一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄酒中含有豐富的多酚物質(zhì)，如沒(méi)食子酸，綠原酸，咖啡酸，阿魏酸和香豆酸等 等，這些酚酸賦予葡萄酒特有的感官特性和是構(gòu)成葡萄酒"骨架成分"的重要活性物質(zhì)，同 時(shí)也具有一定的抗氧化、捕捉自由基、預(yù)防癌癥、抗衰老和防止紫外線損傷等生理功效，比 如阿魏酸也具有抑制血小板血栓素的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作 用。多酚物質(zhì)在葡萄酒的陳釀時(shí)期會(huì)發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)是導(dǎo)致葡萄酒口感和色澤變化的一 個(gè)重要原因，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生了不可低估的作用，最終會(huì)影響葡萄酒的類(lèi)型和品質(zhì)。因 此，對(duì)葡萄酒多酚物質(zhì)含量進(jìn)行的檢測(cè)和監(jiān)控有一定的實(shí)際意義。
[0003] 由于葡萄酒中的成分很復(fù)雜，而且多酚物質(zhì)含量比較低，因此，有必要對(duì)葡萄酒樣 品進(jìn)行前處理，現(xiàn)有技術(shù)的葡萄酒中多酚物質(zhì)含量的測(cè)定采用如下技術(shù)方案：
[0004] 樣品的前處理：AccuBond0DS-C18(500mg，6ml)固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使 用前要分別用6ml甲醇，6ml乙腈和10ml水預(yù)先活化。樣品過(guò)柱后，依次用去離子水和5% 的甲醇淋洗柱子，采用洗脫速度為1. 5ml/min。
[0005] 本發(fā)明的是采用ProElutC18小柱，使用前只需用5ml乙腈和8ml二次去離子水 預(yù)先對(duì)其活化，樣品過(guò)柱后，依次用二次去離子水、2-4%的乙腈水溶液對(duì)其進(jìn)行淋洗，洗脫 速度達(dá)到了 1. 8-2.Oml/min，本發(fā)明的前處理方法采用較少的溶劑對(duì)萃取柱進(jìn)行活化，且采 用比甲醇洗脫能力高的乙腈作為淋洗液，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其具有更加節(jié)省溶劑和時(shí)間的 優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)提高樣品的凈化和富集率，也可以達(dá)到延長(zhǎng)色譜系統(tǒng)和色譜柱壽命的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決上述的固相萃取柱活化需要較多的溶劑，而且樣品凈化 和富集率不高等技術(shù)問(wèn)題而提供一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，該分析 方法是一種操作簡(jiǎn)單、可靠、準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度高，并大大縮短了分析時(shí)間的多酚物質(zhì)定性、 定量分析方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0008] 一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，包括如下步驟：
[0009] (1)、精確吸取20-30ml的待測(cè)葡萄酒經(jīng)過(guò)有機(jī)相針式過(guò)濾器過(guò)濾，然后采用固相 萃取小柱對(duì)葡萄酒進(jìn)行前處理，得到待測(cè)葡萄酒樣品；
[0010] 所述的有機(jī)相針式過(guò)濾器的材質(zhì)為尼龍，過(guò)濾器孔徑為〇. 22um-0. 45um;
[0011] 所述的固相萃取小柱對(duì)葡萄酒進(jìn)行前處理的步驟如下：
[0012] 過(guò)濾后的待測(cè)葡萄酒經(jīng)5-8min通過(guò)固相萃取小柱，待過(guò)濾后的待測(cè)葡萄酒全部 吸附，分別以8ml二次去離子水，5ml的體積百分比濃度為2-4%的乙腈水溶液沖洗固相萃 取小柱后，連續(xù)抽真空3-5min，用3-5ml純乙腈溶劑洗脫，洗脫流速為1. 8-2.Oml/min，所得 的洗脫液在氮吹儀上于55°C下蒸發(fā)至近干后，用純乙腈準(zhǔn)確定容到1. 0-2.Oml，即得待測(cè) 葡萄酒樣品；
[0013] 所述的固相萃取小柱為ProElutC18小柱；所述的體積百分比濃度為2-4%的乙 腈水溶液配制所用的水為二次去離子水；
