎn)錄引物，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA；(i)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物，第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’PCR引物是15-30核苷酸長(zhǎng)，它和位于第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定由T3特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始的位點(diǎn)之間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定有-N1組成的3’末端，其中“N”是四種脫氧核糖核苷酸A、C、G或T中的一個(gè)，該第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼的載體序互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用在四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)中；(j)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物，在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它和位于第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定由T3特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始的位點(diǎn)之間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(i)中一樣，x是由3和4組成的小組中選擇的，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”+1的插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且對(duì)每一個(gè)亞庫，在第二系列亞庫中有4x亞庫；(k)分析第二套PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述48個(gè)錨定引物的混合物具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEO ID NO5)的序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述48個(gè)錨定引物的混合物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO8)的序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述12個(gè)錨定引物的混合物具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO4)的序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述12個(gè)錨定引物的混合物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID No7)的序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求的48方法，其中所述3個(gè)錨定引物的混合物具有A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO3)的序列。
54.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述3個(gè)錨定引物的混合物具有G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO6)的序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述第一個(gè)限制性內(nèi)切酶是MspI，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶是NcotI。
56.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述第一個(gè)5’PCR引物是G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO22)。
57.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述第一個(gè)3’PCR引物和第二個(gè)3’PCR引物是G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-T(SEQ ID NO47)。
58.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述步驟(j)中的“x”是3。
59.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述步驟(j)中的“x”是4。
60.一種檢測(cè)在組織中mRNA表達(dá)模式的變化和生理學(xué)或病理學(xué)變化的關(guān)系的方法，其包括以下步驟(a)獲得沒有受到生理學(xué)或病理學(xué)變化的一個(gè)組織的第一個(gè)樣品；(b)從第一個(gè)樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(c)通過進(jìn)行權(quán)利要求1的(a)-(j)步驟產(chǎn)生代表在第一個(gè)樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第一個(gè)特異序列產(chǎn)物的顯示，確定在組織的第一個(gè)樣品中mRNA表達(dá)的模式；(d)獲得受到生理學(xué)或病理學(xué)變化的一個(gè)組織的第二個(gè)樣品；(e)從第二個(gè)樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(f)通過進(jìn)行權(quán)利要求1的(a)-(j)步驟產(chǎn)生代表在第二個(gè)樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第二個(gè)特異序列產(chǎn)物的顯示，確定在組織的第二個(gè)樣品中mRNA表達(dá)的模式；(g)比較第一和第二個(gè)顯示以確定生理學(xué)或病理學(xué)上變化對(duì)組織中mRNA表達(dá)模式的影響。