一種快速檢測(cè)鵝掌楸屬植物花蜜中單糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是利用毛細(xì)管電泳法分離并檢測(cè)鵝掌楸屬植 物花蜜中葡萄糖和果糖的含量。
【背景技術(shù)】
[0002] 木蘭科鵝掌楸屬（Liriodendron)植物現(xiàn)存2個(gè)種，一種是北美鵝掌楸 (L.tulipiferaLinn.);另一種為鶴掌楸〔L.chinense(Hemsl.)Sarg.〕。鶴掌楸屬花兩性， 呈杯狀，與葉同時(shí)開放或稍后開放；花被片9,外輪萼片3片綠色，向外開展；內(nèi)兩輪花瓣6 片直立。鵝掌楸與北美鵝掌楸花顏色相差很大，鵝掌楸花黃綠色，近基部有黃色縱條紋，而 北美鵝掌楸花翠綠色，近基部有橙黃色或橙紅色色帶。鵝掌楸與北美鵝掌楸的花蜜分泌量 差異也很大，北美鵝掌楸單日花蜜分泌量為ml級(jí)，而鵝掌楸單日花蜜分泌量為ul級(jí)。因此， 在北美洲，北美鵝掌楸為重要的蜜源植物。
[0003] Muller(1883)、Faegri和vanderPijl(1966)認(rèn)為植物花蜜是吸引昆蟲傳份的 重要誘物之一，也是研宄植物與昆蟲協(xié)同進(jìn)化的重要材料。植物花蜜中含有許多昆蟲所需 的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而糖類是其中最重要也是含量最高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研宄表明，花蜜中的多糖主要 是蔗糖，單糖主要是葡萄糖及果糖，而對(duì)于那些開放式花朵的植物，己糖在花蜜的糖類中的 比率占主導(dǎo)性位置。因此花蜜中糖類的檢測(cè)分析對(duì)于探討植物繁殖生態(tài)學(xué)的研宄有著重大 的意義。但是由于一般植物花蜜分泌量一般只有ul?ml級(jí)，并且含有大量的脂類，酚類等 有機(jī)小分子物質(zhì)。而傳統(tǒng)的化學(xué)分析檢測(cè)方法檢出限高，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。
[0004] 對(duì)于單糖的分析，在采用高效液相色譜分析時(shí)，因?yàn)樘穷惐旧碓谧贤鈪^(qū)域基本沒 有吸收峰，而且也無(wú)熒光。所以一般采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。但示差折光檢測(cè)器靈敏度 低，檢出限僅為l〇_6g/l水平級(jí)。而且高效液相色譜本身具有分析時(shí)間長(zhǎng)，樣品用量大，糖柱 成本高的缺點(diǎn)。如果采用氣相色譜法測(cè)定，由于單糖的沸點(diǎn)較高，難以氣化，需要先轉(zhuǎn)化為 揮發(fā)性的衍生物才可以進(jìn)行測(cè)定。
[0005] 近年來，利用毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)各類生物分子（核酸、蛋白質(zhì)、糖類）成為一種新 的選擇。毛細(xì)管電泳具有分離效率高、分析時(shí)間短、進(jìn)樣量少、檢測(cè)限低和多模式等特點(diǎn)。隨 著毛細(xì)管電泳技術(shù)的不斷完善，以及檢測(cè)手段的多樣化，應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)分離各類生 物分子也逐漸增多。但迄今為止，還未有利用毛細(xì)管電泳技術(shù)分離、檢測(cè)植物花蜜中單糖種 類與含量的報(bào)道。
[0006] 目前，常用的毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)器有UV檢測(cè)器、LIF檢測(cè)器，以及PAD檢測(cè)器。其 中，UV檢測(cè)器具有價(jià)格低廉、適用性廣、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最廣的毛細(xì)管電泳儀檢測(cè) 器。適用于UV檢測(cè)器的單糖的檢測(cè)方法一般分為：衍生反應(yīng)后直接測(cè)定法，不經(jīng)衍生化反 應(yīng)直接測(cè)定和間接測(cè)定。而最常用的是衍生反應(yīng)后直接測(cè)定。對(duì)于還原性單糖，衍生反應(yīng) 大都基于還原氨基化反應(yīng)，也就是分子的還原端與帶電的發(fā)色或熒光基團(tuán)的伯胺反應(yīng)成為 希夫氏堿，再利用硼氰氫化鈉還原成仲胺，常用的方法有2-氨基吡啶法、CBQA〔3-(4_羧 基甲酰基）_2_喹啉甲醛〕法、PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）法、ANTS(8-氨基、苯 基-1，3, 6-三磺酸）法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用毛細(xì)管電泳快速分離檢測(cè)鵝掌楸屬植物花蜜 中的葡萄糖和果糖的含量。