[0014] (2)、利用安捷倫1260Infinity高效液相色譜儀，首先將高效液相色譜儀器調(diào)整 至工作狀態(tài)，然后用按體積百分比計(jì)算，即乙腈：二次去離子為5-20% :80-95%的比例組成 的流動(dòng)相反復(fù)沖洗色譜柱直至其基線穩(wěn)定；
[0015] 然后，對(duì)步驟（1)所得的待測(cè)葡萄酒樣品進(jìn)行梯度洗脫分析，即得到待測(cè)葡萄酒 樣品中多酚物質(zhì)的高效液相色譜指紋圖譜的保留時(shí)間和峰面積；
[0016] 所述的高效液相色譜儀的型號(hào)為1260Infinity，在HPLC分析中，采用二極管陣列 檢測(cè)器采集波長(zhǎng)，采集范圍從190nm-210nm至390nm-410nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm-340nm，色譜 柱為AgilentHC-C18 柱子；
[0017] 所述的高效液相色譜儀的色譜條件設(shè)定如下：
[0018] 流動(dòng)相為純乙腈溶劑和體積百分比濃度為0. 1 % _0. 3 %的磷酸水溶液，體積百分 比濃度為〇. 1-0. 3%的磷酸水溶液配制所用的水為二次去離子水；
[0019] 洗脫時(shí)間為0_8min，體積百分比濃度從9% -12%變化至19% -21 %的乙腈流動(dòng) 相；
[0020] 洗脫時(shí)間為8-10min，體積百分比濃度從19% -21%變化至94% -96%的乙腈流動(dòng) 相；
[0021] 洗脫時(shí)間為10_13min，體積百分比濃度從94% -96%變化至89% -91 %的乙腈流 動(dòng)相；
[0022] 流速為 1. 4-1. 6ml/min;
[0023] 色譜柱的溫度為28-32°C;
[0024] 進(jìn)樣量為 5_15ul;
[0025] (3)、配制多酚物質(zhì)的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別經(jīng)過(guò)有機(jī)相針式過(guò)濾器過(guò)濾，而后用高 效液相色譜儀按與步驟（2)中的色譜條件相同的條件下進(jìn)行分析，分別得到多酚物質(zhì)的單 一標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜指紋圖譜中的保留時(shí)間；
[0026] 所述的多酚物質(zhì)的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為沒(méi)食子酸的乙腈溶液、香豆酸的乙腈 溶液、綠原酸的乙腈溶液、咖啡酸的乙腈溶液、阿魏酸的乙腈溶液和槲皮素的乙腈溶液；
[0027] 與步驟（2)得到的待測(cè)葡萄酒中多酚物質(zhì)高效液相色譜指紋圖譜中的保留時(shí)間 進(jìn)行對(duì)照，從而對(duì)待測(cè)葡萄酒中的多酚物質(zhì)進(jìn)行定性分析；
[0028] 或配制一系列濃度梯度的外混合多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)過(guò)有機(jī)相針式過(guò)濾器過(guò)濾，而 后用高效液相色譜儀按步驟（2)中的色譜條件相同的條件下進(jìn)行分析，得到一系列濃度梯 度的外混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜指紋圖譜中的峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，多酚物質(zhì) 的濃度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)多酚物質(zhì)的濃度與峰面積的關(guān)系圖，然后通過(guò)線性回歸得到標(biāo) 準(zhǔn)多酚物質(zhì)的濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；
[0029] 所述的一系列濃度梯度的外混合多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，為沒(méi)食子酸、香豆酸、綠原酸、 咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的混合物的乙腈溶液；
[0030] 將步驟（2)中所得的待測(cè)葡萄酒樣品的高效液相色譜指紋圖譜中的不同峰面積 分別代入到上述的對(duì)應(yīng)的不同的標(biāo)準(zhǔn)多酚物質(zhì)的濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出待 測(cè)葡萄酒樣品中的不同的多酚物質(zhì)的含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄酒中的不同的多酚物質(zhì)進(jìn)行定 量分析。