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述生理學(xué)或病理學(xué)上的變化是從通過轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)第二信使、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子和神經(jīng)調(diào)質(zhì)、細(xì)胞-細(xì)胞接觸、細(xì)胞-底物接觸、細(xì)胞-胞外基礎(chǔ)接觸、及在細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間接觸所介導(dǎo)的過程中篩選的。
62.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述組織來源于一個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述生理學(xué)或病理學(xué)上的變化是從由老年癡呆癥、帕金森神經(jīng)功能障礙、局部缺血、嗜酒、吸毒成癮、精神分裂癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、多重硬化、抑郁癥、雙極躁狂抑郁障礙所組成的小組中篩選的。
64.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述生理學(xué)或病理學(xué)上的變化和學(xué)習(xí)、記憶、情緒、谷氨酸脫氫酶神經(jīng)中毒、進(jìn)食行為、嗅覺、視覺和活動(dòng)障礙、病毒感染、電休克療法、或藥物的配給和藥物的毒副作用有關(guān)。
65.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述生理學(xué)或病理學(xué)上的變化是從由生理節(jié)奏變化、老化及長(zhǎng)期強(qiáng)化所組成的小組中選擇的。
66.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述組織是從由視網(wǎng)膜、小腦皮層、嗅覺泡、丘腦、下丘腦、前垂體、后垂體、海馬、伏隔核、扁桃體、紋狀體、小腦、腦干、交叉上核和脊柱索組成的小組中篩選的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)結(jié)構(gòu)衍生而來的。
67.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述組織是正常的或瘤形成的組織，其是從由心血管系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎、骨骼肌和生殖系統(tǒng)組成的小組中的篩選的一個(gè)器官或器官組織。
68.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述組織是由細(xì)胞組成的正常的或瘤形成的組織，其是從由心血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、末梢神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、體被(包括皮膚、頭發(fā)和指甲)、骨骼系統(tǒng)(包括骨骼和肌肉)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)組成的小組中的篩選的一個(gè)器官或器官組織提取或衍生的。
69.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述組織是由細(xì)胞組成的正常的或瘤形成的組織，其是從由上皮、內(nèi)皮、粘膜、腺體、血液、淋巴、連接組織、軟骨、骨、平滑肌、骨骼肌、心肌、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脾、胸腺、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、松果體、皮膚、頭發(fā)、指甲、牙齒、肝、胰腺肺、腎、膀胱、輸尿管、乳腺、卵巢、子宮、陰道、Testes、前列腺、陰莖、眼和耳朵組成的小組中篩選的一個(gè)器官或器官組織提取或衍生的。
70.一種檢測(cè)一個(gè)篩選的藥物和一個(gè)已知化合物作用不同的方法，其包括以下步驟(a)從用已知生理學(xué)功能的化合物處理的有機(jī)體獲得組織的第一份樣品；(b)從第一份樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(c)通過進(jìn)行權(quán)利要求1的(a)-(j)步驟產(chǎn)生代表在第一份樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第一個(gè)序列特異的產(chǎn)物的顯示，確定在第一個(gè)樣品組織中mRNA表達(dá)的模式；(d)從用被篩選的藥物處理的有機(jī)體中獲得第二份樣品，確定篩選的藥物和一個(gè)已知化合物作用的不同；(e)從第一份樣品中分離一個(gè)mRNA庫；(f)通過進(jìn)行權(quán)利要求1的(a)-(j)步驟產(chǎn)生代表在第二份樣品中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的第二個(gè)序列特異的產(chǎn)物的顯示，確定在第二個(gè)樣品組織中mRNA表達(dá)的模式；(g)比較第一個(gè)和第二個(gè)的顯示，以便檢測(cè)mRNA物種的存在，mRNA的表達(dá)不受已知化合物的影響，而是受被篩選的藥物的影響，因此，表明篩選的藥物和已知化合物作用的差異。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述被篩選的藥物是從由抗抑郁藥、精神抑制藥、安定藥、抗驚厥藥、單胺氧化酶抑制劑、興奮劑組成的組中選擇的。