該方法克服了以往采用的高效液相色譜法所具有的手段復(fù)雜， 分析時(shí)間長(zhǎng)，樣品需求量大的缺點(diǎn)，而且大大節(jié)省了檢測(cè)成本。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 將花蜜樣品采用濾膜過濾后，在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行衍生化處理，然后利用毛細(xì)管電泳 儀分離樣品中葡萄糖和果糖，并用UV檢測(cè)器定性檢測(cè)，最后使用外標(biāo)法對(duì)葡萄糖和果糖進(jìn) 行定量。
[0010] 其中，所述的濾膜，其孔徑為〇. 45ym。
[0011] 其中，在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行衍生化處理的方法為：將濾液和衍生試劑按照體積比 1:1?5:1 (優(yōu)選5:1)混合，密封后在60?80°C(優(yōu)選80°C)水浴鍋內(nèi)水浴0.5?2h(優(yōu) 選lh) 〇
[0012] 其中，所述的衍生試劑配方為：143. 2mga-萘胺、35mgNaBH3CN、450y1無(wú)水甲醇 和41y1冰乙酸混合，按此配方等比例放大或者縮小。
[0013] 具體衍生步驟如下：
[0014] (1)配制衍生液：稱取143. 2mga-萘胺和35mgNaBH3CN，溶于450y1無(wú)水甲醇中， 再加入41yL冰乙酸，混勻。放入冰箱中待用。
[0015] (2)花蜜的柱前衍生：取100ul的花蜜樣品，加入20ul的衍生液置于10ml離心管 中，用封口膜密封。放入80°C水浴鍋中水浴lh。然后加入三氯甲燒和水各lml，充分混勻 后，10000r/min離心5min，重復(fù)3次，去上層水相待測(cè)。
[0016] 其中，毛細(xì)管電泳的反應(yīng)體系為：選擇50umX46cm的石英毛細(xì)管（實(shí)際長(zhǎng)度 40cm)，以pH9. 5、75mmol/l的Na2B407 ? 10H20 水溶液為背景緩沖液，0? 5psi進(jìn)樣 8s，UV= 214nm，20kv的電壓下電泳20min〇
[0017] 有益效果：本發(fā)明獲得了一種快速分離測(cè)定花蜜中葡萄糖、果糖的方法。其優(yōu)點(diǎn)在 于以下幾個(gè)方面：
[0018] 1、使用0. 45um的濾膜過濾樣品，可以有效的去除新鮮花蜜中的微生物和細(xì)菌。避 免對(duì)電泳結(jié)果造成干擾。
[0019] 2、如果電泳背景緩沖液pH值過低，會(huì)導(dǎo)致單糖分子無(wú)法正常電離，則無(wú)法得到 電泳結(jié)果。如果電泳背景緩沖液pH值過高，又會(huì)降低電泳分離度。使用pH= 9. 5的 Na2B407 ? 10H20緩沖液既可以使單糖分子正常電離，又保持了較高的分離度。
[0020] 3、電壓也是影響分離度的重要因子之一。高電壓雖然會(huì)減低電泳時(shí)間，但是卻會(huì) 降低分離度，低電壓反之。使用20kv的電壓既保持了高分離度，又可以快速地得到電泳結(jié) 果。
[0021] 4、大幅度的縮減了樣品的檢測(cè)時(shí)間，從采樣到獲得檢測(cè)結(jié)果只需2h。
[0022] 5、本發(fā)明方法檢出限為0. 028-0. 320mg/ml，精密度，重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD均小于5%。
【附圖說明】
[0023] 圖1北美鵝掌楸花蜜毛細(xì)管電泳圖像
[0024] 圖2鵝掌楸花蜜毛細(xì)管電泳圖像
【具體實(shí)施方式】
[0025] 根據(jù)下述實(shí)施的實(shí)例，可以更好地理解本發(fā)明。實(shí)例所描述的內(nèi)容僅用于說明本 發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0026] 實(shí)施例1 :利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)北美鵝掌楸及鵝掌楸花朵花蜜中葡萄糖、果糖含 量
[0027] (1)儀器與藥品：毛細(xì)管電泳儀（BeckmanP/ACEMDQ電泳儀）、UV檢測(cè)器、毛細(xì) 管、0. 45um濾膜、北美鵝掌楸花蜜、鵝掌楸花蜜（均采于江蘇句容市下蜀鎮(zhèn)南京林業(yè)大學(xué)下 蜀實(shí)習(xí)林場(chǎng)鵝掌楸種源試驗(yàn)林）、葡萄糖、果糖、Na2B407 ? 10H20、a-萘胺、NaBH3CN、甲醇、冰 乙酸（試劑均為分析純）