[0031] 上述的一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，所述的多酚物質(zhì)沒(méi)食子 酸、香豆酸、綠原酸、咖啡酸，阿魏酸和槲皮素。
[0032] 本發(fā)明的有益效果
[0033] 本發(fā)明為一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，在高效液相色譜分析 法分析中，采用價(jià)格較便宜的AgilentHC-C18色譜柱，代替了價(jià)格昂貴的多酚專(zhuān)用色譜柱， 從而降低了對(duì)葡萄酒中多酚物質(zhì)檢測(cè)分析的費(fèi)用。
[0034] 進(jìn)一步，本發(fā)明為一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，采用固相萃 取柱對(duì)葡萄酒進(jìn)行前處理，降低了樣品基質(zhì)的干擾，提高檢測(cè)靈敏度，與傳統(tǒng)的液液萃取方 法相比，固相萃取更加節(jié)省溶劑和時(shí)間，樣品的凈化和富集效率也更高。
[0035] 進(jìn)一步，本發(fā)明為一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，采用外混合 多酚標(biāo)準(zhǔn)品法對(duì)葡萄酒中的多個(gè)酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析，得到的指紋圖譜中含有6個(gè)特征峰并 對(duì)其進(jìn)行指認(rèn)，反映的信息量大，能更好的對(duì)葡萄酒中的多酚物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，并且 在常見(jiàn)濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系和較高的回收率，達(dá)到控制和提高葡萄酒質(zhì)量的目 的。
[0036] 進(jìn)一步，本發(fā)明為一種葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜分析方法，在儀器操作 上簡(jiǎn)單、儀器檢測(cè)分析時(shí)間短，僅需12分鐘，從而使整個(gè)分析流程所耗用的時(shí)間大為縮短， 為多酚物質(zhì)定性定量檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、更有效的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1、實(shí)施例1中的待測(cè)葡萄酒中多酚物質(zhì)的高效液相色譜指紋圖；
[0038] 圖2、實(shí)施例1中的待測(cè)葡萄酒與6種多酚物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜指 紋圖譜對(duì)照?qǐng)D；
[0039] 圖3、實(shí)施例1中的待測(cè)葡萄酒不同濃度梯度的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中多酚物質(zhì)的高效液相 色譜指紋重現(xiàn)性對(duì)照?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
[0041] 本發(fā)明采用的儀器裝置和試劑：
[0042] 2ml液相自動(dòng)進(jìn)樣瓶，50mm*0. 22um的有機(jī)相過(guò)濾膜，50mm*0. 22um的水相過(guò)濾膜， 0. 22um有機(jī)相尼龍針式濾器，購(gòu)于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；
[0043] ProElutC18固相萃取小柱，迪馬科技有限公司；
[0044] HC-C18色譜柱，安捷倫儀器有限公司；
[0045] HPLC1260型高效液相色譜儀：安捷倫儀器有限公司；
[0046] 主要試劑：沒(méi)食子酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和綠原酸：SIGMA公司制造， 純度：99%。
[0047] 檢測(cè)后驗(yàn)證程序：考察了上述條件下的測(cè)定方法分析葡萄酒中多酚物質(zhì)的可行 性。包括測(cè)定該方法的加標(biāo)回收率和重現(xiàn)性。
[0048] 加標(biāo)回收率的測(cè)定是從成品葡萄酒中，添加不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度的沒(méi)食子酸、香 豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和綠原酸的混合溶液，對(duì)