72.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述被篩選的藥物是從由抗帕金森劑、骨骼肌弛緩藥、止痛藥、局部麻醉、膽堿能藥、抗病毒劑、抗痙攣、類固醇和非類固醇類抗發(fā)炎藥物組成的小組中篩選的。
73.一個(gè)數(shù)據(jù)庫，其包括由通過權(quán)利要求1的序列特異產(chǎn)品的顯示的定量產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。
74.權(quán)利要求1的數(shù)據(jù)庫，其進(jìn)一步包括含有涉及到序列相關(guān)性、基因圖譜和細(xì)胞分配的數(shù)據(jù)。
75.一種識(shí)別在一個(gè)樣品中出現(xiàn)的mRNA分子的3’-末端序列和一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫之間的序列身份和相似性的方法，其包括如下步驟(a)用一個(gè)混合的錨定引物從一個(gè)mRNA庫中制備一個(gè)雙鏈cDNA庫，每一個(gè)錨定引物含有一個(gè)5’末端和一個(gè)3’末端，而且包括(i)7-40T殘基的一段序列；(ii)識(shí)別6個(gè)以上堿基的第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割的位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)朝向5’-末端定位是和T殘基的序列相關(guān)；(iii)從4到40個(gè)核苷酸的第一個(gè)填充片段，該第一個(gè)填充片段被定位朝向于與被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)相關(guān)的5’-末端；(iv)第二個(gè)填充片段插入識(shí)別6個(gè)以上堿基被第一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和T殘基序列之間；和(v)相變殘基被定位在從由-V、-V-N、和-V-N-N組成的小組中選擇的每個(gè)錨定引物的3’-末端，其中V是從由A、C和G組成小組中篩選的脫氧核糖核苷酸；N是從由A、C、G和T組成的小組中篩選的脫氧核糖核苷酸，包含有錨定引物的混合物含有所有的V和N的可能；(b)用第一個(gè)限性內(nèi)切酶和第二個(gè)限制性內(nèi)切酶切下雙鏈cDNA庫，第二個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別一個(gè)4-核苷酸序列，形成了一個(gè)分別有第一和第二個(gè)末端的雙鏈cDNA分子庫。(c)來源于步驟(b)的每個(gè)雙鏈cDNA分子于一個(gè)方向被插入進(jìn)一個(gè)載體，其對(duì)于噬菌體特異的啟動(dòng)子是反意義的，在載體中形成了含有插入cDNA分子的構(gòu)建庫，因此分別確定鄰接插入cDNA有意義鏈5’末端和有意義鏈3’末端的5’、3’側(cè)翼載體的序列，而且所述有一個(gè)3’側(cè)翼載體序列的構(gòu)建至少在所述第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和限定的在所述啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度；(d)用被切割的cDNA插入載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生含有克隆插入的載體；(e)用至少一種或不能識(shí)別插入的cDNA分子中的序列，或不能識(shí)別噬菌體特異的啟動(dòng)子中的序列，但能識(shí)別載體上序列的限制性內(nèi)切酶消化在步驟(c)中產(chǎn)生的構(gòu)建庫，這樣就產(chǎn)生了含有插入的cDNA分子的線性片斷，這樣產(chǎn)生的線性片段具有一個(gè)在載體5’端到雙鏈cDNA分子第二個(gè)末端的至少15個(gè)核苷酸的5’側(cè)翼載體序列；(f)通過溫育線性片段和一個(gè)具有起始從噬菌體特異的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的噬菌體特異的RNA聚合酶，產(chǎn)生了反義cRNA轉(zhuǎn)錄的一個(gè)cRNA的制備；(g)用一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶，和一個(gè)15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)且由和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的5’反轉(zhuǎn)錄引物，通過轉(zhuǎn)錄cRNA產(chǎn)生第一鏈cDNA；(h)通過分離第一鏈cDNA形成第一系列亞庫和用第一鏈cDNA作為模板進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第一套PCR產(chǎn)物，第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一個(gè)3’PCR引物是15-30核苷酸長(zhǎng)，它和在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第一個(gè)5’PCR引物被限定有-N1組成的3’-末端，其中“N”是四種脫氧核糖核酸A、C、G或T中一個(gè)，第一個(gè)5’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且和5’側(cè)翼的載體序互補(bǔ)，同時(shí)，第一個(gè)5’PCR引物的互補(bǔ)延伸進(jìn)cRNA的特異插入核苷酸中的一個(gè)核苷酸，在此第一個(gè)5’PCR引物的一個(gè)不同引物被用在四個(gè)不同亞庫中的每一個(gè)中；(i)通過進(jìn)一步分離第一系列亞庫每一個(gè)中的第一套PCR產(chǎn)物成為第二系列亞庫和用第一套PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生第二套PCR產(chǎn)物，在第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的第二個(gè)3’PCR引物是15