一種胃蛋白酶酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]明膠是大分子膠原蛋白受熱后局部分解后的產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)中都具有α鏈組成的三股螺旋構(gòu)象(即膠原域)。生物體中存在的膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)，它主要存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、牙齒、腱肌、韌帶和血管中，是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官保護(hù)機(jī)體的功能。而明膠則是膠原蛋白受熱發(fā)生局部分解或解螺旋后的產(chǎn)物。目前膠原蛋白或明膠主要來源于豬皮、牛骨或水產(chǎn)動(dòng)物的魚皮、魚骨等組織，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、美容等行業(yè)。不同來源的膠原蛋白或明膠具有不同的應(yīng)用區(qū)域。由于宗教的原因，水產(chǎn)動(dòng)物膠原蛋白具有更廣泛的應(yīng)用區(qū)域。但由于膠原蛋白及明膠產(chǎn)品都具有相似的三股螺旋結(jié)構(gòu)，常用的蛋白質(zhì)測(cè)定方法如凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外分光光度法，沒有辦法將區(qū)別膠原蛋白的來源，即不同物種的膠原蛋白目前區(qū)分比較困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法。
[0004]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)解決方案是:
[0005]一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，其步驟如下:
[0006](I)原料溶解:取大分子膠原蛋白或明膠5-50mg，溶于1_50毫升0.1-0.5mol的乙酸中，配成濃度為0.l-10mg/ml的蛋白質(zhì)溶液；
[0007](2)加熱變性:將蛋白質(zhì)溶液在30-100°C水浴中加熱，加熱時(shí)間為10-100分鐘；
[0008](3)加入胃蛋白酶:再在蛋白質(zhì)溶液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的用量為大分子膠原蛋白或明膠用量的0.1wt% -1Owt% ；
[0009](4)酶解反應(yīng):將加入胃蛋白酶的蛋白質(zhì)溶液于水浴中反應(yīng)10-100分鐘，反應(yīng)溫度為 10-60 °C ；
[0010](5)酶解終止:取反應(yīng)后的溶液I毫升，加入胃蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基磺酰氟)5-50微升，終止酶解過程；
[0011](6)制備電泳樣品:在終止酶解過程的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為0.l-10mol/L的Tris溶液(三羥甲基氨基甲烷)10-100微升，充分混勻后于沸水浴中加熱1-10分鐘；
[0012](7)電泳樣品儲(chǔ)存:將沸水浴加熱后的樣品立即冷卻至0°C。
[0013](8)電泳:進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗(yàn)。
[0014]本發(fā)明的原理是:盡管不同來源的膠原蛋白或明膠均具有相似的三螺旋結(jié)構(gòu)，但組成三螺旋結(jié)構(gòu)的α鏈亞基的氨基酸序列不相同，經(jīng)過胃蛋白酶的酶解會(huì)會(huì)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)片段(肽段)。采用SDS-PAGE的方法，將不同的肽段顯示出來，即得到酶解片段的圖譜。不同來源的膠原蛋白經(jīng)過酶解后得到不同的肽段圖譜，根據(jù)肽段圖譜即可以區(qū)別膠原蛋白或明膠的來源。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:可以對(duì)大分子膠原蛋白或明膠的來源進(jìn)行鑒另U，方法簡(jiǎn)單、結(jié)果精確。
【附圖說明】
[0016]圖1為經(jīng)本發(fā)明的胃蛋白酶酶解后的肽段圖譜。
[0017]1:尚分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記物；2:鏈魚皮提取的Jj父原蛋白；3:鏈魚皮提取Jj父原蛋白的酶解肽段圖譜；4:鰱魚鱗提取膠原蛋白的酶解肽段圖譜；5:鯉魚皮提取的膠原蛋白的酶解肽段圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)例1:
[0019](I)原料溶解:取來源于鰱魚皮的大分子膠原蛋白6mg，溶于24毫升0.2mol的乙酸中，配成濃度為0.25mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。
[0020](2)加熱變性:將配成的大分子膠原蛋白或明膠溶液在50°C水浴中加熱，加熱時(shí)間為60分鐘。
[0021](3)加入蛋白酶:在溶液中加入胃蛋白酶(1: 10000)，酶制劑購(gòu)自于sigma公司，其用量為蛋白樣品用量的2%。
[0022](4)酶解反應(yīng):將加入胃蛋白酶的大分子膠原蛋白或明膠溶液在水浴鍋中反應(yīng)50分鐘，反應(yīng)溫度為30 °C。
[0023](5)酶解終止:取反應(yīng)后的溶液I毫升，加入胃蛋白酶抑制劑PMSF30微升，終止酶解過程。
[0024](6)制備電泳樣品:在終止反應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為2mol/L的Tris溶液50微升，充分混勻后于沸水浴加熱6分鐘。
[0025](7)電泳樣品儲(chǔ)存:將沸水浴加熱后的樣品立即冷卻至0°C，冷卻可以在冰水進(jìn)行，或放入冷凍箱。
[0026](8)電泳:進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，參考文獻(xiàn)參考 Laemmli (1970).Laemmli, U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during assembly head of bacter1phageT4.Nature, 277, 680 - 685.實(shí)驗(yàn)中所用高分子蛋白標(biāo)記物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，每個(gè)樣品樣量為10微克，實(shí)驗(yàn)結(jié)果即為圖1的第3條條帶所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過該方法，能對(duì)大分子膠原蛋白或明膠的來源進(jìn)行鑒別。
[0027]實(shí)例2:
[0028](I)原料溶解:取鰱魚鱗大分子膠原蛋白8mg，溶于16毫升0.3mol的乙酸中，配成濃度為0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。
[0029](2)加熱變性:將配成的大分子膠原蛋白溶液在55°C水浴中加熱，加熱時(shí)間為70分鐘。
[0030](3)加入蛋白酶:在溶液中加入胃蛋白酶(1: 10000)，酶制劑購(gòu)自于sigma公司，胃蛋白酶的用量為蛋白樣品用量的6%
[0031](4)酶解反應(yīng):將加入胃蛋白酶的大分子膠原蛋白或明膠溶液在水浴鍋中反應(yīng)70分鐘，反應(yīng)溫度為30 °C。
[0032](5)酶解終止:取反應(yīng)后的溶液I毫升，加入胃蛋白酶抑制劑10微升，終止酶解過程。
[0033](6)制備電泳樣品:在終止反應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為5mol/L的Tris溶液30微升，充分混勻后于沸水浴加熱5分鐘。
[0034](7)電泳樣品儲(chǔ)存:將沸水浴加熱后的樣品立即進(jìn)行冷卻，冷卻可以在冰水進(jìn)行，或放入冷凍箱。
[0035](8)電泳:進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，參考文獻(xiàn)參考 Laemmli (1970).Laemmli, U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during assembly head of bacter1phageT4.Nature, 277, 680 - 685.實(shí)驗(yàn)中所用高分子蛋白標(biāo)記物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，每個(gè)樣品點(diǎn)樣量為10微克，實(shí)驗(yàn)結(jié)果即為圖1的第4條條帶所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過該方法，能對(duì)大分子膠原蛋白或明膠的來源進(jìn)行鑒別。
[0036]實(shí)例3:
[0037](I)原料溶解:取鯉魚皮大分子膠原蛋白10mg，溶于50毫升0.5mol的乙酸中，配成濃度為0.2mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。
[0038](2)加熱變性:將配成的大分子膠原蛋白或明膠溶液在60°C水浴中加熱，加熱時(shí)間為50分鐘。
[0039](3)加入蛋白酶:在溶液中加入胃蛋白酶(1: 10000)，酶制劑購(gòu)自于sigma公司，胃蛋白酶的用量為蛋白樣品用量的4%。
[0040](4)酶解反應(yīng):將加入胃蛋白酶的大分子膠原蛋白或明膠溶液在水浴鍋中反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)溫度為20 °C。
[0041](5)酶解終止:取反應(yīng)后的溶液I毫升，加入胃蛋白酶抑制劑40微升，終止酶解過程。
[0042](6)制備電泳樣品:在終止反應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為8mol/L的Tris溶液60微升，充分混勻后于沸水浴加熱4分鐘。
[0043](7)電泳樣品儲(chǔ)存:將沸水浴加熱后的樣品立即進(jìn)行冷卻，冷卻可以在冰水進(jìn)行，或放入冷凍箱。
[0044](8)電泳:進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，參考文獻(xiàn)參考 Laemmli (1970).Laemmli, U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during assembly head of bacter1phageT4.Nature, 277, 680 - 685.實(shí)驗(yàn)中所用高分子蛋白標(biāo)記物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，每個(gè)樣品點(diǎn)樣量為10微克，實(shí)驗(yàn)結(jié)果即為圖1的第5條條帶所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過該方法，能對(duì)大分子膠原蛋白或明膠的來源進(jìn)行鑒別。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，步驟如下:(1)原料溶解:取大分子膠原蛋白或明膠溶于0.1-0.5mol的乙酸中，配成濃度為0.l-10mg/ml的蛋白質(zhì)溶液； (2)加熱變性:將蛋白質(zhì)溶液在30-100°C水浴中加熱； (3)加入胃蛋白酶:再在蛋白質(zhì)溶液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的用量為大分子膠原蛋白或明膠用量的0.1wt% -1Owt% ； (4)酶解反應(yīng):將加入胃蛋白酶的蛋白質(zhì)溶液于水浴中反應(yīng)10-100分鐘，反應(yīng)溫度為10-60 0C ； (5)酶解終止:取反應(yīng)后的溶液I毫升，加入胃蛋白酶抑制劑5-50微升，終止酶解過程; (6)制備電泳樣品:在終止酶解過程的蛋白質(zhì)溶液中，加入濃度為0.l-10mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液10-100微升，充分混勻后于沸水浴中加熱1-10分鐘； (7)電泳樣品儲(chǔ)存:將沸水浴加熱后的樣品立即冷卻至0°C。 (8)電泳:進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗(yàn)。
2.如權(quán)利要求1中所述的胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，步驟(2)中的加熱時(shí)間為10-100分鐘。
3.如權(quán)利要求1中所述的胃蛋白酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法，其特征在于，步驟(5)中的胃蛋白酶抑制劑采用苯甲基磺酰氟。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胃蛋白酶酶解鑒定大分子膠原蛋白或明膠的方法。采用SDS-PAGE的方法，將不同的肽段顯示出來，得到酶解片段的圖譜，不同來源的膠原蛋白經(jīng)過酶解后得到不同的肽段圖譜，根據(jù)肽段圖譜即可以區(qū)別膠原蛋白或明膠的來源。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、結(jié)果精確。
【IPC分類】G01N27-447
【公開號(hào)】CN104535637
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410766878
【發(fā)明人】段蕊, 張俊杰, 王永久, 蔡學(xué)東, 張建東
【申請(qǐng)人】淮海工學(xué)院, 連云港金水灣食品有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月11日