[0028] (2)樣品前處理：將北美鵝掌楸及鵝掌楸的新鮮花蜜稀釋1倍后用0. 45um濾膜過 濾，將濾液放入4°C冰箱待用。
[0029] (3)衍生試劑配制：用電子天平分別稱取143. 2mga-萘胺和35mgNaBH3CN，溶于 450y1無(wú)水甲醇中，然后加入41y1冰乙酸?；靹蚝蠓湃氡浯?。
[0030] (4)衍生化處理：分別取100y1花蜜濾液，加入20y1衍生試劑置于10ml離心管 中。封口膜密封，放入80°C水浴鍋中水浴lh。然后加入三氯甲燒和水各lml，充分混勻后， 10000r/min離心5min，重復(fù)3次。去上層水相定容至5ml，待測(cè)。
[0031] (5)電泳檢測(cè)：分別取1. 5ml待測(cè)樣品檢測(cè)，設(shè)置電壓為20kv，在pH= 9. 5、 75mmol/lNa2B407 ? 10H20水溶液背景下，0. 5psi進(jìn)樣8s，電泳檢測(cè)20min得到圖1、2,然后 重復(fù)測(cè)定7次，以檢測(cè)重現(xiàn)性。
[0032] (6)本發(fā)明方法檢出限為0. 028-0. 320mg/ml，精密度、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD均小于5%。
[0033] (7)花蜜中葡萄糖、果糖定量計(jì)算。首先將葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化處理 (方法同步驟4)，然后按表1配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。分別平行測(cè)定3次（條件同步驟5)。
[0034] 表1標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制（單位：ml)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，將花蜜樣品采用濾膜 過濾后，在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行衍生化處理，然后利用毛細(xì)管電泳儀分離樣品中葡萄糖和果糖，并 用UV檢測(cè)器定性檢測(cè)，最后采用外標(biāo)法對(duì)葡萄糖和果糖進(jìn)行定量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，所 述的濾膜，其孔徑為0.45 ym。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，在 水浴鍋內(nèi)進(jìn)行衍生化處理的方法為：將濾液和衍生試劑按照體積比1:1?5:1混合，密封后 在60?80°C水浴鍋內(nèi)水浴0. 5?化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，所 述的衍生試劑配方為；143. 2mg a -蒙胺、35mg NaBH3CN、450 y 1無(wú)水甲醇和41 y 1冰己酸混 合，按此配方等比例放大或者縮小。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，毛 細(xì)管電泳的反應(yīng)體系是，W pH9. 5、75mm〇Vl的化284〇7 'lO&O水溶液為背景緩沖液，0. 5psi 進(jìn)樣8s，UV = 214nm，20kv的電壓下電泳20min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)鵝掌楸屬植物花蜜中單糖的方法，屬于化學(xué)分析領(lǐng)域。與利用高效液相色譜檢測(cè)植物花蜜成分的傳統(tǒng)方法相比，本方法具有快速、高效、進(jìn)樣量少、低成本的特點(diǎn)。本發(fā)明利用α-萘胺衍生法，以pH9.5、Na2B4O7·10H2O水溶液為背景緩沖液，在20kv電壓，0.5psi進(jìn)樣8s的條件下，20min即可分離花蜜中葡萄糖、果糖；采用外標(biāo)法測(cè)定葡萄糖、果糖的含量。
【IPC分類】G01N27-447
【公開號(hào)】CN104535638
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510017319
【發(fā)明人】李火根, 呂劍南, 石瑞
【申請(qǐng)人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日