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，它與在第一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和通過噬菌體特異的啟動(dòng)子確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的3’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，第二個(gè)5’PCR引物被限定有一個(gè)由-N1-Nx組成的3’-末端，在此N1和用在第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對(duì)于那個(gè)亞庫的N1是一樣的，“N”象在步驟(h)中一樣，x是從1到5的整數(shù)，這個(gè)引物長(zhǎng)度是15-30個(gè)核苷酸，而且和5’側(cè)翼載體序列互補(bǔ)，同時(shí)引物互補(bǔ)延伸以核苷酸數(shù)量相當(dāng)于“x”+1的插入cRNA的特異插入核苷酸，在此，第二5’PCR引物中每個(gè)不同引物被用在第二系列亞庫的不同的亞庫中，而且對(duì)于第一套亞庫中每一個(gè)亞庫在第二系列亞庫中有4x亞庫；(j)分析第二套PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了一個(gè)代表在mRNA庫中出現(xiàn)的mRNAs的3’-末端的特異序列的展示；(k)洗脫至少一個(gè)與來源于電泳圖譜中的mRNAs相對(duì)應(yīng)的cDNA，其中代表出現(xiàn)在樣品中的3’-末端的mRNAs的條帶被顯示；(l)在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增洗脫的cDNA；(m)克隆擴(kuò)增cDNA進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒中；(n)生產(chǎn)同來源于質(zhì)粒的克隆的DNA相對(duì)應(yīng)的DNA；(o)確定克隆的cDNA的序列；(p)從一個(gè)核苷酸數(shù)據(jù)庫確定相應(yīng)的核苷酸序列，這里所述相應(yīng)的核苷酸序列是被第二個(gè)限制性內(nèi)切酶最末端的識(shí)別位點(diǎn)和Poly(A)尾巴開始之間所界定的序列；(q)比較克隆cDNA序列和相應(yīng)的核苷酸序列，因此可以識(shí)別出現(xiàn)在一個(gè)樣品mRNA的3’-末端序列和一個(gè)數(shù)據(jù)庫序列的身份及相似性。
76.根據(jù)權(quán)利要求76的方法，其進(jìn)一步包括如下步驟(r)在一個(gè)二維圖譜顯示中比較PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和數(shù)量。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的方法，其進(jìn)一步包括如下步驟(s)確定相應(yīng)的核苷酸的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度，這個(gè)長(zhǎng)度和從數(shù)據(jù)庫中確定的大量的相應(yīng)核苷酸產(chǎn)物的長(zhǎng)度相同，確定可以和載體雜交的5’PCR序列的長(zhǎng)度，確定剩余的錨定引物載體序列的介入部分的長(zhǎng)度以及和載體可雜交的3’PCR序列的長(zhǎng)度；(t)比較PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度和已確定的預(yù)測(cè)的相應(yīng)核苷酸序列的長(zhǎng)度，在此相應(yīng)的核苷酸序列的預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度是通過一個(gè)圖解標(biāo)記或文字符在一個(gè)二維圖譜顯示中被證明的。
78.一種識(shí)別與在一個(gè)樣品出現(xiàn)的一個(gè)mRNA分子相對(duì)應(yīng)的一個(gè)cDNA片段序列與一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫之間的身份和相似性的方法，其包括以下的步驟洗脫和在一個(gè)樣品中出現(xiàn)的一個(gè)mRNA分子相對(duì)應(yīng)的一個(gè)cDNA片段；在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增洗脫的cDNA片段產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增的cDNA片段；克隆擴(kuò)增的cDNA片段進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒；產(chǎn)生一個(gè)和cDNA片段對(duì)應(yīng)的一個(gè)DNA分子；測(cè)序那個(gè)產(chǎn)生的DNA分子，因此確定了洗脫的cDNA片段的序列；及，比較洗脫的cDNA片段的序列和數(shù)據(jù)庫中序列，因此識(shí)別序列的身份和相似性。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述比較洗脫的cDNA片段的序列和數(shù)據(jù)庫中序列的步驟是用計(jì)算機(jī)進(jìn)行的。
80.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其包括用圖解顯示比較結(jié)果的附加步驟。
81.一種識(shí)別與在一個(gè)樣品中出現(xiàn)一個(gè)mRNA分子對(duì)應(yīng)的cDNA片段的序列與一個(gè)數(shù)據(jù)庫序列之間的序列身份和相似性的方法，其包括如下步驟洗脫與在一個(gè)樣品中出現(xiàn)的一個(gè)mRNA分對(duì)應(yīng)的cDNA片段，這里cDNA片段有一個(gè)由一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與那個(gè)mRNA分子的一個(gè)Poly(A)尾巴的位置確定的長(zhǎng)度；用和那個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的一個(gè)5’PCR引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確定cDNA片段的部分序列；而且比較洗脫cDNA片段確定的部分序列和cDNA片段對(duì)于在數(shù)據(jù)庫中序列的長(zhǎng)度，來識(shí)別序列的身份和相似性。
82.一種產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)化多核苷酸序列數(shù)據(jù)庫登記的方法，其包括以下步驟從一個(gè)多核苷酸序列數(shù)據(jù)庫登記中選擇一個(gè)源序列；在源序列中定位一個(gè)poly(A)尾巴序列；在源序列中定位一個(gè)和第一個(gè)限制性內(nèi)切酶最靠近的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列；確定和上述限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)鄰接的大約由2-6個(gè)核苷酸組成的一個(gè)索引序列；在源序列中，確定一個(gè)相關(guān)的序列，所述相關(guān)序列包括被poly(A)尾巴和限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)所界定的序列，且至少包括限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的一部分；確定相關(guān)序列的長(zhǎng)度；和存儲(chǔ)關(guān)于poly(A)尾巴的位置和序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)位置和序列、和源序列相關(guān)的相關(guān)序列的長(zhǎng)度的信息，因此可以產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)庫登記。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的方法，其進(jìn)一步包括如下的步驟圖示顯示和索引序列相關(guān)的相關(guān)序列的長(zhǎng)度。
84.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中所述限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)是從由MspI、TaqI，HinP1I組成的小組中選擇的。
85.一種通過減小由于非靶cDNAs擴(kuò)增的背景而改進(jìn)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和數(shù)量的分辨率的方法，其包括如下步驟篩選一個(gè)cDNAs庫的樣品，在這里每一個(gè)cDNA分子包含有插入序列和來源于載體的序列；用一個(gè)可以和來源于載體的序列雜交的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，延伸大約5-6個(gè)核苷酸進(jìn)入插入序列產(chǎn)生一個(gè)cDNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物；再一次分離cDNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物；用一個(gè)可以和來源于載體的序列雜交的一個(gè)3’引物和一個(gè)5’引物和再一次分離cDNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行至少一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，延伸大約7-9個(gè)核苷酸進(jìn)入插入序列產(chǎn)生一個(gè)PCR產(chǎn)物，因此減小由于非靶cDNAs擴(kuò)增的背景。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中有16個(gè)庫的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和16個(gè)不同的反轉(zhuǎn)錄引物。
87.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中有4x亞庫的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在此，5’PCR引物延伸進(jìn)入插入序列的核苷酸的數(shù)量同反轉(zhuǎn)錄引物延伸進(jìn)入插入序列的核苷酸的數(shù)量是不同的。
全文摘要
在一個(gè)mRNA庫中進(jìn)行同步序列特異的mRNAs鑒定的一個(gè)改進(jìn)方法,該方法允許通過一個(gè)組織表達(dá)的幾乎每個(gè)mRNA在一個(gè)凝膠上作為一個(gè)明顯條帶是可見的,該條帶的強(qiáng)度大致和mRNA的濃度相對(duì)應(yīng)?？偟恼f來,該方法包括用錨定引物固定3’－末端點(diǎn)的cDNA的形成,從克隆插入產(chǎn)生克隆插入片段,制備cRNA,從cRNA轉(zhuǎn)錄cDNA,而且進(jìn)行兩個(gè)cDNA的序列特異的PCR的擴(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)先可取的具體體現(xiàn)中,本方法包括比較PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和至少核苷酸序列的一部分和來源于核苷酸序列數(shù)據(jù)庫所確定的期望的數(shù)值。本方法能鑒定mRNA表達(dá)的變化同藥物的配給或生理學(xué)或病理學(xué)的情況的聯(lián)系。對(duì)于改進(jìn)方法的應(yīng)用有用的載體和引物也被提供了。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1331755SQ99814965
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期1999年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月4日
發(fā)明者卡爾·W·哈塞爾, 布賴恩·S·希爾布什 申請(qǐng)人:數(shù)據(jù)基因科技股份有限公司